分子生物学 第五章作业

分子生物学第五章作业

1，哪些重要的科学发现和实验推动了 DNA重组技术的产生及发展？

答：重组DNA技术发展史上的重大事件

1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；

2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；

3.50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。

年份事件

1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。

1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。

1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。

1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。

1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。

1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。

1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。

1961 Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。

1964 C. Yanofsky和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。

1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。

1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。

1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。

1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。

1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。

1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人

1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。

1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling 和G. M. Rubin得到转基因果蝇。

1982 美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。

1983 获得第一例转基因植物。

1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。

1986 GMO首次在环境中释放。

1988 J. D. Watson出任"人类基因组计划"首席科学家。

1989 DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--"Oncomouse"。

1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)

1994 第一批基因工程西红柿在美国上市。

1996 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。

1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。

2，如何理解PCR扩增仪的原理及过程？

答：聚合酶连反应技术又称PCR技术

（1）PCR的基本原理

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

首先将双链DNA在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，然后以单链DNA为模板，并利用反应物中的四种脱氧核苷酸合成新的DNA互补链。

（2）PCR的基本过程

加入模板DNA，PCR引物，四种核苷酸，即适当浓度Mg，DNA聚合酶，经过;

1.变性（Denaturation）：将待扩增的DNA模板加热变性成两条单链；

2.退火（Annealing）：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物退火；

3.延伸（Extension）：在适当条件下，利用DNA聚合酶使引物延伸，产生新的双链。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。

PCR产物是介于引物的5’端之间的双链DNA片段。

3，简述定量PCR的原理和过程？

答：（1）利用荧光测量的PCR仪对整个PCR过程中扩曾DNA的积累速力绘制动态变化图，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数

（2）反应在带透明盖的塑料管中进行，激发光可以直接透过管盖，使其中的激发光被激发，荧光探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA 结合后，才能被激发发出荧光，随着新合成目的DNA片段的增加，结合到DNA上得荧光探针，即被激发产生的荧光相应增加。

最简单的DNA结合的荧光探针是非序列特异性的，一般探针不能区分不同的双链DNA，所以人们设计了能与目的DNA特异性结合的荧光探针，如TapMan探针（是一小段被设计成可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA并且该单链DNA的3，端和5，端带有短波长和长波长两个不同荧光集团这两个荧光集团由于距离靠近，在荧光共振能量转移作用下会发生荧光粗灭因而检测不到荧光，随着PCR反应的进行TapMan 探针结合到目的DNA序列上并挨饿会被具有外切酶活性的TapMan聚合酶逐个切除而降解被切下来的集团解除了荧光粗灭的束缚会在激发光下发出荧光因此产生的荧光直接反映了扩增靶DNA的总量）

4，基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么?

答构建原理上得区别：

Ⅰ真核基因组文库

基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体，构建基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体

常用的构建真核生物细胞基因组文库的载体是λ噬菌体和粘性质粒。

构建基因组文库的步骤

1、载体的制备

2、基因组DNA的制备

3、载体与基因组DNA的连接

4、体外包装提取物的制备和重组DNA的体外包装

5、重组噬菌体滴度的检测、扩增与保存基因组文库

Ⅱ cDNA文库的构建

cDNA文库：真核生物mRNA逆转录所形成的DNA称为cDNA。将cDNA与载体DNA重组，并转化到宿主细菌里或包装成噬菌体颗粒，得到一系列克隆群体。这样的克隆群体叫做cDNA文库。

cDNA文库可直接进行筛选目的基因，由于cDNA中不含内含子，因此所筛选的基因可以直接表达。

构建cDNA文库主要包括以下几个步骤：

1、 mRNA的分离

2、cDNA第一链的合成

3、cDNA第二链的合成

4、cDNA与载体的连接：

5、噬菌体的包装、转染和质粒DNA的转化

如果用质粒DNA做载体，cDNA与载体连接后可直接转染宿主细胞，建立cDNA文库。如采用噬菌体为载体，必需经过体外包装，形成噬菌体颗粒，感染宿主菌。

RNA提取

将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。