脱氧核糖核酸酶酶活力检测方法》标准编制说明
标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明)
标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法（编制说明）标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明)核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法编制说明(征求意见稿)一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会《二О一五年国家标准制修订项目》，项目编号“20154060-T-424”。
本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2016年完成。
本标准起草工作组由中国标准化研究院、浙江工商大学、河北农业大学等单位共同组成。
二、目的及意义核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶，其本质均是蛋白质。
但是不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。
有些核酸酶只能作用于底物RNA，通常称为核糖核酸酶(RNase)，有些核酸酶只能作用于底物DNA，称为脱氧核糖核酸酶(DNase)，核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶统称为核酸酶(Nuclease)。
核糖核酸酶是一类广泛存在于动植物体内的核酸水解酶，从20世纪60年代以来一直作为一种模型蛋白被普遍用于分子生物学研究。
RNase家族包括RNase A、RNase B、RNase C、RNase H、S-RNase、RNase P、RNase T等，主要生理功能是控制细胞内RNA的种类与数量分布，除参与核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解等过程外，还与某些植物的自交不亲和性、器官发生、宿主的防御机制、控制肿瘤血管生成、杀灭肿瘤细胞及抑制病毒复制等有关。
其中核糖核酸酶A一般被认为是核糖核酸酶的典型代表，分子量约为13.64 kDa，通过X射线衍射和质谱分析结果表明，它的空间结构呈肾形分布，见图1。
脱氧核糖核酸酶是将单链或双链DNA同等程度地随机分解，生成具有5'-P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。
脱氧核糖核酸酶的主要用途包括制备不含DNA的RNA样品;RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染;体外T7, T3,,1/15,标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明) SP6等RNA Polymerases催化的RNA转录后去除DNA模板;DNase I Foot printing 研究DNA-蛋白质相互作用;缺口平移(Nick translation);产生DNA随机片段文库;细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照等。
PfAgo核酸内切酶活性检测方法-最新国标
Pf Ago核酸内切酶活性检测方法1范围本文件描述了Pf Ago核酸内切酶活性的检测方法。
本文件适用于Pf Ago核酸内切酶活性的检测。
2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T191-2008包装储运图示标志GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法。
3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
3.1Pf Ago核酸内切酶Pf Ago endonucleasePf Ago核酸内切酶是一种依托向导DNA序列（guide DNA，gDNA）与靶核酸序列碱基互补配对，继而特异识别并剪切靶核酸的核酸内切酶。
3.2Pf Ago核酸内切酶活性单位activity unit of Pf Ago endonuclease在25μL反应体积中，95℃条件下反应，每分钟剪切0.1nmol单链靶核酸DNA所需的Pf Ago蛋白量，定义为一个活性单位(U)。
4原理Pf Ago核酸内切酶是一种依托向导DNA序列（guide DNA，gDNA）与靶核酸序列碱基互补配对，继而特异识别并剪切靶核酸的核酸内切酶，其可以在5’磷酸化的单链gDNA(大于15nt)引导下剪切与gDNA互补的单链DNA底物，从而发挥核酸内切酶作用。
剪切位点常发生在底物与gDNA互补序列的第10位和11位之间的磷酸二酯键处。
根据Pf Ago核酸内切酶的作用原理，在25μL反应体积，95℃反应条件下，单位时间内消耗0.1nmol单链靶核酸DNA的Pf Ago蛋白量来进行活性测定。
5试剂或材料5.1水符合GB/T6882规定的RNase-free超纯水。
5.21mol/L Tris-HCl（pH8.0）按配制所需量，用分析天平称取Tris12.114g，加入80mL超纯水中，充分混匀后用6M盐酸调至pH值8.0±0.05，加入超纯水定容至100.0mL，并用0.22μm微孔滤膜对其过滤，存储于2～8℃，储存期限为24个月。
udg酶标准
udg酶标准UDG酶标准是一种用于检测DNA污染的重要工具。
UDG（Uracil-DNA Glycosylase）是一种能够识别和剪切含有尿嘧啶（U）的DNA分子的酶。
在PCR反应中，如果使用的DNA模板中含有未被完全去除的前一次PCR产物或外源DNA污染物，将会对后续实验产生负面影响。
因此，准确测定和控制PCR反应中的DNA污染是非常重要的。
UDG酶标准的目的是通过定量测定PCR反应中的DNA污染程度，为后续的实验提供准确可靠的数据。
UDG酶标准的使用方法非常简便，下面将介绍一种常用的实验步骤。
首先，准备实验所需的材料和试剂。
包括PCR反应液、UDG酶标准、逆转录酶、引物和试管。
确保所有试剂的质量和纯度都符合实验要求。
接下来，进行PCR反应。
根据实验需要设计好PCR反应的引物和温度条件，将待测的DNA模板与引物一起加入PCR反应液中，进行PCR扩增。
扩增结束后，将PCR产物取出，加入逆转录酶和逆转录缓冲液，进行反转录反应。
这一步的目的是将RNA转化为cDNA，以便后续的定量测定。
反转录反应完成后，加入UDG酶标准和UDG缓冲液。
UDG酶标准是一种已知浓度的UDG酶，它能够切割含有尿嘧啶的DNA分子。
根据UDG酶标准的浓度，可以推断出PCR反应中的DNA污染程度。
将反应混匀后，孵育一段时间，然后加入酶停止液停止反应。
将反应液离心，将上清液转移到新的试管中，准备进行下一步的测定。
最后，利用合适的测定方法，如荧光定量PCR或比色法，测定PCR反应中的DNA污染程度。
根据UDG酶标准的浓度，可以通过测定样品的信号强度，计算出样品中的DNA污染程度。
UDG酶标准的应用有助于准确评估PCR反应中的DNA污染程度，为后续实验提供可靠的数据基础。
通过合理的实验设计和标准操作流程，可以有效避免实验结果的偏差和误差，提高实验的准确性和可重复性。
总之，UDG酶标准是一种重要的实验工具，用于定量测定PCR反应中的DNA 污染程度。
DNase I 脱氧核糖核酸酶
ü 必须在加热之前加入终止溶液（20 mM EGTA）以防止金属（Mg/Ca）离子催化水解 RNA。在 70°C 加热 10 分钟使 DNA 酶 I 和 RNA 变性。
DNase 活性。
质检结果： 泳道 1：Marker 泳道 2：阴性对照（无 DNase I） 泳道 3：DNA + 1 单位 DNA 酶 I. 泳道 4：DNA + 2 单位 DNA 酶 I. 泳道 5：DNA + 3 单位 DNA 酶 I.
