流式细胞内染色方法
流式荧光染色法实验原理及步骤
流式荧光染色法实验原理及步骤原理：荧光染料CFSE，即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。
当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。
这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。
实验步骤，以小鼠脾细胞为例：1.取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中；2.在超净工作台上无菌取出小鼠脾脏；3.用无菌注射器内芯研磨脾脏，尽量不残留较大组织块；再用3mlPBS冲洗后，将脾脏研磨液经200目尼龙网过滤至15mL离心管中，离心350g，5min；4.弃上清后，加入2mL红细胞裂解液，轻微吹打，裂解2min后加入等体积PBS终止裂解反应，混匀后离心350g，5min；5.弃上清，用RPMI1640完全培养基重悬沉淀，并取10μL细胞液计数，将细胞浓度调至2.0×106/ml；6.提前将CFSE按照说明书用DMSO配成5mM母液，并分装储存于-80冰箱，其工作浓度为0.5-25μM；7、取部分细胞作为不染色组阴性对照，其他细胞加入CFSE溶液，使得终浓度为5μM，37°C避光孵育15min；8、加入1ml冰冷的RPMI1640完全培养液，4℃，5min以中止染色；9、弃上清，加入冰冷的含10%FBS的完全1640培养液洗2次，最后用1640完全培养基重悬细胞沉淀，充分吹打成单细胞悬液，将上述细胞悬液加入96孔培养板,每孔105个细胞（阳性对照用PHA刺激）；10、37℃，5%CO2培养3天后用流式细胞仪分析细胞488nm激光器检查细胞增殖情况。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
单克隆抗体染色方法参考(用于流式)
单克隆抗体染色方法参考（用于流式）一、基本操作流程1. 根据细胞密度，计算出5×105 细胞所要吸取细胞悬液的量，把相应量悬液加到流式管中。
1700 rpm离心5 min，弃去上清。
2. 染色（1）CD8单染：计算出本次CD8单染所需抗体的总量，1:50稀释后，往流式管加入50 μL，4℃避光孵育30 min。
（2）CD4单染：计算出本次CD4单染所需抗体的总量，抗体1:25稀释后，往流式管加入50 μL，4°C避光孵育30 min。
（3）CD8、CD4双染：计算出本次CD4、CD8双染所需抗体的总量，按照CD4:CD8:PBS=2.5:1:50比例稀释液加入到流式管中，4°C避光孵育30 min。
3. 往流式管加入1 mL PBS，1700 rpm离心5 min，去除未结合的抗体，离心后小心吸取上清。
加80~150 μL 流式缓冲液混匀上机检测，流式细胞仪分析染色结果（不超过4 h），当仪器读取到10×104个细胞数就可以分析数据。
如果暂时无法检测，避光储存在4℃。
附：96孔板染色操作步骤：1. 根据细胞密度，计算出5×105 细胞所要吸取细胞悬液的量，把相应量悬液加到96孔板中（U型孔），1700 rpm离心5 min。
2. 抗体稀释按照上述方法，每孔加50 μL抗体稀释液染色，4°C避光孵育30 min。
3. 往孔板中加入200 μL PBS，1700 rpm离心5 min，去除未结合的抗体，离心后小心吸取上清。
每孔加入80 μL流式缓冲液混匀后转移到流式管中。
备注：（1）流式缓冲液：含2% FBS和0.4% 0.5 M EDTA的PBS 溶液；（2）用96孔板板进行染色要注意不同样本要隔开2~3个孔避免交叉污染；（3）染色细胞数量为5×10 5，假设悬液细胞计数为6×106 细胞/1000 μL；（4）我们要取5÷60×1000=83.3 μL悬液才是5×105个细胞数。
流式细胞术实验方法
流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。
GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。
用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。
离心，弃上清。
4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
流式胞内染色步骤
一、surface marker染色
1、收获细胞，用1%BSA /PBS 1ml洗涤一次（1500rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
2、加入预先配置好的surface marker抗体混合液（溶于50ul 1%BSA
/PBS），用枪轻轻吹打充分混匀，4度孵育30分钟。
3、1%BSA /PBS 1ml洗涤一次（1500rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
二、Intracellular Staining的步骤
1、Fix/permeabilizatioin Buffer（ebioscience）固定破膜剂
2、固定：加入IC Fix/Perm Buffer 100ul 后，混匀，室温孵育20分钟
3、用1x Perm Wash Buffer 1ml洗涤1次（2000rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
4、破膜：加入1x Perm Wash Buffer 1ml，混匀，4度孵育45分钟。
5、离心（2000rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
6、加入细胞因子抗体（溶于50ul 1x Perm Wash Buffer），4度孵育45分钟。
7、最后再用1xPerm Wash Buffer 1ml洗一次，倾倒后，加入适量300ul PBS 重悬细胞。
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术实验技巧及数据分析一、实验技巧1.细胞样本的准备在进行流式细胞术之前，首先需要准备好细胞样本。
对于悬浮细胞，可以通过离心分离获得单细胞悬浮液；对于贴壁细胞，需要利用胰酶等方法将细胞从培养皿上剥离。
样本的细胞浓度需要适当调整，以保证在实验过程中细胞数目在仪器检测范围内。
2.细胞标记与染色3.样本的处理与染色控制为了减少噪音和误差，需要进行相应的样本处理和染色控制。
常用的处理包括细胞固定、膜破裂和核酸溶解等。
另外，对照组的设置也非常重要，包括负对照、单标对照和血细胞淋巴细胞控制等，以校正仪器和标记的相关性。
4.流式细胞仪的设置与操作流式细胞仪是进行流式细胞术的关键仪器，需要正确设置和操作。
首先，要校准仪器的激发光源、滤光片和检测器等参数，以确保获得准确的荧光信号。
其次，要根据标记物的激发光和发射光波长选择合适的检测通道。
最后，通过检测标记物阳性细胞的信号强度和分布，调整仪器的敏感度和流速，以获得符合实验要求的数据。
二、数据分析1.数据获取与记录在流式细胞术实验结束后，需要用相应的软件（如FlowJo、CellQuest等）获取和记录仪器所产生的原始数据。
这些数据包括细胞整体的荧光信号和散点图等。
2.质量控制与后处理对于数据质量的控制，首先需要排除掉背景信号。
通过设置负对照，根据荧光信号的阈值来确定阳性细胞的比例。
另外，还需要剔除激活的、死亡的和颗粒干扰的细胞等。
3.数据可视化通过制作直方图、散点图和轮廓图等，可以直观地展示细胞的其中一种特定特征（如表达一些蛋白质、细胞周期等）在整个细胞群体中的分布情况。
从图形中可以得出相应的统计结果，并可以进一步比较不同样本之间的差异。
4.数据统计与分析对于一些研究问题，需要计算不同细胞亚群的百分比、中位数、平均值和标准差等。
此外，还可以利用双参数散点图，通过计算相关系数（如Pearson相关系数）来分析两个特征之间的相关性。
