DNase I 脱氧核糖核酸酶
高中生物学中与DNA有关的6类酶
高中生物学中与DNA有关的6类酶1 DNA酶DNA酶，也称脱氧核糖核酸酶，是水解DNA中磷酸二酯键，生成低级多核苷酸或单核苷酸的磷酸二酯酶。
其中能够水解DNA分子内磷酸二酯键的酶又称为DNA内切酶，如DNA酶I（DNase I），DNA 酶II（DNase II）等；而从DNA链的一端逐个水解下核苷酸的酶称为DNA外切酶，如牛脾磷酸二酯酶和蛇毒磷酸二酯酶等非专一性核酸酶（底物也可为RNA）。
在DNase I的作用下，DNA被水解成3′端为游离羟基，5′端为磷酸基团的寡聚脱氧核苷酸，其平均长度为4个脱氧核苷酸残基。
在DNase II的作用下，DNA被水解成5′端为游离羟基，3′端为磷酸基团的寡聚脱氧核苷酸，平均长度约6个核苷酸残基。
牛脾磷酸二酯酶可从DNA的5′羟基端开始逐个切割磷酸二酯键，蛇毒磷酸二酯酶可从DNA的3′羟基端开始逐个切割磷酸二酯键。
人教版高中生物必修2教材中，艾弗里等“证明DNA是遗传物质” 的经典实验就用到了DNA酶。
在该酶作用下，载有S型肺炎双球菌荚膜遗传信息的DNA被分解破坏，无法将R型菌转化成S型，从而进一步证明了DNA 是转化因子。
2 解旋酶DNA分子的许多生物学功能都需要解开双链才能执行，而解旋酶就能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。
解旋酶每解开一对碱基，需要水解2分子ATP。
分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。
如果双链DNA中有单链末端或缺口，则解旋酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。
解开的两条单链随机被单链结合蛋白所覆盖，以防止重新结合成双链或被核酸酶降解。
高中生物教材明确提到了DNA复制需要解旋酶，但转录是否需要解旋酶？教材并未明确指出，不少中学教师对此也是模糊不清。
事实上，在转录过程中，原核生物通过RNA聚合酶的特定亚基使DNA双链解开，也就是说，RNA聚合酶自身具有解旋的功能；而真核生物转录时，是某些蛋白转录因子（如RNA聚合酶Ⅱ的TFⅡ-F 和TFⅡ-H）协助RNA聚合酶形成复合物解开DNA双链，起到解旋酶的作用。
DNase I(RNase Free)
DNase I（RNase Free）使 用 说 明 书TaKaRa Code： D2215包 装：DNase I（RNase Free；5 U/μl） 1,000 Units10×DNase I Buffer 1 ml保 存： -20℃●制品说明本酶是将单链或双链DNA同等程度的随机分解，生成具有5′-P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。
在Mg2+存在时，能在双链DNA上随机地产生切口；而在Mn2+存在下能将双链DNA同时切断，使DNA片段化。
由于DNase I（RNase Free）酶几乎完全除去了Protease及RNase，从而提高了在pH中性区域的稳定性，可以安全地用于RNA的制取。
●酶贮存溶液Tris-HCl（pH7.5 at 4℃） 20 mMNaCl 50 mMCaCl2 0.1 mMGlycerol 50 %●起 源：Bovine pancreas。
●活性定义以小牛胸腺DNA为底物，在25℃、pH5.0的条件为下，1分钟内使反应液的260 nm吸光度增加0.001所需要的酶量定义为1个活性单位（Kunitz Unit）。
●纯 度10 U的本酶和1μg的16S，23S rRNA在37℃、pH7.5的条件下反应4小时，RNA的电泳谱带不发生变化。
●用 途1）用T7或SP6 RNA Polymerase进行体外转录（In vitro transcription）时，合成RNA后，不必 更换Buffer，使用DNase I（RNase Free）即可将模板DNA降解。
2） 与DNA Polymerase I一起用于切口平移（Nick translation）。
3） 在Mn2+存在的条件下，为鸟枪法测序（Shot gun sequencing）制作DNA文库。
4） 用于足迹法（Foot printing）分析DNA-蛋白质相互作用。
●添附Buffer组成（保存：-20℃）10×DNase I BufferTris–HCl（pH7.5） 400 mMMgCl280 mMDTT 50 mM●使用例除去RNA中的基因组DNA1. 在微量离心管中配制下列反应液，全量50μl。
