实验一质粒提取
提取质粒实验报告
提取质粒实验报告提取质粒实验报告引言：质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，通过提取质粒，可以获得目标基因的DNA序列，进而进行进一步的研究和应用。
本实验旨在通过一系列步骤，从细菌中提取质粒，并对提取的质粒进行分析和鉴定。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 大肠杆菌培养液- 质粒DNA提取试剂盒- 离心管- 离心机- 试剂盒中的缓冲液、溶解液、洗涤液、洗涤缓冲液、洗涤液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液2、洗涤缓冲液浓缩液3、洗涤缓冲液浓缩液4、洗涤缓冲液浓缩液5、洗涤缓冲液浓缩液6、洗涤缓冲液浓缩液7、洗涤缓冲液浓缩液8、洗涤缓冲液浓缩液9、洗涤缓冲液浓缩液10- 水浴锅- 离心管架2. 实验方法：- 步骤一：将大肠杆菌培养液离心，收集菌体沉淀。
- 步骤二：将收集的菌体沉淀加入溶解液中，使其充分溶解。
- 步骤三：加入缓冲液，进行离心分离。
- 步骤四：将上清液转移到新的离心管中，加入洗涤液进行洗涤。
- 步骤五：加入洗涤缓冲液进行洗涤。
- 步骤六：加入洗涤缓冲液浓缩液进行洗涤。
- 步骤七：加入洗涤缓冲液浓缩液2进行洗涤。
- 步骤八：加入洗涤缓冲液浓缩液3进行洗涤。
- 步骤九：加入洗涤缓冲液浓缩液4进行洗涤。
- 步骤十：加入洗涤缓冲液浓缩液5进行洗涤。
- 步骤十一：加入洗涤缓冲液浓缩液6进行洗涤。
- 步骤十二：加入洗涤缓冲液浓缩液7进行洗涤。
- 步骤十三：加入洗涤缓冲液浓缩液8进行洗涤。
- 步骤十四：加入洗涤缓冲液浓缩液9进行洗涤。
- 步骤十五：加入洗涤缓冲液浓缩液10进行洗涤。
- 步骤十六：将洗涤后的质粒DNA溶解于水中。
实验结果与讨论：在本实验中，我们成功地从大肠杆菌中提取到了质粒DNA，并进行了分析与鉴定。
通过对提取的质粒DNA进行电泳分析，我们观察到了明显的DNA条带，表明质粒DNA的提取是成功的。
此外，我们还对提取的质粒DNA进行了鉴定。
通过使用限制性内切酶对质粒DNA进行切割，并进行电泳分析，我们可以确定质粒中是否存在目标基因。
实验一低拷贝质粒的大量提取
3、可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇）， 使终浓度为170μg/ml。 有些质粒只要生长达到，新一代的质粒（如pUC质粒）可复制到很高的拷贝数， 因此无需扩增。但像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝复制质粒，有必要扩 增。用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积 和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细 菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。
碱裂解法试验步骤
菌液收集：4℃以8000rpm离心10min，弃上清，敞开离心管口 并倒置离心管，使上清全部流尽。 （每个人35ml菌液）
1、将35ml 培养物的细菌沉淀物重悬于0.35ml溶液Ｉ中。 2、加0.7ml新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，
以混合内容物。切勿剧烈振荡！然后将离心管放置在冰上5 分钟。 4、加0.5ml用冰预冷的溶液Ⅲ。封住瓶口，反复颠倒离心瓶数 次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。于冰上 放置10min，会出现一白色絮状沉淀。（沉淀应包括染色体 ＤＮＡ、 高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物） 5、４℃条件下，12000rpm，离心15min。然后尽可能将上清 全部转到另一离心管中，弃去残留的粘稠状液体。
乙醇洗涤沉淀。倒出乙醇，并除去附于瓶壁的所有液滴，室温下将瓶倒 置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发完全。
9、用TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。每只EP管中加入约50ml。然后集中在一只 EP管中。
10、加入RNAase 3ml（10mg/ml）消化其中的RNA，37 ℃条件下反应1h。 收集
1、将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（OD600约0.6)。培养基中应 含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体培养物进行接种。
实验一 质粒提取
离心分离
• 质粒DNA存在于上清中，回收
纯化
• 苯酚/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀
二、实验原理
碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差 异来分离它们的。在碱性pH，DNA变性，当恢复中性并在高盐离子 浓度时，绝大多数质粒DNA可以准确复性，留在上清中；而线性染色 体DNA不能准确复性，相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质发 生沉淀。离心后获得含有大量质粒的上清液，利用亲水性有机溶剂 （乙醇、异丙醇、PEG8000）使质粒DNA脱水，离心后收集。
五、注意事项——核酸分离、纯化
采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质 的方法
五、注意事项——核酸沉淀、溶解
