化妆品中表皮生长因子的快速检测

CH EN K e1, GUO D i1, SU Zhi- jian2, ZHENG W e i- dong1, HUANG Y a- dong2, X IANG Q i2 ( 11G uangdong P rov ince F oods and Cosme tics T esting Center Company L im ited, G uangzhou, G uangdong 510663, Ch ina;
建立 EGF 类化妆品的质量标准提供实验依据。
关键词: 化妆品; 表皮生长因子; 检测
中图分类号: TQ658
文献标识码: A
文章编号: 1001- 1803( 2010) 01- 0067- 04
Rapid detection of epiderm al grow th factor in cosm etics
SDS- PAGE 电泳结束后, 去除浓缩胶 [ 10] , 取出分 离胶 标记 后 用 转 移 缓 冲 液 室温 浸 泡 30 m in, 并 取 PVDF 膜先在蒸馏水中浸泡 5 m in后置于甲醇中充分 湿润 15 m in, 同时取 2张和 6张与分离胶大小等同的 海绵、滤纸与润湿的 PVDF 膜一同于转移缓冲液中浸 泡 10 m in~ 15 m in, 然后按照 1张海绵 - 3张滤纸 - 分 离胶 - PVDF膜 - 3张 滤纸 - 1张海绵 的排列顺序固 定于 夹子, 将夹子置 于电泳槽 后在冰浴 条件下恒 流 300 mA, 90 m in 转膜; 转膜后 小心取出 PVDF 膜并标 记, 用 PBST 洗涤 3次后放入封闭液中 4 e 过夜, 次日 弃封闭液, PVDF 膜用 PBST 洗涤 3次后, 往其正面加 入按 V (一 抗 ) BV ( 封 闭液 ) = 1B200稀 释的一 抗, 与 PVDF 膜室温作用 3 h 后用 PBST 洗涤 PVDF 膜 4 次, 然后往 PVDF 膜正面加入按 V (二抗 ) BV ( 封闭液 ) = 1B500稀释的二抗, 与 PVDF 膜室温作用 3 h后用 PBST 洗涤 PVDF 膜 10 m in后, 弃去 PBST, 向 PVDF 膜中加 入 DAB显色液显色 2 m in~ 3 m in, 用水漂洗, 拍照。
第 40卷第 1期 2010年 2月
日用 化 学工 业
Ch ina Surfactant D etergent& Cosm etics
V o.l 40 N o. 1 F eb. 2010
化妆品中表皮生长因子的快速检测
陈 科 1, 郭 狄 1, 苏志坚 2, 郑伟东 1, 黄亚东 2, 项 琪 2
( 11 广东省保化检测中心有限公司, 广东 广 州 510663; 21 暨 南大学 医药生物技术研究开发中心, 广东 广州 510630)
表皮生长因子 ( EGF ) 类化妆品是将表皮生长因子 作为生物活性添加剂, 与稳定剂复配后并按一定的比
例添加到化妆品中, 它是生物工程技术及其制品在化 妆品制造领域的渗透和应用 [ 1] 。 EG F 是 1962年美国 科学家 发现的 一种可 促使皮 肤细胞 生长 的成分 [ 2] , EGF 通过与细胞膜上受体结合并激活受体 [ 3 ] , 加速皮
21 B iopharm aceutical R&D Cente r o f Jinan U n iversity, G uangzhou, G uangdong 510630, Ch ina)
Abstract: M ethods adopting sod ium dodecy l sulfate - polyacry lam ide gel electrophoresis ( SDS - PAGE ), W estern B lot ing ( WB ) and MTT for rap id detection o f epiderm al g row th factor ( EGF ) in cosm et ics w ere estab lished. The m inim um detect ion lim it of SDS - PAGE and W B is 01500 m g /L and 01005 m g /L respective ly1T he EGF content in sam ple 1 is about 2 m g /L and the EGF content in sam p le 2 is about 10 Lg /g; the EGF activ ity, detected by MTT, o f sam p le 1 and sam ple 2 is 1114 @ 104 IU /mL and 1197 @ 105 IU /g respect ive ly1T he results show ed that the m ethod can prov ide a basis fo r the estab lishm ent o f qua lity standard o f EGF in cosm et ics. K ey w ord s: cosm etics; ep iderm a l grow th factor; rapid detection
114 EGF 检定方法
11411 SDS- PAGE测定 按照 BIO- RAD 公司蛋白 质电泳仪说明 书安装
好仪器。配制 SDS质量分数 16% 的分离胶溶液, 待分 离胶完全聚合后, 配制 SDS质量分数 6% 的浓缩胶溶 液, 插入样品梳, 待浓缩胶溶 液完全聚合后拔 出样品 梳, 将电极缓冲液注满电泳槽前后槽, 在供试品孔中依 次加入 5 LL 蛋白 M arker, 10 LL 不同浓度的 11311配 制的 EGF 标准品及 10 LL 的 11312 配制的样品 1 和 样品 2, 连接好电源, 按 30 mA, 90 m in 恒流方式进行 电泳。电泳停止后, 取出凝胶进行银染分析 [ 9] 。 11412 W B测定
准确吸取 100 LL 样品 1, 加入 100 LL 的上样缓冲 溶液充分混匀, 100 e 煮沸 10 m in后, 12 000 r /m in离 心 10 m in, 取上清液待用; 称取样品 2约 110 g, 加入 500 LL 体积分数 50% 三氯醋酸后 [ 8 ] , 10 000 r /m in离 心 10 m in, 弃上清液后, 用 1 mL 的无水乙醇洗涤沉淀, 于 10 000 r/m in离心 10 m in, 弃上清液后用无水乙醇 洗涤沉淀并离心重 复操作 3次, 沉淀用 1 mL 的 PBS 溶解后, 从中吸取 400 LL, 再加 100 LL 上样缓冲溶液 后充分混 匀, 100 e 煮 沸 10 m in, 12 000 r /m in 离 心 10 m in, 取上清液待用。
摘要: 采用十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SD S- PAGE )、免疫印迹法 ( W B)和噻唑蓝 ( M TT )比色法对 化妆品中
表皮生长因子 ( EGF )进行快速 检测。 得到 SD S- PAG E 和 W B 的检 出限 分别 为 01 500 mg /L 和 01 005 mg /L; 样品 1中
113 样品制备
11311 标准品溶液的制备 分别准确吸取浓度为 012 g /L 的 EGF 标准溶液,
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加入上样缓冲溶液充分混匀后按倍比稀释 [ 7] , 使得终 浓 度 分 别 为 01005 m g /L, 01050m g /L, 01500 mg /L, 51000 m g /L, 101000 m g /L 和 501000 m g /L, 于 100 e 煮沸 10 m in后, 12 000 r /m in离心 10 m in待用。 11312 供试品溶液的制备
收稿日期: 2009- 08- 18; 修回日期: 2009- 11- 23 基金项目: 广州市科技计划资助项目 ( 2007Z3- E 0641 ); 佛山市科技发展专项资金资助项目 ( 200702009) 作者简介: 陈 科 ( 1982- ) , 女 ( 汉 ) , 广东人, 助理工程师, 电话: 13570207407, E- m ai:l k e_chen273@ 1631 com。 通讯联系人: 项 琪, 助理研究员, 电话: ( 020 ) 85563234, E - m ai:l xiangq@i 1261 com。