dnase使用方法
纯度 10 U的本酶和1 μg的16S, 23S rRNA在37℃、pH7.5的条件下反应4 小时，RNA的电泳谱带不发生变化。
用途 1. 用 T7 或 SP6 RNA Polymerase 进 行 体 外 转 录 （ In vitro
transcription ）时 ，合 成 RNA 后， 不必 更换 Buffer ，使用 Recombinant DNase I（RNase-free）即可将模板 DNA 降解。 2. 与 DNA Polymerase I 一起用于切口平移（Nick translation）。 3. 在Mn2+存在的条件下，为鸟枪法测序（Shotgting）分析 DNA-蛋白质相互作用。 5. 在进行 RT-PCR 反应前，对基因组 DNA 进行降解。
否除去基因组 DNA，同时测定 RNA 的浓度。如果基因组 DNA 没有被完全除去，可以适当增加 Recombinant DNase I(RNase -free)的添加量或者延长反应时间。
V2012.01
Recombinant DNase I （RNase-free）
使用说明书
Takara Code : D2270A
包装量
Recombinant DNase I (RNase-free；5 U/ul) 10×DNase I Buffer
1,000 Units 1 ml
保 存 : -20℃
制品说明 本酶是将单链或双链 DNA 同等程度的随机分解，生成具有 5′-P 末 端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。 由于 DNase I（RNase-free）酶几乎完全除去了 Protease，从而提 高了在 pH 中性区域的稳定性，可以安全地用于 RNA 的制取。
5 μl
生物化学考研考博简答题及名词解释总结
生物化学考研考博简答题及名词解释总结1 试述RNA的种类及其主要功能。
RNA大体可以分mRNA(信使RNA) ；rRNA(核糖体RNA) ；tRNA(转运RNA)不同的RNA 有着不同的功能，其中rRNA是核糖体的组成成分，由细胞核中的核仁合成，而mRNA以及tRNA 在蛋白质合成的不同阶段分别执行着不同功能。
mRNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息传递过程中的桥梁；tRNA的功能是携带符合要求的氨基酸，以连接成肽链，再经过加工形成蛋白质2 酶的化学修饰调节的特点是什么？化学修饰的特点：1）绝大多数属于这类调节方式的酶都具无活性（或低活性）和有活性（或高活性）两种形式。
它们之间在两种不同酶的催化下发生共价修饰，可以互相转变。
催化互变反应的酶在体内受调节因素如激素的控制。
2）和变构调节不同，化学修饰是由酶催化引起的共价键的变化，且因其是酶促反应，故有放大效应。
催化效率长较变构调节高。
3）磷酸化与脱磷酸是最常见的酶促化学反应。
3 酶的变构调节的特点是什么？别构酶的催化位点与别构位点可共处一个亚基的不同部位，但更多的是分别处于不同亚基上．在后一种情况下具催化位点的亚基称催化亚基，而具别构位点的称调节亚基。
多数别构酶处于代谢途径的开端，而别构酶的别构剂往往是一些生理性小分子及该酶作用的底物或该代谢途径的中间产物或终产物。
故别构酶的催化活性受细胞内底物浓度、代谢中间物或终产物浓度的调节。
终产物抑制该途径中的别构酶称反馈抑制(feedback inhibition)．说明一旦细胞内终产物增多，它作为别构抑制剂抑制处于代谢途径起始的酶，及时调整该代谢途径的速度，以适应细胞生理机能的需要。
别构酶在细胞物质代谢上的调节中发挥重要作用。
故别构酶又称调节酶。
4 简述糖酵解和有氧氧化的关键酶。
糖酵解的关键酶：葡萄糖激酶、6-磷酸果糖激酶1、丙酮酸激酶有氧氧化的关键酶：柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶复合体5 简述磷酸戊糖途径的关键酶和生理意义磷酸戊糖途径的关键酶是6-磷酸葡萄糖脱氢酶。
脱氧核糖核酸酶活力检测方法
脱氧核糖核酸酶活力检测方法编制说明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会《二О一五年国家标准制修订项目》，项目编号“-T-424”。
