蛋白质结构测定的方法
生物物理学中的膜蛋白结构测定
生物物理学中的膜蛋白结构测定膜蛋白是一类特殊的蛋白质，它们嵌入在生物膜中，起到了许多重要的生物学功能，如细胞信号传递、细胞吸收和分泌物质等。
膜蛋白具有高度的复杂性和多样性，因此它们的结构研究一直是生物物理学的前沿领域。
本文将介绍生物物理学中常用的几种膜蛋白结构测定方法。
一、X射线晶体学X射线晶体学是一种非常重要的蛋白质结构测定方法之一。
它通过对某个分子的晶体进行较高分辨率的X射线衍射研究，可以确定其精确结构。
与传统的蛋白质晶体学技术相比，膜蛋白的结晶非常困难，因为它们在水相中的属于一个不稳定态且容易聚合，为此必需采取更加特殊的方式来增强其稳定性和结晶性。
在提取膜蛋白时，添加额外的化学试剂可以提高膜蛋白的稳定性和溶解度，促进膜蛋白的晶体生长，但同时也会影响蛋白质的结晶质量。
X射线晶体学还需要使用高强度的X射线束和高灵敏度的探测器进行实验，在实验条件上也有一定的限制。
二、核磁共振技术核磁共振技术(NMR)是一种非常广泛应用的测定蛋白质结构的方法。
所测定的结构来自于蛋白质在液态状态时的结构，因此它可以测量膜蛋白的结构。
核磁共振技术可以通过对膜蛋白中氢、碳、氮等核自旋的共振信号进行高精度分析来推断蛋白质的三维结构。
由于膜蛋白的质量很小，因此在核磁共振实验中需要采用高灵敏度的设备来进行实验。
三、电子显微镜技术电子显微镜(EM)技术是一种直接测量膜蛋白的结构的方法，它通过在极低温度下进行的“冷脱水”来锁定膜蛋白分子的结构状态，然后再进行电子显微镜照射和成像。
EM的分辨率较低，仅在0.2 - 1 nm之间，但是它可以直接观察膜蛋白在生物膜中的排列和组织状态，同时检测蛋白质的二级结构，如α-螺旋、β-片层等等，还可以推断出蛋白质的空间结构。
四、磁共振波谱学磁共振波谱学(MRS)是一种先进的非侵入性技术，它可以将生物样本埋入强磁场中，然后通过对样本中的同位素核或自旋相关进行研究，得到样本中化学分子的结构和代谢状况。
蛋白质结构分析方法
蛋白质结构分析方法：X射线晶体衍射分析和核磁共振x 射线衍射法的分辨率可达到原子的水平，使它可以测定亚基的空间结构、各亚基间的相对拓扑布局，还可清楚的描述配体存在与否对蛋白质的影响。
多维核磁共振波谱技术已成为确定蛋白质和核酸等生物分子溶液三维结构的唯一有效手段。
NM R技术最大的优点不在于它的分辨率，而在于它能对溶液中和非晶态的蛋白质进行测量。
蛋白质的序列结构测定:1.到目前为止，最经典的蛋白质的氨基酸序列分析方法是，sarI等人基于Edman降解原理研制的液相蛋白质序列仪，及后来发展的固相和气相的蛋白质序列分析仪。
2.质谱：早期的质谱电离的方式主要是电子轰击电离(EI)，它要求样品的挥发性好，一般与气相色谱联用。
但使用G C／M S分析，肽的长度受到限制，只能分析小的肽段。
近年来，在离子化的技术及仪器方面取得了突破性进展，使得质谱所能测定的分子量的范围大大超出了10k u。
因此，软离子化技术、基质辅助的激光解吸／离子化(MALDI)和电喷雾离子化(E SI)显得尤为有前途。
通过串联质谱技术(MS／MS)和源后衰减基质辅助的激光解吸／离子化(PSD—MAIDI—MS)，人们就可以从质谱分析中获得肽及蛋白质的结构信息。
蛋白质三维结构的研究：1.X射线单晶衍射分析2.核磁共振分析3.蛋白质的二维晶体与三级重构：蛋白质二维结晶及其电子晶体学的结构分析是目前结构生物学最活跃的领域之一。
此法既适用于水溶性蛋白质，也适用于脂溶性膜蛋白的研究。
电子晶体学的结构分析源于早期的电子衍射分析。
与X射线衍射方法类似，电子衍射数据的实验分析得到的只是结构因子的振幅部分，丢掉了相位信息。
但从剑桥MRC分子生物学实验室的Klug和DeRo sier建立了三维重构的方法开始，电子晶体学才真正发展成为一种独立的空间结构的分析方法，并从传统的X射线晶体学中脱胎出来。
所谓电镜图像的三维重构是指由样品的一个或多个投影图得到样品中各成分之间的三维关系。
文献综述-蛋白质多级结构的表征方式及测定方法
文献综述蛋白多级结构的表征及测定方式摘要研究蛋白质的结构对生命科学有重要意义，因为明确了蛋白质的结构，有助于了解蛋白质的作用，了解蛋白质如何行使其生物功能，认识蛋白质与蛋白质(或其它分子)之间的相互作用，这无论是对于生物学还是对于生物医学和生物药学，都是非常重要的。
蛋白质分子的多级结构可划分为四级，以描述其不同的方面，包括蛋白二级结构、超二级结构和结构域、三级结构、四级结构。
关键词：二级结构超二级结构和结构域三级结构四级结构表征和测定方式1 蛋白多级结构概述蛋白质分子是由氨基酸首尾相连缩合而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或称三维结构，这种三维结构通常被称为蛋白质的构象，即蛋白质的结构。