总结：流式细胞术作为一种快速、高通量和灵敏的细胞分析技术，对于研究细胞标记物的表达和功能等提供了有力的手段。
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
（一）原理一活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）用10% FCS RPMI1640调整细胞浓度为5X 106〜IX 107/ ml取40卩1细胞悬液加入预先有特异性McAb（5〜50卩I）的小玻璃管或塑料离心管，再加50卩I 1 : 20（用DPBS（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇J 4 C 30mi n用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpmx 5mi nJ]加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100〜500 ^1固定液）FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5〜7天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
I （四）注意事项1. 整个操作在4C下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
用于流式细胞分析的细胞内抗原染色方法总结
用于流式细胞分析的细胞内抗原染色改进的基本免疫荧光染色和流式细胞分析操作步骤可用于在单细胞水平上同时流式细胞分析表面分子和细胞内抗原。
通常，细胞用甲醛固定以稳定细胞膜，然后用破膜剂或酒精透化，使得抗细胞内抗原的抗体可以在细胞内进行染色。
染色细胞内的蛋白质时，重要的是要考虑它们的位置，因为这可能决定了最优的操作步骤和缓冲系统。
例如，核蛋白和许多分泌蛋白与Foxp3 /转录因子染色液组合配合良好，而分泌蛋白如细胞因子和趋化因子搭配细胞内固定和破膜缓冲液组合很好。
最后，有几种磷酸化的信号蛋白可能在前面提到的两种缓冲系统中不起作用，但可与固定/甲醇方案一起使用。
应根据经验确定不同缓冲系统和方案中的抗体性能。
细胞表面蛋白质染色操作步骤：1，取100-200w细胞（流式收20w），1200rpm离心8min，留100μL，将细胞重悬。
2，加入1mL 5% BSA（PBS配），1200rpm离心5min，留100μL，将细胞重悬。
重复两次。
这步是封闭，封闭非特异性的表面蛋白分子，防止与抗体非特异性结合。
3，每种抗体加0.3-0.5μL，4℃避光30min。
4，加1mL PBS 终止，1200rpm离心5min，留100μL，将细胞重悬。
5，如果不能马上过流式，加100μL4%多聚甲醛（PBS配），4℃固定。
细胞内抗原染色方法：一、两步法：细胞内（细胞质）蛋白质。
二、一步法：细胞内（核）蛋白质。
三、固定/甲醇的两步法。
一、两步法：细胞内（细胞质）蛋白质在该操作步骤中，固定步骤之后是破膜，在细胞膜上穿孔，这需要在所有后续步骤中持续存在破膜液。
这使得抗体可以进入细胞的细胞质。
因此，所有细胞内染色必须在存在破膜液的条件下进行。
该操作步骤推荐用于体外或体内活化后个体细胞中的胞浆蛋白、细胞因子或其他分泌蛋白的。
流式细胞仪简介和使用方法
从组织获取淋巴细胞
淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松
散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤 便可。
方 法：
1. 将样本置于陪替氏培养皿，加入15ml BSA-PBS； 2. 将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离；
3. 将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。
其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进
其他类型细胞
在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不 同组织处理方法也各异，以下是讲述通用的胶原酶消 化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、 鼠上皮细胞。
材料
1. 解剖刀 2. 0.15%胰蛋白酶 3. Hanks’s缓冲盐或PBS，pH7.3 4. 不含Ca、Mg离子的HBSS 5. II型胶原酶 6. 1%BSA或5%FBS 7. 5ml的吸样管 8. 35um尼龙滤网 9. DNase
反应体积
• 样本中加完抗体后， 1×106细胞反应体积应不小于100ul。
抗体染色
• 最为普通的抗体染色原则：
1×106细胞对1 ug 抗体（抗体供应商所推荐 使用单位），此浓度90%处于过饱合状态
操作
1. 将样本置于皮氏培养皿，加15ml BSA-PBS，将样本切 成1mm3大小，用镊子将其分离； 2. HBSS或PBS洗清 3. 加入10ml无Ca、Mg离子0.2% II型胶原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS； 4. 37ºC摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定；
5. 用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬液； 6. 使用35um滤网过滤，300g离心5分钟； 7. 用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些
目标细胞数量及检测终浓度：1×106/ml
流式细胞抗体染色操作步骤及常见问题(详细版)
流式细胞抗体染色的操作步骤及常见问题一、实验物品准备水平离心机、流式细胞仪、流式细胞管、流式细胞缓冲液、细胞过滤器、15ml离心管、流式抗体、同型对照抗体、避光锡纸、移液器、细胞吸管、细胞计数仪等二、FC受体封闭试剂准备阻断Fc受体的试剂可用于减少非特异性免疫荧光染色。
一般标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数也可能是多克隆抗体。
其基本结构都由两部分组成，即包含有特异性结合抗原位点的Fab段和相对保守的Fc段，抗体的特异性表现在Fab段。
标记时利用Fab 段的抗原结合位点与细胞上抗原分子特异性结合，从而标记并且相对量化细胞表达该抗原分子的情况。
但是，有些细胞表面表达FcR(Fc receptor,Fc受体），如巨噬细胞、树突细胞、B淋巴细胞等，FcR可以与荧光素偶联抗体的Fc段进行非特异性的结合，对结果产生一定的影响。
目前封闭方法主要有两种：（1）用市面上卖的适量的CD16/32的抗体与样品细胞充分混匀，4℃孵育10-15min。
CD16/32是一种Fc受体, 能够与IgG的Fc段结合，而荧光素偶联抗体基本上是IgG抗体，所以在标记荧光素偶联抗体前可以用CD16/32抗体封闭样品细胞，使样品细胞表面的FcR都被抗CD16/32抗体结合，从而阻止后续荧光素偶联抗体与FcR的非特异性结合。
（2）用血清全IgG抗体与样品细胞充分混匀，4℃孵育10-15min。
比如研究人的细胞时，若荧光素偶联抗体来源于小鼠，封闭采用小鼠血清全IgG抗体。
注意：无论选用哪一种方法，原则是如果流式抗体可能与样品细胞的FcR发生非特异性结合，那么在标记荧光素偶联抗体之前先用流式抗体同源的全IgG抗体或CD16/32抗体进行封闭，使样品细胞表面的FcR饱和。
三、流式对照设置流式细胞实验对照设置非常重要，常见有阴性对照和单阳对照。
（1）阴性对照设置目的是去除自发和非特异荧光干扰。