Sangon 泳道1 泳道 2 泳道 3 泳道 4 泳道 5
DNase I 脱氧核糖核酸酶
产品编号 : A610099 包装规格：250 MG / 1 G / 5 G
产品说明: 脱氧核糖核酸酶 I（A610099）是来源于牛胰腺的核酸内切酶，在二价阳离子存在的情况下会降解双链 DNA，生成 3'-OH
寡核苷酸。Mg2+存在条件下，DNase I 可以剪切双链 DNA 位点形成切口，而在 Mn2+存在条件下，DNase I 可以剪切 DNA 的 双链。
抑制剂：EGTA；EDTA；盐浓度> 100 mM 会降低 DNase 活性。
io 分子量：31,000 道尔顿。 B 必备：Ca2+和 Mg2+或 Mn2+
来源：牛胰腺。
n 储存温度：-20°C 储存。避免频繁的温度变化。请参阅产品信息标签上的有效期。 o 终止溶液：20 mM EGTA（pH 8.0）。
脱氧核糖核酸酶活力检测方法
脱氧核糖核酸酶活力检测方法编制说明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会《二О一五年国家标准制修订项目》，项目编号“-T-424”。
本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2016年完成。
本标准起草工作组由中国标准化研究院、浙江工商大学、河北农业大学等单位共同组成。
二、标准制定的背景及意义核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶，其本质是蛋白质。
不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。
有些核酸酶只能作用于核糖核酸（RNA），称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于脱氧核糖核酸（DNA），称为脱氧核糖核酸酶（DNase），核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶统称为核酸酶（Nuclease）。
脱氧核糖核酸酶是将单链或双链DNA同等程度地随机分解，生成具有5'-P 末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。
脱氧核糖核酸酶具有重要的功能，目前主要用途包括制备不含DNA的RNA样品；RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染；体外T7, T3, SP6等RNA Polymerases催化的RNA 转录后去除DNA模板；DNase I Foot printing研究DNA-蛋白质相互作用；缺口平移（Nick translation）；产生DNA随机片段文库；细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照等。
脱氧核糖核酸酶I一般被认为是脱氧核糖核酸酶的典型代表，分子量约32 kDa。
由于脱氧核糖核酸酶具有重要的生理学作用，引起了国内外广泛的关注。
目前已经商业化生产和销售，但是作为脱氧核糖核酸酶的重要质量指标之一的酶的活力，根据文献调研显示相应的测定方法目前仍然没有形成统一的检测和分析标准，各生产和销售厂商对其活力的质量控制各自定义，同一种酶选用不同的活力测定方法结果显示大小差异显著。
这实际上已经成为脱氧核糖核酸酶产品可持续发展的瓶颈问题，给消费者造成了极大的不便。
检测脱氧核糖核酸酶的DNA探针、试剂盒和方法[发明专利]
![检测脱氧核糖核酸酶的DNA探针、试剂盒和方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/6884b429fe00bed5b9f3f90f76c66137ee064fc3.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201610076852.8(22)申请日 2016.02.03C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/34(2006.01)C12N 15/11(2006.01)(71)申请人广州市锐博生物科技有限公司地址510663 广东省广州市科学城科学大道182号创新大厦C3-13(72)发明人张必良 刘霭珊 曹亮克雷格·梅洛(74)专利代理机构广州华进联合专利商标代理有限公司 44224代理人万志香 胡杰(54)发明名称检测脱氧核糖核酸酶的DNA 探针、试剂盒和方法(57)摘要本发明提供一种检测脱氧核糖核酸酶活性的DNA 探针、试剂盒和方法，采用发夹状DNA 探针为脱氧核糖核酸酶的底物，探针的两端或内部分别标记上荧光基团及对应的荧光淬灭基团。
当探针结构完整时，荧光基团与淬灭基团位于同一个DNA 分子上，荧光基团被激发的荧光被淬灭基团吸收，荧光基团不发出荧光；而当探针被脱氧核糖核酸酶降解后，荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团能正常发出荧光。
采用实时定量PCR 仪检测反应体系中发出的荧光强度，即可判断反应体系中是否存在脱氧核糖核酸酶。
本方法可广泛用于生物制品中脱氧核糖核酸酶残留的质量检测，或用于脱氧核糖核酸酶定量测定。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书11页序列表2页 附图5页CN 105648062 A 2016.06.08C N 105648062A1.一种DNA探针，其特征在于,其包含有一个茎环结构，且2个末端或内部分别连接有能量供体基团和能量受体基团，能量供体基团和能量受体基团之间能进行能量转移,所述DNA 探针的碱基长度为15-50个核苷酸，且包含一个能被DNase切割的位点，被降解后的探针的能量供体基团和能量受体基团在不同的探针片段上；所述茎环结构中，其茎结构包括分别位于探针两端的5～15bp的回文互补序列，其环结构包括长度为5～20nt的核苷酸序列，探针退火后形成茎环结构，两个回文互补部分Tm值大于35℃。
乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量检测试剂注册技术审查指导原则
（五）主要原材料研究资料 应提供主要原材料如引物、探针、酶、标准品或企业参考品等的选 择与来源、制备过程、质量分析和质控标准等的相关研究资料。若主要 原材料为企业自己生产，其生产工艺必须稳定；如主要原材料源于外购， 应提供的资料包括：供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原 材料到货后的质量检验资料。 1.企业内部参考品的制备、定值过程。建议采用灭活病毒的血清/ 血浆建立参考品，不宜使用质粒。 2.核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证 资料。 3.聚合酶链反应（PCR）组分的主要材料（包括引物、探针、内标、 各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主 要包括以下内容： （1） 脱氧三磷酸核苷（dNTP） 核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP 和 dTTP，对纯度、 浓度、保存稳定性等的详细验证资料。 （2）引物 由一定数量的 dNTP 构成的特定序列，通常采用 DNA 合成仪人工合成， 合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，并对序列准确性、
细胞荧光定量脱氧核糖核酸多聚酶链式
细胞荧光定量脱氧核糖核酸多聚酶链式脱氧核糖核酸多聚酶链式反应，简称PCR，是一种用于扩增DNA片段的生物技术方法。
它是由美国生物学家基利斯和萨利斯在1983年发明的，也因此两人获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR技术通过酶的作用，可以在非常短的时间内扩增出特定DNA片段，使其数量呈指数级增加。
这项技术的发明，极大地加速了分子生物学的研究速度，也被广泛应用于医学诊断、犯罪科学、考古学等领域。
PCR技术是如何实现DNA片段的扩增的呢？它主要依赖于三个温度调节步骤。
首先是变性步骤，通过高温使DNA双链变性为两个单链；接着是退火步骤，降低温度时引物（两个特定序列的DNA）结合到目标DNA上；最后是延伸步骤，通过DNA聚合酶酶作用，合成新的DNA链。
通过这三个步骤反复循环，可以将目标DNA段扩增。
而在PCR扩增的实验中，需要对反应结果进行定量检测，这就需要用到细胞荧光定量技术。
在PCR反应结束后，通常是通过在洗脱物中加入特定标记的荧光探针，通过与目标DNA结合产生荧光信号。
然后利用光学分光度计或实时荧光定量PCR仪器来测量这些荧光信号，并且以此确定DNA的含量。
通过这项技术，可以非常准确地确定PCR 扩增出的DNA量，其灵敏度和精度非常高。
细胞荧光定量技术的应用不仅局限于PCR扩增反应，它还广泛应用于细胞培养、酶活性测定、蛋白质浓度检测等领域。
目前，基于PCR 技术的荧光定量技术已经成为分子生物学和临床实验室中广泛应用的一种方法。
不仅如此，PCR技术结合细胞荧光定量技术在微生物检测、临床诊断、基因测序等领域也具有重要的应用价值。
在临床诊断中，细胞荧光定量技术的应用使得疾病的诊断更为精准。
比如，在病毒感染的检测中，可以利用PCR技术扩增病毒RNA或DNA，然后通过细胞荧光定量技术准确地测量病毒的含量，从而确定感染情况。
这为病毒性疾病的早期预警和治疗提供了重要的参考数据。
另外，在基因测序中，PCR扩增的DNA片段，通过细胞荧光定量技术，可以用来确定DNA浓度，为后续的测序工作提供了重要的数据支持。
脱氧核糖核酸定量测定--改良二苯胺法
脱氧核糖核酸定量测定——改良二苯胺法一、目的学习用定糖法测定脱氧核糖核酸(DNA)的含量。
二、原理在强酸环境下加热，可以使DNA 中嘌呤碱与脱氧核间的糖苷键断裂。
因而DNA 酸解后生成嘌呤碱基、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸。
脱氧核糖在酸性条件下脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺作用后显示蓝色，在595毫微米有最大吸收。
用二苯胺法测定DNA 含量时灵敏度不高，待测样品中DNA 含量若低于50微克/毫升就难以测定。
如用乙醛增加二苯胺法测DNA 的发色量，并用乙酸戊酯把反应中形成的蓝色产物抽提到有机溶剂相内，如此进行测定灵敏度显著提高。
按此改良二苯胺法，待测样品中DNA 含量在10~150微克/毫升范围内，光密度与DNA 量成正比关系。
样品中含少量RNA不影响测定，而蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛亦能与二苯胺形成各种有色物质，故干扰测定。
三、实验材料，仪器和试剂1、实验材料DNA标准溶液：于分析天平上精确称取纯的鱼精DNA，并以水配成100微克/毫升的溶液(DNA 在水内较难溶，可隔夜配制)。
待测DNA：以水配成约50微克/毫升的溶液。
