细胞内微核的检测
3种微核检测方法的比较
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医学：人外周血淋巴细胞微核测定
06 微核测定的研究展望
CHAPTER
提高检测灵敏度与特异性
优化样本处理
通过改进样本处理方法，减少杂质干扰，提高检测的灵敏度和特 异性。
研发新型标记物
探索新的生物标志物，以更准确地反映细胞损伤和疾病状态。
引入人工智能技术
利用人工智能算法对检测结果进行深度分析和模式识别，提高检测 的准确性和可靠性。
结果分析
计数微核率
对观察到的具有微核的淋巴细胞进行计数，计算微核率。微 核率越高，说明受试者的染色体受到损伤的程度越高。
结果解读
根据微核率的大小，结合受试者的基本信息和健康状况，对 结果进行解读，为受试者的健康状况提供参考依据。
04 微核测定的结果解读
CHAPTER
正常值范围
1
正常值范围因年龄、性别、种族等因素而异，通 常根据大样本统计数据确定。
在辐射损伤评估中的应用
辐射暴露监测
微核测定可以用于监测辐射暴露者的DNA损伤程 度，评估辐射对人体的影响。
辐射剂量估算
通过微核计数可以估算辐射剂量，为受辐射损伤 人员的治疗和康复提供参考。
辐射危险评估
微核测定可以用于评估不同人群在不同环境中的 辐射危险程度，为制定防护措施提供依据。
在药物安全性评价中的应用
02
微核是由于染色体断裂或异常复 制形成的，是细胞染色体异常的 标志之一。
微核测定的历史与发展
微核测定最早由国外学者于20世纪 70年代提出，经过几十年的发展， 已经成为一种广泛应用于医学、生物 学和环境科学领域的实验室技术。
随着技术的不断进步，微核测定的方 法不断完善，检测的灵敏度和特异性 不断提高，为科学研究提供了更加可 靠的实验数据。
医学人外周血淋巴细胞微核测 定
实验三、微核试验
3．固定：
将推好晾干的骨髓片放进染色缸中，甲醇固定15分钟， 取出晾干。
4．染色(建成试剂盒Giemsa染液)
用染液一3滴，染色8min，再加染液二6滴，洗耳球混 匀5min。细流水冲掉玻片染色液，晾干。
9
5．观察计数
先用低倍镜观察，选择分布均匀的区域，再在油镜下观察 计数。 PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）桔黄色。 细胞中的微核大半呈圆形，边缘光滑，嗜色性与核质一致， 一个细胞内可以出现一个或多个微核。
11
注意事项：
1. 注意不要把股骨剪断 2. 挤出骨髓处的肌肉要剔除干净 3. 滴到玻片上的生理盐水不要太多，涂时要涂匀，
以便推片 4. 染色前可以先看一下整体涂片情况，细胞分散度
是否良好 5. 关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优良的染色
12
MN（微核） NCE
正染红细胞 ( 成熟红细胞 ）
显微镜下微核观察 13
微核试验是观察受试物能否产生微核的试验。主要可检出
DNA断裂剂和非整倍体诱变剂(染色体损伤)。 传统的微核试验是体内试验, 常用细胞小鼠骨髓多染红细胞(PCE)
3
微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常 核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一 次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，
计数1000个PCE中含微核的PCE数，并计算200个细胞中 PCE/NCE的比值。
10
6. 结果分析与评价
• 本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。 • PCE／NCE为评价细胞毒性的指标。 • 正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2），
如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制； 如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。
微核的诱导和检测
五 数据分析
1． 计算各测试样品（包括对照组）微核千分率（MCN‰）
五 预期结果
1. 紫外线照射25min时能观察各种畸变类型,且畸 变率较高 2.微核数目可能随试剂的浓度呈正相关，但有实 验数据表示，当浓度上升到一定程度时，微核数 目减少；具体的要看我们自己的实验。
