化妆品中表皮生长因子的快速检测
大鼠表皮生长因子(EGF)说明书
大鼠表皮生长因子(EGF)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中表皮生长因子(EGF)的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠表皮生长因子(EGF)水平。
用纯化的大鼠表皮生长因子(EGF)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入表皮生长因子(EGF)再与HRP标记抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的表皮生长因子(EGF)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠表皮生长因子(EGF)浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：5400ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
外用重组人表皮生长因子
外用重组人表皮生长因子Waiyong Chongzu Ren Biaopi Shengzhangyinzi Recombinant Human Epidermal Growth Factor forExternal Use本品系由高效表达人表皮生长因子基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后冻干制成。
含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
1基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2制造2.1工程菌菌种2.1.1名称及来源重组人表皮生长因子工程菌株系由带有人工合成人表皮生长因子基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。
2.1.2种子批的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
2.1.3菌种检定主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
2.1.3.1划种LB琼脂平板应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。
2.1.3.2染色镜检应为典型的革兰阴性杆菌。
2.1.3.3对抗生素的抗性应与原始菌种相符。
2.1.3.4电镜检查（工作种子批可免做）应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
2.1.3.5生化反应应符合大肠杆菌生物学性状。
2.1.3.6人表皮生长因子表达量在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
2.1.3.7质粒检查该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。
2.1.3.8 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。
2.2原液2.2.1种子液制备将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发酵罐接种用。
2.2.2发酵用培养基采用适宜的不含任何抗生素的培养基。
2.2.3种子液接种及发酵培养2.2.3.1在灭菌培养基中接种适量种子液。
2.2.3.2在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。
发酵液应定期进行质粒丢失率检查（附录ⅨG）。
酶联免疫法快速筛查化妆品中非法使用人表皮生长因子
第49卷第2期2021年1月广㊀州㊀化㊀工Guangzhou Chemical IndustryVol.49No.2Jan.2021酶联免疫法快速筛查化妆品中非法使用人表皮生长因子∗吴㊀震,薛日颖,薛巧如,黄㊀莹(国家药品监督管理局化妆品安全风险评估重点实验室,广东省药品检验所,广东㊀广州㊀510663)摘㊀要:建立化妆品中人表皮生长因子(EGF)的酶联免疫(ELISA)快速筛查方法㊂冻干粉㊁水和啫喱剂化妆品用PBS 缓冲液溶解,以空白加标样品回归拟合四参数标准曲线,以不确定度评估法确定本实验室临界值为0.0781㊁0.0814㊁0.0662,以精密度剖面函数和迭代逼近法确定本实验室最小可检出值为64㊁33㊁30pg /mL㊂使用308个盲样对本方法评价,假阴性率㊁假阳性率和相对准确度分别为0%㊁3.2%㊁99.5%㊂本方法快速㊁灵敏㊁简便,适用于非法使用人表皮生长因子的现场快速筛查㊂关键词:酶联免疫法;化妆品;人表皮生长因子;快速筛查㊀中图分类号:O629.72㊀文献标志码:A文章编号:1001-9677(2021)02-0051-03㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀∗基金项目:广东省科技厅科技计划项目(2019B020208010);广东省医学科学技术研究基金项目(B2018213)㊂第一作者:吴震(1976-),男,博士,主要从事药品化妆品监管和检测技术研究㊂Enzyme Linked Immunoassay for Rapid Screening Illegal UseHuman Epidermal Growth Factor in Cosmetics ∗WU Zhen ,XUE Ri -ying ,XUE Qiao -ru ,HUANG Ying(NMP Key Laboratory of Cosmetics Safety Risk Assesment,Guangdong Institute for Drug Control,Guangdong Guangzhou 510663,China)Abstract :A rapid screening method for determining human epidermal growth factor (EGF)in cosmetics by enzyme linked immunoassay (ELISA)was developed.Lyophilized powder,water and gel cosmetics were dissolved in PBS buffer,and the concentration and absorbance values of stand -addition in blank were fitted with four -parameter logistic model.The LOBs in our lab were 0.0781,0.0814and 0.0662,determined by uncertainty method with blank samples,and the LODs in our lab were 64,33,30pg /mL,determined by precision profile and iterative method with blanks and matrix spikes.The false negative rate,false positive rate and relative accuracy of the mothed were 0%,3.2%,99.5%separately,assessed by 308blind samples.The method is fast,sensitive,convenient,and suitable for field rapid screening illegal use EGF in cosmetics.