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀 会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充 分沉淀 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 （TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase； pH值为8.0，可防止DNA发生酸解）
七、问题与讨论
简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以 及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的 现象及其成因。
10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液或者灭菌水(pH8.0，含 20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
碱裂解法流程图
上清液 沉淀
对数期菌体
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
酒精沉淀
溶液II裂解
分子生物学实验
实验一.质粒提取与琼脂糖电泳一、目的掌握质粒的提取方法及原理；琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。
二、原理1.质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。
质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
在pH 12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。
硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。
2.带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。
电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。
琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。
在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
三、实验材料、仪器、试剂（1）菌种：大肠杆菌DH5α（2）分子生物学试剂10mg/ml溴化乙锭（EB）:按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。
50×TAE电泳缓冲液:24.2g Tris5.71g 冰乙酸10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。
6×上样缓冲液:0.25% 溴酚蓝40%（W/V）蔗糖水溶液1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖溶于100ml 1×TAE电泳缓冲液中，溶化后加入5μl 10mg/ml EB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到0.5mg/ml。
实验一质粒的提取
实验一质粒的提取
实验目的
了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法； 掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。
实验原理
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复 制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小 型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室 常用的方法。
这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与 线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离 它们。
实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器
（二） 材料
大肠杆菌E. coli DH 5α含重组质粒 pET-32a-SmPR10
（三） 试剂
1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml，搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调
• 噬菌体
这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
SDS （ 1%，新鲜配制）
• 酵母人工染色体（YAC）
• 反转录病毒载体
• 表达载体等
pET-32a Vector
The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.
质粒提取实验报告分析
质粒提取实验报告分析引言质粒提取是分子生物学实验中常用的技术手段之一，可以用于获取目标质粒并纯化。
在本次质粒提取实验中，我们使用了传统的琼脂糖凝胶柱层析法提取目标质粒。
本报告将对实验过程、结果和讨论进行详细的分析。
实验方法1. 质粒培养和提取1. 选取目标质粒进行大规模培养，添加适量的抗生素并摇床培养。
2. 收集培养液，离心沉淀并洗涤。
3. 使用琼脂糖凝胶柱层析法提取目标质粒。
2. 质粒浓度检测1. 取提取得到的质粒样品，使用纳米比色计测量DNA的浓度。
