骨骼肌卫星细胞的研究进展

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肌卫星细胞的研究进展

肌卫星细胞的研究进展作者：李小雷来源：《中国保健营养·中旬刊》2013年第03期【摘要】干细胞研究仍然是当今医学的热点问题，尤其是肌肉干细胞因直接参与骨骼肌分化而备受关注。

胚胎和成人体内都存在肌肉干细胞。

由于肌肉卫星细胞在肌肉的发育和再生中发挥主要作用，目前公认的成人体内肌肉干细胞主要是指肌肉卫星细胞。

近年研究发现，肌卫星细胞在组织工程和疾病研究中都起着比较重要的作用，将为治疗包括帕金森病在内的多种临床退行性疾病提供自体干细胞的新来源。

【关键词】肌干细胞；肌再生；肌肉修复；肌卫星细胞【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0141-01肌卫星细胞Mauro[1]等于1961年首次在蛙骨骼肌中发现。

肌卫星细胞是具有增殖和自我更新能力的成肌前体细胞，这种组织特异的祖细胞在出生后骨骼肌的损伤、修复和维持再生中起着重要的作用。

Gussoni等[2]用Hoechest/FACS方法从骨骼肌中分离到多能干细胞，有关性质尚不清楚。

这些肌源干细胞既能形成再生肌纤维，也能有效重建造血系统。

肌源干细胞的这种可塑性，使有关肌卫星细胞的起源、激活与分化的分子调控机制以及肌卫星细胞的干细胞特性等方面的研究成为该领域的热门课题。

1 肌卫星细胞的起源肌卫星细胞属于肌源性细胞谱系，起源仍不完全清楚，目前有两种假说：体节来源和内皮来源。

体节来源假说来自鸡雏鹌鹑异源嵌合体实验，将鹌鹑的胚胎中胚层生肌节移植到宿主鸡的胚胎中，且被移植的鹌鹑细胞有明显的形态特征，可以观察到这些细胞从移植的中胚层生肌节迁徙到胚胎发育的肢体，并组成出生后鸡骨骼肌的肌卫星细胞群。

以后，大量的研究也证明了这一假说。

De Angelis等认为，卫星细胞也有可能是内皮来源的。

从胚胎背侧主动脉分离到的细胞具有与肌卫星细胞相似的形态和基因表达特征，此外，将这种主动脉来源的细胞移植到新生小鼠后，发现这种细胞参与出生后肌肉的生长和再生，并可与中胚层生肌节来源的肌纤维融合。

衰老对骨骼肌卫星细胞增殖分化影响的研究进展

衰老对骨骼肌卫星细胞增殖分化影响的研究进展李江;包海姣;谢平波;周红庆【摘要】伴随着衰老,肌肉质量和强度下降,再生修复能力缺陷,肌卫星细胞数量下降、增殖分化受限.衰老后,微循环灌注不足,肝细胞生长因子、成纤维生长因子等多种生子因子水平下降,性激素及催产素分泌不足影响着卫星细胞的增殖分化.老年人细胞内p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路、成纤维生长因子受体信号轴的生长因子、Janus酪氨酸蛋白激酶2/信号转导子与转录激活子蛋白3信号轴和细胞周期抑制剂、Wnt信号通路、Notch信号通路等的改变也限制了肌卫星细胞的增殖分化.细胞外环境(包括肌纤维外多种类型的细胞和细胞外基质)老化影响肌卫星细胞的增殖分化.衰老后蛋白质合成减少和蛋白质降解也可导致肌肉功能受损.持续性的炎症反应损伤导致骨骼肌再生受阻.骨骼肌自噬功能衰退,导致细胞\"干\"性下降.改善组织灌注、热量限制、饮食调节、自噬调节等被证实可促进老化肌肉再生,改善衰老导致的肌肉损伤修复能力缺陷.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2018(058)045【总页数】5页(P95-99)【关键词】衰老;骨骼肌卫星细胞;增殖分化【作者】李江;包海姣;谢平波;周红庆【作者单位】昆明医科大学附属曲靖医院,云南曲靖655000;昆明医科大学附属曲靖医院,云南曲靖655000;昆明医科大学附属曲靖医院,云南曲靖655000;昆明医科大学附属曲靖医院,云南曲靖655000【正文语种】中文【中图分类】R285.5衰老及慢性老年性肌病对骨骼肌有较大影响，在老化过程中，肌肉质量和强度逐渐下降[1]。