微核测试是一种比较理想的方法。且有研究显 示以植物进行微核测试与以动物进行的一致率 可达99%以上。目前微核测试已经广泛应用于 辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、 染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。 利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可 准确的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用 于污染程度的监测。
实验
微核的诱导和检测
一、实验目的 1．了解微核测试的原理和毒理遗传学在实际 生活与工作中的应用范围及意义 2．学习蚕豆根尖的微核测试技术
二、实验原理
微核简称(MCN)，是真核生物细胞中的一种异常结构，往往 是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。在细胞间期微核呈 圆形或椭圆形，游离于主核之外、大小应在主核1／3以下。 微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。一般认为微 核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，但有些实验 也证明整条的染色体或多条染色体也能形成微核。这些断片 或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第 三个核块
污染物 1.紫外线；紫外线的波长与DNA蛋白的最大吸收量波长相 符合，染色体的蛋白质能够吸收紫外线总的能量，从而 处于激活状态，从而引起一系列的DNA损伤。过量的紫 外辐射可引起细胞内DNA碱基发生突变、DNA断裂、 DNA．DNA交联、DNA．蛋白交联以及染色体畸变等损 伤。DNA损伤若不能及时修复，细胞将发生癌变或死亡， 不同剂量紫外线对细胞DNA的损伤模式不同，可能引起 的微核率也不一样 2.CuSo4；因为重金属抑制和干扰了G1期触发蛋白的合成， 限制了由G1期进入S期。因此，微核的形成是S期DNA 受到损伤的结果
骨髓细胞微核实验报告
骨髓细胞微核实验报告1. 背景骨髓细胞微核实验是一种常用的细胞遗传毒性检测方法，用于评估物质对人体细胞的影响。
该实验可以通过观察细胞核中的微核数量来判断物质是否具有诱发染色体损伤的能力。
在临床研究和毒理学评价中，骨髓细胞微核实验被广泛应用于药物筛选、环境污染物评估和职业危害监测等领域。
2. 实验目的本次实验旨在通过骨髓细胞微核实验，对不同浓度的化学物质进行评估，分析其对人体细胞的遗传毒性作用，并提出相应的建议。
3. 实验方法3.1 实验材料和设备•骨髓细胞培养基•不同浓度的化学物质溶液•细胞培养器•显微镜•细胞计数板•玻璃干片3.2 实验步骤1.采集实验对象的骨髓细胞，并将其接种在含有培养基的细胞培养器中，保持适宜的温度和湿度。
2.将不同浓度的化学物质溶液分别加入不同培养器中，同时设置对照组。
3.在一定时间后，将细胞样本离心并进行固定处理。
4.制备玻璃干片，并使用吉姆萨染色法染色。
5.在显微镜下观察细胞核中的微核数量，并记录下来。
4. 数据分析根据实验结果，我们可以得出以下结论：1.不同浓度的化学物质对骨髓细胞核中微核数量产生了影响。
随着化学物质浓度的增加，微核数量呈现出明显的上升趋势。
2.与对照组相比较，实验组细胞核中微核数量明显增加，表明该化学物质具有一定的遗传毒性作用。
5. 结果讨论本次实验结果表明该化学物质具有一定的遗传毒性作用。
微核是染色体损伤的指示器之一，其数量的增加可能意味着染色体断裂、染色体片段丢失或整个染色体的缺失。
这些染色体损伤与遗传突变和癌症等疾病的发生相关。
基于实验结果，我们建议：1.避免长时间接触该化学物质，特别是高浓度的暴露。
2.在工作场所进行必要的防护措施，如佩戴防护口罩、手套和工作服等。
3.进一步深入研究该化学物质的毒性机制和致突变潜能，以便更好地评估其对人体健康的风险。
6. 结论通过骨髓细胞微核实验，我们评估了一种化学物质对人体细胞的遗传毒性作用，并得出结论该化学物质具有一定的遗传毒性。
血淋巴细胞微核测定
差异显著性检验方法选择
1 2 3
t检验
当两组数据服从正态分布且方差齐性时，可采用 t检验比较两组均数差异的显著性。
非参数检验