肤有显著的生物活性, 市场上含 EGF 的化妆品也日益 增多, 主要有水剂、啫喱和膏霜等。文献 [ 2] 报道添加 质量分数为 1 @ 10- 6% ~ 1 @ 10- 4% 的 EG F 能起到生 物活肤作用。 EGF 添加 量太少, 达 不到其生物活 性, 添加量过多, 增加生产成本。因此作者对水剂、啫喱的 EGF 类化妆品联合采用十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰 胺凝胶电泳 ( SDS- PAGE ) 、免疫印迹法 ( WB ) 和噻唑 蓝 (MTT) 比色法 进行快 速鉴定 分析, 为进 一步建 立 EGF 类化妆品的检测方法和规范化妆品生产及质量 控制提供实验依据。
112 溶液的配制
上样缓冲溶液: 分别称取 T ris 3 g, SDS 10 g, 溴酚 兰 015 g, 加水溶解 后加入甘油 50 m L、B- 巯 基乙醇 5 mL, 调节溶液的 pH = 618, 定容到 100 mL; 转移缓冲 液: 分别称取甘氨酸 219 g, T ris 518 g, SDS 317 g, 加水 溶解后, 加入甲醇 012 mL, 用水定容至 1 000 mL, 4 e 保存; PBS: 分别称取氯化钠 8 g, 氯化钾 012 g, 磷酸氢 二钠 1144 g, 磷酸二氢钾 0124 g, 加水溶解并 稀释至 1 000 mL, 经 121 e , 15 m in 灭菌; PBST: 吸取吐 温 20 011 mL, 用 PBS溶解并稀释, 调节溶液 pH = 714, 定 容至 100 mL; 电泳缓冲液: 分别称取 T ris 15 g, 甘氨酸 94 g, SDS 5 g, 加水溶解并稀释至 1 000 mL; 封闭液: 称 取脱脂奶粉 5 g, 加 入 PBST 溶解并 稀释至 100 mL; DAB显色液: 分别称取 T ris 112 g, DAB 01000 4 g, 氯 化镍 013 g, 加水溶解后, 加入过氧化氢 3 mL, 用 H C l 调节溶液 pH = 716, 用水定容至 100 m L。
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日用化学工业
第 40卷
1 实验部分
111 主要试剂与仪器
EGF 标准品, 012 g /L, 深圳华生园基因工程发展 有限公司; 兔抗人 EGF 多克隆抗体, 一抗, 500 Lg /支, 美国 SANTA 公 司; 辣根过氧化物酶标 记的山羊抗兔 lgG抗体, 二抗, 2 g /L, 威佳科技有限公司; 小分子预染 蛋白 M arker, 北京鼎国生物责任有限公司; 丙烯酰胺, N, Nc- 亚甲双丙烯酰胺, 十二烷基磺酸钠 ( SDS), 聚偏 氟乙烯膜 ( PVDF 膜 ) , 胰蛋白酶, 噻唑蓝 ( MTT ) , 三羟 甲基氨基 甲烷 ( T ris), 3, 3 - 二 氨基联 苯胺 ( DAB ), S igm a Co1L td; Balb / c 3T 3细胞, 暨南大学医药生物研 究开发中 心; RPM I- 1640 培养基, G IBCO Co1L td; 青 霉素、链霉素, 华北制药厂; 胎牛血清 ( FBS), 杭州四季 青生物工程材料有限公司; 其他试剂均为分析纯; 美丽 活肤 时 空 EGF 原 液 ( 样 品 1 ) , 100 m L /支, 批 号: 090208, 赢美溢利生物制品 有限公司; P ro - Skin EGF 啫喱 (样品 2) , 100 g /瓶, 批号: 090113, 京美佳化妆品 有限公司。蛋白质电泳仪, B IO - RAD Co1L td; CO2 培 养箱, T herm o Form a Co1L td; 超净工作台, 苏净集团有 限公司; CK - 40型倒置显微镜, OLym pus Co1L td; 冷冻 离心机, S igm a Co1L td; 酶标仪 680, BIO- RAD Co1L td; 96孔板, Costar Co1L td。
EGF 质量浓度约为 2 m g /L, 样品 2 中 EGF 质 量分 数 约为 10 L g /g; M TT 检 测 样品 1 和样 品 2 中 EGF 的 活性 分 别为
11 14 @ 104 IU /mL和 1197 @ 105 IU /g。结果表明, 采用 SDS- PAG E、W B、M TT 比色法快速检测化妆品中的 EGF 可行, 可为
肤新生细胞替代衰老细胞的进程, 使皮肤年轻化, EGF
含量的多少直接影响皮肤细胞的生长分化速度。 EGF 在化妆品中的作用 [ 4 ] 主要表现在护肤、修护 [ 5] , 抗皱、 防衰老 [ 6] , 美白、祛斑, 防晒及晒后 修复, 抑制 粉刺和
青春痘生长、去除斑痕, 护发、养发。正因为 EGF 对皮