本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2016年完成。
本标准起草工作组由中国标准化研究院、浙江工商大学、河北农业大学等单位共同组成。
二、标准制定的背景及意义核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶，其本质是蛋白质。
不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。
有些核酸酶只能作用于核糖核酸（RNA），称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于脱氧核糖核酸（DNA），称为脱氧核糖核酸酶（DNase），核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶统称为核酸酶（Nuclease）。
脱氧核糖核酸酶是将单链或双链DNA同等程度地随机分解，生成具有5'-P 末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。
脱氧核糖核酸酶具有重要的功能，目前主要用途包括制备不含DNA的RNA样品；RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染；体外T7, T3, SP6等RNA Polymerases催化的RNA 转录后去除DNA模板；DNase I Foot printing研究DNA-蛋白质相互作用；缺口平移（Nick translation）；产生DNA随机片段文库；细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照等。
脱氧核糖核酸酶I一般被认为是脱氧核糖核酸酶的典型代表，分子量约32 kDa。
由于脱氧核糖核酸酶具有重要的生理学作用，引起了国内外广泛的关注。
目前已经商业化生产和销售，但是作为脱氧核糖核酸酶的重要质量指标之一的酶的活力，根据文献调研显示相应的测定方法目前仍然没有形成统一的检测和分析标准，各生产和销售厂商对其活力的质量控制各自定义，同一种酶选用不同的活力测定方法结果显示大小差异显著。
这实际上已经成为脱氧核糖核酸酶产品可持续发展的瓶颈问题，给消费者造成了极大的不便。
生物化学_09 核酸降解和核苷酸的代谢
IMP转变为GMP和 转变为GMP （3）IMP转变为GMP和AMP
2、 补救途径
(利用已有的碱基和核苷合成核苷酸) (1) 磷酸核糖转移酶途径（重要途径）
核苷磷酸化酶
嘌呤核苷 + 磷酸 腺嘌呤 + 5-PRPP
次黄嘌呤(鸟嘌呤) 磷酸核糖转移酶
嘌呤碱 + 戊糖-1-磷酸 AMP + PPi
腺嘌呤磷酸核糖转移酶
基因组DNA 基因组 不被切割
限制—修饰的酶学假说 限制 修饰的酶学假说 1968年，Meselson 和Yuan发现了 型限制性核酸内切酶 年 发现了I型限制性核酸内切酶 发现了 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了 年 和 从流感嗜血杆菌中分离纯化了 第一个II型限制性核酸内切酶 第一个 型限制性核酸内切酶Hind II 型限制性核酸内切酶
（2）尿嘧啶核苷酸的合成 ）
天冬氨酸转氨甲酰酶 二氢乳清酸酶
乳清苷酸焦磷酸化酶／Mg2+ 二氢乳清酸脱氢酶
乳清苷酸脱羧酶
（3） 胞嘧啶核苷酸的合成
尿嘧啶核苷三磷酸可直接与NH3（细菌）或Gln（动物） 细菌） 尿嘧啶核苷三磷酸可直接与 （动物） 反应，生成胞嘧啶核苷三磷酸。 反应，生成胞嘧啶核苷三磷酸。
二、脱氧核糖核酸酶
只能水解DNA磷酸二酯键的酶。 只能水解DNA磷酸二酯键的酶。 DNA磷酸二酯键的酶 牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ） 牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ）： 可切割双链和单链DNA 降解产物为3 DNA， 可切割双链和单链 DNA， 降解产物为 3’ - 磷酸 为末端的寡核苷酸。 为末端的寡核苷酸。 限制性核酸内切酶： 限制性核酸内切酶： 细菌产生的、能识别并特异切割外源DNA DNA特定 细菌产生的 、 能识别并特异切割外源 DNA 特定 中的磷酸二脂键( 序列中的磷酸二脂键 对碱基序列专一） 序列中的磷酸二脂键(对碱基序列专一）的核酸内 切酶。 切酶。
生化酶