当数据不满足正态分布或方差齐性的假设时，可 采用非参数检验，如Mann-Whitney U检验或 Kruskal-Wallis H检验等。
方差分析
当需要比较多组数据均数差异的显著性时，可采 用方差分析（ANOVA），并进一步通过多重比 较确定各组之间的差异。
将分离出的淋巴细胞均 匀涂抹在载玻片上，形 成单层细胞涂片。
用吉姆萨染液对涂片进 行染色，使细胞核着色 。然后用磷酸盐缓冲液 （PBS）冲洗去除多余 染液。
在显微镜下观察染色后 的淋巴细胞涂片，寻找 并观察微核。微核通常 呈圆形或椭圆形，独立 于主核之外，直径小于 主核的1/3。
在显微镜下对观察到的 微核进行计数，通常采 用盲法计数以避免主观 偏见。同时记录下观察 到的细胞总数和微核细 胞数，计算微核率（微 核细胞数/细胞总数） 。
血样采集与处理
血样采集
淋巴细胞分离
采集静脉血样，注意避免溶血和污染 。
通过密度梯度离心法等方法，分离出 血液中的淋巴细胞。
血样处理
将采集的血样进行抗凝处理，通常采 用肝素或EDTA作为抗凝剂。然后，将 抗凝全血在室温下静置一段时间，使 血细胞充分沉降。
微核的观察与计数
涂片制备
染色处理
微核观察
微核计数
监测环境污染
环境中的某些污染物如重金属、农药等，可能对人体遗传物质造成损害 。血淋巴细胞微核测定可用于监测环境污染对人体健康的影响。
03
职业健康监护
某些职业人群可能接触到具有遗传毒性的物质，如放射线、化疗药物等
毒理学 实验三、微核试验
两次染毒：第一次染毒后24小时进行第二次染毒， 6小时后取样；
多次染毒：每天染毒1次，连续染毒5天， 末次染毒后24小时取样。
7
2．骨髓液的制备和涂片
处死：颈椎脱臼法 处理： 取股骨，去掉血污和肌肉，用弯止血钳将骨髓
挤于预先滴有生理盐水的清洁载玻片上，混合均匀后推片
微核试验是观察受试倍体诱变剂(染色体损伤)。 传统的微核试验是体内试验, 常用细胞小鼠骨髓多染红细胞(PCE)
3
微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常 核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一 次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，
实验三、小鼠骨髓细胞微核试验
1
微核(Micronucleus)的概念
微核的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单 体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色 体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单 独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质 内，因比主核小，故称微核。
2
微核试验(Micronucleus test，MNT)的概念
计数1000个PCE中含微核的PCE数，并计算200个细胞中 PCE/NCE的比值。
10
6. 结果分析与评价
• 本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。 • PCE／NCE为评价细胞毒性的指标。 • 正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2），
如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制； 如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。
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3．固定：
将推好晾干的骨髓片放进染色缸中，甲醇固定15分钟， 取出晾干。
4．染色(建成试剂盒Giemsa染液)
微核的检测
注意事项
• 正确掌握微核的形态特征，避免假阳性。 • 以有核细胞形态是否完好作为判断制片优劣的标
准
实验（四）
细胞内微核的检测
原理
环境中有害物质可导致细胞中染色体或纺 锤体的损伤，产生的染色单体或无着丝粒片断 染色体在细胞分裂末期滞留于子细胞胞质中， 形成微核。
原理
本实验选用培养细胞，用顺铂作诱导剂 （或射线、环磷酰胺等） ，促使细胞中染色体 断裂，产生微核。
微核经Giemsa染色后呈紫红色，胞质被染 成淡灰蓝色。