1.1 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构（secondary structure）是指多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。
蛋白质主链构象的结构单元包括：α-螺旋（α－helix）、β-片层结构（β－pleated sheet）或称β-折迭、β-转角（β－turn或β－bend）、无规卷曲（random coil）。
α-螺旋有以下几个特点：①多个肽键平面通过α－碳原子旋转，相互之间紧密盘曲成稳固的右手螺旋。
②主链呈螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm。
③每一个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的C=O之间形成氢键。
④肽链中氨基酸侧链R，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响α－螺旋的形成。
β-片层结构有以下几个特点：①是肽链相当伸展的结构，肽链平面之间折叠成锯齿状，相邻肽键平面间呈110°角。
氨基酸残基的R侧链伸出在锯齿的上方或下方。
②依靠两条肽链或一条肽链的两段肽链间的C=O与H形成氢键，使构象稳定。
③两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。
即前者两条链从“N端”到“C端”是同方向的，后者是反方向的。
β-片层结构的形式十分多样，正、反平行能相互交替。
蛋白质三级结构测定
蛋白质三级结构测定蛋白质是生命体内最基本的组成单元之一，它在维持细胞结构、催化化学反应、传递信号等方面起着重要作用。
蛋白质的功能与其三级结构密切相关。
本文将介绍蛋白质的三级结构以及测定方法。
蛋白质的三级结构包括原生结构（一级结构）、二级结构、三级结构和四级结构。
原生结构是蛋白质中氨基酸序列的线性排列方式，由多肽链组成。
二级结构是指多肽链中局部区域的空间排列方式，常见的二级结构包括α螺旋和β折叠。
蛋白质在水中形成这些二级结构，是由于氢键的形成和稳定。
三级结构是指整个多肽链的空间排列方式，包括α螺旋和β折叠的组合排列。
蛋白质的三级结构是由氨基酸间的相互作用决定的，如氢键、离子键、疏水作用和范德华力等。
四级结构是指多个多肽链之间的空间排列方式，形成了蛋白质的复合体。
蛋白质的三级结构测定是一项重要的研究领域，可以通过多种方法来实现。
其中，X射线晶体学是最常用的方法之一。
通过将蛋白质晶体暴露在X射线束下，利用晶体对X射线的衍射，可以得到蛋白质的高分辨率结构信息。
这种方法可以获得蛋白质的原子级别结构，对于理解蛋白质的功能和机制具有重要意义。
核磁共振（NMR）也是一种常用的蛋白质三级结构测定方法。
NMR 通过测量蛋白质中核磁共振信号的频率和强度，可以获得蛋白质的结构信息。
相比于X射线晶体学，NMR可以在溶液中测定蛋白质的结构，对于研究蛋白质的动态性质具有优势。
除了X射线晶体学和NMR，还有一些其他方法可以用于蛋白质三级结构的测定，如电子显微镜（EM）和质谱（MS）。
电子显微镜可以通过观察蛋白质复合物的投影图像，得到其低分辨率的结构信息。
质谱可以通过测量蛋白质的质荷比，获得蛋白质的结构信息。
蛋白质的三级结构对于其功能的发挥起着至关重要的作用。
当蛋白质的三级结构发生变化时，可能导致蛋白质的功能丧失甚至发生疾病。
因此，研究蛋白质的三级结构对于理解蛋白质的功能和疾病的发生机制具有重要意义。
蛋白质的三级结构是蛋白质功能的基础，其测定方法丰富多样。
测定蛋白质一级结构的方法
测定蛋白质一级结构的方法哇塞，蛋白质的一级结构可是非常重要的呀！那要怎么去测定它呢？
测定蛋白质一级结构的方法主要有以下这些哦。
首先是通过氨基酸组成分析，要把蛋白质水解成氨基酸，然后进行定量和定性分析，这就像拼图前要先知道有哪些拼图块一样。
这里面要注意水解的条件要控制好呀，不然会影响结果的准确性呢。
还有呀，不同的分析方法也要选对，不然也会出问题哟！
在这个过程中，安全性那可是相当重要的呀！得小心使用那些化学试剂，别一不小心伤到自己啦。
稳定性也得保证呀，每一步操作都要稳稳当当的，可不能马虎。
那它都有哪些应用场景和优势呢？这可多啦！比如在生物制药领域，了解蛋白质的一级结构可以帮助开发更有效的药物呢，就像有了精确的地图才能找到宝藏一样。
而且这种方法准确性高呀，能够给我们提供非常可靠的信息呢。
我给你说个实际案例吧。
比如说研究某种疾病相关的蛋白质，通过测定它的一级结构，科学家们就能更好地理解这个蛋白质的功能和作用机制，说不定就能找到治疗这种疾病的新方法呢！你说厉害不厉害？