2. 根据测量结果计算质粒的浓度。
实验结果1. 质粒提取情况根据琼脂糖凝胶柱层析法分离得到的质粒经紫外线照射后观察，发现提取效果良好，目标质粒很大程度上得到了纯化。
2. 质粒浓度检测根据纳米比色计的测量结果，计算得到质粒的浓度为XX ng/μl。
测量的标准曲线显示结果可靠。
结果分析1. 实验验证质粒提取的过程中，通过琼脂糖凝胶柱层析法有效地分离出了目标质粒，并得到了相对较纯的质粒样品。
通过紫外线照射观察质粒形态，进一步确认了提取效果良好。
2. 质粒浓度结果根据浓度检测结果，我们可以初步了解到质粒的含量。
这对后续实验的设计和操作非常重要。
结论通过本次实验使用琼脂糖凝胶柱层析法提取质粒，成功获得了相对纯净的目标质粒样品。
质粒的浓度检测结果进一步验证了实验的成功。
这为后续的实验研究和应用提供了基础数据。
改进和展望1. 实验中可以尝试使用其他提取方法，比较不同方法的效果并选取最佳方案。
2. 在质粒浓度检测方面，可以引入其他的分析方法，如凝胶电泳等，以更全面地评估质粒的品质。
参考文献[1] 张三, 李四. 质粒提取实验方法综述[J]. 生物技术通讯,20XX,XX(XX):XX-XX.。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
实验一质粒DNA的提取及检测
☆原理示意图 返回目录 返回原理
三、实验仪器、材料与试剂
（一）仪器：恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌、 （三）试剂：
LB培养基（液体、固体） 溶液I 溶液II 溶液III TE(pH8.0)
溶液 I
50 mmol/L 葡萄糖/1mg/mL溶菌酶 25 mmol/L Tris·Cl (pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 在10 lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，
六．注意事项
为提高质粒产量，要注意下面两个步骤： 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮； 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5~10次) ，使蛋白
质和核酸变性； 加溶液III后pH要达到中性(轻柔振荡5~10次 )，使质粒
DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分 开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌 握。
12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管
沉淀法
上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min
12000rpm，离心15min
沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（轻弹混匀、离心）
12000rpm，离心10min
晾干沉淀
沉淀用20ul TE溶解
吸附法
吸附管用BL 500ul平衡
6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体
100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温10min
加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体
加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性
12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管
质粒提取实验报告
1. 学习并掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和操作步骤。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳技术，用于检测提取的质粒DNA。
3. 熟悉实验室安全操作规程，提高实验技能。
二、实验原理质粒是细菌细胞质中独立于染色体之外的小型环状双链DNA分子，具有自主复制能力。
在基因工程中，质粒常作为载体携带外源基因进行扩增和表达。
本实验采用碱裂解法提取质粒DNA，其原理是利用碱性环境使细菌细胞壁和细胞膜破裂，蛋白质变性，从而使质粒DNA与蛋白质等杂质分离。
随后，通过酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤纯化质粒DNA。
三、实验材料1. 大肠杆菌菌种（含有质粒）2. LB液体培养基3. 碱裂解液（含SDS、NaOH）4. 酚-氯仿5. 乙醇6. TE缓冲液7. 琼脂糖8. 电泳缓冲液9. DNA分子量标准10. 紫外线灯11. 凝胶电泳仪12. 离心机13. 微量移液器14. 玻璃棒1. 菌液制备：将含有质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜。
2. 离心：取1.5ml菌液，4000r/min离心5min，弃上清液。
3. 碱裂解：向沉淀中加入100μl碱裂解液，混匀，室温放置5min。
4. 酚-氯仿抽提：取1/3体积的酚-氯仿，加入上述裂解液，混匀，室温放置10min。
5. 离心：4000r/min离心10min，取上清液。
6. 乙醇沉淀：向上清液加入等体积的乙醇，混匀，-20℃放置1h。
7. 离心：8000r/min离心10min，弃上清液。
8. 溶解：用50μl TE缓冲液溶解沉淀，即为提取的质粒DNA。
9. DNA琼脂糖凝胶电泳：取5μl提取的质粒DNA，加入1μl DNA分子量标准，进行琼脂糖凝胶电泳。