2、仪器移液管、72型分光光度计、电热恒温水浴箱、温度计3.试剂4%二苯胺冰醋酸溶液：20克二苯胺(分析纯)加少量冰醋酸(分析纯)微热至全部溶解后，再以冰醋酸定容到500毫升，只限当天使用。
0.16%乙醛水溶液:取40%乙醛0.4毫升,加水至100毫升。
20%过氯酸:71.4毫升70%过氯酸(HClO₄,分析纯)加水至250毫升。
乙酸戊酯(化学纯)或乙酸异戊酯(化学纯)。
四、操作步骤1、标准曲线制作按下表在各管内分别加入不同量的100微克/毫升DNA标准溶液，然后每管加水使体积均达2毫升。
向各管加入2毫升20%过氯酸与4毫升4%二苯胺冰醋酸溶液，混匀后再加0.2毫升0.16%乙醛水溶液并充分摇匀。
56₄保温一小时后，流动水冷却，并向各管反应混合液内加2毫升乙酸戊酯，试管加塞，剧烈振摇，使反应生成蓝色物质充分地被抽提到乙酸戊酯相内。
组织脱氧核酸聚合酶链反应检测
组织脱氧核酸聚合酶链反应检测全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：PCR技术的原理是在适当的温度下，通过特定的引物和DNA聚合酶，使目标DNA片段在体外快速扩增。
这种扩增能力使PCR在短时间内将DNA复制数以百万计，从而可以在很小的样本中检测到目标基因或病原体。
组织脱氧核酸聚合酶链反应检测有许多应用领域，其中包括但不限于以下几个方面：1.基因突变检测：PCR可以有效地对基因进行扩增，然后通过分析PCR产物的序列，对特定基因的突变进行检测，从而帮助人们了解一些遗传疾病的发生机制。
2.感染病原体检测：PCR可以在体外复制和扩增微生物的DNA或RNA，用来快速检测病原体，如病毒、细菌和真菌等，特别是在病原体存在量极少的情况下，PCR技术尤为重要。
3.药物敏感性检测：通过PCR技术可以检测一些临床中引起药物抗性的基因，进而根据检测结果合理地选择治疗方案，提高药物治疗的效果。
4.疾病诊断：PCR技术在许多疾病的早期诊断、预后判断和疗效监测中发挥着重要作用，如癌症、遗传性疾病等。
除了以上几个方面，PCR技术还可以在遗传学研究、食品安全监测、法医学鉴定等领域得到广泛应用。
在实际操作中，PCR技术的操作流程通常包括以下几个步骤：1. 提取DNA：首先需要从样本中提取目标DNA，可以是血液、唾液、组织等。
2. 引物设计：根据目标基因的序列设计两个特定的引物，这两个引物分别位于待扩增DNA片段的两端。
3. PCR扩增：在PCR反应管中，将目标DNA片段与引物和聚合酶加入，按照一定的温度循环扩增。
4. PCR产物分析：通过凝胶电泳、荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析，检测目标基因是否存在或其数量。
PCR技术的应用在生物医学领域有着重要的意义，但也存在一些局限性，如PCR扩增是通过复制DNA来检测目标基因，所以可能会受到污染的干扰，PCR技术对反应条件的要求比较严格，在操作不当的情况下容易造成假阳性或假阴性的结果。
脱氧核糖核酸采样操作流程及评分标准
脱氧核糖核酸采样操作流程及评分标准一、脱氧核糖核酸采样操作流程脱氧核糖核酸（DNA）采样是分子生物学研究中一个重要的步骤，用于提取目标生物体中的DNA分子，并进行后续的实验操作。
以下是脱氧核糖核酸采样的操作流程：1. 样品准备：a. 根据实验需求，选择合适的组织、细胞或体液样品。
样品可以是血液、组织切片、唾液等。
b. 将样品储存在合适的冷藏条件下，确保DNA的稳定性。
c. 若样品经过冷冻保存，请在采样前将其充分解冻。
2. 细胞破碎：a. 将待采样的组织或细胞等加入离心管中。
b. 加入1X细胞裂解缓冲液和蛋白酶K，进行细胞破碎。
缓冲液中通常含有盐、EDTA等成分，能够破坏细胞膜和核膜，释放DNA。
c. 缓冲液中的蛋白酶K可降解细胞蛋白，避免其对DNA的影响。
3. DNA纯化：a. 加入等体积的酚/氯仿混合液，进行DNA的萃取。
酚/氯仿是一种用于分离DNA和蛋白质的有机试剂。
b. 轻轻摇晃离心管使两种液体充分混合。
c. 离心架上离心管，使混合液两相分离。
DNA会在两相交界处形成一个清晰的层。
d. 将DNA层转移到干净的离心管中，避免携带上层的蛋白质和底层的碎细胞。
4. DNA沉淀：a. 加入相应体积的冷乙醇，使DNA沉淀。
乙醇中的离子浓度高于DNA层，可以促进DNA的沉淀。
b. 用转管架离心，沉淀DNA。
c. 倒去上清液，留下DNA沉淀。
5. DNA洗涤：a. 加入70%乙醇，洗涤DNA沉淀。
乙醇用来去除沉淀中的盐等杂质。
b. 离心沉淀一定时间，倒去上清液，避免沉淀流失。
6. 重溶：a. 加入适量的TE（Tris）缓冲液，使DNA重溶。
TE缓冲液能够稳定DNA并提供合适的pH值。
b. 倒置离心管若干次，使DNA溶解均匀。
7. DNA浓度测定：a. 通过分光光度计或荧光检测仪等设备测定DNA的光吸收或荧光强度，来评估DNA的浓度。
二、脱氧核糖核酸采样评分标准脱氧核糖核酸采样的质量对于后续实验的结果具有重要的影响。
酶活力的测定-国标
木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1. 三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。
2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。
吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。
3. 氢氧化钠溶液（20g/L）称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。
待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。