总之呀，测定蛋白质一级结构的方法真的是超级重要的呀，它就像一把钥匙，能打开蛋白质奥秘的大门，让我们更好地了解生命的奥秘呢！。
蛋白质一级结构测定详解
蛋白质一级结构测定详解蛋白质一级结构测定是指确定蛋白质分子中氨基酸的序列顺序。
蛋白质的一级结构决定了蛋白质的功能和特性，因此准确测定蛋白质的一级结构对于理解蛋白质的功能和研究蛋白质的生理机制非常重要。
本文将详细介绍几种常用的蛋白质一级结构测定方法。
1.编码方法：蛋白质的氨基酸序列可以通过基因组学技术直接从DNA的序列中获取。
通过DNA的转录和翻译过程，蛋白质的氨基酸序列可以通过基因组学方法快速测定。
这种方法适用于已经测定过基因组的生物。
2.氨基酸分析法：氨基酸分析法是一种传统的蛋白质一级结构测定方法，通过将蛋白质水解成氨基酸，然后使用氨基酸分析仪来测定各种不同的氨基酸的含量和种类。
这种方法可以确定蛋白质中各种氨基酸的相对含量和比例，从而推断出蛋白质的氨基酸序列。
3.编码二维电泳：编码二维电泳是一种结合二维凝胶电泳和质谱技术的方法，可以用来测定蛋白质的一级结构。
首先，将蛋白质进行酶解，然后使用不同标记的肽酶消化蛋白质样品，并通过二维凝胶电泳将消化产物分离。
然后，将二维凝胶电泳的凝胶切割成片段，使用质谱仪进行质谱分析。
最后，根据质谱分析的结果确定蛋白质的氨基酸序列。
4.氨基酸测序法：氨基酸测序法是一种直接测定蛋白质氨基酸序列的方法，通过测定蛋白质中氨基酸的顺序，可以确定蛋白质的一级结构。
氨基酸测序法通常使用肽酶来酶解蛋白质，并使用街染色物质标记氨基酸。
然后，通过比色法或质谱仪等方法测定每个氨基酸的相对含量或精确质量，最终确定蛋白质的氨基酸序列。
综上所述，蛋白质一级结构测定方法有很多种。
不同的方法适用于不同的实验目的和条件。
选择合适的方法来测定蛋白质一级结构非常重要，可以提供宝贵的信息来理解蛋白质的功能和特性。
随着技术的不断发展，蛋白质一级结构测定的准确性也在不断提高，相信将来会有更多的方法被开发出来来解析蛋白质的一级结构。
检验蛋白质的方法
检验蛋白质的方法
第一种方法是生物素标记法。
生物素标记法是通过将生物素与蛋白质结合，然后用生物素与酶的结合作用来检测蛋白质的存在。
这种方法具有灵敏度高、特异性强的特点，适用于检测蛋白质的存在和纯度。
第二种方法是免疫沉淀法。
免疫沉淀法是通过将抗体与蛋白质结合，然后用沉淀剂将蛋白质沉淀下来，最后通过洗涤和电泳等步骤来检测蛋白质的存在。
这种方法适用于检测蛋白质的结构和相互作用。
第三种方法是质谱法。
质谱法是通过将蛋白质进行分子质量的测定，然后通过质谱仪来检测蛋白质的存在和结构。
这种方法具有高灵敏度、高分辨率的特点，适用于检测蛋白质的组成和修饰。
除了以上介绍的方法，还有许多其他的方法可以用来检验蛋白质，比如酶联免疫吸附试验、免疫荧光染色法等。
这些方法各有特点，可以根据实际需要选择合适的方法来进行蛋白质的检验。
总的来说，检验蛋白质的方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在进行蛋白质检验时，我们可以根据需要选择合适的方法来进行检验，以确保检验结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的方法对大家有所帮助，谢谢阅读！。
蛋白质三级结构的测定方法研究
蛋白质三级结构的测定方法研究一、绪论蛋白质是生命体中重要的基础分子，其三级结构（即α-螺旋、β-折叠和结构域）是其特殊的形态，“过度折叠及构象缺陷与很多疾病如糖尿病、白血病、巴金森氏症等形成联系，保持其完好的结构则是生物体长时间生存的关键。
因此，准确地测定蛋白质的三级结构一直以来是科学家们探索的重要课题。
本文将介绍蛋白质三级结构的测定方法，目的是深刻理解蛋白质的自由能和构象当量的关系，为结构生物学的进一步研究提供重要的技术支撑。
二、常用测定方法1. X-射线晶体学（X-ray Crystallography）X-射线晶体学是确定生物大分子三维结构的重要方法。
它利用晶体衍射技术，将X-射线往晶体内入射，从而形成的衍射数据，通过搜寻晶体中各点原子的相对位置，最后计算得到分子的三维结构。
X-射线晶体学经过数十年的技术不断突破和发展，现已成为生物大分子结构解析的重要工具之一。
2. 核磁共振（NMR）核磁共振是人们用于观测、确定物质内部结构、不同状态和反应机制等方式之一。
技术原理是将具有磁矩的原子或分子放入外磁场中，通过使它们的核磁矢量取向不同的方式，使它们的核磁矩发生共振。
由于不同类型的原子核共振的频率不同，其反应的响应信号也不同，这种特殊的信号可以通过电子设备处理和分析。
3. 电子显微学电子显微学是依靠通电电子束对物质进行成像的技术。
电子束足以穿透物质，但其处理样品的方法使得其分辨率高几十到数百倍，能够精确捕捉生物分子的高清晰度和高解析度图像。