10. 观察：打开紫外线灯，观察电泳结果。
五、实验结果1. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的质粒DNA在相应位置出现条带，与DNA分子量标准相符。
2. 提取的质粒DNA纯度较高，无杂质。
六、实验讨论1. 碱裂解法提取质粒DNA操作简便，效率较高，是实验室常用的提取方法。
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
下面是进行碱裂
解法提取质粒DNA的实验步骤：
1. 培养细胞：选择所需的质粒含有目标基因的细菌，如大肠杆菌等，并在适当的培养基中培养细菌，使其达到对数生长期。
2. 收集细菌：将培养好的细菌菌液转移到离心管中，并进行离心，以沉淀细菌。
3. 溶解细菌：加入一定浓度的碱液（例如0.2N NaOH）使细
菌溶解。
通常使用细菌菌液总量的1/5体积的碱液，并轻轻摇
晃混合。
4. 添加中和液：将等体积的中和液（例如3M乙酸酸化乙酸钠
溶液）加入到溶解好的细菌溶液中，并迅速而轻轻地混合。
5. 离心：将混合液进行离心，以除去沉淀的细菌残渣和碱液。
6. 提取DNA：将上一步离心得到的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，并轻轻摇晃，使DNA沉淀。
7. 沉淀DNA：进行高速离心，使DNA沉淀。
8. 弃去上清液：弃去上清液，保留沉淀的DNA。
9. 洗涤DNA：使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除残留的盐类和碱液。
10. 干燥DNA：使用洗涤干净的乙醇或空气干燥DNA沉淀。
11. 溶解DNA：用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解DNA。
12. 储存DNA：将溶解好的DNA储存于适当的温度和条件下，用于后续实验。
实验一碱裂解法提取质粒DNA
实验一-碱裂解法提取质粒DNA 碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。
质粒是一种裸露的、结构简单的小型环状DNA，它们存在于许多细菌细胞中，可以自主复制和表达。
质粒通常用于克隆和转化实验，是分子生物学实验中常用的工具之一。
一、实验目的通过碱裂解法提取质粒DNA，进一步了解质粒的基本性质和提取过程，为后续的分子生物学实验打下基础。
二、实验原理碱裂解法是一种利用细菌细胞壁和质粒DNA在不同pH值下稳定性的差异，将细胞壁和质粒DNA分离的方法。
在pH值高于7.5的环境下，细菌细胞壁的稳定性降低，而质粒DNA的稳定性相对较高。
通过加入碱液（如NaOH）并加热，可以破坏细菌细胞壁，使细胞内容物释放出来。
在pH值低于7.5的环境下，质粒DNA的稳定性降低，而细菌染色体DNA的稳定性相对较高。
通过加入高浓度的醋酸钾溶液并冰浴，可以沉淀出染色体DNA，而质粒DNA则留在上清液中。
三、实验步骤1.准备所需试剂和器材，包括细菌培养液、NaOH、KAc、冰浴、离心管、移液器等。
2.将细菌培养液倒入离心管中，用移液器加入适量NaOH，搅拌均匀。
3.将离心管放入沸水浴中加热5分钟，使细菌细胞壁破裂，释放出细胞内容物。
4.用移液器加入适量KAc，搅拌均匀，使pH值降低至7.5以下。
5.将离心管放入冰浴中冷却10分钟，使染色体DNA沉淀出来。
6.用离心机将上清液和沉淀物分开，收集上清液。
7.在收集的上清液中加入适量的乙醇，放在-20℃冰箱中冷冻1小时，使质粒DNA沉淀出来。
8.用离心机将沉淀物和上清液分开，收集沉淀物。
9.用适量的TE缓冲液溶解沉淀物，得到质粒DNA溶液。
10.用紫外分光光度计测定质粒DNA溶液的浓度和质量。
四、实验结果与数据分析1.实验结果：通过紫外分光光度计测定，得到质粒DNA溶液的浓度和质量。
通常，提取到的质粒DNA溶液需要有一定的浓度和质量才能进行后续的分子生物学实验。
2.数据分析：根据实验数据可以分析出提取到的质粒DNA溶液的质量和浓度是否符合要求。
细菌质粒提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握碱裂解法提取细菌质粒的原理和操作步骤。
2. 了解质粒DNA在分子生物学研究中的应用。
3. 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
二、实验原理质粒是细菌细胞内的一种小型、环状、双链DNA分子，独立于细菌染色体之外。
质粒携带的基因可以赋予细菌额外的生理代谢能力，如抗生素耐药性等。
碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法，其原理如下：1. 在碱性条件下，蛋白质与DNA发生变性，质粒DNA与染色体DNA分开。
2. 加入盐溶液使pH值恢复至中性，质粒DNA迅速复性，而染色体DNA不易复性，形成网状结构。
3. 通过离心，将质粒DNA与蛋白质、染色体DNA等杂质分离。
三、实验材料与仪器1. 仪器：恒温摇床、台式离心机、微量移液器、紫外灯、凝胶成像系统、电泳仪、凝胶制备装置等。
2. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、NaOH溶液、SDS溶液、KAc溶液、酚/氯仿/异戊醇溶液、无水乙醇、TE缓冲液、琼脂糖、DNA Marker、染色剂等。
3. 菌种：含质粒的大肠杆菌菌株。
四、实验步骤1. 菌液的制备：将含质粒的大肠杆菌菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
2. 收集菌体：取适量培养液，4000r/min离心2min，收集菌体。
3. 菌体裂解：向菌体中加入NaOH和SDS溶液，65℃水浴10min，使蛋白质与DNA变性。
4. 质粒DNA的纯化：向裂解液中加入KAc溶液，混匀后4℃静置10min，使质粒DNA沉淀。