微核的计算
先用低倍镜粗检，后用高倍镜，选细胞 分布均匀，细胞无损，着色适当的区域，计数。
每张玻片计数100-200个细胞，按“1‰”计 算微核的出现率，微核计数以“细胞”为单位， 即一个细胞中出现2个或2个以上微核时，也只 按“1”计算。
结果
微核大多数呈单个圆形，边缘光滑整齐，嗜色 性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色。
器材与试剂
• 显微镜、载玻片、染色缸、滴管等 • 培养细胞（PC12，小盖片） • 顺铂(终浓度20umol/l、40umol/l、60umol/l） • 甲醇固定液 • PBS（pH7.4） • Giemsa应用液（临用现配）
Giemsa原液：PBS＝1：9混合而成。
操作
培养细胞（小盖片）——加顺 铂—24—h PBS洗涤3次——甲醇固定 5min—— Giemsa染色5min——自 来水冲洗——显微镜下观察——计 数
实验5蚕豆根尖细胞微核检测技术
微核试验的应用 微核试验广泛应用于药品、食品添加剂、农药、化妆品、工
业化学品、环境污染物等遗传毒性的检测、安全性评价和遗传 损害的监测,为接触有害物质人群提供遗传损害检测和工作环境 监测,为行政管理部门的决策、立法奠定理论依据。
环境物质监测和致突变物检测 化疗后的细胞学损伤观察 放疗的遗传学损伤分析 特定人群的突变损伤检测和早期预报 利用微核试验筛选抗癌物质 利用微核试验指示环境污染的程度
编辑课件
微核形成机理
化学毒性物质 染色体断裂剂 可诱发染色体发生断裂的遗传毒性物质。细胞
核的主要成分是染色体,在正常的情况下细胞分裂时染色体被 纺锤丝牵引平均分向细胞的二极,形成二个正常的核,被平均 分配给二个细胞。在染色体断裂剂如丝裂霉素存在下,染色体 发生断裂,并不发生重接或不在原处重接,则形成了无着丝粒 的段片,在细胞分裂后期不能向两极移动,而残留在细胞中央 的赤道板附近,当子细胞形成时则游离于细胞质中形成不含着 丝粒的微核 。
编辑课件
2）污染指数（pollution index)
污染指数（PI)=样品实测MN‰ 平均值/标准水MN‰ 平均值 PI在 0- 1.5 区间为基本无污染
1.5-2.0区间为轻度污染 2.0-3.5区间为中度污染 3.5以上为严重污染 注：1）对严重污染的水环境，监查处理时造成根尖死亡，应稀释 后再做测试； 2）如RT> 35℃，MN本底会增高，但可经污染指数数据处理， 不会影响监测结果。
一般认为微核是有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。 这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主 核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时， 它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。微核率的多少与和 作用因子的剂量或辐射累积效应有正相关。
细胞毒理学实验六细胞微核的检测
预冷的玻片
有丝分裂指数（mitoticindex）：某一 分裂组织或细胞群中，处于有丝分裂M 期的细胞数占其总细胞数的百分数。
分裂相细胞数 有丝分裂指数 = ————————
细胞总数
有丝分裂指数
实验组（环磷酰胺）
对照组
平均值
取秋水仙素不同剂量组染色体制片，各随机选取3-5个视 野，统计各视野内的有丝分裂指数，并可对结果进行统计 学分析（独立样本T检验），比较两组数据有无显著性差 异。
镜检时，你能在视野中看到几种类型的细胞？ 计算吞噬细胞的吞噬指数和吞噬百分数。
吞噬百分数=
活化的吞噬细胞的数量 100个吞噬细胞
活化的吞噬细胞中吞噬的鸡红细胞的总量
吞噬指数=
100个活化的吞噬细胞
吞噬百分数
实验组
对照组
吞噬百分数平均 值
吞噬指数
吞噬指数平均值
在实验组和对照组小鼠腹腔液涂片上各随机选取多个视 野，统计各视野内的吞噬百分数和吞噬指数，并对结果 进行统计学分析（独立样本T检验），比较两组数据有无 显著性差异。
纺锤体毒物作用也可以产生微核，主核未能形成而 形成了一组小核。该微核往往比一般典型的微核稍 大。
骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而 且微核自发率低，是微核试验常用的细胞样本。
1．器材：解剖器具、注射器、离心机、离心管、恒 温水浴箱、载玻片、酒精灯等.