阴性对照主要包括两个部分，即:空白对照（检测样本自发荧光）和同型对照（检测样本自发荧光+非特异性荧光）。
流式细胞术实验方法及应用
淋巴细胞
T淋巴细胞（CD3+）
CD3+CD8（CD4+）
IFN-r
IL-4
数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图 和二维等高图等。最常用的为单参数直方图 和双参数散点图。
FSC
SSC
参数的意义: FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大，
散射光越强，细胞越小,散射光越弱; SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长 常用荧光素
异硫氰酸（FITC）
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI）
藻红蛋白偶联物（PECY5）
藻红蛋白偶联物（PECY7）
别藻青蛋白（APC）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
激发光波长（nm ）
488 488 488 488
488
633 633
细胞群周期与DNA倍
体时，将DNA含量直 方图分为三部分， 即G0/G1、S、G2/M
G0/G1 (2C)
S (2C→4C)
GG22//MM
(4(4CC) )
三个细胞峰。
方法：
细胞悬液（1*106） 70%冰乙醇 4ºC ，24h 离心去固定液 PBS洗2次 RNase
30min PBS洗1次
八、数据分析
流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行 分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独 特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一 片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数 分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形 门、任意门和四象门等。
任意门、矩形门
线性门
四象门
多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被 分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻 辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。
细胞内细胞因子的流式检测讲解
刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和
刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测 IFN-γ 则可选择 PMA 和Ionomycin 同时刺激；如果用 CD4 做表面标记，由于多数病人的
CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，
4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。
当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。 ③同型对照 ：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的
免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表减少非特异性的背景染色，保证结
果的准确性
① Fc 受体阻断 ： 使用试剂阻断 Fc 受体可以有效减少非特异荧光染色，在
小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig 或血清。
② 表面结合的细胞因子的阻断 ：使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体，
阻断细胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合 引起的背景。
荧光素的选择： 检测相对低表达细胞因子如 IL-4时，应选用PE或APC
Monensin Brefeldin-A(BFA) 6、固定剂
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在 细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。 一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液
7、破膜剂
将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与 相应的细胞因子结合。 一般使用含1％皂甙、0.05％NaN2的Hanks溶液/HBBS
标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记
细胞内IL-1β的细胞内染色结果
未使用阻断剂
使用阻断剂
阴影部分代表的是同型对照染色结果； 黑色代表的是未使用破膜剂的染色 结果； 灰色代表的是使用破膜剂的染色结 果。
流式细胞术胞内染色方法(GSK公司课件)
Multicolor staining in CytometryQualification for clinical immunology Michel JanssensQualification of a multicolor staining in CytometryOutlineIntroduction Development of the ICS test (Intracellular Cytokine Staining) Optimization of test Qualification/Validation of test Results ConclusionsIntroductionVaccinology and ImmunologyVaccine CandidateImmunogenicityEfficacy Clinical TrialsMeasurement of the Immune ResponseHumoralCellularIntroductionImmunological MemoryIntroductionWhich component do we need to measure cellular response ?PREPOSTCell FrequencyCell FunctionsIntroductionIn vitro restimulation of lymphocytes : Intracellular cytokine staining assay (1-day)Cytokine productionDevelopment of ICS testIntracellular cytokine staining : 4-color stainingNo activation0.04 0.00 0.10Antigen0.140.002.89CD8IL-20.050.002.061.05CD40.01 1.41!IFNγDevelopment of ICS testIntracellular cytokine staining : From 4 colors to 7 colorsInformative and sensitive read-outArticles: – "Nine-color flow cytometry for accurate measurement of T cell subsets and cytokine responses. Part I: Panel design by an empiric approach. Part II: Panel performance across different instrument platforms. (Roederer et al - Cytometry A. 2008;73A(5):400-410;410-420) – "Precision and linearity targets for validation of an IFNγ ELISPOT, cytokine flow cytometry, and tetramer assay using CMV peptides (Maecker et al - BMC Immunol. 