㊀Key words :ELISA;cosmetics;EGF;rapid screening人表皮生长因子(Human Epidermal Growth Factor,hEGF,EGF,Cas No:62253-63-8)是由53个氨基酸组成,相对分子量6216Da 的多肽,广泛存在于人体体液和多种腺体中[1-2]㊂EGF 具有促进细胞增殖等生物学效应,被广泛应用于烧烫伤㊁创伤等的治疗,近来被尝试用于化妆品,以改善皮肤问题[3-5]㊂国家药品监督管理局在2019年2月发布的消费警示指出化妆品配方中使用或宣称含有EGF 的,均属于违法产品[6]㊂我们在国家化妆品监督抽检工作中发现市售宣称含有EGF,或以寡肽名义标注实际含有EGF 的化妆品现象严重㊂目前我国并无法定的化妆品中EGF 的检测方法,陈科等研究了凝胶电泳SDS -PAGE㊁免疫印迹WB 和MTT 比色法对水剂和啫喱化妆品的EGF 进行快速检测[7],但方法速度较慢且复杂,另有用于药品的免疫印迹法㊁免疫斑点法㊁电泳法㊁高效液相色谱法㊁在线免疫高效液相色谱等检测方法[8-9],以及用于人或动物体液的酶联免疫(ELISA)法[10]㊂为有效识别和防控化妆品中非法使用EGF 的风险,利用ELISA 法快速㊁灵敏㊁简便的特点,可采取先快速筛查出疑似样品,再用实验室HPLC 和质谱法进一步定量和确证的策略㊂本工作通过适用性㊁样品处理方法㊁临界值㊁最小可检出值[11-13]的确定,建立化妆品中EGF 的ELISA 快速筛查方法,并对方法进行了评价[14]研究㊂1㊀实㊀验1.1㊀仪器与试剂TECAN SPARK 酶标仪;奥盛MB100-2A 恒温振荡器;METTLER XS205DU 电子天平;Eppendorf 5810R 离心机;BIO -RAD 1575洗板机㊂PBS 缓冲溶液:取NaCl 8g,KCl 0.2g,Na 2HPO 41.42g,KH 2PO 40.27g,加入800mL 水溶解,用盐酸调节pH 至7.4,加水定容至1L,用0.22μm 滤膜过滤即得㊂所用试剂为分析52㊀广㊀州㊀化㊀工2021年1月纯,水为二级实验用水㊂人表皮生长因子ELISA Kit 共7个来源的8个品种:上海抚生A099349-48T;上海抚生SU -B10401-48T;康朗生物IC -EGF -Hu -96T;ICImmunoClone IC -EGF -Hu -96T;TSZ SU -B10401-96T;Abcam 17772-96T;RayBiotech ELH -EGF -1;欣博盛生物EHC126㊂阳性对照品:上海普欣,重组人表皮生长因子GMP -105-04,批号EGMP10504062,含量98.82%;上海昊海生物,外用重组人表皮生长因子,批号20180826-2;桂林华诺威基因,重组人表皮因子滴眼液,批号201908089C㊂样品:来源于网络购买㊁国家化妆品监督抽检㊁广东省化妆品风险监测的化妆品共36个品种,其中冻干粉剂13个,水剂15个,啫喱剂8个㊂1.2㊀样品处理和加标样品制备对于冻干粉剂:称取混匀后的样品,按每1mg 加入1mL 的PBS 缓冲溶液溶解,必要时稀释备用;对于水剂:取样品0.25mL 加入0.25mL 的PBS 缓冲溶液溶解备用;对于啫喱剂:称取样品0.25g 加入0.25mLPBS 缓冲溶液溶解,必要时以4000r /min 离心15min,取水层备用㊂取三种剂型的空白化妆品,按样品处理方法处理,用于溶解和稀释试剂盒内对照品,按试剂盒说明书配制成系列浓度加标溶液备用㊂1.3㊀方法临界值确定按化妆品类型选择空白基质样品进行至少30次测试㊂使用正态性检验Shapiro -Wilks 检验结果正态性,排除显著偏离正态分布数值;使用离群值检验格拉布斯检验剔除结果离群值㊂吸光度测量临界值为:y c =y b +t 1-α(ν)s b1J +1K(1)其中y b 是测量吸光度在空白基质状态下的估值:y b =ðJJ =1y iJ(2)而t 1-α是可接受第一类错误概率α(通常为0.05)下的t 分布相应的分位数,自由度ν=J -1,空白样品测量的标准差估值为:s b =ðJ J =1(y i -y b )2J -1(3)K 2㊂1.4㊀最小可检出值确定制取合适的空白基质样品加标标准溶液,选取8个浓度点,浓度范围覆盖测试样品可能浓度范围,测量吸光度结果㊂使用如下四参数模型,用最小二乘法回归拟合该剂型加标标准曲线:Y =C 0-C 31+(X C 2)C 1+C 3(4)其中C 0㊁C 1㊁C 2㊁C 3为模型系数,X 为EGF 浓度,Y 为检测吸光度㊂当α=β=0.05时(β为第二类错误概率),根据最小可检出值为30%相对偏差的定义,有:d 11+(XC 2)C 1()dlog X X =xd=ρy (x d )0.132(5)其中x d 为EGF 浓度最小可检出值,ρy 为以X 的函数表示的变异系数㊂EGF 浓度的最小可检出值可以从式(5)指定的斜率得到:①计算空白基质状态下的变异系数值ρy (x b ),作为ρy (x d )的近似值;②在可接受的误差允许范围内,根据式(5)计算得到x d 1;③制备x d 1浓度相应的空白基质加标样品,重复临界值实验;④计算x d 1浓度相应的空白基质加标样品的变异系数ρy (x d 1),作为ρy (x d )的第二次近似值;⑤在可接受的误差允许范围内,根据式(5)计算得到x d 2;⑥比较x d 1和x d 2的值,如果不在可接受的误差允许范围内,改变相应的x d 的迭代值,重复步骤③~⑤;如果在可接受的误差允许范围内,以x d 2作为x d 的估值,相应的测量吸光度估值为y d 2,用以实际中代替x d 和y d ㊂当样品中EGF 浓度恰为最小可检出值时,方法测量值在最小判断值为:x f =(1-1.645ˑ0.3)x d =0.5065x d (6)在α=0.05置信区间内,根据标准模型计算得到的对应测量吸光度最小判断值为y f 作为方法的cut -off 值㊂2㊀结果与讨论2.1㊀方法适用性使用8种试剂盒对PBS 缓冲溶液(阴性对照)㊁阳性对照品㊁化妆品样品进行测试,结果表明:全部试剂盒自带标准溶液在一定范围内均可呈现良好线性,基本能复现产品说明书的最小可检出浓度,但是部分试剂盒对全部实际化妆品测试结果为阳性或全部为阴性,不同试剂盒对个别同一样品测试结果存在显著不同,不同试剂盒的灵敏性㊁准确性存在显著差异㊂适用性实验证明ELISA 方法适用范围虽然可由动物体液扩展至化妆品中EGF 的快速筛查,但试剂盒产品质量㊁实验室环境和实验水平影响结果非常明显,必须确定快速筛查方法在实际使用时的临界值㊁最小可检出值等性能指标,并对方法进行评价后方可使用㊂2.2㊀样品处理方法EGF 是水溶性多肽且性质不稳定,经调查市售宣称使用EGF 的化妆品多为冻干粉㊁水和啫喱剂型,由于不同剂型间性质差异巨大,研究按剂型不同进行了样品处理方法实验㊂实验考察了PBS 缓冲溶液㊁0.2%牛血清蛋白(BSA)溶液㊁0.4%BSA 饱和氯化钠溶液㊁饱和氯化钠溶液为提取溶剂时100pg/mL 浓度下空白样品加标回收率情况,结果如表1所示,由于本方法只作为现场快速筛查使用,样品处理方法要求简便㊁快速,选择使用PBS 缓冲溶液较好㊂表1㊀不同提取溶剂的回收率Table 1㊀Recovery for different extracting solvents样品剂型溶剂种类PBS 溶液0.2%BSA 溶液0.4%BSA 