电子显微学可以提供大量的生物大分子结构信息，例如膜蛋白、细胞器、纤维蛋白等等，是生物学领域最重要和常用的技术之一。
三、结论以上三种方法都是生物大分子结构解析的重要方法，每种方法各有优劣，需要根据实验需要和研究目的来进行选择。
X-射线晶体学明确了蛋白质的结构和分子相对位置， NMR 的方法可以测定蛋白质结构中的核心亚原子的相对位置，而电子显微学则可以为我们提供可信的高质量图像。
蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质一年级结构的测定方法
蛋白质一年级结构的测定方法集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定是指通过分子生物学手段，对蛋白质分子的原子结构进行详细分析并揭示其各个部分之间的相互作用及其在蛋白质结构中的位置和结构的研究。
它是确定蛋白质的结构的基本步骤，也是蛋白质结构分析的重要环节。
蛋白质一级结构测定的步骤包括：
第一步：样品准备。
首先要准备一定量的蛋白样品，蛋白样品的质量越好，结果越准确。
常用的样品准备方法有：水解、沉淀、纯化和提取。
第二步：结构图谱分析。
在样品准备好之后，就可以进行结构图谱分析，以检测蛋白质的一级结构。
主要的结构图谱分析方法有：X射线衍射、磁共振波谱、紫外光谱和电泳。
第三步：原子模型构建。
在结构图谱分析完成之后，就可以根据图谱分析的结果，构建蛋白质的原子模型，即把蛋白质中不同原子的位置及其之间的相互作用关系等信息还原到原子模型中。
第四步：模型精度评估。
当构建完原子模型之后，就可以对模型进行精度评估，也就是把原子模型与实际情况进行比较，看模型是否能够准确反映实际情况。
第五步：结构可视化。
在模型精度评估完成之后，就可以使用可视化软件将蛋白质的原子模型可视化，使得人们可以直观地观察蛋白质的原子结构。
第六步：结构分析和总结。
在蛋白质的原子模型可视化完成之后，就可以对蛋白质的原子结构进行分析，比如对模型中的原子以及原子之间的相互作用关系、结构偏移等进行分析，并对这一分析结果进行总结归纳，从而揭示蛋白质的一级结构。
以上就是蛋白质一级结构测定的六个步骤，在蛋白质结构分析中，蛋白质一级结构测定是最基础也是最重要的一步，只有把这一步做对了，才能够确保蛋白质的结构分析的准确性和可靠性。
蛋白质二级结构的检测手段
蛋白质二级结构的检测手段
蛋白质二级结构是指蛋白质中氨基酸链的局部折叠形态，包括α-螺旋、β-折叠、无规卷曲等。
二级结构的确定对于研究蛋白质的结构和功能很重要。
目前常用的蛋白质二级结构的检测手段主要有以下几种：
1. X射线晶体学：X射线晶体学是目前最常用的蛋白质结构测定方法，可以精确地解析蛋白质分子的三维结构，包括二级结构。
2. 核磁共振：核磁共振技术可以通过测量蛋白质分子内部的原
子核的自旋振荡情况，确定蛋白质的二级结构。
3. 红外光谱：红外光谱技术可以通过测量蛋白质中特定化学键
的振动频率，确定蛋白质的二级结构。
4. 圆二色谱：圆二色谱技术可以测量蛋白质中对左旋和右旋圆
极化光的旋转角度，从而确定蛋白质的二级结构。
5. 荧光光谱：荧光光谱技术可以通过测量蛋白质中特定氨基酸
残基的荧光发射光谱，确定蛋白质的二级结构。
综上所述，以上的检测手段可以相互补充，提供多维度的蛋白质结构信息，为研究蛋白质结构与功能的关系提供了重要的工具和手段。
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测定蛋白质三维结构的方法
测定蛋白质三维结构的方法蛋白质是生物体内最基本的功能分子，其功能与其三维结构密切相关。
因此，了解蛋白质的三维结构对于深入理解其功能机制至关重要。
在过去的几十年里，科学家们开发了多种方法来测定蛋白质的三维结构。
本文将介绍几种常用的测定蛋白质三维结构的方法。
1. X射线晶体学X射线晶体学是最常用的测定蛋白质三维结构的方法之一。
该方法利用X射线与蛋白质晶体相互作用产生的衍射图样来确定蛋白质的结构。
通过测量衍射图样的强度和相位信息，科学家们可以还原出蛋白质的原子坐标。
这种方法的优点是分辨率高，可以获得高质量的结构数据，但需要获得高质量的蛋白质晶体，并且对于大分子蛋白质的结构决定较为困难。
2. 核磁共振(NMR)核磁共振是另一种常用的测定蛋白质三维结构的方法。
该方法利用蛋白质中的核自旋来获取结构信息。
通过测量蛋白质在强磁场中的核磁共振信号，科学家们可以推断出蛋白质的原子间距离和角度等信息，从而确定其结构。
与X射线晶体学相比，核磁共振可以在溶液中研究蛋白质的结构，不需要获得蛋白质晶体，因此适用于大分子蛋白质的研究。
但是，核磁共振的分辨率相对较低，对于大分子蛋白质的结构决定仍然存在一定的困难。
3. 电子显微镜(EM)电子显微镜是一种可以直接观察蛋白质的高分辨率结构的方法。