4. 盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。
0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。
5. 酪蛋白溶液（10.0g/L）称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。
冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。
使用前重新确认并调整pH至规定值。
二、分析步骤1. 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。
L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。
表1 L-酪氨酸标准溶液分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。
以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。
利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。
其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。
2. 样品的测定待测酶液的制备：称取酶样品1g。
然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。
测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。
脱氧核糖含量测定方法
脱氧核糖含量测定方法
脱氧核糖（deoxyribose）的含量可以通过以下方法进行测定：
1. 雌三醇氧化法：将样品与雌三醇反应生成紫色结晶，并用分光光度计测定吸光度，从而测定脱氧核糖的含量。
2. 核酸染色法：将样品与特定染料（如苏木精、吖啶橙等）结合，形成特定的染色复合物，通过光谱或荧光光度计测定复合物的吸光度或荧光强度，进而确定脱氧核糖的含量。
3. 红外光谱法：将样品制备成样品盘，使用红外光谱仪进行测定，脱氧核糖的含量可以通过其在红外光谱图谱中的特征峰值进行定量分析。
4. 比色法：利用脱氧核糖的还原性与某些金属离子（如铁离子）的氧化性反应生成比色产物，通过比色计测定产物的吸光度，从而确定脱氧核糖的含量。
需要注意的是，不同的测定方法有其各自的优缺点，适用于不同的研究目的和实验条件。
因此，在选择测定方法时应根据实际情况综合考虑。
关于原料药中酶残留限度药典检测方法
关于原料药中酶残留限度药典检测方法在药物生产过程中，原料药的质量直接影响到药物的稳定性和疗效。
而酶残留限度则是影响原料药质量的重要因素之一。
为了保证原料药的质量，药典检测方法是必不可少的。
本文将会按类介绍一些关于原料药中酶残留限度的药典检测方法。
一、酰胺酶测定法酰胺酶是一类针对酰胺键进行水解的酶，常用在药物合成反应中。
酰胺酶测定法是通过对原料药中残留的酰胺酶进行检测来判断原料药的质量。
该方法的原理是将待检测的药物与酰胺酶反应，测定反应前后的酶活力差值。
酶活力差值与待检测药物中酶的残留量成正比。
二、脱氧核糖核酸酶测定法脱氧核糖核酸酶是一类酶，它主要作用是水解脱氧核糖核酸（DNA）。
在药物生产过程中，脱氧核糖核酸酶的残留会影响到药物的稳定性和疗效。
因此，脱氧核糖核酸酶测定法是判断原料药中酶残留的一种方法。
该方法的原理是将待检测的样品与脱氧核糖核酸进行反应，测定反应前后脱氧核糖核酸的降解程度。
脱氧核糖核酸降解程度与药物中脱氧核糖核酸酶的残留量成正比。
三、葡萄糖氧化酶测定法葡萄糖氧化酶是一种将葡萄糖氧化成葡萄糖酸的酶。
在药物生产过程中，葡萄糖氧化酶通常用于检测生物反应器中的葡萄糖含量。
葡萄糖氧化酶测定法是通过将待检测的药物与葡萄糖氧化酶进行反应，测定反应前后的葡萄糖含量，从而判断药物中葡萄糖氧化酶残留量的方法。
以上三种检测方法均是通过将待检测的样品与酶进行反应，测定反应前后相关物质的含量差值，从而判断原料药中酶残留量的。
这些药典检测方法不仅可以保证原料药的质量，同时也为药物疗效的稳定性提供了保障。
总之，原料药中酶残留限度药典检测方法是确保药物质量的重要手段之一。
对于药物生产企业来说，只有通过高质量的原料药和严格的药典检测方法，才能在保证药物疗效的同时，提升企业的核心竞争力。
脱氧核糖核酸酶ⅰ失活条件
脱氧核糖核酸酶ⅰ失活条件
脱氧核糖核酸酶I（DNase I）是一种内切核酸酶，主要用于消
化DNA。
DNase I的失活条件可以通过多种方式实现，以下是一些常
见的方法：
1. 高温失活，将含有DNase I的反应混合物在较高温度（通常
在70°C至75°C）下加热一段时间（通常在10分钟至30分钟），可以使DNase I失活。
高温能够改变酶的构象，从而影响其活性。
2. 螯合剂失活，将含有DNase I的反应混合物中加入螯合剂
（如EDTA），螯合剂可以与酶中的金属离子结合，从而影响酶的活性。
3. 酸性条件失活，将含有DNase I的反应混合物置于酸性条件
下（如低pH），可以使DNase I失活。
酸性条件会改变蛋白质的电
荷状态，从而影响其活性。
4. 酶抑制剂失活，加入特定的酶抑制剂（如PMSF）可以抑制DNase I的活性，从而实现失活。
需要注意的是，选择何种失活条件取决于实验的具体要求和条件。
在失活DNase I时，需要确保选择的方法不会对其他实验成分产生负面影响，并且需要对失活效果进行验证。
另外，失活后的废弃物需要按照生物废弃物处理的要求进行处理。