生物化学酶集锦（期末考试要求）一、糖代谢1、磷酸葡萄糖激酶PEK：参与糖降解，限速酶。
AMP是PEK的变构激活剂；柠檬酸是变构抑制剂；NADH和脂肪酸也是抑制剂；PH下降时抑制PEK活性，糖降解速率降低。
相对应的糖异生酶是二磷酸果糖磷酸激酶。
2、己糖激酶：参与糖降解，将葡萄糖转化为6--磷酸葡萄糖。
高能荷抑制、高柠檬酸水平抑制。
相对应的糖异生酶为6-磷酸葡萄糖磷酸酯酶。
3、丙酮酸激酶：将PEP转化为丙酮酸或草酰乙酸，参与糖降解，高能荷抑制、高乙酰辅酶A抑制。
相对应的糖异生酶为PEP羧激酶。
4、丙酮酸羧化酶：丙酮酸羧化为草酰乙酸，以生物素为辅酶，辅助因子乙酰辅酶A和镁离子。
5、丙酮酸脱氢酶系：将丙酮酸催化成乙酰辅酶A，有丙酮酸脱氢酶（E1）、二氢硫辛酸转乙酰酶（E2）和二氢硫辛酸脱氢酶（E3）含有硫胺素焦磷酸（TPP）、硫辛酸、CoASH 、FAD、NAD、Mg2+ 等 6种辅助因子。
ATP、NADH、乙酰CoA 和脂肪酸能抑制酶活性。
使E1的一个亚甲基磷酸化而失活；CoA抑制E2，NADH 抑制E3。
AMP、NAD、CoASH能别构激活酶的活性。
6、柠檬酸合酶：草酰乙酸与乙酰CoA合成柠檬酸，三羧酸循环的限速酶。
ATP、NADH和琥珀酰CoA是抑制剂；ADP是激活剂。
此外，草酰乙酸与乙酰CoA浓度对其有影响。
7、异柠檬酸脱氢酶：异柠檬酸先脱氢成草酰琥珀酸再脱羧成α--酮戍二酸。
有两种酶，一种以NAD为辅酶，另一种以NADP为辅酶。
对NAD专一的酶位于线粒体中，是三羧酸循环重要的酶。
受ＡＴＰ抑制。
8、α--酮戍二酸脱氢酶复合酶：α--酮戍二酸脱氢为琥珀酰-CoA。
由α--酮戍二酸脱氢酶、转琥珀酰酶和二氢硫辛酸脱氢酶组成。
也需要硫胺素焦磷酸（TPP）、硫辛酸、CoASH 、FAD、NAD、Mg2+ 等 6种辅助因子。
同样受到产物NADＨ、琥珀酰--CoA及ATP、ＧＴＰ的反馈抑制。
9、琥珀酰--CoA合成酶：由琥珀酰--CoA生成琥珀酰。
检测脱氧核糖核酸酶的DNA探针、试剂盒和方法[发明专利]
![检测脱氧核糖核酸酶的DNA探针、试剂盒和方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/6884b429fe00bed5b9f3f90f76c66137ee064fc3.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201610076852.8(22)申请日 2016.02.03C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/34(2006.01)C12N 15/11(2006.01)(71)申请人广州市锐博生物科技有限公司地址510663 广东省广州市科学城科学大道182号创新大厦C3-13(72)发明人张必良 刘霭珊 曹亮克雷格·梅洛(74)专利代理机构广州华进联合专利商标代理有限公司 44224代理人万志香 胡杰(54)发明名称检测脱氧核糖核酸酶的DNA 探针、试剂盒和方法(57)摘要本发明提供一种检测脱氧核糖核酸酶活性的DNA 探针、试剂盒和方法，采用发夹状DNA 探针为脱氧核糖核酸酶的底物，探针的两端或内部分别标记上荧光基团及对应的荧光淬灭基团。
当探针结构完整时，荧光基团与淬灭基团位于同一个DNA 分子上，荧光基团被激发的荧光被淬灭基团吸收，荧光基团不发出荧光；而当探针被脱氧核糖核酸酶降解后，荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团能正常发出荧光。
采用实时定量PCR 仪检测反应体系中发出的荧光强度，即可判断反应体系中是否存在脱氧核糖核酸酶。
本方法可广泛用于生物制品中脱氧核糖核酸酶残留的质量检测，或用于脱氧核糖核酸酶定量测定。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书11页序列表2页 附图5页CN 105648062 A 2016.06.08C N 105648062A1.一种DNA探针，其特征在于,其包含有一个茎环结构，且2个末端或内部分别连接有能量供体基团和能量受体基团，能量供体基团和能量受体基团之间能进行能量转移,所述DNA 探针的碱基长度为15-50个核苷酸，且包含一个能被DNase切割的位点，被降解后的探针的能量供体基团和能量受体基团在不同的探针片段上；所述茎环结构中，其茎结构包括分别位于探针两端的5～15bp的回文互补序列，其环结构包括长度为5～20nt的核苷酸序列，探针退火后形成茎环结构，两个回文互补部分Tm值大于35℃。