5. 离心：4000r/min离心10min，收集沉淀。
6. 洗涤：向沉淀中加入70%乙醇，混匀后4℃静置10min，再次离心，收集沉淀。
7. 干燥：将沉淀干燥至完全无水。
8. 溶解：向沉淀中加入适量TE缓冲液，溶解质粒DNA。
9. 琼脂糖凝胶电泳检测：取适量质粒DNA溶液，加入上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
五、实验结果与分析1. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，质粒DNA在凝胶上呈现清晰的单一条带，表明质粒DNA已成功提取。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告(2020年整理).pptx
实验一、质粒 DNA 的提取及检测
【实验目的】 1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术 3、学会 PCR 操作的基本技术
第一部分 质粒DNA 的提取
一、实验原理： 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差
二、仪器与试剂 1、仪器 恒温摇床、台式离心机 2、试剂 溶液 I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE 缓冲液、胰 RNA 酶、酚、氯仿
三、实验步骤 1、 将 2mL 含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的 LB 液体培养基加入到试管中，接入含 pUC19
质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 2、 取 1.5mL 培养物倒入微量离心管中，4000r/min 离心 2min。 3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4、 将细菌沉淀悬浮于 100μL 溶液 I 中，充分混匀，室温放置 10 min。 5、 加 200μL 溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上 5min。 6、 加入 150μL 溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置 15min。 7、 12000r/min，离心 15min，将上清转至另一离心管中。 8、 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心 5min，
变性
94℃
45s
退火
56℃
45s
延伸
72℃
45s
完全延伸
72℃
3min
（3）PCR 结束后，取 10μl 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光条带。
第三部分 PCR 扩增制备目的基因
实验一 质粒DNA的提取及定性定量分析
XX学院课程实验报告姓名专业班级成绩日期第次实验同组姓名指导教师实验名称实验一质粒DNA的提取及定性定量分析一，实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。
二，实验原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。
在PH介于12.0~12,5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性，而共价闭合环状质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密结合在一起，当加入PH4.8的乙酸甲高盐缓冲液恢复PH至中性时，共价闭合的环状质粒DNA的复性迅速而准确，而线性染色体的DNA因两条互补链已完全分开，复性就没这么迅速准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与大分子的RNA、蛋白质—SDS复合物等一起，沉淀下来而被除去。
三，实验器材小指管、台式离心机、漩涡振荡器、大肠杆菌、冰、溶液I、溶液II、溶液III.、酚：氯仿：异戊醇、氯仿：异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、TE缓冲液等四，实验步骤1、将过夜培养的大肠杆菌菌液加入1.5ml小指管中，4000r／min离心1min，吸去培养液，将所有菌体细胞收集到一个小指管中。
2、加入100微升溶液I于含菌体细胞的小指管中，漩涡震荡将细胞沉淀悬浮，室温放置10min.3、加入200微升溶液II（新鲜配制），轻轻混匀内容物，1min之内加入150微升溶液III（冰上预冷），盖紧管口，轻轻混匀数次，冰上放置15min让质粒DNA复性（千万不可以用漩涡振荡器）。
4、12000r／min离心10min，将上清液转至令一1.5ml小指管中。
5、向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1去蛋白质和脂质），漩涡混匀后，冰上放置10min，12000r／min离心10min，将上清液转至令一1.5ml小指管中。
6、向上清液加入2倍体积无水乙醇，漩涡混匀后，冰上放置10min，12000r／min离心10min，吸去上清液。
[整理版]实验一质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳
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实验一、质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳一、实验目的掌握质粒DNA提取的基本原理与实验技能，同时熟悉DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理与实验技能，进而了解质粒和核酸的基本性质以及琼脂糖凝胶电泳的特性。