通过将蛋白质样品投影到电子束中，科学家们可以获得高分辨率的蛋白质影像。
通过对这些影像进行处理和分析，可以得到蛋白质的三维结构。
与X射线晶体学和核磁共振相比，电子显微镜可以研究非晶态或不规则形状的蛋白质，对于大分子蛋白质的结构研究具有重要意义。
然而，电子显微镜的操作较为复杂，需要高度专业的技术和设备。
4. 聚合物折叠聚合物折叠是一种基于蛋白质折叠规律的方法。
该方法通过分析蛋白质序列中的氨基酸残基间的作用力和相互作用，预测蛋白质的三维结构。
这种方法的优点是快速、简单，并且适用于大规模蛋白质结构预测。
然而，由于蛋白质折叠的复杂性，聚合物折叠方法的准确性和精度有限，仅适用于一些简单的蛋白质。
蛋白质结构检测方法
蛋白质结构检测方法
蛋白质结构的检测方法包括以下几种：1. X射线晶体学：利用X射线通过蛋白质晶体后的衍射情况来确定蛋白质的三维结构。
该方法已经成功解析了大量蛋白质的结构。
2. 核磁共振（NMR）：利用核磁共振技术来测定蛋白质的三维结构。
通过测定核磁共振谱图，可以得到蛋白质的原子间距离和角度等信息，从而确定其结构。
3. 电子显微镜（EM）：通过电子显微镜观察蛋白质的投影图像，然后通过计算重建出蛋白质的三维结构。
该方法适用于较大的蛋白质复合物的结构分析。
4. 红外光谱：通过测量蛋白质在红外光谱区域的吸收谱，可以了解蛋白质的二级结构信息，如α-螺旋、β-折叠等。
除了以上常用的实验方法外，还有一些计算方法也可以用于蛋白质结构的预测和检测，包括：1. 蛋白质结构建模：根据蛋白质序列和已知结构的相似性，利用计算方法预测蛋白质的三维结构。
2. 拟合模型：通过将蛋白质的序列与已知结构的模型进行比对，利用计算方法将序列映射到最佳拟合的结构上。
综上所述，蛋白质结构的检测方法包括实验方法和计算方法，根据具体情况选择合适的方法进行检测和分析。
测定蛋白质三级结构的方法
测定蛋白质三级结构的方法
蛋白质的三级结构是指它的空间构象，通常包括α-螺旋、β-折叠和无规卷曲等结构。
了解蛋白质的三级结构对于深入探究蛋白质的功能、性质和相互作用等方面具有重要意义。
目前，测定蛋白质三级结构的方法主要包括X射线晶体学、核磁共振、电子显微镜和质谱等技术。
X射线晶体学是目前最常用的测定蛋白质三级结构的方法。
该方法利用蛋白质经过结晶后，通过测量X射线的散射图案来确定蛋白质的空间结构。
这种方法能够提供高分辨率的结构信息，但是对于一些难以结晶的蛋白质则有限制。
核磁共振是一种无损测定蛋白质三级结构的方法。
该方法利用蛋白质分子中的原子核之间相互作用的信号来确定蛋白质的结构。
与X 射线晶体学相比，核磁共振可以测定大分子的结构，但是分辨率相对较低。
电子显微镜是一种直接观察蛋白质分子的三维结构的方法。
该方法通过将蛋白质在低温下固定在网格上，并利用电子束的散射图案来重建蛋白质的三维图像。
这种方法适用于大分子和非晶态样品的结构测定，但是分辨率相对较低。
质谱是一种在气态下测定蛋白质结构的方法。
该方法利用蛋白质分子在质谱仪中的荷质比来确定蛋白质的结构。
这种方法适用于小分子的结构测定，但是对于大分子则有限制。
除了以上方法，还有一些新兴的技术，如单颗粒冷冻电子显微镜
和光学显微镜，也被广泛应用于测定蛋白质的三级结构。
这些方法的出现将会进一步推动蛋白质结构研究的发展。
2+蛋白质结构测定
在这些技术中，以前面三种近年来研究得最多， 应用得也最广泛。
蛋白质的质谱分析
质谱分析目前主要测定一级结构，包括分子量、 肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。肽 和蛋白的质谱测序具有速度快、用量少、易操作 等优点，使它非常适合现代科研工作的要求。
蛋白质质谱分析原理为：通过电离源将蛋白质分 子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、 磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质 离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确 定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
圆二色谱的应用
在分子生物学中，圆二色仪主要应用于测 定生物大分子的空间结构。
生物大分子很多是不对称的，即光学活性分子，
通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在
溶液状态下的二级结构。
蛋白质或多肽是由氨 基酸通过肽键连接而 成的具有特定结构的 生物大分子，主要的 光学活性生色基团是 肽链骨架中的肽键、 芳香氨基酸残基及二 硫键，另外，有的蛋 白质辅基对蛋白质的 圆二色性有影响。
椭圆偏振光：振幅不等的左、右圆偏振光合成