DNAse I(RNase free)操作方法及步骤说明书
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://DNase I (RNase free) 使 用 说 明 书浓度：产品组成、储存、浓度：-20℃ 保存1年。
3U/μl制品说明：DNase I ，即Deoxyribonuclease I ，中文名称为脱氧核糖核酸酶I ，是一种可以消化单链或双链DNA 产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。
DNase I 水解单链或双链DNA 后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。
DNase I 活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。
镁离子存在条件下，DNase I 可随机剪切双链DNA 的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I 可在同一位点剪切DNA 双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。
产品特点：本产品使用本公司特有的DNase 和独特的反应液消化后不需要繁琐的苯酚/氯仿抽提灭活，可直接用于反转录反应，使用起来非常快速，方便。
活性单位：37℃10分钟内，将能够完全降解1μg pBR322质粒DNA 所需的酶量定义为1个活性单位。
来源：大肠杆菌表达的31kd 重组蛋白 。
酶贮存缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH7.5)，10 mM CaCl 2，50% (v/v)glycerol 。
10×DNase Buffer ：100 mM Tris-HCl (pH7.5 at 25℃)，25 mM MgCl 2，1 mM CaCl 2。
纯度：不含其它DNA 内切酶和外切酶，不含RNA 酶。
适用范围：制备不含DNA 的RNA 样品； RT-PCR 反应前RNA 样品中去除基因组DNA 等可能的DNA 污染； 体外T7, T3, SP6等RNAPolymerases 催化的RNA 转录后去除DNA 模板；DNase I footprinting 研究DNA-蛋白质相互作用；缺口平移(nick translatioin)；产生DNA 随机片断文库；细胞凋亡TUNEL 检测中部分剪切基因组DNA 作为阳性对照。
核酸的降解和核苷酸代谢 (2)
核酸的降解和核苷 酸代谢 (2)
核酸
核酸酶
核苷酸
核苷 核苷酸酶 磷酸
戊糖 核苷酶 碱基
嘧啶分解 嘌呤分解
1 核酸的酶促降解
• 核酸酶
– 对底物的作用位点：
• 核酸外切酶 • 核酸内切酶
– 对底物的选择性：
• 核糖核酸酶 • 脱氧核糖核酸酶 • 限制性内切酶(具有位点专一性)
1.1 核酸酶
1.外切核酸酶对核酸的水解位点
当体内核酸大量分解(白血病、恶性肿瘤等)或食入 高嘌呤食物时，血中尿酸水平升高，超过 0.48mmol/L(8mg/dl)时，尿酸盐过饱和形成结晶， 沉积于关节、软组织、软骨及肾等处，而导致关节 炎、尿路结石及肾疾患，称为痛风症。
痛风的尿酸钠结晶
痛风的药物治疗：别嘌呤醇
别嘌呤醇
次黄嘌呤
别黄嘌呤
痛风症的治疗机制
核苷的直接利用
尿苷磷酸化酶
尿嘧啶+ 1-磷酸核糖
尿嘧啶核苷 + Pi
尿苷激酶
尿苷/胞苷+ATP
UMP/CMP + ADP
第12章 核酸代谢
①尿嘧啶核苷酸的生物合成
20世纪40年代已阐明嘧啶环合成途径。
嘧啶核苷酸是由天门冬酰胺、 PRPP和氨基甲
酰磷酸等形成的。
嘧啶环上各原子的来源
C
来自NH3 4
N3 C2
C5 C6
来自天冬氨酸
来自CO2
N 用同位素标记实验证明：嘧啶环上的N3来自NH3， C2来源于CO2，其余4个原子来源于天冬氨酸。
灵长类、鸟类、爬虫类以及大多数昆虫中嘌
呤的最终产物为尿酸；除灵长类以外的哺
乳动物、腹足类则为尿囊素；某些硬骨鱼 中则尿囊素再继续分解为尿囊酸；大多数 鱼类、两栖类中尿囊酸再分解为尿素和乙 醛酸；海洋无脊椎动物星虫类、甲壳类则 将尿素分解为氨和CO2。
• 体内嘌呤核苷酸的分解代谢主要发生在肝、小肠 及肾中。
2 核酸内切酶