同时，掌握微量移液器、凝胶成像系统、紫外投射仪等实验仪器的使用方法。
二、实验原理利用SDS使细胞膜裂解，同时在碱作用下细菌的线形染色体DNA变性，而质粒DNA（共价闭合环状DNA，cccDNA）的二条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，从而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中，通过离心将可以将质粒DNA提取出来。
DNA制备膜可选择性地吸附DNA，从而可快速地纯化质粒DNA。
琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。
实验室中常规实验，一般用琼脂糖水平凝胶电泳装置进行DNA电泳。
DNA在琼脂糖凝胶电泳中的快慢与DNA分子大小、琼脂糖浓度、DNA分子构象、电流电压和离子强度等多种因素有关。
DNA的显色原理为溴化乙啶（EB）或其它染料可嵌入堆积的碱基对之间，在紫外灯下发荧光。
但需注意EB是一种强诱变剂！三、实验材料、仪器与试剂（一）、实验材料含有质粒pBS的DH5α菌株（二）、实验仪器微量移液器，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，冰箱，琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统，紫外投射仪等。
（三）、实验试剂与配制1、小量质粒DNA提取试剂盒2、LB液体培养基: 蛋白胨（tryptone）10g, 酵母提取物（yeast extract）5g, NaCl10g, 用NaOH调至pH7.2-7.5。
高压下蒸汽灭菌20分钟。
3、LB固体培养基：每升液体培养基加12g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。
4、氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 ℃下保存备用。
实验一 质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测
实验一质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测一、实验内容1.采用碱裂解法提取质粒DNA2.采用限制性内切酶对质粒进行酶切3.采用琼脂糖电泳对所提取的质粒DNA及其酶切产物进行鉴定二、实验目的和要求1.掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法2.掌握限制性内切酶酶切DNA的操作过程3.掌握琼脂糖电泳的原理和方法三、实验仪器、材料和试剂1.仪器：摇床、无菌操作台、离心机、电泳仪、凝胶成像仪等2. 材料：移液枪、枪头、离心管、三角烧瓶等3. 试剂：LB培养基，卡那霉素，质粒提取试剂盒，琼脂糖，电泳缓冲液TAE,核酸染料，DNA Marker(DL2000，λ-Hind III digest DNAMarker), Eco R I内切酶等。
四、实验操作1. 质粒提取（1）挑取单菌落至3 mL LB液体培养基，37℃摇动（200 rpm）培养过夜。
（2）转移菌液至1.5 mL Eppendorf管中，12000 rpm离心45 sec，尽量弃尽上清。
（3）加入250 l 预冷的PI(请先检查是否加入RNaseA)，使用移液器彻底混匀细菌沉淀，充分悬浮，静置2 min。
注意：如果有未彻底悬浮的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度的偏低。
（4）向离心管中加入250ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈振荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。
此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒收到破坏。
如果未变得清亮，可能菌体过多，裂解得不彻底，应减少菌体量。
（5）向离心管中加入350ul 溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。
12,000rpm离心1min，此时在离心管底部形成沉淀。
注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小的白色沉淀，可再次离心后取上清。
（6）向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL，12,000rpm 离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附管重新放入收集管中。
质粒提取酶切实验报告
质粒提取酶切实验报告实验一质粒的提取酶切实验目的掌握质粒小量快速提取法。
用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度。
实验原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子。
大小在1~200kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子。
主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。
他可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型。
采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。
用酒精沉淀洗涤，可得到质粒DNA。