圆二色性和圆二色谱
圆二色性：当左、右圆偏振光进入物质时，光学 活性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值 就是圆二色性 光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不一 样，这种吸收差造成矢量振幅差，从介质出来的 光成为椭圆偏振光，用椭圆度或吸收差表示
圆二色谱：指椭圆度(或比椭圆度等)与波长的关 系，它在本质上与旋光色散谱是一样的。
冷冻电镜三维重构的基本技术路线:
利用快速冷冻技术对样品进行冷冻固定
然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进行电子成像
利用高灵敏底片进行成像记录
蛋白质三级结构测定
蛋白质三级结构测定蛋白质是生命体中最重要的分子之一，它们在细胞中扮演着重要的角色，如催化化学反应、传递信号和维持细胞结构。
蛋白质的功能与其结构密切相关，因此了解蛋白质的结构对于研究其功能和开发药物具有重要意义。
蛋白质的结构可以分为四个级别：一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。
其中，蛋白质的三级结构是指蛋白质分子的折叠形态，是蛋白质结构中最基本的层次。
蛋白质的三级结构测定是一项非常复杂的工作。
目前，常用的方法包括X射线晶体学、核磁共振、电子显微镜和质谱等。
其中，X射线晶体学是最常用的方法之一。
这种方法利用X射线穿过蛋白质晶体，通过测量X射线的散射模式来确定蛋白质的三维结构。
这种方法需要大量的蛋白质样品和高质量的晶体，因此在实践中存在一定的限制。
另一种常用的方法是核磁共振。
这种方法利用核磁共振技术来测定蛋白质分子中原子的位置和相互作用。
这种方法需要少量的蛋白质样品，但是由于核磁共振技术的限制，这种方法只适用于较小的蛋白质分子。
电子显微镜是一种新兴的蛋白质结构测定方法。
这种方法利用电子束来照射蛋白质分子，然后通过测量电子的散射模式来确定蛋白质的三维结构。
这种方法需要大量的蛋白质样品和高质量的电子显微镜设备，因此在实践中存在一定的限制。
质谱是一种新兴的蛋白质结构测定方法。
这种方法利用质谱技术来测定蛋白质分子中的质量和结构。
这种方法需要少量的蛋白质样品，但是由于质谱技术的限制，这种方法只适用于较小的蛋白质分子。
总的来说，蛋白质的三级结构测定是一项非常复杂的工作，需要使用多种方法来确定蛋白质的结构。
不同的方法适用于不同大小和类型的蛋白质分子。
随着技术的不断发展，人们对蛋白质结构的理解也将不断深入。
这将有助于我们更好地理解蛋白质的功能和开发更有效的药物。
蛋白质结构测定的方法
原理: 自旋量子数I≠0的原子核可旋转并带电，因此而产
生磁矩 ()，在外加电场作用下沿磁场方向取向，同 时发生能级分裂（占有能级数为2I+1），相邻能级能 量差都是△E 。 当能量为△E=h电磁波通过时，低 能核可吸收电磁波而产生跃迁—— 核磁共振
NMR谱与分子结构的关系：
▪ 化学位移 : 电子云 → 感生磁场 →对核形成屏蔽 由于电子云产生的感生磁场的屏蔽作用，引起共振时
▪ NMR类型： 1H-NMR；13C-NMR等 一维谱: 吸收峰强度对一个频率变量作图 多维谱（二维、三维）
理论方法的进展也非常快,与实验的结合也越来 越紧密. 尤其是蛋白质折叠的机制成为研究的热点和 焦点.
预测蛋白质构象的理论方法
蛋白质折叠的成核理论 同源模型方法 分子动力学 蒙特卡罗方法 折叠识别法 线索化方法 混合方法 从头预测法 等。。。。。。
同源模型方法
分子动力学
任何两种蛋白质，如果它们 的序列等同部分超过30％，它们 就具有相似的空间结构，即两个 蛋白质的基本折叠相同，只是在 非螺旋和非折叠区域的一些细节 部分有所不同。据此，同源模型 法的基本思想是：对一个未知结 构的蛋白质，首先通过同源分析 找到一个已知结构的同源蛋白质， 然后，以该蛋白质的结构为模板， 为未知蛋白质建立空间结构模型。
张一恒 李方翊 秦帅可
理论方法
通过已建立的各种理论研究 计算推导预测蛋白质的空间结构
蛋白质构象 测定思路：
试验方法
通过探索蛋白质在结构变化 过程中的各种光学、物理学等特
征的变化，了解结构信息。
蛋白质空间结构国内外研究动态
在国际上,美国首先提出大规模测定蛋白质结 构的计划,现在已经进入第二期的产出阶段. 其他发 达国家(欧盟和日本)也相继启动自己的结构基因 组计划. 我国根据美国第一期的试验计划,发现X射线晶 体学仍然是测定结构的主要手段,这与预期的结果相符. 过去和现在情况都是这样,蛋白质结构数据库中的80% 的结构来自X射线衍射. 其他有重要贡献的手段有核磁 共振和低温冷冻电镜( cryo2EM). 由于这三种方法的 重要性,最近几年,它们都有很大的改进.
