蛋白质一级结构测序解析
蛋白质一级结构测序原理
蛋白质一级结构测序原理
蛋白质一级结构测序是通过确定蛋白质中氨基酸的序列来确定其一级结构的方法。
有两种常用的方法用于蛋白质一级结构的测序：酶法和质谱法。
酶法是最常用的测定蛋白质一级结构的方法之一。
这种方法利用特定的酶将蛋白质分解成小片段，然后通过测定每个片段中氨基酸残基的类型和顺序来确定蛋白质的氨基酸序列。
其中，最常用的酶是胰蛋白酶和胃蛋白酶，它们在特定的条件下能够切割蛋白质中的肽键。
通过将蛋白质与这些酶反应，可以生成一系列的片段，这些片段之间存在特定的顺序关系。
接下来，通过分离和测定每个片段中的氨基酸数量和类型，可以推断出蛋白质的氨基酸序列。
质谱法是另一种常用的测定蛋白质一级结构的方法。
这种方法利用质谱仪对蛋白质进行分析，并测定其分子量和氨基酸成分。
在质谱仪中，蛋白质会被电离成荷质比之后进行分子量测定。
通过测量荷质比，可以推断蛋白质的氨基酸序列。
质谱法相比酶法的优势在于其速度更快且能够直接测定大分子量的蛋白质。
综上所述，蛋白质一级结构测序的原理主要包括酶法和质谱法。
通过分析蛋白质中氨基酸的序列，可以确定蛋白质的一级结构。
蛋白质一级结构测定详解
蛋白质一级结构测定详解蛋白质一级结构测定是指确定蛋白质分子中氨基酸的序列顺序。
蛋白质的一级结构决定了蛋白质的功能和特性，因此准确测定蛋白质的一级结构对于理解蛋白质的功能和研究蛋白质的生理机制非常重要。
本文将详细介绍几种常用的蛋白质一级结构测定方法。
1.编码方法：蛋白质的氨基酸序列可以通过基因组学技术直接从DNA的序列中获取。
通过DNA的转录和翻译过程，蛋白质的氨基酸序列可以通过基因组学方法快速测定。
这种方法适用于已经测定过基因组的生物。
2.氨基酸分析法：氨基酸分析法是一种传统的蛋白质一级结构测定方法，通过将蛋白质水解成氨基酸，然后使用氨基酸分析仪来测定各种不同的氨基酸的含量和种类。
这种方法可以确定蛋白质中各种氨基酸的相对含量和比例，从而推断出蛋白质的氨基酸序列。
3.编码二维电泳：编码二维电泳是一种结合二维凝胶电泳和质谱技术的方法，可以用来测定蛋白质的一级结构。
首先，将蛋白质进行酶解，然后使用不同标记的肽酶消化蛋白质样品，并通过二维凝胶电泳将消化产物分离。
然后，将二维凝胶电泳的凝胶切割成片段，使用质谱仪进行质谱分析。
最后，根据质谱分析的结果确定蛋白质的氨基酸序列。
4.氨基酸测序法：氨基酸测序法是一种直接测定蛋白质氨基酸序列的方法，通过测定蛋白质中氨基酸的顺序，可以确定蛋白质的一级结构。
氨基酸测序法通常使用肽酶来酶解蛋白质，并使用街染色物质标记氨基酸。
然后，通过比色法或质谱仪等方法测定每个氨基酸的相对含量或精确质量，最终确定蛋白质的氨基酸序列。
综上所述，蛋白质一级结构测定方法有很多种。
不同的方法适用于不同的实验目的和条件。
选择合适的方法来测定蛋白质一级结构非常重要，可以提供宝贵的信息来理解蛋白质的功能和特性。
随着技术的不断发展，蛋白质一级结构测定的准确性也在不断提高，相信将来会有更多的方法被开发出来来解析蛋白质的一级结构。
测定蛋白质一级结构的方法进展
测定蛋白质一级结构的方法进展蛋白质的一级结构，指的是蛋白质分子中氨基酸的序列，其测定包括蛋白质分子多肽链 的数目和多肽链中的氨基酸的精确序列两方面。
蛋白质的氨基酸序列测定对了解其结构与功 能以及生物进化、遗传变异的关系极有意义，对生命科学的发展更是起到了推进作用，而当 今蛋白质组的研究更需其支持。
测定蛋白质一级结构并作出肽谱的重要性在于：①可用于分 子克隆中寡核苷酸探针的制备；②为cDNA推导的氨基酸序列提供证据；③为重组DNA产生 的蛋白质作指纹分析;④蛋白质的完整结构鉴定;⑤确定翻译后修饰的位点;⑥决定簇的定位;⑦二硫键的确定。
蛋白质测序的基本思路是先将蛋白质用化学法或酶法水解成肽段， 再对肽段进行氨基酸 序列测定，其中化学法裂解的肽段一般较大，适于自动序列分析仪测定；酶法的优点是专一 性强，降解后肽段易纯化，产率较高，副反应少。
得到纯肽后需对肽段进行氨基酸测序，测 定方法主要是化学法，酶法也有一定意义。
化学法以Edman降解法最为经典，它对所有氨基 酸残基具有的普适性和近乎定量的高产率，使其成为近50年来N端顺序分析技术的基础。
近 年来,在蛋白质序列测定方面出现了一些新的技术手段,现对这些新技术作一些简单的介绍。
一、液相色谱（LC）HPLC是肽谱分析常用的工具,常用粒度为5-10μm的大孔烷基化硅胶吸附剂为色谱柱的 填料,通过增加有机溶剂的浓度进行梯度洗脱,其发展目标是加快分析速度和提高灵敏度.对 小肽的分离可选用小孔径C18载体，粒度5-10μm。
1、微柱高效液相色谱普通柱通常为4.6mmI.D.,而微柱液相色谱柱直径<2.1mm,它是由科学家Ishii首次提出 的，现在已成为Edman降解自动序列分析仪分离低微克量蛋白质和肽的基础。
它一般重现良 好，且用样量少，并能快速地进行蛋白质分析。
其流速通常为10-200μl/min,出峰时间短, 峰型尖窄,从而大大提高了检测灵敏度,可达1pmol;回收率高,因为微柱的载体少,非专一性 吸附少。
蛋白质的一级结构分析与预测方法
蛋白质的一级结构分析与预测方法蛋白质是一类生物分子，它们在机体中起到了举足轻重的作用。