2．试剂 0.1%秋水仙素溶液、Carnoy固定液（甲醇： 冰醋酸＝3：1;甲醇：冰醋酸＝1：1 ）、0.075 mol / L KCI溶液、Giemsa染液、小牛血清等。
小鼠解剖残渣不要放入下水道。
实验结束后，请将实验用小鼠及垃圾放入垃圾袋， 值日生务必带走。
实验中使用的过滤细胞的尼龙滤网请勿丢弃，实验 完毕后放入白瓷盘并用玻璃漏斗或试剂瓶压住。
生物细胞的微核检测技术
生物细胞的微核检测技术一、原理微核(micronuclei)简称MCN,是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应有主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，整条染色体或几条染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成第三个核块。
微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。
所以许多人认为可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。
由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们很需要有一套高度灵敏，技术简单的测试系统来监视环境的变化。
只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。
目前国内外不少部门已把“微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。
二、步骤1.大蒜幼根的培养：提前3～5天进行培养，将大蒜瓣剥去外边膜质枯皮，下端可见许多微微凸起的根原体，将蒜瓣架在烧杯（大小与蒜瓣适宜）口上，杯中盛满清水，使蒜瓣的下部浸入水中，置温暖处，注意每天换水，经3～5天后，即可长出1-2cm的嫩根。
2.处理根尖：阳性检测采用M CrO3，M NaN3，M EMS，对照用自来水处理，处理时间24h。
3.恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次2-3min，洗净后在水中恢复培养24h。
4.固定：用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后弃去固定液，或换入70％酒精中保存。
5.酸解：弃去固定液，用清水漂洗2-3次，吸净水，加入6M盐酸，于室温解离10min，弃去盐酸，漂洗根尖2-3次，彻底洗净盐酸。
6.染色：截下1-2mm长的根尖，滴加石炭酸品红染液，染色10min，加盖玻片，压片观察。
微核测定实验报告
1. 掌握微核检测的基本原理和方法。
2. 了解微核形成的原因及其与遗传毒性的关系。
3. 通过实验，验证不同处理条件下细胞微核率的差异。
二、实验原理微核检测是一种快速、简便的遗传毒性检测方法，主要用于评估化学物质、物理因素等对生物体遗传物质的损伤。
实验原理是：在细胞分裂过程中，染色体发生断裂或畸变，导致染色体片段或整个染色体未能正常分配到子细胞中，形成微核。
通过显微镜观察细胞核形态，计数含微核的细胞数量，计算微核率，从而评估遗传毒性。
三、实验材料1. 细胞培养液2. 细胞培养皿3. 不同处理组的试剂（如溶剂、药物等）4. 显微镜5. 计数板6. 染色剂7. 计数器四、实验方法1. 将细胞培养至对数生长期。
2. 将细胞分为不同处理组，分别加入溶剂、药物等试剂，设置对照组。
3. 在不同处理条件下培养细胞24小时。
4. 收集细胞，用染色剂染色，制片。
5. 在显微镜下观察细胞核形态，计数含微核的细胞数量。
6. 计算微核率，并统计分析各组数据。
1. 对照组微核率：5.0% ± 0.5%2. 溶剂处理组微核率：4.5% ± 0.3%3. 药物处理组微核率：7.5% ± 0.8%六、实验分析1. 对照组微核率较低，说明正常细胞分裂过程中微核形成较少。
2. 溶剂处理组微核率略有下降，可能与溶剂对细胞的轻微损伤有关。
3. 药物处理组微核率明显升高，说明该药物具有一定的遗传毒性。
七、实验结论1. 微核检测是一种快速、简便的遗传毒性检测方法。
2. 本实验结果表明，该药物具有一定的遗传毒性，需要进一步研究其作用机制。
八、实验讨论1. 微核形成的原因可能与染色体断裂、畸变、缺失等因素有关。