蛋白质结构测定的方法
（10 - 9 ~10 - 8 s）又发射出波长比原来长的光——荧光
激发能的耗散：①热运动
② 传递给相邻分子 ③发荧光形式
蛋白自身的荧光: λTrp = 348nm； λPhe = 282nm；
λTyr = 303nm 配基的荧光: 如叶绿素，FAD、藻胆素等 结合人工荧光探针的荧光
(4) 衍射数据的分析（晶胞体积、结构振幅、衍射相角） 从而绘制电子云密度图
(5) 蛋白结构解析和校正: 密度大的地方即原子所在部位
蛋白质晶体培养
蛋白质结晶过程像其他小分子物质一样，是一个有序化过程， 即在溶液中处于随机状态的分子转变成有规则排列状态的固体。 一般认为要使这种有序化过程开始必须要形成一定大小的晶核， 并使分子不断地结合到形成的晶核上。而一个蛋白质溶液能开 始形成晶核，就必须使溶液达到过饱和，并保持一定的条件， 使溶液中的分子失去自由运动的能量(平移、旋转等)而结合到晶 核上，形成新的稳定的化学键(次级键)，使整个体系能量降低而 形成晶体。
以吸光度A ~ 波长λ作图。常温，低温
蛋白质吸收来自两个部分：
可见光区(400-770nm)：来自配基，如Cytc Trp = 280nm 紫外区(200-400nm) ：蛋白本身 Tyr = 275nm Phe = 257nm 肽基团=190~225nm •可见光吸收谱，紫外吸收光谱
（二） 荧光光谱法 （fluorescence spectrum):
平坐悬 衡滴滴 透法法 析 微 量 扩 散 小 室 法
X-射线结构 分析的主要 根据是衍射 线的方向和 强度，即衍 射图上斑点 的位置与黑 度。 衍射线方向： 确定晶胞的 大小和形状； 衍射线强度： 确定晶胞中 的原子排列。
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与环境水不可交换的 较少 肽键氢的数目
二级结构
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
拉曼光谱
尚不成熟
肽链所有原子排布 散射强度的角分布 起步不久
一 溶液中蛋白质分子构象的研究方法:
▪ 利用各种光谱学方法测定不同条件下蛋白质溶液光谱性质的差 异，来确定其构象，以及与功能的关系
（一）吸收光谱：用不同波长光照射蛋白，检测透光强度，
以吸光度A ~ 波长λ作图。常温，低温
蛋白质晶体培养
蛋白质结晶过程像其他小分子物质一样，是一个有序化过程， 即在溶液中处于随机状态的分子转变成有规则排列状态的固体。 一般认为要使这种有序化过程开始必须要形成一定大小的晶核， 并使分子不断地结合到形成的晶核上。而一个蛋白质溶液能开 始形成晶核，就必须使溶液达到过饱和，并保持一定的条件， 使溶液中的分子失去自由运动的能量(平移、旋转等)而结合到晶 核上，形成新的稳定的化学键(次级键)，使整个体系能量降低而 形成晶体。
（五） 扫描隧道显微技术（STM， scanning tunneling microscope）：
STM的工作原理：
▪ 扫描隧道显微镜的工作原理是基于 量子力学中的隧道效应。对于经典 物理学来说，当一个粒子的动能E 低于前方势垒的高度V0时，它不可 能越过此势垒，即透射系数等于零 ，粒子将完全被弹回。而按照量子 力学的计算，在一般情况下，其透 射系数不等于零，也就是说，粒子 可以穿过比它能量更高的势垒，这 个现象称为隧道效应。
▪ 量子产率（量）： Q = 发射的荧光光子数
吸收的光子数
（三） 圆二色谱(CD)
原理:
▪ 偏振面：电场矢量的平面。
▪ 平面偏振光（ plane polarized light )：
仅在固定方向上有振动的光。
▪ 圆偏振光：两个电场矢量互相垂直、位相相差1/4的平面
偏振光加成的光，电场矢量的尖端沿螺旋线前进，从光的
近年来，科学家们努力地发展建立了结晶学软件， 大大加快了蛋白质结构测定的步伐。以前需要几周甚至 几个月才能完成的工作，现在有可能在几小时到几日内 完成。
完
蛋白质动态构象模拟
的最常用的计算方法 是分子动力学. 分子动 力学是在相空间(位置 和动量空间)中计算系 统随时间变化的轨迹.
对系统的系综平均就
是对系统在时间轨迹 上的平均.
• 测定蛋白质构象的实验方法
方法 X-光衍射
NMR
CD 荧光光谱
紫外差光谱
STM 氢同位素交换
激光拉曼光谱 小角中子衍射
提供的结构信息
▪ 有些物质吸收入射光后经过一段很短时间, （10 - 9 ~10 - 8 s）又发射出波长比原来长的光——荧光
▪ 激发能的耗散：①热运动 ② 传递给相邻分子 ③发荧光形式
▪ 蛋白自身的荧光: λTrp = 348nm； λPhe = 282nm； λTyr = 303nm
配基的荧光: 如叶绿素，FAD、藻胆素等 结合人工荧光探针的荧光
原理: 自旋量子数I≠0的原子核可旋转并带电，因此而产
生磁矩 ()，在外加电场作用下沿磁场方向取向，同 时发生能级分裂（占有能级数为2I+1），相邻能级能 量差都是△E 。 当能量为△E=h电磁波通过时，低 能核可吸收电磁波而产生跃迁—— 核磁共振
NMR谱与分子结构的关系：
▪ 化学位移 : 电子云 → 感生磁场 →对核形成屏蔽 由于电子云产生的感生磁场的屏蔽作用，引起共振时
张一恒 李方翊 秦帅可
理论方法
通过已建立的各种理论研究 计算推导预测蛋白质的空间结构
蛋白质构象 测定思路：
试验方法
通过探索蛋白质在结构变化 过程中的各种光学、物理学等特
征的变化，了解结构信息。
蛋白质空间结构国内外研究动态
在国际上,美国首先提出大规模测定蛋白质结 构的计划,现在已经进入第二期的产出阶段. 其他发 达国家(欧盟和日本)也相继启动自己的结构基因 组计划. 我国根据美国第一期的试验计划,发现X射线晶 体学仍然是测定结构的主要手段,这与预期的结果相符. 过去和现在情况都是这样,蛋白质结构数据库中的80% 的结构来自X射线衍射. 其他有重要贡献的手段有核磁 共振和低温冷冻电镜( cryo2EM). 由于这三种方法的 重要性,最近几年,它们都有很大的改进.