饱和氯化钠溶液饱和氯化钠溶液冻干粉剂80%51%38%-水剂73%67%19%-啫喱剂101%-11%10%㊀㊀注:-表示实验未进行㊂回收率实验表明化妆品的基质效应明显,为进一步消除基第49卷第2期吴震,等:酶联免疫法快速筛查化妆品中非法使用人表皮生长因子53㊀质效应影响,本方法选择与待测样品性质尽可能相似的样品作为空白,并使用空白加标样品来建立标准曲线㊂在确定临界值㊁加标标准曲线和最小可检出值等实验中,适当选择多个化妆品空白进行实验,增加实验数据可以减少方法的误差㊂2.3㊀临界值和最小可检出值按步骤确定方法的性能指标,结果如表2所示㊂数据表明不同类型化妆品空白基质临界值不同,且与试剂盒说明书宣称值存在差异,使用精密度剖面函数一般2~3次迭代就可以较快速㊁准确得到方法最小可检出值㊂使用判断值进行结果判断可以防止在最小可检出值附近出现假阴性的偏差㊂表2㊀本实验室的性能指标Table 2㊀The performance indexs in our labEHC126吸光度临界值x d 1/(pg /mL)x d 2/(pg /mL)x d 3/(pg /mL)x f /(pg /mL)冻干粉0.0781175656432水剂0.0814100403317啫喱0.0662713930152.4㊀方法评价评价使用的盲样涉及冻干粉㊁水剂和啫喱三种基质的空白㊁阴性和阳性样品㊂每种基质的阳性样品由3个代表性阴性样品加入一定量对照品分别制备,浓度分别为1倍㊁3倍和10倍方法最小可检出值,共270份㊂评价另使用36个化妆品样品和2种市售药品作为实际样品,其中4个冻干粉和1个水剂样品经HPLC 检测方法确证为阳性样品;1个水剂和1个啫喱剂样品的HPLC 检测结果浓度在检出下限附近,通过其他信息综合判定为阳性样品㊂方法的假阴性率和假阳性率结果如表3所示㊂表3㊀方法评价性能指标结果Table 3㊀Performance results of the method evaluation样品情况a检测结果b 阳性阴性总数阳性2770277阴性13031总数27830308假阴性率(pf -/%)pf -=0/277=0假阳性率(pf +/%)pf +=1/31=3.2相对准确度/%(277+30)/(277+31)=99.5㊀㊀注:a 由确证方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果;b由待评价方法或产品筛查得到的结果㊂2.5㊀ELISA 快速筛查方法与HPLC 检测方法结果的比较由于化妆品基质较复杂且ELISA 方法原理的限制,使用ELISA 快速筛查化妆品中EGF 结果存在一定不确定性,如有必要可用HPLC 方法进行定量并确证㊂表4是6个结果呈阳性实际化妆品样品用不同检测方法结果的比较,结论基本相符㊂由于ELISA 快速筛查方法比HPLC 检测确证方法的灵敏度高约2个数量级,对于极低浓度的样品,会出现ELISA 快速筛查方法结果阳性但HPLC 检测方法结果小于检出限的情况㊂后续我们将进行更灵敏的确证方法的研究㊂表4㊀ELISA 和HPLC 检测结果比较Table 4㊀The results comparison by ELISA and HPLC methods样品类型ELISA 法结果HPLC 法结果/(μg /g)Y5冻干粉阳性22844Y6水剂阳性<0.4Y17冻干粉阳性93Y18冻干粉阳性204Y19水剂阳性<0.4Y25啫喱阳性<0.43㊀结㊀论本工作利用ELISA 方法快速筛查化妆品中非法使用EGF,通过适用性㊁临界值和最小可检出值的计算和判断,根据不确定度评估出实际使用方法的性能参数,从而简便㊁准确㊁灵敏地快速筛查非法使用EGF 化妆品,并对方法进行了评价,满足化妆品现场监管和实验室检测需要,具有实际应用价值㊂参考文献[1]㊀HUANG H W M S.2KV4EGF[EB /OL].[2019-12-24].http:// /pdb /explore /jmol.do?structureId =2kv4&bionumber =1&jmolMode =HTML5.[2]㊀BOONSTRA J,RIJKEN P,HUMBEL B,et al.The epidermal growthfactor[J].Cell Biology International,1995,19(5):413-430.[3]㊀刘薇,陈庆生,龚盛昭,等.表皮生长因子及其在化妆品中的应用研究进展[J].日用化学品科学,2014,37(1):36-39.[4]㊀陈立琼.hEGF 在化妆品中美白/延缓衰老功效的探索[D].无锡:江南大学,2008.[5]㊀陈秋东,许永兴,徐志南.人表皮生长因子及其在化妆品中的应用[J].日用化学工业,2002,32(5):38-40.[6]㊀国家食品药品监督管理局.化妆品监督管理常见问题解答[EB /OL].[2019-12-24]. /WS04/CL2202/334387.html.[7]㊀陈科,郭狄,苏志坚,等.化妆品中表皮生长因子的快速检测[J].日用化学工业,2010,40(1):67-70.[8]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015年版)[M].2015年6月第1版.北京:中国医药科技出版社,2015.[9]㊀Kagel J R,Rossi D T,Nordblom G D,et al.Considerations in thedevelopment of a sensitive HPLC assay for human epidermal growth factors in human plasma[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,1995,13(10):1205-1213.[10]李雪玲,吴学诗,赖锦昌,等.表皮生长因子间接竞争酶联免疫吸附测定法的建立[J].暨南大学学报(自然科学与医学版),2003,24(6):31-35.[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会.GB /T 33260.1-2016检出能力第1部分:术语和定义[S].北京:中国标准出版社,2016.[12]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会.GB /T 33260.3-2018检出能力第3部分:无校准数据情形响应变量临界值的确定方法[S].北京:中国标准出版社,2018.[13]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会.GB /T 33260.5-2018检出能力第5部分:非线性校准情形检出限的确定方法[S].北京:中国标准出版社,2018.[14]广东省食品药品监督管理局.GDFDA BZ06-2018化妆品快速筛查方法和产品评价技术规范[S].广州:2018.。
EGF（冻干粉）表皮生长因子（怎么改善皮肤）
EGF（冻干粉）表皮生长因子（怎么改善皮肤）EGF表皮生长因子重组人表皮细胞生长因子（EGF）【性质】英文名：Recombinant Human Epidermal Growth Factor EGF是Epidermal Growth Factor的英文缩写，中文名称为表皮生长因子，是人生长因子中的一种，由53个氨基酸组成的相对分子量为6045的小分子多肽，采用独特的色谱技术分离纯化、冻干制备。
HS Code: 3002 9090 【品质】外观：白色疏松状或粉状冻干品。
纯度：>95.0% ，采用反相-高效液相（RP-HPLC）方法测定。
纯度：>95.0% ，采用还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），银染检测。
【用途】重组人表皮生长因子作为一种强有力的细胞分裂因子，具有多种生物活性，EGF具有修复表皮、抗衰老、淡化色斑、平复皱纹、淡化红血丝、滋润皮肤，修复等功效，人体中EGF的含量多少直接决定着皮肤的年轻程度，EGF因此又被誉为“美丽因子”，主要表现为：①在体内刺激皮肤组织、角膜和气管上皮组织的生长繁殖。