2. 微核检测结果受多种因素影响，如实验条件、细胞类型、处理时间等。
3. 在实际应用中，应结合其他遗传毒性检测方法，全面评估物质的遗传毒性。
九、实验改进1. 在实验过程中，可增加实验重复次数，提高实验数据的可靠性。
骨髓细胞微核实验报告
骨髓细胞微核实验报告骨髓细胞微核实验是一项常用的毒理学检测方法，可以有效地评价某种物质对DNA损伤的影响，具有重要的毒性评价价值。
本文将对骨髓细胞微核实验进行详细的介绍和解读，为相关研究人员提供指导。
一、骨髓细胞微核实验原理骨髓细胞微核实验是通过体外培养动物骨髓细胞，观察其亚微米级大小的微核（Micronucleus，MN）形成情况来评价物质对DNA损伤的影响。
在骨髓细胞分裂时，如果染色体发生异常分离或断裂，就会产生一个或多个亚微米级的小核结构，称为微核。
微核中包含未被分离的染色体片段或全染色体，它们将被保留在新细胞核内，从而形成有两个或多个核的细胞。
形成微核的细胞与正常细胞相比，DNA的稳定性已经受到了不同程度的损伤。
因此，骨髓细胞微核实验通过检测细胞中微核的数量和形态，可以初步判断某种物质对DNA的损伤程度，进而评价其毒性。
二、骨髓细胞微核实验步骤1. 骨髓细胞培养：将动物骨髓细胞取出，利用适当的培养基进行体外培养。
通常可以采用罗氏61#或麦戈文液等培养基，具体选择应根据实验需要确定。
2. 处理检测物质：将待检测物质加入到骨髓细胞培养基中，通常需要设立不同的浓度梯度，以便观察物质对骨髓细胞DNA损伤的剂量效应。
3. 细胞收集：培养一定时间后，用适当的方法收集细胞，可选择离心法或离心浓缩法等，通常可在离心时加入适当的溶解剂溶解红细胞。
4. 细胞扩增：将收集到的细胞加入到分装好的培养皿中，加入细胞生长因子，推动细胞继续增殖。
5. 制片染色：取适当量的细胞悬液，制作染色片并染色。
一般情况下，常用的染色方法包括单盐酸染色、儿茶酚蓝染色和吉姆萨染色等。
6. 观察分析：观察所制的染色片，采用恒定镜观察和计数，并对微核数量和形态进行统计分析。
为了获得稳定可靠的数据，一个实验通常需要做多组重复测定。
三、常见问题解答1. 什么因素会影响骨髓细胞微核实验的结果？骨髓细胞微核实验受多种因素影响，如细胞染色质特征、培养时间和环境温度等，需要掌握合适的技术方法和实验环境。
植物细胞的微核测试技术及其应用
• • • •
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七 影响化学诱变效应的因素
• 诱变剂的理化特性 • 被处理材料的遗传类型及生理状态 • 诱变剂的浓度和处理时间： • 处理的温度： • 诱变剂溶液pH：
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06生物技术一班
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八 实验时应注意的问题
• 安全问题。化学诱变剂都有不同程度的毒性，在
06生物技术一班 4
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化学诱变剂的种类和性质
• 烷化剂类
甲基磺酸乙酯（EMS）、乙基 磺酸乙酯（EES）、甲基磺酸甲酯 （MMS）、丙基磺酸丙酯（PPS）、甲基 磺酸丙酯（PMS）、甲基磺酸丁酯 （DES）、亚硝基乙基脲（NEH）、亚硝 基乙基尿烷（NEU）、亚硝基胍（NTG）、 硫酸二乙酯（DES）、硫酸二甲酯 （MES）、乙烯亚胺（EI）。 • 核酸碱基类似物 5—溴脲嘧啶（5— BU），5—溴去氧脲嘧啶核苷（5— BUdR），8—氮鸟嘌呤、咖啡碱、马来酰 肼，2—氨基嘌呤（2AP）。 2013-10-26 5 06生物技术一班
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06生物技术一班
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解离： 将固定后的根尖清水清洗几次后，吸干水， 分装在试管中加入1N HCl溶液，在60℃ 下水解10min。解离后的根尖再用清水洗 2-3次，便于着色。 8. 染色，压片： 将解离后的根尖切除伸长区部位，放入凹 面玻片内，滴加改良苯酚品红溶液染色 10分钟左右。制片时，取根尖于干净载 玻片上，切取1mm左右的生长区，其余 部分弃掉，加半滴染液，加盖玻片。用镊 子在材料的部位轻压几下，使生长区细胞 分散开。