蛋白质分子结构的研究是生物学、药学等领域的热门研究方向。
在研究蛋白质的结构、功能和特性时，常常需要对其一级结构进行分析和预测。
本文将介绍蛋白质一级结构的分析与预测方法。
一、蛋白质一级结构概述蛋白质的一级结构指的是其氨基酸序列。
蛋白质分子由20种左右的氨基酸组成，通过不同的排列组合构成不同的蛋白质。
氨基酸是一种含有羧基（-COOH）、氨基（-NH2）和一侧链的有机化合物，它们通过肽键相连构成肽链，进而构成蛋白质分子。
蛋白质的一级结构是其二级、三级结构和功能的基础。
因此，研究蛋白质的一级结构对于研究蛋白质的结构和功能具有非常重要的意义。
二、蛋白质一级结构分析方法1. 比对分析法：比对分析法是一种通过比对蛋白质序列进行分析的方法。
这种方法通过比对蛋白质序列与已知蛋白质数据库中的序列进行比较，从而推测出该序列可能具有的功能和结构。
比对分析法具有预测准确率高、速度较快等优点，因此被广泛应用于蛋白质序列的分析领域。
2. 生物物理学方法：生物物理学方法包括了一系列的实验方法，如X射线晶体衍射等，可以用来研究蛋白质的空间构象和形态。
通过对蛋白质分子的实验分析，可以进一步了解其一级结构及其对应的生物学功能。
3. 生物信息学方法：生物信息学方法是一种透过计算机程序对蛋白质序列进行分析的方法。
生物信息学方法可以预测蛋白质的物理化学性质、表观结构和功能等，包括常见的基于机器学习方法的蛋白质结构预测模型和关于序列特征分析、耦合谱分析的小标签搜索技术。
生物信息学方法是当前研究蛋白质的一级结构的热门方法之一。
它以深度学习模型和新算法为手段，对大量的已知蛋白质序列进行训练，然后使用预测模型对新蛋白质进行预测。
生物信息学方法具有速度快、预测准确率高等优点，因此仍在不断发展和完善。
三、蛋白质一级结构预测方法1. 基于比对分析法的蛋白质一级结构预测：由于氨基酸序列是蛋白质一级结构的关键，因此比对分析法也可以被用于预测蛋白质一级结构。
蛋白质 一级结构
蛋白质一级结构蛋白质是生命体中重要的大分子有机化合物，由氨基酸残基通过肽键连接而成。
蛋白质的一级结构是指由氨基酸的线性排列所组成的序列，其决定了蛋白质的功能和特性。
蛋白质的一级结构是由20种不同的氨基酸残基组成的。
每个氨基酸残基都有一个共同的核心结构，包括一个氨基基团（NH2），一个羧基（COOH）以及一个侧链（R）。
侧链的不同决定了不同氨基酸之间的化学性质和功能。
蛋白质的一级结构可以通过测序技术确定。
在测序过程中，科学家们将蛋白质分解成小片段，并逐个测定每个氨基酸的序列。
通过这种方法，可以确定蛋白质的具体组成和顺序。
蛋白质的一级结构对于其功能至关重要。
不同的氨基酸序列决定了蛋白质的特定结构和功能。
例如，一些氨基酸序列可以形成螺旋状的α-螺旋结构，而另一些氨基酸序列则可以形成折叠的β-折叠结构。
这些结构对于蛋白质的稳定性和功能起着重要作用。
蛋白质的一级结构还可以受到一些生物化学反应的影响。
例如，蛋白质的氨基酸序列可以通过酶的作用而发生改变，从而影响蛋白质的功能。
此外，一些突变也可以导致蛋白质一级结构的改变，进而影响其功能。
蛋白质的一级结构还可以通过一些生物物理技术进行研究。
例如，核磁共振（NMR）和X射线晶体学可以用于确定蛋白质的三维结构。
这些技术可以提供有关蛋白质一级结构的详细信息，从而帮助科学家们理解蛋白质的功能和机制。
总结起来，蛋白质的一级结构是由氨基酸的线性排列所组成的序列。
这种结构决定了蛋白质的功能和特性。
通过测序技术和生物物理技术，我们可以研究和了解蛋白质的一级结构，从而揭示其在生命体中的重要作用。
蛋白质的一级结构研究对于深入理解生命活动的机理具有重要意义。
蛋白质的一级结构及分析
多肽具有特征性的氨基酸 组成，多肽或蛋白质以酸 水解产生游离-氨基酸 的混合物。当完全水解时 ，每一种类型的蛋白质产 生一种特征性的氨基酸比 例或混合物。20种氨基酸 几乎从不以相同的比例出 现在一个蛋白质中，有高 有低，甚至有的只出现一 次或根本不出现。
蛋白质的结构层次
1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出 蛋白质的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构： 氨基酸序列 secondary structure 二级结构： α螺旋，β折叠 tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体
• 多肽与蛋白质有时混用，但一般将分子量在10000以 下的称为多肽。
• 肽或蛋白质的水解是耗能的，由于高的活化能，水 解很慢，蛋白质的肽键非常稳定，多数胞内条件下 的半衰期为7年。
肽键就是一个氨基酸的α-羧基与另一 个氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的键
水解
缩合
氨基酸连接成肽链后，由于氨基酸之间通过一个氨基酸的 氨基与另一个氨基酸的羧基缩合脱水，肽链上的一个氨基酸单位 被称为残基（residue），带有游离-氨基的一端被称为氨基（末） 端（或N端），带有游离-羧基的一端被称为羧基（末）端（或 C端）。
received Nobel Prize in Chemistry in 1958.