核酸内切酶特异地水解多核苷酸内部各键，是特异性 强的磷酸二酯酶。 如牛胰核酸酶作用于嘧啶核苷酸的磷酸二酯键，生成 嘧啶核苷 -3-磷酸或末端为嘧啶核苷 -3-磷酸的寡核 苷酸。
牛胰核酸酶专一作用于RNA，对DNA及其它磷酸二酯
化合物不作用或作用活性很低。
牛胰 RNase 具有高度热稳定性。许多 RNAase 也都是
大肠杆菌的EcoR I对DNA的识别顺序和酶作用 产物的粘性末端。
限制酶的命名较为特殊。以EcoRI为例，第1个大写字 母 E 为大肠杆菌的属名 (Escherichia) 的第 1 个字母， 第 2 、 3 两个小写字母 co 为它的种名 (coli) 的头两个 字母。第4个字母用大写R，表示所用大肠杆菌的菌 株。最后一个罗马字表示从该细菌中分离出来的这 一类酶的编号。
脱氧核糖核酸酶专一水解DNA，
作用方式:作为内切酶，可切断双链或单链;
DNA RNA及核酸
限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的
DNA，对自身起了保护作用。 发现概况:
（1）限制性内切酶的特征
① 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点
② 粘性未端，平整末端
（2）限制性内切酶的命名
EcoRI
（3）限制性内切酶举例
（四）非专一性核酸酶类（nonspecific nuclease） 介绍二种外切酶
1980年牛心线粒体tRNAser只有63个核苷酸， 沉降常数3S，缺少D环和D臂，呈二叶草型。
近年来发现2种线虫线粒体tRNA也不是标准
的三叶草结构。
2．rRNA的二级结构
3．mRNA的二级结构
The secondary structure of HEC-SOD’s mRNA. the free energy of result is –587.9J.
⑤ tRNA分子中含有较多的修饰成分。
（2）rRNA的一级结构
原核生物核糖体 5S rRNA， 23S rRNA
50S
34种蛋白质 70S 30S 21种蛋白质 16S rRNA
真核生物核糖体
5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA
60S
49种蛋白质
80S 18SrRNA
40S
33种蛋白质
用1～2个已知浮力密度的标准DNA样品作参考
2 0 4.22 (r 2 r0 ) 1010
式中 ρ：未知DNA的密度
ρ0：标准DNA的密度 ω：角速度（弧度/秒） r： 未知DNA与转轴之间的距离 r0：已知DNA与转轴之间的距离
2．DNA中G-C含量的测定
G-C对的含量与浮力密度之间呈正比关系 Rolfe-Meselson导出了如下公式：
实验二 植物基因组DNA的提取笔记
实验二植物基因组DNA的提取Tris 读音“吹斯”脱氧核糖核酸酶DNase是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。
镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。
苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。
苯酚使蛋白变性，离心时沉淀下来，而DNA溶解在溶液中。
在提取DNA时用的原料成分的关系,很多植物源提取材料里面含有酚类物质,酚类物质是芳族环上的氢原子被羟基或功能衍生物取代后生成的化合物酚类物质如果经氧化后就会很容易于DNA共价结合引起褐变.这就是褐变现象,为有效除去酚类物质，需要在研磨时加入抗氧化的PVP，用PVP是利用它的“CO-N=”基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强，结合成复合物后,通过离心除去。
另外，在加入提取液时，加入B-巯基乙醇可使多酚氧化酶失活，防止酚类物质被氧化，主要是“-SH基”可以打断多酚氧化物酶的二硫键而使之失活，防止酚类化合物被氧化。
巯基乙醇加入的目的是提供一种还原剂，这样酚类物质就不能被氧化成醌，从而影响你提DNA的实验。
巯基乙醇兼有这两方面功能，消泡和保护DNA。
特别是样品中酚类物质较多的时候，可以适当增加巯基乙醇的量，DNA提取的成功率更高。
巯基乙醇有消泡的作用。
不然你加了CTAB在震荡过程中会出现大量气泡，影响后续操作。
不是用来防止DNA氧化的。
PVP粉才是用来防止氧化的。
还原剂，防止酚的氧化。
很重要。