• 吖啶类（嵌入剂）
吖啶橙、二氨基吖啶、 人工合成ICR化合物。 • 无机化合物 H2O2、LiCl、亚硝酸、 MnCl2、CuSO4等。 • 简单有机化合物 抗生素、丝裂毒素、重 氮丝氨酸、中性红甲醛、氧化乙烯、重氮 甲烷、氨基甲酸乙酯、链霉素等。 • 异种DNA 高级酚 羟胺（HA）、苯的衍 生物、嘌呤及其衍生物、磺胺药物。 • 生物碱 石蒜碱、秋水仙碱、喜树碱、长 春花碱等。
微核检测技术
微核检测技术一、目的1. 了解微核测试原理和毒理遗传学意义。
2. 学习小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖的微核测试技术。
二、原理微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。
有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。
当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。
已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。
所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。
由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。
只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。
目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。
70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。
此后，微核测定逐渐从动物、人扩展到植物领域。
人和动物的微核测试多用骨髓和外周血细胞，这需要一定的培养条件与时间，细胞同步化困难，微核率低，一般只在0.2%左右。
而植物系统则更直接、更简便。
如采用高等植物花粉孢子利用其天然的同步性作微核测试材料，取得较好效果，其中70年代末Te-Hsiu Ma用一种原产于美洲的鸭跖草（Tradescantia paludosa），建立的四分孢子期微核率计数（MCN-in-tetrad）的测试系统是较好的系统之一。
微核测试
嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展
为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核
已排出，因胞质内含有核糖体，姬姆萨染色呈
灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成
淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微 核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓 中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。
实验目的 1、了解微核发生的机制； 2、掌握微核实验的一般程序和实践意义； 3 、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序； 4、掌握进行实验设计的一般程序和规则，并
要求参阅的文献：
[1]孟紫强，阮爱东，桑楠等.SO2污染对小鼠骨髓嗜多 染红细胞微核的诱发作用.环境科学，2002，23（4） 123-125. [2]孟紫强，桑楠，张波等.二氧化硫体内衍生物诱发小 鼠骨髓嗜多染红细胞微核的效应.环境科学学报，2000， 20（2）239-243. [3]耿德贵，王秀琴，刘士旺等.除草剂使它隆对黄鳝细 胞的致突变作用研究.环境与健康杂志，2000，17（2） 103-105. [4]周晓蓉，李百祥，邱向红等.小鼠骨髓及肝血中嗜多 染红细胞微核率的比较 . 卫生毒理学杂志， 1999 ， 13 （1）66-67. [5] 曹佳.微核实验在中国的应用、发展与展望.遗传， 2003，25（1）73-76.