• In 1965, he developed the chain termination method, also known as the "Sanger method." He later received another Nobel Prize in Chemistry in 1980 "for contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids."
蛋白质分子基础5-蛋白质一级结构测定
C末端分析
a)肼解法 b)还原法：硼氢化锂还原剂 c)羧肽酶法
还原法
肽链C末端AA ↓硼氢化锂 α－氨基醇 ↓水解 C末端氨基酸+ α－氨基醇 ↓ 色谱法鉴定
羧肽酶法
羧肽酶法：
最有效，最常用的测C端殘基方法 性质：肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降 解，释放出游离AA。
巯基含量测定
DTNB法(5.5’-二硫代双(-2-硝基苯甲酸)
Protein-Ｓ- +R-S-S-R(DTNB) Protein-S-S-R+RSProtein-SH Protein-S-S-Protein+RS-(CNT) R
-
-COOH -NO2
反应产物(CNT)在412nm处可产生光吸收， 根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含 量。
优点:Trp在水解中不受破坏。
蛋白质的水解
磺酸水解
4mol/L 甲基氨酸 ( 含 0.2%β- 吲哚乙胺 ) 色氨酸可 回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸 钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。 缺点: 水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破 坏。 优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。
蛋白质化学
蛋白质一级结构的测定
序列测定的基本方法学
将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的 肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。 再将不同方法得到的序列进行比对，就可以 得到肽链的一级结构。
序列测定一般步骤
纯度要求:纯度在97%以上。
双向电泳；凝胶电泳；N-末端测定；纯化至恒定酶活； 肽谱分析。
蛋白质一级结构是什么？
百泰派克生物科技
蛋白质一级结构是什么？
蛋白质的一级结构是指蛋白质中氨基酸序列的线性排列。
换句话说，它是由蛋白质中各个氨基酸按特定顺序连接起来的结构。
图1. 蛋白质一级结构的测定。
蛋白质是由20种不同的氨基酸构成的，每种氨基酸都有其独特的侧链。
这些氨基酸通过肽键连接起来，形成肽链。
当我们说到蛋白质的一级结构时，我们是指这个肽链上的氨基酸的确切顺序。
这个一级结构是由基因编码的，并且对蛋白质的功能至关重要。
即使只有一个氨基酸的变化，也可能导致蛋白质功能的显著改变或失活，这在许多遗传疾病中都有所体现。
例如，镰状细胞贫血症就是由于血红蛋白中的一个氨基酸替代引起的。
蛋白质还有更为复杂的结构，如二级、三级和四级结构，这些更高级的结构是基于一级结构上的氨基酸序列而形成的，并对蛋白质的功能起着关键作用。
蛋白质一级结构测序策略
蛋白质一级结构测序策略引言：蛋白质是生物体内最重要的分子之一，它们在细胞的结构、功能和调节中扮演着重要角色。
蛋白质的一级结构是指其氨基酸序列的排列方式。
了解蛋白质的一级结构对于深入研究其功能和相互作用具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质一级结构测序策略。
一、质谱法测序质谱法是一种常用的蛋白质一级结构测序方法。
其中最常用的是质谱法结合肽质谱和蛋白质质谱。
肽质谱是通过将蛋白质酶解成肽段后进行质谱分析，得出肽段的质量/电荷比。
而蛋白质质谱则是通过直接分析整个蛋白质的质量/电荷比，来获取蛋白质的一级结构信息。
二、DNA测序法DNA测序法也可以用于蛋白质一级结构的测序。
这种方法通过将DNA 转录成RNA，再将RNA翻译成蛋白质，从而获取蛋白质的一级结构信息。
DNA测序法具有高通量和高准确性的特点，可以同时测序大量的蛋白质，但需要注意转录和翻译的准确性。
三、核磁共振法测序核磁共振（NMR）是一种常用的蛋白质结构研究方法，也可以用于蛋白质一级结构的测序。
通过核磁共振技术，可以测量蛋白质中氢、碳等原子的化学位移，从而推断出氨基酸的序列。
四、质谱法结合DNA测序法质谱法和DNA测序法可以结合使用，以提高蛋白质一级结构测序的准确性和可靠性。
首先，通过质谱法分析蛋白质的肽段，得到部分氨基酸的序列信息。
然后，通过DNA测序法获取蛋白质的基因组DNA序列，进一步推断出蛋白质的完整一级结构。
五、荧光标记法测序荧光标记法是一种常用的蛋白质一级结构测序方法。
该方法通过将蛋白质的氨基酸残基与荧光染料结合，然后使用荧光显微镜观察荧光信号的强弱和位置，从而推断出蛋白质的一级结构。
六、电泳法测序电泳法也可以用于蛋白质一级结构的测序。