当肌肉损伤或负荷增加时，可通过骨骼肌卫星细胞的增殖、分化来实现肌纤维的再生修复。

肌卫星细胞是指成年个体肌肉组织内存留的肌前体细胞，在受到刺激后，活化的肌卫星细胞迁移至损伤部位并终末分化、融合形成肌纤维，完成损伤后修复。

老化及慢性肌病导致肌卫星细胞再生潜能降低。

肌卫星细胞分离培养及鉴定

肌卫星细胞分离培养及鉴定摘要：一、肌卫星细胞简介1.肌卫星细胞的功能和特点2.在肌肉组织中的分布二、肌卫星细胞分离培养方法1.常用培养方法2.实验操作流程3.注意事项三、肌卫星细胞鉴定方法1.形态学观察2.免疫荧光染色3.分子生物学方法四、肌卫星细胞在医学研究中的应用1.肌肉再生与修复2.肌肉疾病的研究3.肌肉生物学研究正文：肌卫星细胞是一种存在于肌肉组织中的干细胞，具有自我更新和分化为肌肉细胞的能力。

它们在肌肉组织中具有重要的生理功能，对于肌肉的再生与修复具有关键作用。

近年来，肌卫星细胞在医学研究中的应用日益广泛，本文将对肌卫星细胞的分离培养及鉴定方法进行介绍。

一、肌卫星细胞简介肌卫星细胞，也称为肌肉干细胞，主要分布于骨骼肌纤维周围。

它们具有自我更新和分化为肌纤维、脂肪细胞和成纤维细胞的能力，对于维持肌肉组织的稳态和再生具有重要作用。

肌卫星细胞在肌肉组织中的分布特点为：数量较少，呈散在分布；具有强的分裂能力，可以快速扩增；具有长时间自我更新的能力。

二、肌卫星细胞分离培养方法肌卫星细胞的分离培养方法有很多种，常用的方法有：胶原酶消化法、机械分离法、激光捕获显微切割法等。

其中，胶原酶消化法是最常用的方法。

实验操作流程如下：首先，取动物肌肉组织，用胶原酶进行消化；然后，用离心机将细胞分离；最后，将细胞悬液接种到培养皿中，放入含有适当生长因子的培养基中进行培养。

在实验过程中，需要注意无菌操作、合适的消化时间和温度、恰当的培养条件等因素，以保证细胞的生长和扩增。

三、肌卫星细胞鉴定方法肌卫星细胞的鉴定方法主要包括形态学观察、免疫荧光染色和分子生物学方法。

形态学观察是通过光学显微镜观察细胞的形态特征，如细胞大小、形状、染色质等。

免疫荧光染色是利用特异性抗体标记细胞表面抗原或细胞内分子，通过荧光显微镜观察细胞是否表达特定抗原。

分子生物学方法主要是通过PCR、Western blot等方法检测细胞内的基因表达或蛋白质水平。

肌肉卫星细胞

肌肉卫星细胞是骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性细胞。

它们在一般情况下是处于静息状态的，当被激活后，具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌细胞的能力。

在那里它们通过形成与肌肉纤维融合的先驱细胞来对损伤做出反应。

有研究报告说，它们能充当干细胞，但卫星细胞群的混合性质意味着，它们的干细胞身份难以证明。

”“最新一期Nature刊登由美国斯坦福大学医学院的Sacco等人的研究结果：研究小组通过利用克隆分析证实卫星细胞的确是干细胞、能够自我更新，从而澄清了相关问题。