②加速角膜、皮肤等表皮创伤的修复。
③抑制胃酸分泌。
④促进人皮肤上皮细胞、角膜上皮细胞、哺乳动物上皮细胞生长。
⑤增强表皮细胞的蛋白质、DNA、RNA的合成和细胞代谢等。
EGF的护肤功效：1.改善皮肤微循环（光洁），促进透明质酸合成和分泌（滋润）：EGF能促进细胞外透明质酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增强皮肤的亲水性，保持皮肤内水分。
EGF能改善皮肤微循环，令气血通畅，防止代谢产物淤积，使皮肤富有营养。
2.减少黑色素沉积（淡化色斑）：EGF通过促进肌肤内多种细胞的生长、分化，产生大量的新生细胞，来替代有色细胞。
在EGF的作用下，皮肤保持健康，表皮的黑色素会随着新陈代谢由皮肤表面排出，自然剥落。
3.修复皮肤各种纤维（去皱）：EGF能够促进真皮层内纤维母细胞的增殖，修复老化的胶原纤维与弹性纤维。
化妆品检验依据标准
重组人表皮生长因子复方抗菌凝胶生物活性检测方法的建立
重组人表皮生长因子复方抗菌凝胶生物活性检测方法的建立首席医学网2006年05月25日【关键词】磺胺嘧啶银摘要:目的与方法通过探讨用MTT法检测重组人表皮生长因子（rhEGF）复方抗菌凝胶生物活性的试验参数，包括凝胶剂中卡波姆含量对测定的屏蔽作用、不同试剂对卡波姆组分屏蔽作用的解除、抗菌成分磺胺嘧啶银浓度以及EGF含量对复方凝胶检测方法的影响作用等，建立一套适合用于EGF复方抗菌凝胶剂生物活性的检测方法。
结果优选出的最佳条件：EGF质量分数为20 μg/g，卡波姆质量分数为1.0%，用尿素+PBS+甘氨酸作屏蔽剂，磺胺嘧啶分数浓度为0.5%~2.0%。
结论本文方法可快速准确地对EGF复方凝胶活性进行检测,从而为复方凝胶剂的开发提供条件。
关键词:重组人表皮生长因子;磺胺嘧啶银; 复方;凝胶剂MTT法表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)可明显促进创面愈合，尤其对一些难愈合创面作用更佳，具有很高的临床价值［1-6］。
目前临床上主要使用基因工程生产的重组人表皮生长因子（recombinant human EGF, rhEGF）凝胶剂［7］。
古巴的rhEGF凝胶与磺胺嘧啶银的复方制剂已经上市，国内也有数家单位正处于研发阶段［8,9］。
在开发rhEGF复方抗菌凝胶的过程中，最大的困难在于rhEGF复方抗菌凝胶的生物活性检测问题。
本文通过改良MTT［10］结合酶联仪的检测方法，对rhEGF复方抗菌凝胶几个组分浓度进行分析，拟建立了一套简便有效的检测方法。
1 材料和方法1．1 细胞株Balb/c3T3，由中国药品生物制品检定所提供。
1．2 培养基RMIP 1640，购自GIBCO公司；1．3 试剂四甲基偶氮唑盐(MTT), 购自JANSSEN HIMICA公司；小牛血清(calf serum ，CS)，购自Hyclone公司；EDTA、NaCl、磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)、尿素、甘氨酸（上海生工公司），分析纯。
人重组人表皮生长因子(rh-EGF)说明书
品中的重组人表皮生长因子（rh-EGF）呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD
值），通过标准曲线计算样品中人重组人表皮生长因子（rh-EGF）浓度。 试剂盒组成
1 30 倍浓缩洗涤液
20ml×1 瓶
7 终止液
6ml×1 瓶
2 酶标试剂
6ml×1 瓶
8 标准品（2400ng/L） 0.5ml×1 瓶
300 ng/L
3 号标准品
150μl 的 4 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
150 ng/L
2 号标准品
150μl 的 3 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
75 ng/L
1 号标准品
150μl 的 2 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
3 酶标包被板
12 孔×8 条
9 标准品稀释液
1.5ml×1 瓶
4 样品稀释液
6ml×1 瓶
10 说明书
1份
5 显色剂 A 液
6ml×1 瓶
11 封板膜
2张
6 显色剂 B 液
6ml×1/瓶
12 密封袋
1个
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能
马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物请避光保存。 7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9．本试剂不同批号组分不得混用。 保存条件及有效期 1．试剂盒保存：；2-8℃。 2．有效期：6 个月
化妆品快速检测工作总结
化妆品快速检测工作总结
化妆品是现代人日常生活中不可或缺的一部分，但是由于市场上化妆品种类繁多，质量参差不齐，因此化妆品的质量安全问题备受关注。
为了保障消费者的权益，化妆品快速检测工作显得尤为重要。
化妆品快速检测工作主要包括对化妆品中的成分、微生物、重金属等有害物质
进行检测。
首先，对于化妆品中的成分，快速检测需要通过高效液相色谱、气相色谱质谱联用等技术手段，对化妆品中的成分进行定性和定量分析，确保产品中的成分符合相关标准和法规要求。
其次，对于微生物污染问题，快速检测需要借助生物快速检测技术，对化妆品中的细菌、霉菌等微生物进行快速检测，确保产品的微生物指标符合卫生标准。
此外，对于化妆品中的重金属等有害物质，快速检测需要利用原子吸收光谱、电感耦合等离子体质谱等技术手段，对化妆品中的重金属进行快速检测，确保产品中的重金属含量符合相关标准要求。
在化妆品快速检测工作中，仪器设备的更新换代、技术手段的不断创新以及标
准法规的不断完善，为化妆品快速检测提供了更为便捷、快速和准确的手段。
同时，化妆品生产企业也应加强自我管理，建立健全的质量管理体系，严格把关原辅料采购、生产工艺控制等环节，确保产品质量安全。
总的来说，化妆品快速检测工作对于保障消费者的权益、维护市场秩序具有重
要意义。
各方应共同努力，加强合作，促进化妆品质量安全工作的不断提升，为消费者提供更加安全、放心的化妆品产品。
常用化妆品检测方法
常用化妆品检测方法化妆品检测方法可分为物理性能检测、化学成分分析、生物学评价和安全性评估等几个方面。
下面将对常用的化妆品检测方法进行详细介绍。
一、物理性能检测：1.外观检测：通过目测和显微镜观察化妆品的形状、颜色和纯度等外观特征。
2.包装检测：检测包装结构的耐摔、耐压、耐磨等性能，以确保产品在运输过程中不会受损。
3.气味检测：通过嗅觉感知化妆品的气味，检测气味是否正常或有异常臭味。
4.重量检测：使用天平检测化妆品的质量，确保产品规格和称重准确。
5.测试pH值：使用酸碱指示剂或pH计检测化妆品的酸碱性，以确定其pH值是否在正常范围内。
6.粘度测试：使用粘度计测定化妆品的粘度，以判断其流动性和适应性。
二、化学成分分析：1.紫外-可见光谱检测：通过测量化妆品在紫外-可见光范围内的吸收或反射光谱，来分析其中的化学成分。
2.红外光谱检测：利用红外光谱仪分析化妆品中的各种有机化合物和无机物质，确定其分子结构和组成。
3.超高效液相色谱检测：利用色谱柱和特定的流动相，在高压力下将化妆品中的各种化学成分进行分离和定量分析。
4.气相色谱-质谱联用检测：结合气相色谱和质谱的技术，可以对化妆品中的有机化合物进行高效、快速、准确的检测和鉴定。
5.原子吸收光谱检测：通过测量化妆品中金属元素的吸收光谱，来分析其中的金属离子浓度。
6.核磁共振谱分析：利用核磁共振技术对化妆品中的化学成分进行结构分析和组成确定。