2008;9:9.)In addition to IL2 and IFNγ, other markers were added :– CD3: discrimination of CD8+ vs NK cells – TNFα: pro-inflammatory cytokine, cytotoxicity, anti-viral – CD40L: T-cell help to B- and CD8+ T-lymphocytesFrom detection of: CD4, CD8, IL-2, IFNγ TO CD3, CD4, CD8, IL-2, IFNγ, CD40L, TNFαOptimization of ICS testWhat ?Which antigen to restimulate PBMCs?– Protein? Peptide pools? – Max number of peptides per pool? Size? Peptide concentration? – Antigen toxicity?In vitro stimulation period?– 6 hours vs 20 hoursAntibodies?– Concentration ? At what time? Extra/Intra cellular?Data : how to analyse? Capture of data? Automation?Optimization of ICS testResultsWhich Antigen to restimulate PBMCs: – 15-mer peptide pools (overlap 11 aa)Article: – "Use of overlapping peptide mixtures as antigens for cytokine flow cytometry." (Picker et al - J Immunol Methods. 2001;255(1-2):27-40)– Up to 210 peptides – At 1.25 µg/ml/peptide – Antigen toxicity assess using spiking with SEB or model Ag In vitro stimulation period : – 20 hours (Brefeldin A added after the two first hours)Optimization of ICS testResultsAntibodies used for staining : – matrix analysis [ ] A [ ] B [ ] CStep of stainingAt thawing Extracellular IntracellularAntibody concentration– Optimized results : (staining in plates - 106 cells-50 µl/well)Extracellular : 20 min RT– <> CD3, <> CD4 and <>CD8Intracellular : 20 min RT (after cytofix/cytoperm step)– <> IFNγ, <> CD40L, <> IL2,<> TNFα γ αOptimization of ICS testResultsData analysis:– focus on “double positives”– Articles : “Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination” Erika Hammarlund (Nature Med 2003; 9 (9) -1131-7) "Live-cell assay to detect antigen-specific CD4+ T-cell responses by CD154 expression. " Chattopadhyay PK. (Nat Protoc 2006;1(1):1-6) "Direct access to CD4+ T cells specific for defined antigens according to CD154 expression." Frentsch M. (Nature Med 2005; 11(10):1118-24)– Internal validationCD40L (CD154) expressed on all activated CD4+ T cells Same magnitude of the results in "single" vs "double positive CD4+T cells Background is quite lower in double <> singleOptimization of ICS testResultsData analysis:– focus on “doubles positives"! #" "CD3+/CD4+ or CD3+/CD8+ : – – – – – All double: cells expressing at least two different cytokines (CD40L, IL-2, TNFα, or IFNγ) d-CD40L: cells expressing CD40L and another cytokine (IL-2, TNFα, or IFNγ) d-IL-2: cells expressing IL-2 and another cytokine (CD40L, TNFα, or IFNγ) d-TNFα: cells expressing TNFα and another cytokine (CD40L, IL-2, or IFNγ) α d-IFNγ: cells expressing IFNγ and another cytokine (IL-2, TNFα, or CD40L) γOptimization of ICS testResultsData analysis:– Diva software - batch analysis (1)Optimization of ICS testResultsData analysis:– Diva software - batch analysis (2)Analysis template double cytokine (Bkg response)CD3+/CD4+CD3+/CD8+Optimization of ICS testResultsData analysis:– Diva software - batch analysis (2)Analysis template double cytokine (Antigenic response)CD3+/CD4+CD3+/CD8+Optimization of ICS testGSK Standard ICS Method : protocol (SOP)Peripheral Blood mononuclear cells 1. Short