指导原则编号-国家食品药品监督管理总局_29170
附件1乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量检测试剂注册技术审查指导原则一、前言本指导原则旨在指导注册申请人对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）脱氧核糖核酸(deoxyribose nucleic acid, DNA)定量检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBV DNA）定量检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
如申请人认为有必要增加本指导原则不包含的研究内容，可自行补充。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
二、适用范围乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个严重的公共卫生问题，我国属乙型肝炎感染地方性流行区。
根据2006年全国乙型肝炎流行病学调查，我国的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，每年因乙型肝炎导致的肝硬化和肝癌死亡约30余万例，新发乙型肝炎病例约50 万～100万例，乙肝防治是当前及今后相当长时间内要面临的重要任务。
乙型肝炎是血源传播性疾病，主要经血（如不安全注射等）、母婴及性接触传播。
HBV属嗜肝脱氧核糖核酸（DNA）病毒科（hepadnaviridae），基因组长约3.2 kb，为部分双链环状DNA。
急性HBV感染DNA存在先阳性后消失的发展过程，慢性HBV感染的自然史一般可分为4个期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活动或低（非）复制期和再活动期，其中免疫耐受期HBV DNA滴度较高（大于20 000 IU/ml），免疫清除期表现为血清HBV DNA滴度大于2000 IU/ml，但一般低于免疫耐受期。
重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的复性及活性鉴定
重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的复性及活性鉴定刘大和;张允;郭雄军;郭平川;Sorajo Umar;李锦秀;陈劲春【摘要】建立尿素梯度凝胶过滤复性重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的方法.将诱导表达的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ包涵体通过初步纯化后变性,然后在尿素梯度凝胶过滤色谱柱Sephadex G-75中复性,洗脱流速0.4 mL/min,复性完毕后透析除去小分子复性剂,使用琼脂糖电泳法检验其有活性后,再用单向酶扩散法测定其酶活力为655.8 U/mg,复性得率为83.7％.最后通过LC-ESI-MS/MS从氨基酸序列组成上证明复性产物是重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ.结果表明,建立的方法能成功用于复性变性的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ包涵体蛋白,获得了可用于结构和功能研究的具有生物学活性的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)009【总页数】5页(P155-159)【关键词】重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ;尿素梯度;凝胶过滤;包涵体;复性;酶活【作者】刘大和;张允;郭雄军;郭平川;Sorajo Umar;李锦秀;陈劲春【作者单位】北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029;北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029;北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029;北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029;北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029;北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029;北京化工大学生命科学与技术学院,北京100029【正文语种】中文随着基因工程技术的发展，大肠杆菌被广泛用于高水平表达有重要价值的外源性蛋白质，但是使用大肠杆菌高水平表达的产物大多数是没有活性的包涵体［1］，这就需要一个有效的手段把非活性状态的包涵体蛋白转化为有活性的天然状态。
因疏水作用而引起的蛋白聚集是包涵体正确复性率极低的根本原因。
传统的稀释复性和透析复性能通过控制蛋白质的起始浓度（10-50 μg/mL）防止聚集，获得相对较高的复性产率，但是这两种方法耗时长，操作繁琐，不适合工业化大规模复性［2］。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
脱氧核糖核酸酶活力检测方法编制说明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会《二О一五年国家标准制修订项目》，项目编号“20154057-T-424”。