在细胞内，共价闭环DNA（cccDNA）常以超螺旋形式存在。
若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（ocDNA）。
在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。
限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。
EcoR=1\*ROMANI和Bgl=2\*ROMANII的识别序列和切口是：EcoR=1\*ROMANI：G↓AATTCBgl=2\*ROMANII:A↓GATCTG，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
用已知分子量的线状DNA为，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。
实验一 质粒DNA 的提取纯化
实验一质粒DNA 的提取纯化本实验采用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒从大肠杆菌E. coli Top10中抽提质粒pUC19。
该试剂盒采用改进的SDS-碱裂解法，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA 的目的。
适合于从1～4 mL细菌培养物中提取多至20μg高纯的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。
本实验要求：1．通过本实验学习和掌握改进的SDS-碱裂解法提取质粒DNA。
原理把一个目的DNA片段通过重组DNA技术，进入受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
质粒(Plasmid)作为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，广泛应用于基因操作的各个方面。
因此，质粒的分离与提取是分子生物学中最常用、最基本的实验技术。
质粒是一种染色体外的DNA分子，其大小范围从1～200kb不等。
大多数来自细菌细胞的质粒为双链、共价闭合环状的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型和松驰控制型。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
通常所用的质粒载体有pBR322、pUC18、pUC19等，本实验提取pUC19质粒。
从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
碱裂解法的原理是：碱性条件下，用十二烷基磺酸钠(SDS) 破坏菌体细胞壁，并使菌体蛋白质和染色体DNA变性，双链解开。
01 质粒的提取.
实验仪器、材料、试剂
（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机
5. 微量取液器
（二）材料
含重组质粒的大肠杆菌 DH 5α菌液。
（三）试剂 1. SolutionⅠ 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.· Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0)
4. 加400μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-10 次，室温放置5分钟。室温13,000 rpm离心10 分钟，小心取上清。 5. 将吸附柱安置于收集管上，加入500μl溶液 P4，室温13,000 rpm离心1分钟，弃滤液；将 上一步所得上清液加入吸附柱AC中（吸附柱 放入收集管中），13,000 rpm离心1分钟，弃 滤液。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏 低。
3．加250μl的溶液P2，温和地上下翻转6－10 次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！ 所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。 此时菌液应变 得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。
取出吸附柱ac放入一个干净的离心管中在放入一个干净的离心管中在吸附膜的中间部位加2025l洗脱缓冲液洗脱缓冲液eb洗脱缓冲液事先在6570水浴中加热效果更好室温放置水浴中加热效果更好室温放置11分钟13000rpm离心11分钟洗脱dna可立即用或或保于下游分子生物学实验或20
实验一 质粒ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ提取（碱法）
载体结构的三大要素： • • • 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制起点
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③质粒对宿主生存并不是必需的。
Replication of plasmid
• stringent manner – 复制子（pSC101）的调节分子是RepA 蛋白，它对复制的起始具有正向作用，而对其自身基因的 转录具有负调控作用。严紧型质粒的复制需要蛋白质的不 断合成，这种质粒在每个细胞中只有1-5个拷贝。
溴化乙锭(ethidium bromide EtBr)：0.5ug/ml
荧光染料，含有一个可以嵌入DNA堆积碱基 之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几 乎没有碱基序列特异性。
SYBR gold fluorescence dye：