他们将一个表达荧光素酶的卫星细胞移植进了小鼠的肌肉中，发现它能够大量增殖，有助于肌肉纤维的形成，而且可以被再次移植。

因此断定肌肉卫星细胞也是一种干细胞。

”肌肉中肌肉卫星细胞非常多。

我们在进行性肌营养不良的肌肉病变中很容易发现大量的由卫星细胞分化而来的再生细胞。

然而，这些干细胞中缺乏、缺损某些膜蛋白基因。

因此，即使发生再生，也只能再生膜功能缺损肌纤维，免不了肌纤维变性坏死的命运。

我们实验室的研究重点是，如何保护膜蛋白缺损的肌纤维，而不是通过基因治疗，如何根治肌营养不良。

因为目前世界上哪一个实验室也做不到这一点，某些研究成果，即使在动物身上似乎有效，但人身上还是没有得到证实。

在肌肉修复功能当肌肉细胞进行损伤，静止卫星细胞从基底膜下方的释放。

他们被激活，并重新进入细胞周期。

这些分裂的细胞被称为“过境放大池”前接受生肌分化，形成新的肌管（有丝分裂后）。

也有证据表明这些细胞能够与现有的肌纤维融合，促进生长和修复。

肌肉再生的过程，涉及相当大的重塑细胞外基质，并发生了广泛的破坏，是不完整的的。

肌肉存款瘢痕组织成纤维细胞内，这可能削弱肌肉的功能，是一个的重要组成部分肌营养不良症的病理。

卫星细胞增殖肌肉损伤（西尔，等，2003），并形成新的肌纤维，通过对胎儿肌肉的发育（帕克等人，2003年）的过程类似。

经过多次细胞分裂，卫星细胞开始与周边核保险丝损坏的肌管，并进行进一步的分化和成熟，作为标志（帕克等，2003）。

肌卫星细胞自我更新

域的膜糖蛋白Ｃ４是静息ＭＳＤ３Ｃ的特异性标志。ＭＳ的激活Ｃ
伴随着短暂完整Ｃ４表达，Ｄ３随后下调，激活阶段晚期不再表至
达Ｃ３。虽然大部分增殖的细胞不再表达Ｃ３，Ｄ３在 “ ｅＤ４Ｄ４Ｃ４ｒ
２０３２：７－７．０３，（）３１３６
［７］ＧｎｎｒｅｎａｏＤＡ．Ｔｈｒｐｆｌｒｉｂｏｃｉｌｓｈｔｍａｉｅａｙｏｌｇｃｒｎｈａａｔｍａｗｉｏｌａｅｈ —
（辑：会龙）编黄
肌卫星细胞自我更新
ＣＨＩＳＯＵＲＮＥＥＪＮＡＩＯＦＡＮＡＴ）ｏ．３Ｎｏ４２１（ＭＹＶ１３．００
解剖学杂志
２１第３卷第４００年３期
ｌ０ — ２２２３１１．
ｚｍａ：ｎｉｇｎｃｎｌａｔｏｙＪ．Ｅｘ（ｐｎＢｏＴｈｒｕｂａｔＩＥｍｏｏｌａｎｉｄ［］ — ｏｂｐ）ｉｉｅ，ｌ
俞莉廖华越
（方医科大学，１一临床医学院２０级临床医学八年制，南第０５２解剖学教研室，广州５０１）１５５骨骼肌纤维由于运动、伤等可能发生损伤、亡及坏死，外凋
Ｚ．１Ｐａ７ｘ
１肌卫星细胞的自我更新
骨骼肌发生始于肌节形成。肌纤维的外周形成基膜后，才能确定形态学上位于基膜和纤维浆膜之间的单核细胞为

骨骼肌卫星细胞研究进展

摘要：章从骨骼肌卫星细胞的生长发育过程到自我更新再到衰老缺失、文以及与生长因子的关系进行了综述，论讨了骨骼肌卫星细胞在细胞和分子水平的调节机制，骨骼肌损伤修复提供了深入的理论依据。为关键词：骼肌；长修复；星细胞；活；殖分化骨生卫激增
祖先。
胞的生长发育过程、自我更新、衰老缺失、以及与生长因子的关系等方面进行了综述。
１卫星细胞的起源２卫星细胞的激活
在成体的肌细胞中，星细胞处于静息状态，卫而不进行有丝分裂，即使在某些特定的情况下，只有也有限的基因表达和蛋白合成。然而，受到外界刺当
合，成多核肌管。经典的骨骼肌卫星细胞理论的形提出距今已有４８年的历史 ¨ ，文从骨骼肌卫星细本
胚胎发育后期，肌纤维周围的细胞可以表达在Ｐｘ。通过条件性基因敲除（ｒ／ｏＰ）验发现ａ７Ｃｅｌｘ实骨骼肌卫星细胞由体轴下表达Ｐｘａ３的细胞引起。与此同时，大量的群旁细胞（ｉｅｐｐｌｉｎ，Ｓ）ｓｏｕａｏｓＰ也ｄｔ来自体轴下的体节并可能与卫星细胞来自于相同的
果。细胞内在的信号可能由细胞膜内的１一磷酸一鞘氨醇（ｐｉｏｉｅ１ｐｏｐａ，ＳＰ）起。ＳＰｓｈｎｓ一一ｈｓｈｔｇｎｅ１引１是细胞膜磷脂代谢的中间产物，是卫星细胞进入细