term in vitro stimulation :106 cells/well w versus w/o antigen + CD28 and CD49d AB for 2 hours 37° C + Brefeldin A O/N 37° C Extracellular staining: CD3,CD8 and CD4 Fixation and permeabilisation Intracellular staining: IFNγ, IL-2, TNFα, CD40Lgiug2. Staining :3. Acquisition & Analysis : 4. Results :FACSCantoII /FACS LSRII instrument Diva softwareExpressed as frequencies of double cytokines CD4+ or CD8+ T cells responding to the antigenValidation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringWhy ?Rules? – Does this fall under regulation : GCP, GMP, GLP? – Is it a diagnostic assay (IVD)?NO NO(But ensure confidentiality)– Do we know if the assay is a correlate for efficacy NO – Is it an FDA/EMEA requirement? Recommendations We have to : – Be confident in the integrity of data – Generate reliable infoAs Product development & Critical decisions are guided by the assay dataValidation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringWhat is required?– – – – – –Sample integrity (confidentiality) A GLP-like environment to conduct experiments (documented) A qualified SOP for the method and documented Qualified and calibrated instruments Qualified operators Interpret FDA Guidance and ICH Q(R1)* parameter definitions for the assay:And design experiments to address the specific parameters– Defined statistical analysis for relevance and quality of the data* ICH = International Conference on Harmonization - guidelines part Q(R1)Validation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringAssay validation packageWill consist of : 1st part - Assay validation plan:Description, scope and goal of the assay GLP-like environment documentation Documented test method List of materials and equipments Documented qualification and calibration of critical instruments Documented competency tests to use the validated SOP for operators Procedures for testing each parameter of ICH Q(R1) Acceptance criteria for each performance parameter Definition of the statistical analysisValidation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringAssay validation packageWill consist of: 2nd part - Assay validation report :To :– Proof that validation was approached in a planned and logical manner – Proof that the plan was followed and is reflected in the data – Proof that the SOP used in the clinical trial is based on the validation testsConsisting of :– Concise report (an easily interpreted view of the data)All will be maintained in the QA archives (auditors will ask to see it)Validation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringAssay validation parametersShould fulfil the parameters described in: – The ICH Q(R1) guidelines; – using FDA "Guidance for Industry - Bio-analytical Method Validation"– "Validation involves documenting, through the use of specific laboratory investigations, that the performance characteristics of the method are suitable and reliable for the intended analytical applications"Validation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringAssay validation parametersValidation characteristics to be considered are:Accuracy Precision– Repeatability – ReproducibilitySpecificity Linearity Range Detection and Quantification Limits (LOD-LOQ)It may not be possible to test all parameters: explanation in the validation reportValidation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringAccuracyDefinition: – Comparison between "what's measured" and "true" values – Comparison of the results of the proposed analytical procedure with those of a second well-characterized procedure. In ICS assay for vaccine clinical trials: – Not applicableWhy?