本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2016年完成。
本标准起草工作组由中国标准化研究院、浙江工商大学、河北农业大学等单位共同组成。
二、标准制定的背景及意义核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶，其本质是蛋白质。
不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。
有些核酸酶只能作用于核糖核酸（RNA），称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于脱氧核糖核酸（DNA），称为脱氧核糖核酸酶（DNase），核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶统称为核酸酶（Nuclease）。
脱氧核糖核酸酶是将单链或双链DNA同等程度地随机分解，生成具有5'-P 末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。
脱氧核糖核酸酶具有重要的功能，目前主要用途包括制备不含DNA的RNA样品；RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染；体外T7, T3, SP6等RNA Polymerases催化的RNA 转录后去除DNA模板；DNase I Foot printing研究DNA-蛋白质相互作用；缺口平移（Nick translation）；产生DNA随机片段文库；细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照等。
脱氧核糖核酸酶I一般被认为是脱氧核糖核酸酶的典型代表，分子量约32 kDa。
由于脱氧核糖核酸酶具有重要的生理学作用，引起了国内外广泛的关注。
目前已经商业化生产和销售，但是作为脱氧核糖核酸酶的重要质量指标之一的酶的活力，根据文献调研显示相应的测定方法目前仍然没有形成统一的检测和分析标准，各生产和销售厂商对其活力的质量控制各自定义，同一种酶选用不同的活力测定方法结果显示大小差异显著。
这实际上已经成为脱氧核糖核酸酶产品可持续发展的瓶颈问题，给消费者造成了极大的不便。
鉴于此，开展脱氧核糖核酸酶活力检测方法标准的制定，具有重要的现实意义，可有助于规范市场上此类产品的乱象，切实保障消费者的使用。
经济全球化浪潮使标准竞争上升到了战略地位，特别是进入21世纪以后，生物技术和生物产品发展迅速，发达国家纷纷制定包括脱氧核酸酶等在内的各自的标准化发展战略，以应对因经济全球化对自身带来的影响。
此外，此类标准的制定也同样满足《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》中明确把实施技术标准战略作为我国科技发展的两大战略之一的目标，有助于保障国家科学发展、社会和谐。
三、标准制定原则及主要内容（一）标准编制原则标准的制定过程中采用文献调查法、专家座谈法、凝胶电泳方法等多种研究方法，方法科学先进、过程周密严谨、数据真实可信、结果明确。
本标准是为相关组织脱氧核糖核酸酶活性检测提供技术支撑，考虑到生产、监管等不同需求，在方法选择上，主要基于现状、现有成熟的技术以及结果及验证基础确定的，因此实用性较强。
（二）标准制订主要依据1、标准编写遵循GB1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的有关要求。
2、标准编写内容参考了与脱氧核糖核酸酶活性检测相关文献，标准参照了GB/T 6379.1-2004《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）》第1部分总则与定义和GB/T 6379.2-2004《测量方法与结果的准确度》第2部分确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法。
（三）本标准的主要内容本标准主要包括以下7个部分：（1）范围；（2）术语和定义；（3）原理；（4）仪器设备及器具；（5）主要试剂；（6）分析步骤；（7）结果分析等。
四、主要工作过程1、组成标准起草小组根据国家制修订有关程序和要求，2015年10月下旬，中国标准化研究院主持召开了《脱氧核糖核酸酶活性检测》国家标准制定研讨会。
会上，组成了标准起草工作组，明确了任务要求，安排了工作进度，成立了标准起草工作小组，会议研究讨论了《脱氧核糖核酸酶活性检测》初稿，对起草小组在标准起草过程中的一些思考及难点问题进行了深刻讨论，各单位代表就标准内容及方法选择进行了讨论。
2、开展相关调研情况脱氧核糖核酸酶活性检测标准属于生物产业领域的标准，是支撑生产方、第三方组织开展产品评价的技术依据。
起草工作小组首先针对生产和检测开展了大量的调研工作。
从满足实际检测需要出发，开展了国内外相关资料的收集和确认工作，资料的检索和信息的收集过程中，分析比较了大量的国内外文献方法，在符合标准化工作规划和标准化计划要求的基础上，初步形成了检测方法的制定思路，期间参与人员进行了多次交流和讨论。
3、标准起草完善过程在广泛调查研究的基础上，标准起草单位组织相关技术人员对脱氧核糖核酸酶活性检测标准项目进行了预研，课题组成员广泛收集了国内外脱氧核糖核酸酶活性的标准、文献，了解了国内外相关技术动态，并且明确了工作思路和进程安排，分析了通过前期的实验摸索、反复论证，确定了本标准方法设定的一系列重要参数：其中包括温度、pH、底物浓度、反应时间、酶活最适测定范围等指标参数，开展了实际样品的检测。