该方法通过将蛋白质样品在电场作用下进行分离，根据蛋白质的电荷、大小和形状差异，推断出蛋白质的一级结构。
结论：蛋白质一级结构测序是研究蛋白质功能和相互作用的重要手段。
目前常用的测序策略包括质谱法、DNA测序法、核磁共振法、质谱法结合DNA测序法、荧光标记法和电泳法等。
蛋白质的一级结构解析：揭示生物分子的基本构成
蛋白质的一级结构解析：揭示生物分子的基本构成蛋白质是生物体内最为重要的生物分子之一，其构成了细胞的基本组成部分，承担着众多生命活动的关键功能。
蛋白质的一级结构即氨基酸序列，是揭示蛋白质基本构成的基石。
本文将详细讨论蛋白质的一级结构，探究其对揭示生物分子基本构成的重要性。
图1。
一、氨基酸：蛋白质的构建单元。
氨基酸是蛋白质的构建单元，蛋白质的一级结构由氨基酸的排列顺序决定。
氨基酸是一类含有氨基（NH2）和羧基（COOH）的有机化合物，它们的侧链不同导致了不同的性质和功能。
目前已经发现了20种常见的氨基酸，它们通过肽键的形成连接成了多肽链，进一步组装成完整的蛋白质分子。
氨基酸序列的不同排列组合赋予了每个蛋白质独特的结构和功能。
二、序列决定结构与功能。
蛋白质的一级结构是蛋白质结构和功能的基础。
不同的氨基酸序列将决定蛋白质的折叠方式，从而形成特定的二级、三级和四级结构。
二级结构包括α-螺旋和β-折叠等，而三级结构则是由二级结构的相互作用所决定。
蛋白质的结构决定了其功能，包括催化反应、信号传递、结构支持等多种生物学过程。
因此，通过解析蛋白质的一级结构，我们可以揭示其结构和功能之间的关系，为进一步的研究和应用奠定基础。
三、测定一级结构的方法。
确定蛋白质的一级结构是蛋白质研究的基础工作之一。
目前，有多种实验方法可用于测定蛋白质的氨基酸序列。
其中，蛋白质测序技术是最常用的方法之一，它通过将蛋白质分解成氨基酸，并通过化学或质谱技术进行测定。
另外，基因组学和转录组学的发展也为蛋白质的一级结构研究提供了新的途径。
通过分析基因组和转录组数据，我们可以预测蛋白质的一级结构，为进一步的实验研究提供指导。
四、应用于生物制药领域。
蛋白质的一级结构解析对于生物制药领域具有重要意义。
在生物药物的研发过程中，了解药物候选分子的氨基酸序列是至关重要的。
这有助于验证药物的合成准确性和纯度，并确保其结构与功能的一致性。
此外，蛋白质一级结构的解析还为药物安全性评估提供了依据，可以帮助鉴定潜在的毒性位点和不良反应。
蛋白质一级结构的测定
其他裂解肽的方法：
A：部分酶分解法：0.1N HCl在110度或6N HCl 在37度水解，但特异性不强，因此对大片段和 肽均不适用； B：羟胺法：反应机理是通过羟胺作用，先形成 一个琥珀酰亚胺环状物然后导致肽键的裂解。 羟胺专一性的裂解Asn-Gly的肽链，产率可达 70%以上。但酸性条件下切割Asn-Pro； C： 稀酸切割Asp-Pro肽键：蛋白质中Asp-Pro键 对酸不稳定； D：Cleavage at Trp resides by oiodosobenzoine acid (亚碘酰基苯甲酸）产率： 70%-100%
多肽的专一性降解（specific cleavage of
大于20的多肽一般需要预先进行降解，尽管目 前的测序可以一次测定60-70氨基酸残基，但 由于氨基酸组成、纯度、产率等因素的影响这 种几率比较少。多肽的降解不外于化学法和酶 法俩种。 1 化学法（大片段）
A:Cyanogen bromide (CNBr) 它选择性的切断Met残 基的羧基侧肽链，将Met转化为高丝氨酸（Homoser) 和高丝氨酸内酯(Homoserine lactone)。 在氨基酸组成分析时高丝氨酸和高丝氨酸内酯相距甚 远。高丝氨酸在丝氨酸之后，而高丝氨酸内酯在组氨 酸之后。计算时可将高丝氨酸和高丝氨酸内酯相加， 计算甲硫氨酸的量。 the protein）
• 蛋白质高级结构研究需要一级结构的知识; 蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构 如:牛胰核糖核酸酶的复性实验 基因工程中包涵体的问题 • 蛋白质一级结构与分子进化的关系; 细胞色素C是广泛存在于需氧生物线粒体呼吸链中 的起传替作用的一种蛋白质通过它可以绘出生物进 化树,一般在进化树位置相距越远,则氨基酸的顺序 差别越大. • 一级结构与遗传病(分子病); 镰刀状细胞贫血症中的血红蛋白(HbS),他仅是β -链 上第六号的Glu变为Val ，从而导致生物功能上的巨 大差异
蛋白质一级结构测序-1
谷 氨
R 1
R 2
R 3
R 4
酸
水解位点
肽链
蛋 白• 谷氨酸蛋白酶： R1=Glu、Asp(磷酸缓
酶 和 精
冲液); 冲液)
R1=Glu (磷酸缓冲液或醋酸缓
氨
酸 蛋• 精氨酸蛋白酶： R1=Arg
白
酶
化学法：可获得较大的肽段
溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能选 择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。
O
CH2Cl
-OOC CH CH 2 SCH 2
O
NH 3+
ICH2CNH2 -OOC CHCH2 SCH2CNH2
NH3+
O
保 护 作用：这些反应可用于巯基的保护。
SS
S
S
S
S
胰岛素
SH
HSHO-CH2-CH2-SH
SH
SH
SH
SH
ICH2COOH SCH2C00HSCH2C00H
SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H
-HN-CH-CO-NH-
CH-CO-
R1
R2
O
O
O
O
N HC HC N HC HC N HC HC N HC HC
R 1
R 2
水解位点
R 3
R 4
肽链
糜 蛋
• 或胰凝乳蛋白酶 （Chymotryps
白 in）：R1=Phe,
酶 Trp,Tyr时水解
快; R1= Leu， Met和His水解
稍慢。
胰蛋白酶水解：
溴化氰水解：
甘-丙-丙-苏-蛋-组-酪-苯-精 甘-丙-丝-蛋-丙-亮-异-赖 苯-甘-亮-蛋-丙-缬-丝-精 亮-甘-丙-天
蛋白质一级结构测定详解
2020年10月2日星期五
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本法的优点： （1）除去N末端氨基酸后剩下的肽链 部分仍是完整的，可以依照前法重复 测定新生的N末端氨基酸。
2020年10月2日星期五
4
天然蛋白质分子量的测定，对于蛋
白质一级结构的测定是十分重要的信息。 根据蛋白质的分子量和蛋白质分子中氨 基酸的平均分子量，可以大致估计蛋白 质分子中氨基酸组成的数目。
在蛋白质序列测定中，对分子量测 定的要求不高，误差小于10%即可以。
分子量的测定立法主要有：
SDS-凝胶电游泳法、超速离心法、
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丹磺酰氯（DNS-Cl）法双向层析指纹图
2020年10月2日星期五
2b3ack
异硫氰酸苯酯法：目前应用最广泛的 一种氨基末端的测定方法多肽或蛋白 质与PITC在pH≈9，40 ℃作用时形成 苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质（简称 PTC多肽或蛋白质）后者与酸在有机 溶剂中反应后，代表N末端的PTC氨基 酸环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物 而从肽链上掉下来，此产物可用气液 色谱法进行鉴定。
2020年10月2日星期五
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氨
基
酸
组
成
测
定
2020年10月2日星期五
12
2020年10月2日星期五
13
氨
基
酸
自
动
分
析
仪
原
理
图 2020年10月2日星期五
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多肽链的末端分析
（氨基）端的测定 （1）2，4-二硝基氟苯法（DNP）
（2）丹磺酰氯（DNS-Cl）法（DNS）
（3）异硫氰酸苯酯（PITC）-Edman降解法
能研究生命过程中的许多复杂问题。
蛋白质测序
Protein Sequencing
氨基酸序列（一级结构） → 空间结构 （高级结构） → 功能
一级结构的要点
蛋白质主链由氨基酸以酰胺键连 接，多肽的线性结构叫肽链，组 成肽链的氨基酸叫氨基酸残基。
一级结构要点：
⑴蛋白质中的肽键都是由α-NH2和α-COOH结合 生成的。 ⑵每一种蛋白质都有相同的肽主链结构，各种 蛋白质间的差异是蛋白质的氨基酸种类、数量 及排列顺序不同。 ⑶氨基酸的α-NH2和α-COOH缩合，只有末端及 侧链基团有化学活性。 ⑷每个蛋白质或每个蛋白质的亚基只有一个αNH2 和α-COOH ⑸分子量大于5000的活性肽才能称为蛋白质。
（一） 蛋白质测序的一般步骤
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成。 （4） 断裂链内二硫键。
蛋白质测序的一般步骤
（5） 分析多肽链的N末端和C末端。 （6） 多肽链部分裂解成肽段。 （7） 测定各个肽段的氨基酸顺序 （8） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （9） 确定多肽链中二硫键的位置。
（二） 蛋白质测序的基本策略
对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端， 但目前只能测60个N端氨基酸。
1、 直接法（测蛋白质的序列）
2、 间接法（测核酸序列推断氨 基酸序列）
1、 直接法（测蛋白质的序列）
•两种以上特异性裂解法 N-------------------- C
A 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4
（3）转化
ATZ—A
PTH—A
用GC或HPLC测定PTH-A
PTC肽：苯氨基硫甲酰肽
ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）
蛋白质一级结构的测序。
蛋白质一级结构的测序。
引言：蛋白质是细胞中最基本的生物大分子，其功能多种多样，包括酶催化、结构支持、运输、信号传递等。
了解蛋白质的一级结构是研究蛋白质功能和结构的重要基础。
本文将介绍蛋白质一级结构的测序方法以及其在生物科学中的应用。
一、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构指的是其氨基酸序列，即由20种氨基酸按照特定的顺序组成的链状结构。
氨基酸是蛋白质的构建单元，每个氨基酸由一个氨基、一个羧基和一个侧链组成。