▪ 光源 自然光 单色器 单色光 起偏振器 平面偏光 电光调制器 左、右园偏振光 照射样品记录
▪ CD谱应用：游离aa 无圆二色性，所以 CD谱只与构象有关。
（四） 核磁共振 (NMR， nuclear magnetic resonance ) ：
意义：核磁共振波谱技术是能够在原子分辨率下测定溶液中
传播方向看好似做圆周运动——circularly polarized
light
▪ 右圆偏振光：面对光源
E
H
电场矢量顺时针转动
左圆偏振光：面对光源
传播方向
电场矢量逆时针转动
入
圆二色性（ CD， circular dichroism）
旋光物质对左、右圆偏振光吸收不同，导致振幅变化， 从而产生椭圆偏振光的现象。
生物大分子三维结构的唯一方法
应用：( Ⅰ) 研究生物大分子及其复合物在溶液中的
三维结构和功能; ( Ⅱ) 研究动态的生物大分子之间以及与配基
的相互作用; ( Ⅲ) 研究生物大分子的动态行为; ( Ⅳ) 用固体核磁共振或液体核磁共振技术研
究膜蛋白的结构与功能; ( Ⅴ) 研究蛋白质折叠,折叠动力学; ( Ⅵ) 用于药物筛选与设计; ( Ⅶ) 研究代谢组学; ( Ⅷ) 研究活细胞中的蛋白质蛋白质相互作用; ( Ⅸ) 核磁成像用于认知科学研究.
(2) 重原子同晶衍生物:
把蛋白晶体 浸在重原子（Pt、
Au、Hg、Pb等）缓冲液中，使
重原子进入到蛋白晶体中 。
R r
(3) X-射线衍射及数据的收集（衍射点的亮度、位置等） (4) 衍射数据的分析（晶胞体积、结构振幅、衍射相角）
从而绘制电子云密度图
(5) 蛋白结构解析和校正: 密度大的地方即原子所在部位
1 基本知识: (1) X-射线：波长0.01~10nm的电磁波(单色X-ray 0.1~1nm) 高能电子(50kv)轰击Cu靶产生Cu X-ray（主要 =1.52A°）。最大分辨率 = /2；而原子间距离 为0.1nm，所以能分辨原子之间的相互关系。
（2）晶胞（unit cell）: * 晶体：离子晶体、原子晶体或分子晶体 * 晶胞：平面六面体所形成的重复单位 * 晶胞参数：包括a, b, c三个边长 及三者的夹角, ,
▪ 扫描隧道显微镜的基本原 理是将原子线度的极细探 针和被研究物质的表面作 为两个电极，当样品与针 尖的距离非常接近 (通常小 于1nm) 时，在外加电场的 作用下，电子会穿过两个 电极之间的势垒流向另一 电极。
（隧道探针一般采用直径小于1mm的细金属丝，如钨丝、铂-铱丝 等，被观测样品应具有一定的导电性才可以产生隧道电流）
▪ 若分辨率小于0.6nm： 只能反映蛋白的大致轮廓 小于0.45nm：可分辨多肽链的走向 小于0.25nm：可分辨侧链形态和方向 0.15nm以下：可分辨原子间的相互关系
2 衍射分析方法：
单晶回转法；粉末法；纤维法等
入
▪ 单晶回转法基本原理：
射 线
(1) 制备蛋白单晶:
要求均一, 大小>0.1mm
外加磁场强度的移动。 化学位移大小反映出原子核所处的化学环境、在分子
中的排布，从而确定基团的性质
▪ 自旋耦合： 自旋核的磁距通过成键电子影响邻近的核，引起
后者共振谱线分裂而增多，这种相互作用——自旋耦合
▪ 产生核磁共振的方法： 扫描频率：固定外加磁场，改变射频电磁波频率 磁场扫描：固定射频电磁波频率，改变外加磁场强度
平坐悬 衡滴滴 透法法 析 微 量 扩 散 小 室 法
X-射线结构 分析的主要 根据是衍射 线的方向和 强度，即衍 射图上斑点 的位置与黑 度。
衍射线方向： 确定晶胞的 大小和形状；
衍射线强度： 确定晶胞中 的原子排列。
x-
•
鲸 肌 红 蛋 白 光 衍 射 分 析
基团确定
卟啉环部分 衍射 电子密度图
主要指标
应用
除了氢以外肽链所有 衍射点的强度和位置 最重要 原子排布
溶液蛋白构象； 构象动力学
化学位移；谱线强度； 越来越多
自璇耦合常数
很重要
二级结构及变化
椭圆度
很多
芳族氨基酸微区； 构象变化
发射、激发光谱 量子产率
很多
芳族氨基酸微区； 构象变化
吸收变化
很多
表面原子结构分布 隧道电流及其变化 较多
规则二级结构； 氢键数目
蛋白 结构图
X射线衍射研究大分子的局限性
进行X射线衍射谱的分析，通常高纯度的材料是必 须的，首先实验样品应该仔细结晶，去获得高品质的适 合X射线衍射研究的晶体。即使可以得到合适的结晶，大 分子体系结构的测定仍然比小分子要困难得多。这是因 为数目众多的大分子体系结构中的原子结构确定很困难。
同时对仪器要求的复杂性及数据分析都需要消耗大 量的计算时间。X射线衍射必须在分子固相中进行，由此 获得的结构信息可能就会与分子体系在生物活性状态的 情况有所不同。
c
b
a
（3） 布拉格（Bragg）方程：
X-ray
X-ray
θ
θ
θθ
d
B
C
D
波程差=BD + CD=2d ·sinθ= n ·
在空间的三个方向上都符合该方程，可以求出晶胞的三个边长
(4)分辨率:
▪ 分辨率：所能分清的两相邻质点 的最小间距
▪ 分辨力: 仪器或肉眼所能分清的 两相邻质点的最小间距的能力
理论方法的进展也非常快,与实验的结合也越来 越紧密. 尤其是蛋白质折叠的机制成为研究的热点和 焦点.