– There is no "International standard" available for CMI assay. – There is no "Gold standard assay" available.Validation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringPrecision / RobustnessDefinition: – "Closeness of agreement between a series of measurements for the same samples" = variability of the testUsually expressed as the variance, standard deviation or coefficient of variationR&R plan in GSK: – 10 samplesNot activated = Background Antigen activated– Tested :In duplicates at four different days By at least 2 OperatorsValidation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringPrecision / RobustnessPublished results: – BMC Immunology 2005, 6:13. Standardization of cytokine flow cytometry assays. Maecker H., Rinfret A., D'Souza P. et al.Reproducibility CV's (%) >0,5% 18-24 0,5%<>0.1% 24-57 <0.1% >57GSK results:Reproducibility CV's (%) >0,5% < 25% 0,5%<>0.1% 0.1%<>0.05% 25-36 32-57 <0.05% >57Validation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringPrecision / RobustnessGSK results : – Bridging (Deming's regression) : new operator or interlab validation– At least 40 independent samplesValidation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringSpecificityDefinition: – "Detection of the analyte in the presence of potentially interfering substances"Difficult to test adequately without a purified analyte. No international standard reference for calibrating detection of human T cells Antigen specific is currently available. HVTN (HIV Vaccine Trial Network) : not applicable in ICSIn GSK: to assess the specificity, we study the specific T cell responses before and after vaccination with the candidate vaccines.Validation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringSpecificityGSK results:4000 Frequency of c y t+ ac tiv ated CD4 (Cy t+ Ac t CD4/MioCD4) 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 D0 D60– –Pre-vaccinationLow/no cyt+ CD4+ T detectedPost-vaccinationSignificant CD4+ T cells detectedValidation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringLinearity and rangeDefinitions: – "Linearity is the ability to obtain results that are directly proportional to the concentration of analyte in the sample" – "Range is the range of analyte concentration over which the proportionality is maintained with good precision" In GSK: to demonstrate linearity & range : – What to use : Dilution "Post vac." into "Pre vac." PBMCs – Test a minimum of 5 levels (in triplicates) – Demonstration using linear regression and R²Validation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringLinearity and rangeGSK results:10 % CD4 specific T cells (estimated)Linearity1R2 = 0.99870.10.010.001 0.0010.010.1110% CD4 specific T cells (true)– –R² ≅ 0.999 ≅ linearity Specific response seems linear from ≅ 0.02% to …Difficult to define an upper limit for the range– Reported in literature : typical T cell responses range from 0.1 to 10 %Validation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringDetection and quantification limits = LOD - LOQDefinitions: – LOD : "the lowest concentration that can be detected but not necessarily quantified"In GSK :– As "stopped" gate put at 75000 of CD4+ Tcells – And as technically, cytometry is able to detect 1 CD4-specific T cell – LOD for CD4+ Tcells = 1/75000 = 