氨基酸的侧链决定了蛋白质的特性和功能。
二、蛋白质一级结构的测序方法1. 氨基酸分析法氨基酸分析法是最早用于蛋白质测序的方法之一。
通过将蛋白质水解成氨基酸，然后利用色谱技术分离和定量各种氨基酸，从而确定蛋白质的氨基酸序列。
2. Edman降解法Edman降解法是一种经典的蛋白质一级结构测序方法。
该方法利用酸性试剂（如氟酸）将蛋白质分解为氨基酸，并将第一个氨基酸与试剂反应形成标记物。
然后通过酸性条件将标记物从蛋白质中分离出来，再次进行降解，直到将所有的氨基酸测序完毕。
3. 质谱法质谱法是一种高效、准确的蛋白质测序方法。
通过将蛋白质分解为小片段，然后利用质谱仪测定这些片段的质量和质荷比，从而推断出蛋白质的氨基酸序列。
质谱法在蛋白质组学研究中得到了广泛的应用。
三、蛋白质一级结构测序的应用1. 研究蛋白质功能蛋白质的一级结构直接决定了其功能。
通过测序蛋白质的氨基酸序列，可以推断出其功能和相互作用的方式。
这对于研究蛋白质的生物学功能、药物研发等具有重要意义。
2. 预测蛋白质结构蛋白质的一级结构是预测其三维结构的基础。
通过测序蛋白质的氨基酸序列，可以利用生物信息学方法预测蛋白质的二级结构、三级结构甚至四级结构，从而揭示蛋白质的功能和结构特征。
3. 研究蛋白质变异蛋白质的一级结构在不同个体和物种之间存在差异，这些差异与个体的遗传背景和疾病易感性有关。
通过测序蛋白质的氨基酸序列，可以研究蛋白质的变异情况，从而深入了解蛋白质与疾病之间的关系。
蛋白质一级结构的测定
05
蛋白质一级结构测定的应用 与展望
在生物科学研究中的应用
蛋白质功能研究
通过测定蛋白质一级结构，可以 深入了解蛋白质的功能和作用机 制，为生物科学领域的基础研究 提供重要信息。
生物进化研究
蛋白质一级结构的比较分析有助 于揭示生物进化的规律和机制， 为生物进化研究提供有力支持。
生物标志物发现
蛋白质一级结构的测定可以为生 物标志物的发现和鉴定提供依据， 有助于疾病预警、诊断和治疗。
详细描述
序列分析法是测定蛋白质一级结构最直接的方法，包 括Edman降解法、化学裂解法、质谱法等。Edman 降解法是通过将蛋白质一级结构中的每个氨基酸残基 依次进行化学修饰和测序，从而确定氨基酸的排列顺 序。化学裂解法则是利用化学试剂将蛋白质分解成较 小的肽段，再测定每个肽段中氨基酸的组成和排列顺 序。质谱法则通过分析蛋白质的离子化特性来确定氨 基酸序列。
质谱技术的优势与局限性
优势
质谱技术具有高灵敏度、高分辨率和高 准确性等优点，能够快速准确地测定蛋 白质一级结构，且样品需求量少，适用 于大规模蛋白质组学研究。
VS
局限性
质谱技术对于样品纯度和分子量范围有一 定的要求，对于复杂样品和低丰度蛋白质 的测定仍存在挑战。同时，质谱仪器成本 较高，操作和维护较为复杂。
肽质量指纹图谱
通过将蛋白质酶解成肽段，利用质谱技术分析肽段的质量， 可以获得肽质量指纹图谱，用于蛋白质的鉴定和一级结构 的测定。
串联质谱
串联质谱技术通过将肽段离子进一步裂解，产生更小的片 段离子，从而更精确地测定肽段序列和氨基酸组成，进一 步确定蛋白质一级结构。
磷酸化位点测定
质谱技术还可以用于磷酸化位点的测定，通过分析磷酸化 肽段的离子，可以确定磷酸化位点和磷酸化类型。
蛋白质一级结构
蛋白质一级结构蛋白质一级结构是指由氨基酸组成的多肽链的线性序列。
它是蛋白质最基本的结构层次，决定了蛋白质的功能和特性。
蛋白质一级结构的研究对于理解生物分子的功能和进化具有重要意义。
蛋白质是生命体内最为重要的分子之一，它在细胞的结构、代谢、传递和调控等方面发挥着重要的作用。
蛋白质的一级结构由20种不同的氨基酸残基通过肽键连接而成。
这些氨基酸残基在连接方式、种类和数量上的差异决定了蛋白质的种类和功能。
蛋白质一级结构的研究方法主要有两种：序列分析和结构预测。
序列分析是通过测定蛋白质的氨基酸残基顺序来研究其一级结构，常用的方法有质谱法、电泳法和DNA测序法等。
而结构预测则是通过计算机模拟和分析蛋白质的结构来推测其一级结构，目前的研究主要利用分子动力学模拟和人工智能算法进行。
蛋白质一级结构的研究对于揭示蛋白质的功能和进化具有重要意义。
蛋白质的功能大部分是由其一级结构所决定的，不同的氨基酸残基顺序将导致蛋白质结构的差异，从而决定了其功能的不同。
例如，一些氨基酸残基的替换可以导致蛋白质的结构和功能发生改变，进而影响生物体的生长发育和疾病的发生。
此外，蛋白质一级结构的研究还可以帮助人们理解生物分子的进化机制。
蛋白质的氨基酸顺序在进化过程中发生了改变，这些改变经过长时间的积累，导致了生物体之间的差异。
通过比较不同物种的蛋白质一级结构，可以揭示生物体的进化关系及其适应环境的方式。
蛋白质一级结构的研究还可以应用于药物研发和治疗疾病。
许多药物的作用机制与蛋白质一级结构的变化密切相关。
通过研究蛋白质一级结构的变化，可以设计出具有特定功能的药物，从而治疗疾病或控制生物过程。
总之，蛋白质一级结构是蛋白质最基本的结构层次，决定了其功能和特性。
蛋白质一级结构的研究对于理解生物分子的功能、进化和药物研发具有重要意义。
通过深入研究蛋白质一级结构的变化，可以揭示生物体的进化关系、疾病发生机制，并为新药的发现和治疗提供重要的指导。
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O NH CH C R1 R2
O NH CH C R3
