测序基本步骤

一、氨基酸组成
蛋白质经盐酸水解后成为个别氨 基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分 开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋 白质中的百分组成或个数。
二、末端测定的具体方法
二硝基氟苯法（DNP法） 肼解法 化学法 二甲基氨基萘磺酰氯法 （Dansyl-氯法） 还原成氨基醇法
酶解法
亮氨酸氨肽酶法 细胞外氨肽酶法
羧肽酶 CpA CpB CpC 来源 胰脏 胰脏 植物或微 生物 专一性 能释放除Pro、Arg、Lys外的所有 的C-端氨基酸 主要水解C-端为Arg、Lys的肽键 相当广泛，几乎能释放C-端的所有 氨基酸
还原成氨基醇法
• 多肽C-端氨基酸可被硼氢化锂（LiBH4） 还原成α-氨基醇，用层析法可以鉴定氨 基酸种类。 • Sanger早期测定胰岛素C-末端氨基酸采 用此法。
三、水解肽链成肽段
水解酶或化 水解部位 学试剂 胰蛋白酶 羧基侧 作用的氨基酸 赖氨酸、精氨酸 芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色 氨酸和酪氨酸） 甲硫氨酸
胰凝乳蛋白 羧基侧 酶 溴化氰 羧基侧
•水解后得到的肽段，可用离子层析或其他层析方法将其分离 纯化。比如用双向电泳可以得到肽图，由此可知肽段的多少。
四、 Edman降解法测定肽 段的氨基酸序列
耦联： 使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的碱性 条件下对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽 链的N-端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫 甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。 水解： PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基 肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基 的噻唑啉酮苯胺衍生物。
萃取： 将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应 液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基 的肽仍留在溶液中。 转化： 萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸 作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内 酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。
C-末端之肼解法
• 多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链 上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物 能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基 酸分离。 • 肼解过程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被 破坏而不易测出，C-末端的精氨酸转变为鸟氨酸
羧肽酶法
• 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个地 水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基 酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-端残疾顺序
DNFB
肽段经过分离纯化后， 即可进行氨基酸测序。但是 获得数据之后，还不能得出 整条多肽链的氨基酸排列顺 序，因为尚不清楚这些片段 在多肽链中的先后次序。一 般需要用到多种水解法，并 分析出各肽段的氨基酸顺序， 然后经过组合排列对比，最 终得出完整肽链中的氨基酸 序列。
六、确定肽段在多肽链中 的次序
反向遗传法分析多肽链的氨基酸序列
基本原理：中心法则 基本步骤： 1、分离编码蛋白质的基因 2、测定DNA序列 3、排列mRNA出序列 4、按照三联密码原则推演氨基酸序列
为什么进行蛋白质测序?
基因组测序,为了破译遗传密码.现在密码已破,那进行蛋白质组测序有必要
吗? 基因研究贯穿了整个20世纪,100多年里,双螺旋结构的提出,中心法则的发 现,直至基因组的重大突破,使基因研究达到了前所未有的深度与广度. 然而,基因只是信息的携带者,蛋白质才是执行者.基因组计划有其固有的局限性, 基因组测序是否正确,要从其表达的蛋白来验证,否则,只是一堆乱码而已.3.5万 左右基因中一半以上是理论推断,需要从蛋白质角度确认.而且,从蛋白质研究的 自身发展来看,我们无法逃避蛋白质组表达谱分析,只是时间问题而已. 以前,对蛋白质的研究是优于基因的,因为PCR,测序自动化使其发展猛.80 年代末,Hillen Kamp发展的激光解析质谱,Fem J设计的电喷雾质谱可以高效,精 确的测量生物大分子的质量,并测定部分序列,进而用于数据库的检索.Mann M 等再此基础上通过建立"肽质量指纹图谱与肽序列标签"等技术实现了质谱对蛋 白质进行大规模准确快速自动化的测序. 结构生物学是生命科学领域又一个新的研究热点，飞速发展的蛋白质结构 分析技术是研究蛋白质功能的基础。随着蛋白质组时代的来临，许多基因组分 析留下的悬而未决的问题，可能通过直接的蛋白质的分离和鉴定而得到解决。
氨基酸序列测定的基本步骤（化学方法）
分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端和羧基末端 为何种氨基酸
把肽链水解成片段
测定各肽段的氨基酸排列顺序 综合运用多种水解法分析肽段中的氨基酸顺序
测序前的准备工作
要求： 样品纯度：97%以上 相对分子质量：允许误差在10%左右 （一）多肽链的拆分 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质；可用 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍或高浓度的盐处理，即可使寡聚蛋白质 中的亚基。 如果多肽链间通过共价键（S—S）连接在一起，可采用氧化剂或还 原剂将其断裂。 （二）测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即 可确定多肽链的数目。 （三）二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸 胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后 用烷基化试剂保护生成的巯基，以防它重新被氧化。
利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错 重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 • — — — — — — — — — — — 多肽
• 氨基酸序列
重叠法：小片段重叠的原理主要 用于一级结构的测定
七、确定原多肽链中二硫 键的位置
一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键 的蛋白质 选用该法的好处： • 该酶的专一性比较低，切点多，生成肽 段包括含有二硫键的肽段比较小，对后 面的分离、鉴定比较容易； • 该酶的作用pH在酸性范围，有利于防止 二硫键发生交换而造成的麻烦。
蛋白质一级结构（primary structure）的测定
• 蛋白质测序的发展简史
自从1953 年Sanger首次完成胰岛素的 氨基酸顺序测定以来，目前已有很大改进。 但是Sanger花费多年时间才基本搞清胰岛 素的一级结构，现在由于方法改进及自动 化分析仪器的产生，现在已有数百种蛋白 质的氨基酸序列问世。
羧肽酶A法ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ羧肽酶B法 羧肽酶C法
二硝基氟苯法(Sanger法）
2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链 N-端的游离氨基作用，生成黄色二硝基苯衍 生物（DNP-氨基酸）
氨基肽酶法
• 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多 肽链的N-端逐个地向里水解。
• 根据不同的反应时间测出酶水解所释 放出的氨基酸种类和数量，按反应时 间和氨基酸残基释放量作动力学曲线， 从而知道蛋白质的N-端残疾顺序
Edman降解法测序每次只能测定几十个氨基酸残基， 所以要测定较大蛋白质的氨基酸序列，需要将其降解为 一些肽段，经HPLC分离出各个肽段，然后再进行 Edman降解测序。
五、鉴定每个肽段氨基酸 顺序
ABCDE
*ABCDE
部分水解
*A,*AB,*ABC,*ABCD,*ABCDE
完全水解
*A,*A+B,……*A+B+C+D+E *A,*A+*B,……*A+*B*+*C+*D+ *E
蛋白质一级结构的比较可以揭示进化 的关系
蛋白质一级结构 是由编码它的基因确 定的，蛋白质一级结 构之间的差别可以反 映出进化关系。亲缘 关系密切的蛋白质的 氨基酸序列非常类似， 一级结构中氨基酸残 基序列差别越大，它 们的亲缘关系就越远。 细胞色素c是由一条含 有104至111个氨基酸 残基的多肽链组成的， 由于细胞色素c几乎存 在于所有的需氧生物 中，所以通过在分子 水平上比较来自不同 种属的细胞色素c，可 以看出它们之间的进 化关系。