0.0013%– LOQ : "the lowest concentration that can be quantified with acceptable precision"Two approaches:– + 2 SD over geomean of log of the background values ≈0.03% – Or more conservative: decide of an acceptable % of precision and determine the LOQ as the minimal concentration with at least this % of precision (f.i. if 30% ≈0.1%)In GSK: under evaluationValidation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringRobustness : some other aspectsQuality criteria : – Viability of samples at thawing must be upper than 80% – Acquisition of at least 4000 CD4+ and CD8+ T cells – Background response must be lower than 0.1% in CD4 and CD8 double cytokine positive population.Validation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringRobustness : internal standardsQuality controls : – QC standard controls: samples with a specific positive response introduced in each testing run. – ROLLING controls: 2 samples tested in previous testing run retested in the next one.S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7… S2 S4 S10 S11 S12 S13… S11 S13 S20 S21 S22 S23…$%– Calibration of instruments by Calibration particles : mixture of particles dyed to eight different fluorescent intensitiesValidation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringRobustness : some other aspectsQuality controls: QC Chartscontrol4 3.8 Log(Events) 3.6 3.4 3.2 3 2.8 2.6 0 20 40 60 Day 80 100 120Validation of the ICS test used for Cellular Immune MonitoringRobustness : some other aspectsTechnical aspects / automation – Instruments : FACS BD LSRIITM or CANTOTM II + HTS:Auto-connection Instrument-PC Automatic fluidic start-up and shut-down Check of pressure and all fluid level– Software: BD FACSDivaTM (version 5)Automatic compensations Template of acquisition Template for batch analysis– Statistical analysis:Raw data charged automatically into clinical databases– (IT application developed for data capture & transfer)BD, BD FACSCanto, BD LSR II, BD FACSDiva are trademarks of Becton Dickinson and Company.ICS test in GSK vaccine clinical trialsResultsCD4 response measured after 2 vaccinations (rec.Ag +/- Adj.)4000 nbre of specific CD4 T cells per Moi of CD4 T cells 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 D0 D30 Ag D60 D0 D30 Ag + adj 1 group/tim epoint D60 D0 D30 Ag + adj 2 D60ICS test in GSK vaccine clinical trialsConclusionIn GSK Intracellular cytokine staining has been Developed Optimized & Validated To measure the cellular immune response induced by our candidate vaccinesAcknowledgments& – –' ( ! ! * * , ) ' ' ! ) + ( $ + ' . / -'。
流式细胞术是什么？流式细胞术原理及步骤
流式细胞术是什么？流式细胞术原理及步骤蛋⽩质或核酸等⽣物⼤分⼦在某个细胞中或细胞群体中的含量分析对了解该物质的⽣物学功能是⼗分重要的。
从前⼈们常⽤显微分光光度测定技术，⽬前流式细胞术得到了越来越⼴泛的应⽤。
流式细胞术（flow cytometry）可定量地测定某⼀细胞中的DNA、RNA或某⼀特异的标记蛋⽩的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量，它还可将某⼀特异染⾊的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染⾊体分离出来，甚⾄可⽤于细胞的分选。
流式细胞术技术原理细胞群体分散后对待测的某种成分进⾏特异的荧光染⾊，然后使悬液中的细胞⼀个个快速通过流式细胞仪（每秒可达⼏万个细胞）。
当含有单个细胞的液滴通过激光束时，带有不同荧光的细胞所在的液滴被充上正电荷、负电荷，或不被充电，同时检测器可测出并记录每个细胞中的待测成分的含量。
因带有不同表⾯标志的细胞所带的电荷的种类不同，当液滴通过⾼压偏转板时，带不同电荷的液滴发⽣偏转，从⽽达到将细胞分选的⽬的。
如果染⾊过程不影响细胞活性，那么分离出来的细胞还可以继续培养。
流式细胞仪分选原理⽰意图流式细胞术可⽤于测定哺乳动物细胞的许多参数, 尤其是细胞周期中的变化, 如细胞⼤⼩、细胞内某些成分的含量等。
⽤⼀种可以可逆性通透细胞膜的单克隆抗体, 可直接测定相应的可溶性细胞内蛋⽩。
GFP等荧光蛋⽩可作为基因表达的报道分⼦, 流式细胞术可利⽤它来检测菌株细胞内产物的表达情况。
细胞株可以设计成能使GFP 同步表达, 并与⽬标蛋⽩的表达量相⼀致。
其荧光含量的测定结果可⽤于指导产量的控制、细胞株选择、质量控制。
流式细胞检测实验步骤
流式细胞检测实验步骤一、样品准备在进行流式细胞检测之前，需要准备好待检测的样品。
样品可以是细胞培养液、组织切片、血液等，具体根据实验需求而定。
对于血液样品，需要进行抗凝处理，防止细胞凝结。