O NH CH C R4
O NH CH C
梭 菌 蛋 白 酶
• 梭状芽孢杆菌中分离，专一性强 • R1=Arg 。
化学法：可获得较大的肽段
溴化氰水解法：它能选择性地切割由甲 硫氨酸的羧基所形成的肽键。 羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。
4 、鉴定多肽链 N －末端、 C －末端氨基酸残 基
多肽链的另一部分样品进行末端残基的确定，以 便建立两个重要的氨基酸序列参考点，方法比较多。
5、裂解多肽链成较小的片段
酶解法，化学法。
采用两/多种不同的断裂方法将多肽断裂成两套 或多套肽段，并将其分离。
6、测定各肽段的氨基酸序列
7、片段重叠法重建完整多肽链一级结构
质谱法(Mass Spectrometry, MS)，即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、 分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出了离子的准确质量， 就可以确定离子的化合物组成。这是由于核素的准确质量是一多位小数，决不会有两 个核素的质量是一样的，而且决不会有一种核素的质量恰好是另一核素质量的整数倍。
一级结构的化学键？
2.一级结构的意义
测定蛋白质氨基酸顺序的重要意义：
• 测定蛋白质中的AA顺序，是走向阐明其生 物功能基础中的很重要步骤。顺序可以给 出更多的信息。 • 为了了解多肽链折叠成三维构象所受到的 限制，顺序测定是必须的。 • AA顺序的改变可以导致异常的功能和疾病， 所以顺序测定是分子病理学的一个重要部 分。 • 蛋白质中的AA顺序很能指明它的进化史。
二硫键位置的确定
+
第 二 向
a b
-
pH6.5 图中a、b两个斑点是 由一个二硫键断裂 产生的肽段
+
第一向
-
Brown和Hartlay对角线电泳图解
（九）蛋白质测序举例
• 胰岛素测序自学
胰岛素的分子量为5734道尔顿，由51氨基酸组成。含A、B两条链，（A链：21肽 ，B链：30肽）。 A链和B链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20B19)连接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之 间形成一个链内二硫键。
利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼
凑出整条多肽链的AA顺序。
8、确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的 位置 不包括辅基成分分析
（二）鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸 残基
Sanger法（二硝基氟苯反应）
N端
DNS法（丹磺酰氯反应）
Edman法（苯异硫氰酸脂反应）
氨肽酶法
肼解法
C端
羧肽酶法 LiBH4还原法
蛋白质顺 序测定基 本方法路 线
纯蛋白质
二硫键拆开
末端氨基酸测定 专一性裂解
将肽段分离并测出顺序
将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序
测定一级结构的基本方法
基本步骤： (1) 测定末端氨基酸数目，确定蛋白质分子是由几条 肽链构成的； (2) 拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链内二硫键 并分离出每条肽链。 (3)将肽链完全水解，测定每条多肽链的氨基酸组成 (4)鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基 (5)至少用两种方法将多肽链水解成较小的片段； (6)分离并测定各肽段的氨基酸序列； (7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构； (8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。
3.LiBH4还原法
多肽+ LiBH4
水解
α-氨基醇+ n氨基酸
含C—端氨基酸,用层析法鉴定
（三）二硫桥的断裂
几条多肽链通过 二硫键交联在一起。 可在8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍存在 下，用过量的巯基乙醇(还原法) 处理，使二硫键还 原为巯基，然后用 烷基化试剂碘乙酸 （ICH2COOH）保护 生成的巯基，以防 止它重新被氧化。
4.根据核苷酸序列的推定法
蛋白质链 核糖体
（七）肽段在多肽链中次序的决定
重叠肽（overlaping peptide）—— 片段重叠法重建完整多肽链一级结构
片段重叠法重建完整多肽链一级结构 所得资料：
氨基末端残基 H
羧基末端残基 S
第一套肽段
OUS PS
第二套肽段
SEO WTOU
EOVE
RLA
O NH CH C R1 R2
O NH CH C R3
O NH CH C R4
O NH CH C
嗜 热 菌 蛋 白 酶
• R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met 以及其它疏水性强的氨基酸水解速 度较快。 • R2=Pro或Gly 水解受抑。 • R1或R3=Pro 水解受抑。