骨骼肌卫星细胞的培养及其在骨骼肌组织工程研究中的应用

ｃｌｓｌｃｔｇｎｅｔｅａａｌｍｉａｆｋｌｔｌｅｌ，ｏａｉｕｄｒｈｂｓｌａｎｏｓｅｅａｍｕｃｅｉｒ，ｃｎｒｂｔｔｍｕｃｅｒｗｔｎｓｌｆｂｅｓｏｔｉｕｅｏｓｌｇｏｈ，ｆｎｔｎｕｃｉｏ
ｆｏｂｄｉｓｅｈｖｅｎｍｕｈｓｕｉｄ．ＴｈｉｒｌｅａｉｎａｄｄｆｅｅｔｔｏｎｓａｆｌｓａｒｃｔｄｆｏｒｍｏｙｔｓｕａｅｂｅｃｔｄｅｅｒｐｏｉｒｔｎｉｒｎｉｉｎｏｃｆｏｄｆｂｉａｅｒｍｆｏｆａｂｏｔｒａｔｉａｅｂｅａｉｕｌｔｅｔｄＴｈｓｐｐｒｒｖｅｈｒｇｅｓｓｏｋｌｔｌｍｕｃｅｓｔｌｉｉｍａｅｉｌｍａｒｘｈｖｅｎｖｒｏｓｙａｔｍｐｅ．ｉａｅｅｉｗｓｔｅｐｏｒｓｅｆｓｅｅａｓｌａｅｌｅｔｃｌｎｖｖｉｏａｉｎ，ｐｏｉｒｔｏｅｌｉｅｓｉｏｓｌｔｏｒｌｆａｉｎ，ｉｅｔｃｔｏａｄｈｆａｉｉｔｔｂｕｅｉｔｓｕｅｇｎｅｉｇｅｄｎｉａｉｎｎｔｅｅｓｂｌｙｏｅｓｄｎｉｓｅｎｉｅｒｎｉｆｉｒｓａｃｅｅｒｈ．
ｉｊｒｓｏｅｅ，ｔｅｅｉｃｒｅｔｔｅｍｔｏｓｔｏｓｕｔｎｖｔｈｉａｔｉｉｋｌｔｓｕ．Ｓｔｌｅｎｕｉ．Ｈｗｖｒｈｒｕｒｎｌｌｔｅｈｄｏｃｎｔｃｉｏｔｅｂｏｒｆａｓｅｅａｔｓｅａｅｉｅｓｙｉｌｒｉｒｉｃｌｌｉｌｔ

肌卫星细胞分离培养及鉴定

肌卫星细胞分离培养及鉴定【原创实用版】目录1.肌卫星细胞的概述2.肌卫星细胞的分离方法3.肌卫星细胞的培养条件4.肌卫星细胞的鉴定方法5.肌卫星细胞在医学研究中的应用正文肌卫星细胞 (Myoblasts) 是骨骼肌组织的一种干细胞，具有自我更新和分化为肌肉细胞的能力。