然后依据GB/T 1.1—2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》、GB/T 1.2—2002《标准化工作导则第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法》等标准编制要求，对《脱氧核糖核酸酶活性检测》标准开展了起草工作。
于2016年3月中旬，起草工作小组完成了《脱氧核糖核酸酶活性检测》国家标准（草案）。
2016年6月，在北京组织有关单位和专家分别召开了标准草案讨论会，重点对脱氧核糖核酸酶活性检测和流程提出了完善建议。
同时对方法进行了验证，针对验证所出现的问题，在2016年11月11组织专家对标准逐字逐句进行了讨论完善，形成了《脱氧核糖核酸酶活性检测》国家标准征求意见稿。
五、国内外研究概况目前国内外对于脱氧核糖核酸酶活性的检测方法主要有单相酶扩散法和紫外吸收法两种。
其中单相酶扩散法其原理是当荧光染料溴化乙锭（Ethidium Bromide, EB）与DNA结合后可形成一种荧光络合物，在紫外光照射下发出较强的荧光。
在含有EB与DNA的琼脂板上打孔加样，孔中的DNase向周围扩散，水解琼脂板中的DNA形成水解环，在紫外透射仪下可见为不发荧光的暗环。
在一定条件下水解环的大小与DNase的活性成正比。
实验结果证明该方法重复性好，受外界环境影响小，但检测时间长，并且使用的EB 染料具有较大的污染。
脱氧核糖核酸酶适用于紫外分光光度法检测其活性，核酸的最大吸收波长在260 nm，核酸降解后，降解产物的吸光度会增加，即产生增色效应。
通过A260 nm值的改变来鉴定脱氧核糖核酸酶的作用，可对脱氧核酸酶的酶活力进行定量研究。
故本标准采用紫外-可见分光光度法，该方法操作简单、重复性较好，反应时间短，并且没有环境污染，安全环保。
六、关键试验内容和技术指标说明6.1分析方法及其条件的选择与优化6.1.1 分析方法的选择根据文献报道，脱氧核糖核酸酶适用于紫外-分光光度法检测其活性，脱氧核糖核酸的最大吸收波长在260 nm，脱氧核糖核酸降解后，降解产物的吸光度会增加，即产生增色效应。
通过吸光度A260 nm值的改变来鉴定脱氧核糖核酸酶的作用，进而对脱氧核糖核酸酶的酶活力进行定量研究。
6.1.2 反应条件的选择脱氧核糖核酸酶可以水解DNA上嘧啶残基的3′端和相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，结合前期试验结果，本方法设定反应温度范围为25-65℃、反应时间范围为1-15分钟等，通过酶活力的测定确定最终的反应温度、反应时间和pH值。
6.1.3 酶活力定义脱氧核糖核酸酶活力：以浓度为0.15 mg/mL的1.5 ml小牛胸腺DNA为底物，在35 ℃且pH 5.0的条件下，1分钟内使反应液在260 nm处的吸光度增加0.001所需要的酶量为一个活性单位（U）6.2 定量方法的建立6.2.1 结果分析与计算按照式（1）计算：C (U/mg) =△A260×1000×稀释倍数(1)式中：C（U/mg）——核糖核酸酶活力。
△A260——检测管与空白对照管在260 nm处测定得到的吸收值差值。
1000——吸光度原值与活力规定中规定吸光度0.001的换算系数。
6.3 方法特异性6.3.1 标准曲线的制定由于底物DNA的分子量不固定，没有确定的分子量，另外脱氧核糖核酸酶催化底物生成的物质也不确定，所以无法参考常规酶活力的检测方法，即无法通过计算脱氧核糖核酸酶催化底物DNA生成的真实的量来表示酶的活力，因此没有制定标准曲线。
6.3.2 仪器设备及器具恒温水浴槽。
紫外-可见分光光度计：吸光度精确至0.001。
pH计：精确至0.01。
1 cm 比色皿。
电子天平：精度为0.0001 g。
电子天平：精度为0.01 g。
6.3.3溶液配置本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6882规定的二级水。
以下所有试验操作步骤均应在洁净的无外源DNA酶环境中进行。
（1）0.1 mol/L 乙酸/乙酸钠（NaAc/HAc）缓冲液，pH 5.0称取8.2 g NaAc，0.45 g不含有结晶水的MgCl2，0.21 g无水CaCl2溶于蒸馏水中，缓慢加入HAc调pH至5.0，混匀后定容至1000 mL。
（2）0.15 mol/L NaCl溶液称取8.766 g NaCl溶于蒸馏水中，混匀后定容至1000 mL。
（3）小牛胸腺脱氧核糖核酸来源于小牛胸腺，含量≥98%。
6.3.4 吸光值测定方法优化后的吸光值测定方法为取检测管若干，空白管中依次加入小牛胸腺DNA溶液1.5 mL、水0.5 mL与NaAc/HAc缓冲液1 mL；将稀释后的待测酶液各取0.5 mL分别加入样品管中标号并加入NaAc/HAc缓冲液1 mL和小牛胸腺DNA溶液1.5 mL（反应体系为3 mL）。
在35 ℃恒温下，以空白管为对照依次测定各个稀释度待测酶液在260 nm下10 min后的吸光值。
具体的底物浓度、反应时间、反应温度等根据优化过程中的实际实验情况确定。
6.3.5 结果记录与计算记录各个稀释倍数下各样品管在260 nm紫外光的吸收值A260，并计算与空白管的差值△A260。
6.4 实验结论6.4.1 底物浓度的确定酶促反应的底物浓度非常重要。
低浓度的底物由于提供的底物不足，酶活力测定值偏小，并且由于吸光度值吸光度变化过小，往往是千分位上的变化，测定不准确。
加大底物浓度，能提供足够的反应底物，催化反应速度增加，酶活力测定值也增大，但如果底物浓度过大，酶促反应将过于迅速，导致相对标准偏差增大，因此必须选择合适的底物浓度。