H2N CH C N- 端 氨 基 酸
+
HN CH C HN CH C OH C -端 氨 基 酸 O Rn O
H H2N CH C NHNH2 +H2N CH C OH NH2NH2 C -端 氨 基 酸 氨基酸酰肼
R
2. 羧肽酶的方法
是目前最有效也是最常用的方法。 羧肽酶是一类肽链外切酶，它专一地从肽链的C －端依次切下一个氨基酸残基，释放出游离的氨 基酸。据一定时间内切下的数量来测氨基酸的数 量。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B 来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。
• 或胰凝乳蛋白酶： 糜 • R =Phe,Trp,Tyr时 1 蛋 水解快; 白 酶 • R1=Leu，Met和His 水解稍慢。 • R2=Pro 水解受抑。
O NH CH C R1 R2
O NH CH C R3
O NH CH C R4
O NH CH C
胃 蛋 白 酶
• R1和R2＝Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它 疏水性氨基酸水解 速度较快。 • R1=Pro 水解受抑
多肽 多肽
DNS-氨基酸
具有荧光，检测灵敏度高
(3)Edman法（苯异硫氰酸脂反应）
PITC
无N-端氨基的剩余部分
用层析法分离
(4) 氨肽酶法
从多肽链的N未端依次向内切
NH2 ---aa---aa---aa---aa……. 据一定时间内释放出的AA的数量和种 类来推测.
常用的是亮氨酸氨肽酶（LAP）：当N端 第二个氨基酸是脯氨酸时，LAP不能将N 端氨基酸水解下来
O NH CH C R1 R2
O NH CH C R3
O NH CH C R4
O NH CH C
胰 蛋 白 酶
• R1=Lys和Arg 侧链（专一 性较强，水 解速度快）。 • R2=Pro 水解 受抑。
O NH CH C R1 R2
O NH CH C R3
O NH CH C R4
O NH CH C
N-未端的测定方法
(1) Sanger法 DNFB （二硝基氟苯）反应
H O2N O2N DNFB F H O2N O2N N H C R1 C O H N O C N H H C
O
H C O N
H C R2
O C N H
H C R3 C
O
H N
H C R4
O C N H
H C R5 C
O
F
+
N H2
C-未端的测定方法
1.肼解法
是目前最好的方法 用色谱法鉴定 多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸 即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成 肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于 水的物质而与C-端氨基酸分离。 注:末端若为半胱氨酸或胱氨酸就不能用此 法，必须烷基化后再肼解。
R
O
R n-1O
Rn O
确定原多肽链中二硫键的位置。
二 硫 键 位 置 的 确 定
1、采用胃蛋白酶水解：切点多，生成的
肽段包括含二硫键的肽段都比较小；酸性环 境下防止二硫键发生交换，二硫键稳定。
2、将所得的肽段利用对角线电泳技术 进行分离。 3、然后同其它方法分析的肽段进行比 较，确定二硫键的位置。
对角线电泳： 把水解的混合肽段点到滤纸中央，在 pH6.5的条件下，进行第一向电泳，肽段将 按其大小及电荷的不同分离开来。然后把滤 纸暴露在过甲酸蒸气中，使-S-S-断裂。这时 每个含二硫键的肽段被氧化成一对含半胱氨 磺酸的肽。滤纸旋转90度角在与第一向完全 相同的条件下进行第二向电泳。在这里，大 多数肽段的迁移率未变，并将位于滤纸的一 条对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段比原来 含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都 偏离了对角线。肽斑可用茚三酮显色确定。
VERL
APS
HOWT
HO
借助重叠法确定肽段次序：
末端残基 H
末端肽段 HOWT
S
APS
第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS
第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全顺序 HOWTOUSEO VERLAPS
（八）确定半胱氨酸残基间形成二硫键 交联桥的位置 蛋白质一级结构的顺序测定完成后， 将未拆开二硫键的同一种蛋白质再一次 进行专一性的酶解，将含二硫键的肽段 进行酶解，分离出含二硫键的肽，对该 肽进行氧化或还原，切断二硫键，生成 二个小肽段，将这两个小肽段与原肽链 氨基酸顺序进行比较，即可确定二硫键 位置。
（六）肽段氨基酸序列的测定
1、 Edman法（苯异硫氰酸酯法） Edman于1950年首先提出。
顺序分析的 N-端分析法 最主要的方法 特点：能够不断重复循环，将肽链N-端 氨基酸残基逐一进行标记和解离。
PITC
PTC-肽
2、氨肽酶法或羧肽酶法 3、质谱法（MS）
灵敏度高、所需样品少、测定速度快
1、测定蛋白质分子中多肽链的数目。