三、生物学评价：1.细菌检测：采用平皿菌落计数法和膜过滤法，检测化妆品中的菌落总数、霉菌和酵母菌等微生物的数量。
2.皮肤刺激性测试：通过在动物或人体上施加或涂抹化妆品，观察皮肤的变化和刺激反应，判断其皮肤刺激性。
3.眼刺激性测试：利用鸡胚或家兔等动物的眼睛，判断化妆品对眼睛的刺激性和损伤情况。
4.皮肤渗透性测试：使用离体皮肤、动物模型或人体志愿者，评估化妆品对皮肤的渗透性和吸收性。
5.致致敏性测试：通过敏感人群或动物皮肤的接触测试，判断化妆品是否有过敏反应，如红肿、瘙痒等。
化妆品检测方法大全
化妆品检测方法大全
一、宏观检测：
1.结构和形状分析：利用显微镜和形象分析仪等分析仪器，对样品的
结构和形状进行分析描述。
2.材质分析：利用比色板和二氧化碳化学分析仪等分析仪器，对样品
的材质进行分析描述。
3.成分检测：利用HPLC和GC等成分检测仪器，确定样品中的主要成分，如精油，vitamin，和其它各种成分。
4.抗菌分析：利用抗菌荧光分析仪，确定样品的抗菌力。
5.物理性能检测：利用物理性能检测仪，测定样品的透明度，色泽，
粘度，质地，半衰期等物理性能。
6.包装安全性测试：利用包装安全性测试仪测定样品的包装是否安全，例如印刷质量，耐热性，耐燃性，抗渗透性等。
二、微观检测：
1. 活性成分含量：利用活性成分测定仪、萃取粉末测定仪、HPLC等
分析仪器，检测样品中的活性成分含量，包括精油，vitamin，胶原蛋白，维生素等等。
2.全质量测定：利用原子吸收分光光度计，确定每一种成分的全质量
含量。
化妆品皮肤致敏检测方法
化妆品皮肤致敏检测方法化妆品皮肤致敏检测方法整理化妆品引起的皮肤过敏可分为三个阶段：诱导接触、诱导阶段和刺激接触。
诱导接触是身体接触过敏原引起的致敏状态。
此时，皮肤有轻微反应或无明显反应。
在一段诱导期（数周甚至数年）后，如果身体再次接触过敏原，将导致迟发性超敏反应，并可能发生在皮肤上，而不是最初接触的部位。
皮肤致敏可解分为5个方面:①化学物穿透进入皮肤;②与内源性蛋白反应;③皮肤代谢,有的化学物,称为前半抗原,需要通过皮肤代谢进行活化成为半抗原之后才具备结合皮肤蛋白的能力。
④树突细胞(dc)激活:半抗原化的蛋白被未成熟的dc细胞识别,导致dc活化,然后启动一系列的反应。
激活后的dc具有一些特性,如上调细胞表面标志物(cd83或cd86),分泌多种细胞因子(il一1β),下调参与抗原摄取的蛋白(如水通道蛋白)。
⑤抗原特异性免疫反应。
传统人体实验单次斑贴试验:受试者接受单次斑贴,分别持续24、72或96h,在诱发期间和去除斑贴后的10一14d,用激发斑贴作用48h后,对皮肤反应进行评分。
通常在激发斑贴后,需继续试用产品4w,该试验仅能检测潜在的有效致敏剂,敏感性不足。
人体重复斑贴试验：重复斑贴试验与上述方法基本相同，只是在10-14天的致敏诱导期内，每2天对同一部位连续给药数次；2周后，必须在另一位置的皮肤上进行另一次斑贴试验。
人体最大化试验:包括同一皮肤位置的5次重复的4h8封闭式斑贴,在去除和再施加斑贴之间有24h的休止期。
刺激性物质的浓度是引起中等程度红斑的浓度,对非刺激物质,试验部位诱发前预先经5%的sls斑贴2h4处理。
最后一次诱发斑贴后,休止2周。
在发生轻微刺激反应的皮肤部位经4h8封闭斑贴后进行评分,记录致敏指数。
人体最大化试验可能对皮肤造成严重的后果,操作起来有一定的风险。
一般认为，通过动物实验或其他有效方法确认为过敏原的化妆品原料不应由志愿者进行测试。
因为每次测试通常需要150-200名志愿者，这不仅耗时，而且非常昂贵。
化妆品中有害成分的检测方法及其应用
化妆品中有害成分的检测方法及其应用化妆品作为日常生活中不可或缺的一部分，已经成为了现代社会中的大众消费品之一。
然而，随着化妆品生产的不断发展，一些有害成分也顺势而来。
这些成分可能会引起皮肤过敏、癌症等疾病。
因此，对于化妆品中有害成分的检测十分重要，下面将从两个方面入手，分别介绍化妆品中有害成分的检测方法及其应用。
一、检测方法目前，对化妆品中有害成分的检测主要分为六个方法：气质联用色谱（GC-MS）法、高效液相色谱（HPLC）法、电化学分析法、SERS方法、表面等离子体共振（SPR）法、质谱分析法。
1.气质联用色谱（GC-MS）法气质联用色谱（GC-MS）法是一种将气相色谱（GC）和质谱（MS）技术结合的分析方法。
该方法的灵敏度高、选择性好、分辨率高，特别适用于分析挥发性有机物。
因此，GC-MS法是目前检测化妆品中有害成分最为常见的方法之一。
2.高效液相色谱（HPLC）法高效液相色谱（HPLC）法是一种化学分析方法，利用固定相和液相，在高压下实现化物的分离。
由于该方法较为适用于非挥发性有机物的分离，因此该方法在化妆品中有害成分的检测中也有广泛应用。
3.电化学分析法电化学分析法是利用电化学原理对化学物质进行检测的方法。
这种方法能够在较短时间内快速检测出化妆品样品中的有害成分，是一种比较实用的方法之一。
4.SERS方法表面增强拉曼散射（SERS）方法，是一种通过吸附在金属纳米颗粒表面上的目标分子对光进行增强的技术。
这种方法能够在检测有害成分的同时，无需化学标记，对于化妆品的成分检测尤其有用。
5.表面等离子体共振（SPR）法表面等离子体共振（SPR）法，又称为生物传感器技术。
利用此方法可以把检测样品的化学信息转换为光学信号，通过测量光学信号的变化来检测样品中的有害成分，这也成为了一种非常实用的方法。
6.质谱分析法质谱分析法是一种分析方法，可用于检测离子化分子的化学组成。
该方法将化学样品离子化成离子，再将其经过分子间碰撞的过程，分析其组成。
表皮生长因子的性质及其在化妆品中的应用_
表皮生长因子的性质及其在化妆品中的应用1、表皮生长因子的一般性质及其应用情况对热具有良好的稳定性，在蒸馏水中加热至100℃30分钟仍不会失掉其生物活性。
在EGF的作用下，体内K+和糖等低分子物大量进入细胞内，糖的分解量变大，RNA和蛋白质的合成增加，作用15小时左右，EGF开始促进DNA的合成，并由此趋向刺激细胞的分裂。
……所以，间歇地为皮肤和黏膜补充EGF，可以持续促进DNA的连续合成，从而保持表皮细胞的连续增殖与分化。
各种研究表明：EGF不仅在促进和调节表皮细胞生长增殖方向起作用，而且对促进皮肤和黏膜创伤的愈合、消炎镇痛、防治溃疡方面亦有特效；并能有效地抑制粉刺和青春痘的生长，保护皮肤和黏膜免受或少受机械和化学损伤。
国内专利《具有生物活性的洁护肤、洁护发化妆品及其制造方法》（公开号：CN1063410A）是将EGF添加于化妆品中而产生的功能性生物化妆品。
EGF用于护肤化妆品中，可以促进细胞增殖生长，重组皮肤表层和内层，改善皮肤结构，延缓皮肤老化，并能防止皮肤毛囊发炎，促进伤口愈合，对于损伤之皮肤提供彻底养护。
2、表皮生长因子的活性研究以I125标记的rhEGF为探针，发现来源于内、中、外三个胚层的细胞均有EGF受体存在。
人的角质细胞、胶原细胞和成纤维细胞等正常细胞均有特异的EGF受体。
对EGF活性的研究可以通过细胞培养的方法，采用人胚表皮细胞进行体外单层培养，加入EGF继续培养一段时间后加入3H-Tdr（胸腺嘧啶核苷），再培养几小时，然后去除培养液，固定细胞，再将细胞用碱溶解后，取一定量于滤纸上测定同位素渗入量，与对照组想比较，其生长速度增长2~2.5倍。
也可以利用EGF消炎镇痛的供销，测定EGF对炎症和疼痛的抑制率来定性测定它的活性；消炎主要看EGF对皮肤通透性的抑制作用。
3、表皮生长因子的毒理研究（1）急性皮肤刺激性试验——EGF为无刺激性（2）急性毒性试验——EGF为无急性毒性*一般医学临床使用EGF时，推荐用量为1000~2000μg/人，约合25μg/Kg（按人体重60Kg）。
ELISA方法测定重组人表皮生长因子滴眼液中rhEGF含量