是一种特有的能够激发荧光的非对称花青 染料。
• 其灵敏度更高 • 当被波长为300nm的透射光照射时，可
Relaxed manner – pMB1/colE1复制子
质粒的应用
• 质粒的特点使质粒成 为携带外源基因进入 细菌中扩增或表达的 重要媒介物，这种基 因运载工具在基因工 程中具有极广泛的应 用价值。
• 大多数基因工程使用 松弛型质粒。
常用质粒
pGEM®-7Zf(-) Vector circle map and sequence reference points
超螺旋DNA＞线状DNA ＞开环DNA
2.凝胶浓度
3.电场强度
低电压时，迁移率与电压成正比。
当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范 围反而减小。要获得大于2kb DNA片段的 良好分辨率，电压一般不超过 5V/cm。
4. 缓冲液离子强度
TAE 比 TBE TPE 快10% 三种的分辨率相近
凝胶上DNA的染色
重组质粒的构建包括质粒酶切、酶切产物目的片段的回收、回 收片段与载体连接等步骤，涉及一系列相互关联的酶促反应。
3. 电泳
背景知识
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α（1-3）β（1-4）交替构 成的线状聚合物。
Chemical Structure of Agarose
水平板凝胶电泳 垂直板凝胶电泳
• relaxed manner –在携带pMB1/colE1复制子的质粒中，正 向调节分子是一种RNA （RNAII），用作引发DNA前导链 的起始合成。其复制不需要任何质粒编码的蛋白质。完全 依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质。每个细胞中有 15-20个拷贝。
• 通过对复制子改造，拷贝数能达到500-700 （例如 pPUC19）。
binding site of pUC/M13 Reverse Sequencing Primer 158–174
2. DNA重组
背景知识
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的 DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 +、ATP存在 的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子 进行连接。
质粒是一种小的双链环状DNA分子，是独 立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助 性遗传单位。
用于基因克隆的载体
必须具备的条件：
1）能够在寄主细胞内独立自主复制； 2）具有可检测的选择性标记； 3）具有多克隆位点； 4）具有较高的外源DNA的载装能力; 5) 具有针对受体细胞的可转移性。
载体种类：有来自大肠杆菌的质粒、λ噬菌体、 M13噬 菌体、噬菌粒外，还有酵母、细菌人工染色 体载体以及动、植物病毒载体。
121–140
lacZ start codon
162
lac operator
182–198
β-lactamase (Ampr) coding region
1319–2179
phage f1 region
2363–2818
binding site of pUC/M13 Forward Sequencing Primer 2939–2955
背景知识
1. 质粒与载体
1952， J. Lederberg reviews the literature on cell heredity and suggests the term plasmid for all extrachromosomal hereditary determinants.
Pouring a Horizontal Agarose Gel
影响DNA在凝胶中迁移率的因素
样品的物理性状 凝胶浓度 电场强度 缓冲液离子强度
1.样品的物理性状
DNA分子的大小
迁移率与碱基对数的常用对数成反 比。分子越大，迁移得越慢。
DNA构象
超螺旋环状 线状DNA 切口环状
质粒分子，在一定条件下，泳动率的大 小顺序为：
T7 RNA polymerase transcription initiation site
1
SP6 RNA polymerase transcription initiation site
123
T7 RNA polymerase promoter (–17 to +3)
2982–3
SP6 RNA polymerase promoter (–17 to +3)
以发出量黄色荧光
• 1：10,000稀释使用，用电泳缓冲液当天 配置，室温存放。
模块一 重组质粒构建和重组子Байду номын сангаас筛选与鉴定
实验一 质粒DNA的提取和电泳检测 实验二 重组质粒的构建：酶切、目的片段回收、连接 实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化 实验四 重组质粒的鉴定
分子生物学与基因工程实验技术
前言
模块一 重组质粒构建和重组子的筛选与鉴定 模块二 植物遗传转化 模块三 转化烟草的鉴定
模块一 重组质粒构建和重组子的筛选与鉴定
实验一 质粒DNA的提取和电泳检测 实验二 重组质粒的构建：酶切、目的片段回收、连接 实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化 实验四 重组质粒的鉴定
Characteristics of plasmids
①是染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构， 不同质粒大小在2-300 kb之间，＜15kb的小质粒比较容易 分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。