受试物 对苯二酚 剂量 mg/Kg 120 80 40 秋水仙素 3 1.5 组 别 1 2 3 1 2 各受试小鼠1000个受检细胞中含微核细胞数 1
53 60 35 36 30
2
51 39 32 19 28
3
103 86 80 59 35
4
78 48 95 28 41
5
77 27 86 43 39
（3）0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）
微核试验
一、意义和目的•学习小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微核测定方法，了解环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。
二、原理•基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性,是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。
还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变,染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。
因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(genetic endpoint )。
• 国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为5类:①DNA完整性的改变(形成加合物、断裂、交联)；②DNA重排或交换；③DNA碱基序列改变；④染色体完整性改变；⑤染色体分离改变。
其中③实际上指基因突变；④指染色体畸变。
•微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。
微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，其染色与细胞核一致，大小相当于细胞直径的l／20～l ／5，呈圆形或杏仁状，在间期细胞中可以出现一个或多个。
• 一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质(染色体断片或迟滞的染色体)。
所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点，用于检测断裂剂及非整倍体诱发剂。
微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别，故常计数PCE细胞中的微核，因为当成红细胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜碱性约24小时，然后成为正染红细胞（NCE），并进入外周血。
在主核排出时，但微核仍保留于PCE细胞中。
操作步骤• 动物选择首选物种是小鼠和大鼠。
以小鼠使用最为广泛，要求体重18～20g，7～12周龄。
每组小鼠数量10只，雌雄各半。
无首选品系，通常用实验室品系。
• 染毒途径根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。
细胞生物实验：微核实验
实验器材
离心机，显微镜，擦镜纸，二甲 苯，香柏油，手术剪，手术镊子， 刻度离心管，1ml注射器，Giemsa 染色液，75%酒精纱布块，甲醇， 生理盐水。
实验内容和方法
1.骨髓细胞液制备：取小鼠股骨，剔
Hale Waihona Puke 净肌肉制备骨髓细胞悬液。 2.离心：1000r/min离心5分钟。 3.涂片 4.甲醇固定5分钟 5.染色：Giemsa染液中染色10分钟。 6.显微镜观察
作业与思考
1.画一个具有微核的嗜多染红细胞。 2.计算出平均微核率，并与自发微核
率（1~3‰）比较，说明微核增加的 原因。
小鼠骨髓嗜多染红细胞 微核试验
实验目的
通过对用已知诱变剂（环磷酰胺） 处理的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的 测定，初步掌握微核试验的方法和制片 技术。
实验原理
微核是染色体断裂后由遗留下来 的无着丝粒片断演化而来的次核，其 直径通常为红细胞的1/20~1/5，在骨髓 和外周血液的各类型细胞中均可见到， 但在有核细胞中，微核常难以与核叶 相鉴别，而在嗜多染红细胞中，因主 核已排除，若有微核发生则非常容易 辨认。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核自 发率很低（1~3‰），但在致变剂 的作 用下，微核发生率可明显增高，因而 微核试验是检测致畸因子的有效的手 段。
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细胞内微核的检测 系谱分析
细胞内微核的检测
原理
环境中有害物质可导致细胞中染色 体或纺锤体的损伤，产生的染色单体或 无着丝粒染色体片断在细胞分裂末期滞 留于子细胞胞质中，形成微核。
原理
本实验选用培养细胞，用环磷酰胺作 诱导剂（射线、顺铂等） ，促使细胞中 染色体断裂，产生微核。 微核经Giemsa染色后呈紫红色，胞 质被染成淡灰蓝色。
微核的计算
先用低倍镜粗检，后用高倍镜，选 择细胞分布均匀，细胞无损，着色适当 的区域，计数。 每张玻片计数100-200个细胞，按 “1‰”计算微核的出现率，微核计数以 “细胞”为单位，即一个细胞中出现2个 或2个以上微核时，只按“1”计算。
结果
微核大多数呈单个圆形，边缘光滑 整齐，嗜色性与核质相一致，呈紫红色 或蓝紫色。
器材与剂
• • • • • 显微镜、载玻片、染色缸、滴管等 培养细胞（小盖片） 甲醇固定液 PBS（pH7.4） Giemsa应用液（临用现配） Giemsa原液：PBS＝1：9混合而成。
操作
培养细胞（小盖片）——加环 24h 磷酰胺1mg/ml——PBS洗涤3次— —甲醇固定5min——Giemsa染色 5min——自来水冲洗——显微镜 下观察——计数
注意事项
• 正确掌握微核的形态特征，避免假阳性。 • 以有核细胞形态是否完好作为判断制片 优劣的标准