·药物研发·ELISA方法测定重组人表皮生长因子滴眼液中rhEGF含量张军1李玉柱2樊婷婷1,2（1. 上海昊海生物科技股份有限公司 上海 201613；2. 上海利康瑞生物工程有限公司 上海 201707）摘要目的：建立重组人表皮生长因子（rhEGF）滴眼液中rhEGF含量的检测方法，并进行方法学验证。
方法：应用商品化试剂盒Quantikine ELISA，采用酶联免疫定量测定技术（ELISA）测定样品中的rhEGF含量。
结果：标准曲线的线性范围为20~200 pg/mL；中间精密度所得相对标准偏差RSD为14.98%（n=9）。
低、中、高3个质量浓度的平均回收率分别为94.08%、100.46%、104.89%，相对标准偏差分别为11.03%、9.85%、8.75%（n=3），重复检测10次的相对标准偏差为5.58%。
结论：该研究建立的ELISA方法专属性强，精密度、准确度、稳定性均良好，适用于重组人表皮生长因子滴眼液中rhEGF含量的检测。
关键词 重组人表皮生长因子 ELISA 滴眼液中图分类号：R927.2; R988.1 文献标志码：A 文章编号：1006-1533(2024)05-0077-04引用本文 张军, 李玉柱, 樊婷婷. ELISA方法测定重组人表皮生长因子滴眼液中rhEGF含量[J]. 上海医药, 2024,45(5): 77-80.Determination of recombinant human epidermal growth factor (rhEGF)content in rhEGF eye drops by ELISAZHANG Jun1, LI Yuzhu2, FAN Tingting1,2(1. Shanghai Haohai Biotechnology Co., Ltd., Shanghai 201613, China;2. Shanghai Li Kang Rui Biological Engineering Co., Ltd., Shanghai 201707, China)ABSTRACT Objective: To establish a method for the determination of rhEGF content in rhEGF (recombinant human epidermal growth factor) eye drops and perform method validation. Methods: The content of rhEGF in eye drops was determined using a commercial kit Quantikine by enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA). Results: The linear range of the standard curve was 20-200 pg/mL. The relative standard deviation (RSD) of intermediate precision was 14.98% (n=9). The average recoveriesof low, medium, and high concentrations of samples were 94.08%, 100.46% and 104.89% with RSD 11.03%, 9.85%, 8.75% (n=3), respectively. The RSD for 10 replicates was 5.58%. Conclusion: The ELISA method established in this study has a good specificity, precision, accuracy and stability, and is suitable for the determination of the content of rhEGF in rhEGF eye drops.KEY WORDS rhEGF; ELISA; eye drop重组人表皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF）是由53个氨基酸组成的活性多肽，具有广泛的生物学效应，能促进各种表皮组织生长，应用广泛。
化妆品快速检测工作总结
化妆品快速检测工作总结
化妆品是现代人生活中不可或缺的一部分，但是其中可能存在一些对人体健康
有害的成分。
因此，化妆品的快速检测工作显得尤为重要。
在过去的一段时间里，我们进行了大量的化妆品快速检测工作，现在我来总结一下这些工作的成果和经验。
首先，我们采用了先进的检测设备和技术，如高效液相色谱仪、气相色谱仪等，这些设备能够快速、准确地检测出化妆品中的有害成分，如重金属、激素类物质等。
同时，我们还采用了一些新型的检测方法，如质谱分析、核磁共振等，这些方法能够更加全面地检测出化妆品中的各种成分，为消费者提供更加安全的产品选择。
其次，我们建立了一套完善的快速检测工作流程，从样品采集、样品处理、检
测分析到结果判定，每个环节都有严格的标准和程序。
这些工作流程的建立，保证了我们的检测工作能够高效、准确地进行，为消费者提供了可靠的检测结果。
此外，我们还积极开展了化妆品快速检测技术的研究和开发工作，不断推进检
测技术的创新和升级。
我们与多家科研机构和企业合作，共同研发了一些新型的检测方法和设备，为化妆品快速检测工作提供了更多的选择和可能性。
在今后的工作中，我们将继续加强对化妆品快速检测工作的研究和实践，不断
提升我们的检测能力和水平，为保障消费者的权益和健康提供更加有力的支持。
希望通过我们的努力，能够让更多的人使用到安全、放心的化妆品产品。
生长因子的生产工艺流程和产品检验方法
生长因子的生产工艺流程和产品检验方法生长因子是一类具有促进细胞生长和分化能力的蛋白质，广泛应用于医学、生物工程等领域。
本文将详细介绍生长因子的生产工艺流程和产品检验方法。
一、生长因子的生产工艺流程1. 原料准备生长因子的主要原料包括细胞培养基、营养物质和辅助剂等。
首先需要准备好这些原料，并确保其质量符合要求。
2. 细胞培养细胞培养是生长因子生产的关键步骤。
首先需要选择适合的细胞株，并进行培养基配制。
将细胞接种到含有培养基的培养皿中，然后放入恒温恒湿的培养箱中进行培养。
定期观察细胞的形态和增殖情况，确保细胞处于健康状态。
3. 细胞扩增经过一段时间的培养，细胞数量会逐渐增加。
当达到一定密度时，需要进行细胞扩增。
将细胞从原来的培养皿中转移到更大的培养容器中，以提供更多的营养物质和空间。
细胞扩增的过程需要注意保持细胞的健康状态，避免细胞死亡或突变。
4. 生长因子制备细胞扩增到一定程度后，可以开始制备生长因子。
首先将培养基收集下来，然后通过离心等方法去除细胞和杂质。
接下来可以使用柱层析、凝胶过滤等技术对生长因子进行纯化和富集。
最后将纯化后的生长因子进行冻干或冷冻保存，以便后续使用。
5. 产品包装生长因子制备完成后，需要进行产品包装。
通常采用无菌包装方式，将生长因子装入无菌瓶或注射器中，并密封保存。
在包装过程中要注意避免污染和氧化。
6. 产品储存完成产品包装后，需要将生长因子储存起来。
一般情况下，生长因子应存放在低温、干燥、避光的条件下，以确保其稳定性和活性。
二、生长因子的产品检验方法1. 外观检查首先需要对生长因子的外观进行检查。
观察其颜色、透明度和是否有悬浮物等，以确保产品的质量。
2. pH值检测生长因子的pH值对其稳定性和活性有重要影响。
使用pH计测量生长因子溶液的pH值，确保其在合适的范围内。
3. 细菌检测生长因子作为一种生物制品，需要进行细菌检测以确保产品无菌。
常用方法包括培养基平板法和聚合酶链式反应（PCR）等。
化妆品中表皮生长因子的快速检测
摘要: 采用十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SD S- PAGE )、免疫印迹法 ( W B)和噻唑蓝 ( M TT )比色法对 化妆品中