肌卫星细胞在肌肉生长和修复过程中起着重要的作用，因此对于肌卫星细胞的分离、培养和鉴定是非常重要的。

一、肌卫星细胞的概述肌卫星细胞是一种未分化的干细胞，主要存在于骨骼肌组织中。

它们可以自我更新并不断分化为新的肌肉细胞，也可以分化为其他类型的细胞，如神经细胞、心肌细胞等。

因此，肌卫星细胞在肌肉组织的修复和再生中起着重要的作用。

二、肌卫星细胞的分离方法目前，常用的肌卫星细胞分离方法包括组织消化法、酶消化法、流式细胞术等。

其中，组织消化法是最常用的方法之一。

这种方法使用胰蛋白酶等酶类将肌肉组织消化，使肌卫星细胞从组织中释放出来。

然后，通过离心等方法将肌卫星细胞分离出来。

三、肌卫星细胞的培养条件肌卫星细胞的培养需要适宜的温度、湿度、气体和营养条件。

一般来说，肌卫星细胞在 37°C、5% CO2 和 95% 空气的条件下生长最佳。

培养基方面，常用的有 DMEM、M199 等。

同时，需要加入适当的生长因子和细胞因子，以促进肌卫星细胞的生长和分化。

四、肌卫星细胞的鉴定方法常用的肌卫星细胞鉴定方法包括免疫荧光染色、流式细胞术、Western blot 等。

其中，免疫荧光染色是最常用的方法之一。

这种方法使用特定的抗体标记肌卫星细胞，然后用荧光显微镜观察标记的细胞。

流式细胞术和 Western blot 等方法也可以用来鉴定肌卫星细胞。

五、肌卫星细胞在医学研究中的应用肌卫星细胞在医学研究中具有广泛的应用前景。

大鼠骨骼肌卫星细胞培养的研究

的大鼠骨骼肌肌卫星细胞，行体外原代骨骼肌和传代骨骼肌的细胞培养。传至第２后，进代用分化培养基诱导分化，骨骼肌细胞各观察个阶段的形态特征并拍照。［结果］此方法分离的细胞成活率较高，外生长、体增殖良好。在分化培养基条件下，细胞分化良好，可融合成肌管。【结论］实验成功探讨了新生大鼠骨骼肌卫星细胞的分化能力并建立了卫星细胞纯化方法，该适用于开展细胞移植和肌组织工
ＺｔＮＧｌｎｌｔａ（ｃｏｌｆｉｅｎｅＮｎｎｎｖｒｔ，ａｔｇＪｎｓ２０）ＩＡＣｌ－ｅｌＳｈｏｆＳｉｃ，ａｔｇＵｉｓｙＮｎｎ，ｉｇｕ２６叽ｅｍｉｏＬｅｅｏｅｉｏａ
Ａｓ１ｂｃｖＴｅｍｅｄｆｈｕｉｃｔｎｃｌｒｎｅｔｃｔｎａｄｔｉｏｉｌｈｒｃｒｔｓｆｋｌａｕｃａｌｔｃｌｉｏｂＩ喇ｅｔｅｈｔｓｏｅｐｒａｉ，ｕｔｅａｄｉｎｆａｏｎｅｂｏｇｃａａｔｉｃｅｔｌｓｌｓｔｌｅｅｌｉｖｒＯｉＪｏｈｔｉｆｏｕｄｉｉｉｈｌａｃｅｓｏｓｅｍｅｅｉｓｎｔｉｗＩｅｐｏ．ＭｅｏｓｋｌｔｍｓｌｓｅｉｅｓｈｒｅｔｏａｒｔｗＩｓｏｐｒｉｕｕｔｅａｄⅡ ｌｃｌｃｌｒ．ｈｋｌａ心ｌｅｘｌｒ｛ｔｄＳｅａｌｃｅｐｃｎａｖｅｆｒｓｅｅｕｅｔｄｕｅｔｓｅｃｌｒｎ心ｅｅｌｕｔｅＴｅｓｅｅｌⅡ ｅｅｅｈＪｅｌ１ｍｓｄｌａｄｏｓｕｕｔ