如果不加提出的核酸会呈现灰黑色。
异戊醇的作用是消除抽提过程中出现的泡沫。
我们实验室是灭菌后加PVP和巯基乙醇,每次用前65度水浴。
加CTAB时应在通风橱中进行。
基因工程3-3基因操作的工具酶
对于限制性核酸内切酶EcoR I切割后形成的5’ 延伸末端可用32PdATP标记：
而BamH I切割后形成的5’延伸末端可用
32PdGTP标记：
3.3.3 T4 DNA聚合酶 是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化的一
种特殊的DNA聚合酶。
合成的方向移动——缺口平移（Nick
Translation）。
应用缺口平移法制备DNA杂交探针，其典型的 反应体系是：在25 l总体积中含有1 g纯化的特 定的DNA片段，并加入适量的DNase I、pol I、 32PdNTP和未标记的dNTP。
脱氧核糖核苷酸酶 I（DNase I）是一种内切酶， 它能够水解单链或双链DNA，形成带有5’-磷酸 末端的单（寡）核苷酸。
1. T4 DNA聚合酶也是一种多功能酶：
(1) 5’ 3’的聚合酶活性 (2) 3’ 5’的外切酶活性
其外切酶活性比E.coli DNA Pol I 的活性高200倍。
(3) 取代反应活性
如果在反应混合物中仅存在一种dNTP，则此酶的3’ 5’ 外切酶活性将从dsDNA的3’末端降解，直到互补于这个 dNTP的碱基出现为止，然后在这一位置发生取代反应。
A，故加入寡聚dT后，mRNA就可以成为逆转录酶很好的模 板，由此可合成cDNA。
(2) DNA依赖的DNA聚合酶 以ssDNA为模板，以带有3’-OH末端的DNA
片段为引物，沿5’ 3’方向合成DNA链。
可在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA。
(3) 外切RNA酶活性 底物是RNA-DNA杂交分子中的RNA链，其水
2. T4 DNA聚合酶在基因工程中的应用
(1) 以填充反应标记带有5’延伸末端的dsDNA片 段
DNaseⅠ(RNase free)
北京雷根生物技术有限公司 DNase Ⅰ(RNase free)简介：脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)是一种非特异性核酸酶切酶，大多数来源于重组E.coli 菌株，含有牛胰腺DNase Ⅰ的MBP 融合克隆。
DNase Ⅰ可用于降解单链或双链DNA ，其原理为DNase Ⅰ水解磷酸二酯键产生带有5'-磷酸基团和3'-OH 的单核苷酸或寡核苷酸。
DNase Ⅰ(RNase free)由DNase Ⅰ、酶保护液、防腐剂等组成，浓度为2000U/ml ，不含RNase ，用于单链DNA 、双链DNA 、染色质、RNA:DNA 杂交链。
多用于无DNA 污染的RNA 的制备，逆转录及体外转录等实验。
组成：操作步骤(仅供参考)：1、 根据不同实验，应加入适量的酶，以便充分消化DNA 。
2、 大多数情况下，取DNase Ⅰ(RNase free) 2～5μl(即4～10U)，加入10×DNase Buffer10ul 以及待处理液，最后用去离子水或RNase-Free ddH 2O 补至100μl 。
3、 25～37℃孵育10min 。
4、 灭活条件：75℃孵育10min 。
注意事项：1、应注意避免污染和反复冻融。
2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
编号 名称 NR0002 NR0002 Storage 试剂(A): DNase Ⅰ(RNase free) 2000U 10KU -20℃ 试剂(B): 10×DNase Buffer 5ml 25ml RT 试剂(C): RNase-Free ddH 2O 5ml 25ml RT 使用说明书 1份。
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ü 必须在加热之前加入终止溶液（20 mM EGTA）以防止金属（Mg/Ca）离子催化水解 RNA。在 70°C 加热 10 分钟使 DNA 酶 I 和 RNA 变性。
DNase 活性。
质检结果： 泳道 1：Marker 泳道 2：阴性对照（无 DNase I） 泳道 3：DNA + 1 单位 DNA 酶 I. 泳道 4：DNA + 2 单位 DNA 酶 I. 泳道 5：DNA + 3 单位 DNA 酶 I.