表皮生长因子 ( EGF )进行快速 检测。 得到 SD S- PAG E 和 W B 的检 出限 分别 为 01 500 mg /L 和 01 005 mg /L; 样品 1中
114 EGF 检定方法
11411 SDS- PAGE测定 按照 BIO- RAD 公司蛋白 质电泳仪说明 书安装
好仪器。配制 SDS质量分数 16% 的分离胶溶液, 待分 离胶完全聚合后, 配制 SDS质量分数 6% 的浓缩胶溶 液, 插入样品梳, 待浓缩胶溶 液完全聚合后拔 出样品 梳, 将电极缓冲液注满电泳槽前后槽, 在供试品孔中依 次加入 5 LL 蛋白 M arker, 10 LL 不同浓度的 11311配 制的 EGF 标准品及 10 LL 的 11312 配制的样品 1 和 样品 2, 连接好电源, 按 30 mA, 90 m in 恒流方式进行 电泳。电泳停止后, 取出凝胶进行银染分析 [ 9] 。 11412 W B测定
第 40卷第 1期 2010年 2月
日用 化 学工 业
Ch ina Surfactant D etergent& Cosm etics
V o.l 40 N o. 1 F eb. 2010
化妆品中表皮生长因子的快速检测
陈 科 1, 郭 狄 1, 苏志坚 2, 郑伟东 1, 黄亚东 2, 项 琪 2
( 11 广东省保化检测中心有限公司, 广东 广 州 510663; 21 暨 南大学 医药生物技术研究开发中心, 广东 广州 510630)
SDS- PAGE 电泳结束后, 去除浓缩胶 [ 10] , 取出分 离胶 标记 后 用 转 移 缓 冲 液 室温 浸 泡 30 m in, 并 取 PVDF 膜先在蒸馏水中浸泡 5 m in后置于甲醇中充分 湿润 15 m in, 同时取 2张和 6张与分离胶大小等同的 海绵、滤纸与润湿的 PVDF 膜一同于转移缓冲液中浸 泡 10 m in~ 15 m in, 然后按照 1张海绵 - 3张滤纸 - 分 离胶 - PVDF膜 - 3张 滤纸 - 1张海绵 的排列顺序固 定于 夹子, 将夹子置 于电泳槽 后在冰浴 条件下恒 流 300 mA, 90 m in 转膜; 转膜后 小心取出 PVDF 膜并标 记, 用 PBST 洗涤 3次后放入封闭液中 4 e 过夜, 次日 弃封闭液, PVDF 膜用 PBST 洗涤 3次后, 往其正面加 入按 V (一 抗 ) BV ( 封 闭液 ) = 1B200稀 释的一 抗, 与 PVDF 膜室温作用 3 h 后用 PBST 洗涤 PVDF 膜 4 次, 然后往 PVDF 膜正面加入按 V (二抗 ) BV ( 封闭液 ) = 1B500稀释的二抗, 与 PVDF 膜室温作用 3 h后用 PBST 洗涤 PVDF 膜 10 m in后, 弃去 PBST, 向 PVDF 膜中加 入 DAB显色液显色 2 m in~ 3 m in, 用水漂洗, 拍照。
微流控芯片技术在化妆品功效评价中的应用
微流控芯片技术在化妆品功效评价中的应用组织胞进样、培养、分选、裂解和分离检测等过程集成于一块芯片上[4]。
三、细胞培养技术在化妆品功效评价中的应用细胞培养技术始于20世纪初，现己广泛应用于生物学、医学各个领域。
近年来，人们对化妆品的要求从以美容为主转向美容与护理并重，进一步发展到以科学护理为主，兼顾美容的效果。
基于安全性、功能性和自然性的“绿色化妆品”的开发成为当前化妆品发展的一大趋势。
目前，化妆品科学己渗透到生物学、化学、药学、皮肤生理学等领域。
生物技术以其自身的优势及强大的生命力自然介入到了化妆品工业的发展中，细胞培养技术具有经济、快速的特点，既可用来毒性分析，也可进行功能测试，是保证化妆品安全、有效的必要手段，自然也成为化妆品功效评价的手段。
细胞培养是指从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行孵育培养，使之生存并增殖。
动物细胞培养技术可模拟人体内的生理环境，研究细胞与细胞之间的反应，细胞与间质之间的反应等，为皮肤生理学、病毒学、免疫学等提供了技术基础。
目前许多功能性化妆品中人多采用了天然动植物提取物，以达到美白、抗衰老、祛斑、抗过敏等功效，这就需对活性原料进行预筛选。
四、微流控芯片细胞实验室在化妆品功效评价中的应用成纤维细胞是皮肤真皮中的主体细胞成分，它与自身分泌的胶原纤维、弹性纤维及基质成分一同构成了真皮的主体[5]。
成纤维细胞的主要功能是：合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、基质大分子物质和某些生长因子，成纤维细胞还具有黏附特性和趋化性，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用，成纤维细胞的减少也是引起皱纹产生的重要原因。
已有大量的研究证明成纤维细胞因其特有的生物学特性改变，在皮肤老化过程中扮演着重要角色[6]。
我们将成纤维细胞在微流控芯片实验室内进行培养，可以直观地观察功效添加剂对细胞生长形态的影响，快速测定于抗衰老功效检测的靶位点羟脯氨酸的含量、I型胶原纤维的含量，达到对化妆品原料快速、高效、高通量的筛选评价[7-8]。
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摘要: 采用十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SD S- PAGE )、免疫印迹法 ( W B)和噻唑蓝 ( M TT )比色法对 化妆品中
表皮生长因子 ( EGF )进行快速 检测。 得到 SD S- PAG E 和 W B 的检 出限 分别 为 01 500 mg /L 和 01 005 mg /L; 样品 1中
肤有显著的生物活性, 市场上含 EGF 的化妆品也日益 增多, 主要有水剂、啫喱和膏霜等。文献 [ 2] 报道添加 质量分数为 1 @ 10- 6% ~ 1 @ 10- 4% 的 EG F 能起到生 物活肤作用。 EGF 添加 量太少, 达 不到其生物活 性, 添加量过多, 增加生产成本。因此作者对水剂、啫喱的 EGF 类化妆品联合采用十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰 胺凝胶电泳 ( SDS- PAGE ) 、免疫印迹法 ( WB ) 和噻唑 蓝 (MTT) 比色法 进行快 速鉴定 分析, 为进 一步建 立 EGF 类化妆品的检测方法和规范化妆品生产及质量 控制提供实验依据。
CH EN K e1, GUO D i1, SU Zhi- jian2, ZHENG W e i- dong1, HUANG Y a- dong2, X IANG Q i2 ( 11G uangdong P rov ince F oods and Cosme tics T esting Center Company L im ited, G uangzhou, G uangdong 510663, Ch ina;
建立 EGF 类化妆品的质量标准提供实验依据。
关键词: 化妆品; 表皮生长因子; 检测
中图分类号: TQ658
文献标识码: A
文章编号: 1001- 1803( 2010) 01- 0067- 04
Rapid detection of epiderm al grow th factor in cosm etics
EGF 质量浓度约为 2 m g /L, 样品 2 中 EGF 质 量分 数 约为 10 L g /g; M TT 检 测 样品 1 和样 品 2 中 EGF 的 活性 分 别为
11 14 @ 104 IU /mL和 1197 @ 105 IU /g。结果表明, 采用 SDS- PAG E、W B、M TT 比色法快速检测化妆品中的 EGF 可行, 可为