对于组织切片，需要将其切成小片或粉末状，以便于后续处理。
二、细胞染色染色是流式细胞检测中的重要步骤，通过染色可以标记细胞表面的抗原或抗体，以便后续的检测和识别。
常用的染色方法包括免疫荧光染色、化学荧光染色等。
染色时需要选择适当的抗体或荧光染料，按照说明书进行操作，并控制好孵育时间和温度。
三、细胞洗涤洗涤是为了去除染色过程中细胞表面的多余抗体或染料，以便于后续的检测。
洗涤时需要使用适当的缓冲液，如PBS或HBSS等，轻柔地冲洗细胞，直到洗涤干净。
四、细胞固定对于一些需要检测活细胞的实验，需要进行细胞固定。
常用的固定方法包括用1%多聚甲醛或1%乙二胺四乙酸（EDTA）进行固定。
固定可以保持细胞的形态和功能，防止细胞在检测过程中发生变形或失活。
五、流式细胞仪检测流式细胞仪是进行流式细胞检测的主要设备，通过该设备可以快速准确地检测细胞表面的抗原、内部的酶等物质。
检测时需要将处理好的细胞通过流式细胞仪的喷嘴，在液流的作用下形成单个细胞悬液，经过激光束照射后产生散射光和荧光信号，这些信号被光电倍增管接收并转换为电信号，经过放大和滤波后送入计算机进行分析和处理。
六、结果分析流式细胞检测的结果通常以散点图或直方图的形式表示，通过分析这些图形可以得到细胞的表面抗原表达、细胞内酶的活性等信息。
对于表达相同抗原的细胞群可以进行聚类分析，以便更好地了解细胞的表型和功能。
此外，还可以使用统计分析方法对实验数据进行处理和比较，以得出更准确的结论。
七、质量控制为了保证流式细胞检测结果的准确性和可靠性，需要进行质量控制。
质控包括以下几个方面：确保流式细胞仪的性能稳定，定期进行校准和维护；使用已知阳性样本进行测试，验证实验方法的可靠性；控制好实验条件和操作过程，避免误差和干扰；对实验数据进行评估和审核，确保结果的准确性和可信度。
流式细胞术染色步骤
流式细胞术染色步骤在染色之前，首先用1份固定破膜浓缩液放在3份固定破膜稀释液中稀释成想要的工作液的体积，这种缓冲液储存不能超过1天。
例如，检测12个样本，用3ml固定破膜浓缩液加入到9ml固定破膜稀释液中。
试剂盒中所提供的破膜缓冲液是10倍浓度的，在使用前应该用蒸馏水稀释成1倍的溶液，这种破膜缓冲液应在每次使用前配成新鲜的。
1,加100µl准备好的细胞（1×106）到每一个试管里；2，通常先标记表面分子，使用大约0.125µg FITC -CD4和0.06µg PE - CD25 抗体放在100µl 流式着色缓冲液中。
如果在特殊应用的时候最好滴定这些试剂。
4℃避光孵化30min。
Fc block可以在表面抗体孵化前加入；3，使用冷流式细胞着色缓冲液清洗，离心并弃去清洗液1500rmp离心，5分钟4，悬浮细胞沉淀物，给每个样本加1ml准备好的新鲜固定/破膜工作液，再次悬浮溶液；5，在暗处4℃孵化30min~18h（当用固定/破膜工作液孵化30min~18h不同的时间变化，只要用相同的供者样本，所得到的结果是具有可比性的）6，用2ml破膜缓冲液洗涤细胞，离心并弃去上层清夜；2500rmp离心，5分钟7，重复步骤6；8，0.5µg Fc block放在1倍破膜缓冲液，体积调整至100µl ，4℃放置15min；9，阻滞步骤后不用清洗，加0.5µg小鼠PE-Cy5-FOXP3（FJK-16S）抗体或者PE-Cy5-IgG2a同型对照抗体放入到1倍透化缓冲液中，暗处4℃至少孵化30min。
要想在实验中得到最理想的染色请做进一步的滴定；10，用2ml破膜缓冲液洗涤细胞，离心并弃去上层清夜；3500rmp离心，5分钟11，重复步骤10；12，悬浮适当的流式细胞着色缓冲液体积，上流式细胞仪检测并且记录，由于固定和破膜的过程中细胞数量的FSC/SSC分布与肝细胞不同，因此需要在入口和电压上做出相应调整。
流式细胞染色步骤
流式细胞染色步骤一、流式细胞染色的概念和意义流式细胞染色是一种通过荧光标记物来对细胞进行检测和分析的技术。
该技术可以用来研究细胞表面分子、内部结构和功能等方面，对于诊断疾病、筛查药物、研究免疫学和癌症等领域都具有重要的应用价值。
二、流式细胞染色的基本步骤1. 细胞样品的处理：将待检测的细胞样品经过处理后变成单个细胞悬液状态，以便于流式细胞仪进行检测。
2. 细胞染色：将荧光标记物与待检测的细胞样品进行反应，使其产生荧光信号。
3. 流式细胞仪检测：将经过染色后的单个细胞悬液注入到流式细胞仪中，利用仪器中激光器产生的光线对标记物进行激发，并通过检测器来收集产生的荧光信号。
4. 数据分析：对采集到的数据进行分析，得出相应结果。
三、详解流式细胞染色的步骤1. 细胞样品的处理细胞样品的处理是流式细胞染色中非常重要的一步，它可以影响到后续步骤中数据的准确性和稳定性。
一般来说，可以采用以下方法处理细胞样品：（1）消化酶分离法：将组织切成小块后加入消化酶进行消化，使其变成单个细胞悬液状态。
（2）机械分离法：通过机械手段将组织碾碎、刮下或振荡等方式使其变成单个细胞悬液状态。
（3）冷冻解冻法：将组织或细胞经过低温冷冻后解冻，使其变成单个细胞悬液状态。
2. 细胞染色在流式细胞染色中，荧光标记物是非常重要的一环。
荧光标记物可以与待检测的分子特异性结合，以便于在流式仪器中检测到。
一般来说，可以采用以下方法进行染色：（1）直接染色法：将荧光标记物直接加入到待检测的单个细胞悬液中，使其与目标分子结合。
（2）间接染色法：通过抗体的特异性识别，将荧光标记物与待检测的分子结合。
3. 流式细胞仪检测流式细胞仪是一种高级的仪器设备，能够对单个细胞进行多参数检测。
在流式细胞染色中，经过染色后的单个细胞悬液会被注入到流式仪器中进行检测。
流式仪器会利用激光器产生的光线对标记物进行激发，并通过检测器来收集产生的荧光信号。
一般来说，可以采用以下步骤进行流式仪器的设置和调整：（1）选择合适的波长：根据荧光标记物的特性和激发波长选择适当的波长。
thermo流式细胞表面和细胞内染色方案
thermo流式细胞表面和细胞内染色方案流式细胞表面染色方案：1. 细胞准备：将待染色的细胞进行离心，去除培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
2. 细胞固定：将细胞用4%的冷甲醛溶液进行固定，固定时间一般为15-30分钟。
3. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
4. 细胞孵育：将细胞悬浮于含有特定抗体的PBS缓冲液中，孵育时间一般为30-60分钟。
5. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
6. 细胞荧光标记：将细胞悬浮于含有荧光标记的二抗的PBS缓冲液中，孵育时间一般为30-60分钟。
7. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
8. 细胞检测：将细胞悬浮于PBS缓冲液中，通过流式细胞仪进行细胞表面染色的检测。
流式细胞内染色方案：1. 细胞准备：将待染色的细胞进行离心，去除培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
2. 细胞固定和渗透：将细胞用4%的冷甲醛溶液进行固定，固定时间一般为15-30分钟。
然后使用0.1%的Triton X-100或0.5%的Saponin进行细胞渗透，渗透时间一般为10-20分钟。
3. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
4. 细胞孵育：将细胞悬浮于含有特定抗体的PBS缓冲液中，孵育时间一般为30-60分钟。
5. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
6. 细胞荧光标记：将细胞悬浮于含有荧光标记的二抗的PBS缓冲液中，孵育时间一般为30-60分钟。
7. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
8. 细胞检测：将细胞悬浮于PBS缓冲液中，通过流式细胞仪进行细胞内染色的检测。