Sangon 泳道1 泳道 2 泳道 3 泳道 4 泳道 5
DNase I 脱氧核糖核酸酶
产品编号 : A610099 包装规格：250 MG / 1 G / 5 G
产品说明: 脱氧核糖核酸酶 I（A610099）是来源于牛胰腺的核酸内切酶，在二价阳离子存在的情况下会降解双链 DNA，生成 3'-OH
寡核苷酸。Mg2+存在条件下，DNase I 可以剪切双链 DNA 位点形成切口，而在 Mn2+存在条件下，DNase I 可以剪切 DNA 的 双链。
抑制剂：EGTA；EDTA；盐浓度> 100 mM 会降低 DNase 活性。
io 分子量：31,000 道尔顿。 B 必备：Ca2+和 Mg2+或 Mn2+
来源：牛胰腺。
n 储存温度：-20°C 储存。避免频繁的温度变化。请参阅产品信息标签上的有效期。 o 终止溶液：20 mM EGTA（pH 8.0）。
在切口平移中，DNase I 剪切出作为 DNA 合成起始位点的单链切口，并通过剪切双链 DNA 克隆随机的 DNA 片段。 DNase I 是一种色谱级纯的制剂。它以冻干粉末的形式提供，其活性约为 500 Kunitz U/mg。为了获得最大的稳定性， DNase 须以至少 1 mg/ml 的浓度溶解在含有 20 mM Tris-HCl 和 1 mM MgCl2，且 pH 7.5 的 50%甘油中。该溶液可以在-20ºC 温度下储存至少一年。
本产品消化时间不得超过 15 分钟或消化温度高于 37 ºC，否则残留的污染性 RNA 酶将开始降解 RNA。
使用说明： 1. 此 DNase 溶液不含 RNase 抑制剂。 2. 在不同的缓冲条件下，完全消化给定量的 DNA 所需的 DNA 酶量可能需要凭经验确定。例如，盐浓度> 100 mM 会降低
n 等于一个 Kunitz 单位。可在产品信息标签上查看单位浓度。 a 步骤 S 1. 向无RNA酶的PCR管中加入：
1 μg RNA 样品； 49 μl 的 1×反应缓冲液：40 mM Tris-Cl（pH 8.0），2.5 mM（最高达 10 mM）MgSO4，1 mM（最高达 10 mM）CaCl2； 1 μl DNase I，1 单位/ml * ü 请参阅分析说明书以了解该批次的活性。为了溶解至少 1 unit/ml 浓度的 DNA 酶 I，推荐使用储存缓冲液：50e 的单位定义是在 37°C 温度下，50 μl 含有 40 mM Tris-HCl（pH 8.0），2.5 mM（最高 10 mM）MgSO4，1 mM（至
多 10 mM）CaCl2 的缓冲液中，10 分钟内完全降解 1 μg λDNA 所需的量。在这些测定条件下，一个单位的 DNA 酶活性大约
h 推荐的 1×反应缓冲液： c 40 mM Tris-HCl（pH 8.0），2.5 mM（最多 10 mM）MgSO4，1 mM（最多 10 mM）CaCl2.。
注意：如果原料中含有 EGTA，EDTA，其他螯合剂和/或高浓度的盐，推荐使用含有更高浓度的镁离子和钙离子缓冲液。
te 热灭活：65°C 终止溶液中 10 分钟。