SDS- PAGE 电泳结束后, 去除浓缩胶 [ 10] , 取出分 离胶 标记 后 用 转 移 缓 冲 液 室温 浸 泡 30 m in, 并 取 PVDF 膜先在蒸馏水中浸泡 5 m in后置于甲醇中充分 湿润 15 m in, 同时取 2张和 6张与分离胶大小等同的 海绵、滤纸与润湿的 PVDF 膜一同于转移缓冲液中浸 泡 10 m in~ 15 m in, 然后按照 1张海绵 - 3张滤纸 - 分 离胶 - PVDF膜 - 3张 滤纸 - 1张海绵 的排列顺序固 定于 夹子, 将夹子置 于电泳槽 后在冰浴 条件下恒 流 300 mA, 90 m in 转膜; 转膜后 小心取出 PVDF 膜并标 记, 用 PBST 洗涤 3次后放入封闭液中 4 e 过夜, 次日 弃封闭液, PVDF 膜用 PBST 洗涤 3次后, 往其正面加 入按 V (一 抗 ) BV ( 封 闭液 ) = 1B200稀 释的一 抗, 与 PVDF 膜室温作用 3 h 后用 PBST 洗涤 PVDF 膜 4 次, 然后往 PVDF 膜正面加入按 V (二抗 ) BV ( 封闭液 ) = 1B500稀释的二抗, 与 PVDF 膜室温作用 3 h后用 PBST 洗涤 PVDF 膜 10 m in后, 弃去 PBST, 向 PVDF 膜中加 入 DAB显色液显色 2 m in~ 3 m in, 用水漂洗, 拍照。
第 40卷第 1期 2010年 2月
日用 化 学工 业
Ch ina Surfactant D etergent& Cosm etics
V o.l 40 N o. 1 F eb. 2010
化妆品中表皮生长因子的快速检测
陈 科 1, 郭 狄 1, 苏志坚 2, 郑伟东 1, 黄亚东 2, 项 琪 2
( 11 广东省保化检测中心有限公司, 广东 广 州 510663; 21 暨 南大学 医药生物技术研究开发中心, 广东 广州 510630)
收稿日期: 2009- 08- 18; 修回日期: 2009- 11- 23 基金项目: 广州市科技计划资助项目 ( 2007Z3- E 0641 ); 佛山市科技发展专项资金资助项目 ( 200702009) 作者简介: 陈 科 ( 1982- ) , 女 ( 汉 ) , 广东人, 助理工程师, 电话: 13570207407, E- m ai:l k e_chen273@ 1631 com。 通讯联系人: 项 琪, 助理研究员, 电话: ( 020 ) 85563234, E - m ai:l xiangq@i 1261 com。
21 B iopharm aceutical R&D Cente r o f Jinan U n iversity, G uangzhou, G uangdong 510630, Ch ina)
Abstract: M ethods adopting sod ium dodecy l sulfate - polyacry lam ide gel electrophoresis ( SDS - PAGE ), W estern B lot ing ( WB ) and MTT for rap id detection o f epiderm al g row th factor ( EGF ) in cosm et ics w ere estab lished. The m inim um detect ion lim it of SDS - PAGE and W B is 01500 m g /L and 01005 m g /L respective ly1T he EGF content in sam ple 1 is about 2 m g /L and the EGF content in sam p le 2 is about 10 Lg /g; the EGF activ ity, detected by MTT, o f sam p le 1 and sam ple 2 is 1114 @ 104 IU /mL and 1197 @ 105 IU /g respect ive ly1T he results show ed that the m ethod can prov ide a basis fo r the estab lishm ent o f qua lity standard o f EGF in cosm et ics. K ey w ord s: cosm etics; ep iderm a l grow th factor; rapid detection
114 EGF 检定方法
11411 SDS- PAGE测定 按照 BIO- RAD 公司蛋白 质电泳仪说明 书安装
好仪器。配制 SDS质量分数 16% 的分离胶溶液, 待分 离胶完全聚合后, 配制 SDS质量分数 6% 的浓缩胶溶 液, 插入样品梳, 待浓缩胶溶 液完全聚合后拔 出样品 梳, 将电极缓冲液注满电泳槽前后槽, 在供试品孔中依 次加入 5 LL 蛋白 M arker, 10 LL 不同浓度的 11311配 制的 EGF 标准品及 10 LL 的 11312 配制的样品 1 和 样品 2, 连接好电源, 按 30 mA, 90 m in 恒流方式进行 电泳。电泳停止后, 取出凝胶进行银染分析 [ 9] 。 11412 W B测定
准确吸取 100 LL 样品 1, 加入 100 LL 的上样缓冲 溶液充分混匀, 100 e 煮沸 10 m in后, 12 000 r /m in离 心 10 m in, 取上清液待用; 称取样品 2约 110 g, 加入 500 LL 体积分数 50% 三氯醋酸后 [ 8 ] , 10 000 r /m in离 心 10 m in, 弃上清液后, 用 1 mL 的无水乙醇洗涤沉淀, 于 10 000 r/m in离心 10 m in, 弃上清液后用无水乙醇 洗涤沉淀并离心重 复操作 3次, 沉淀用 1 mL 的 PBS 溶解后, 从中吸取 400 LL, 再加 100 LL 上样缓冲溶液 后充分混 匀, 100 e 煮 沸 10 m in, 12 000 r /m in 离 心 10 m in, 取上清液待用。
肤新生细胞替代衰老细胞的进程, 使皮肤年轻化, EGF
含量的多少直接影响皮肤细胞的生长分化速度。 EGF 在化妆品中的作用 [ 4 ] 主要表现在护肤、修护 [ 5] , 抗皱、 防衰老 [ 6] , 美白、祛斑, 防晒及晒后 修复, 抑制 粉刺和
青春痘生长、去除斑痕, 护发、养发。正因为 EGF 对皮
113 样品制备
11311 标准品溶液的制备 分别准确吸取浓度为 012 g /L 的 EGF 标准溶液,
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加入上样缓冲溶液充分混匀后按倍比稀释 [ 7] , 使得终 浓 度 分 别 为 01005 m g /L, 01050m g /L, 01500 mg /L, 51000 m g /L, 101000 m g /L 和 501000 m g /L, 于 100 e 煮沸 10 m in后, 12 000 r /m in离心 10 m in待用。 11312 供试品溶液的制备
表皮生长因子 ( EGF ) 类化妆品是将表皮生长因子 作为生物活性添加剂, 与稳定剂复配后并按一定的比
例添加到化妆品中, 它是生物工程技术及其制品在化 妆品制造领域的渗透和应用 [ 1] 。 EG F 是 1962年美国 科学家 发现的 一种可 促使皮 肤细胞 生长 的成分 [ 2] , EGF 通过与细胞膜上受体结合并激活受体 [ 3 ] , 加速皮
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