肌卫星细胞在组织工程及创伤修复中应用的研究进展

目前，卫星细胞培养多采用分步酶消化法分离出单个细肌胞＿，过差速贴壁法或流式细胞仪等方法进行纯化口１通，再进行单层细胞培养。刚分离出来的细胞呈圆形，胞折光性细
骨骼肌卫星细胞属于组织干细胞，源于胚胎中胚层，有增起具
然，卫星细胞的增殖分化是一个多细胞因子的共同调节过肌程，可能是以浓度依赖性的方式进行作用。极
２肌卫星细胞在体外培养及生物学特性研究
细胞被激活进入有丝分裂循环，时提供肌肉修复的成肌细及
胞＿。不论损伤形式如何，骼肌的再生过程大致相同［。创】］骨２］伤研究发现，伤后首先是受损肌纤维出现不同程度坏死，创然后在受累区域出现巨噬细胞清除坏死肌纤维，保留坏死肌纤但维周围的基底膜，像许多中空 “ 就管道 ” 的支架。“ 样管道 ” 的样微环境能充分诱导再生肌纤维分化，沿原先肌纤维的方向排并列。肌组织受创后约３１ｈＭＳ即有骨骼肌生肌调节因子～２，ＣＭｙＤＭｙ５的表达，时ＭＳ被激活，伤后１周内迅速分ｏ／ｆ此Ｃ在裂、殖，量达到高峰，后仍维持一定的分裂能力，数量增数之但却逐渐减少。减少的卫星细胞沿着残留的基底膜在原肌纤维（已被清除）位，互融合，为肌小管。肌小管不断接受新部相成

成年大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、鉴定及体外增殖

维目：１咆前！救荠述转Ｌ完成二贴肇细胞多为血卦她， ¨
预冷的ＰＳ抗生素缓冲液漂洗３次。将肌肉组织分Ｂ离成若干细小的肌束，剪成１ｍｍａ右的肌肉碎左
维Ｌｂｒｏ＇ｎｍａａｄｏａａｖｄｃｎ＃ａｏｔ￣ＡｉｌｎｍｐｒｔｅＭｅｉｅａＣｉｉ
肌卫星细胞纯度在９％以上。细胞体外培养时在第３Ｏ天进入对数生长期，５６ｄ－进入增殖平台期。
细胞体外培养时无须特殊诱导可以自出现成肌定向分化，发相互融合形成具有自发收缩特性的肌管细胞。结论体外培养获取的骨骼肌卫星细胞数量可以满足组织工程研究的需要。【关键词】骼肌卫星细胞：殖：化；定骨增分鉴【中图分类号】３２＋【Ｒ２．４文献标识码】【７Ａ文章编号】０４８４（０７０ —０００１０ —４８２０）１２—５０
ＰＢＳ抗生素缓冲液（／霉素，２０Ｕ／）青链０ｍ１，
Ｉ型胶原酶（ｉｍａ，胰蛋白酶（ｉａ，胎牛血清Ｓｇ）Ｓｇ）ｍ
有一定的自我更新能力【。在个体的生命发育过程２】中，骨骼肌卫星细胞随着年龄的增长逐渐减少［。３】因此，如何利用少量的肌肉组织分离、培养得到数量足够的骨骼肌卫星细胞是相关领域细胞移植治疗的关键。研究旨在通过建立骨骼肌卫星细胞的本体外培养、增殖体系，为细胞移植治疗泌尿外科疾病做好技术上的准备。

肌卫星细胞增殖及分化影响因素研究进展

因素研究进展作一综述。
关键词
骨骼肌；卫星细胞；细胞因子；成肌调节因子；力学因素；分化；增殖
ＤＯＩｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉＳＳｒＬ１６７３ — ７０８３．２０１３．０２．００９
２．１ＭＲＦ与肌卫星细胞增殖和分化
性修复仍是骨科临床面临的重大难题，虽然现有肌腱转位、游离肌肉移植等方法可满足动力性修复，但是修复后外观及分布不均的缺点突出。近年研究显示，有增殖和自我更新潜力的肌卫星细胞可能避免此不足，并在骨骼肌修复研究中发挥重要作用。本文就肌卫星细胞增殖及分化的影响因素研究作一综述。
一
在成体肌细胞中，通常处于静息状态的卫星细胞并不进行有丝分裂，然而当受到外界一些刺激，如牵拉、损伤或肌肉萎缩引起病变时却能够被激活，从而进入细胞周期Ｇ１期］。是何因素在静息状态期引起并调控卫星细胞激活，至今尚无明确的研究结果。研究显示，一氧化氮（ＮＯ）／肝细胞生长因子（ＨＧＦ）／肝细胞生长因子受体（ｃ－ＭＥＴ）信号通路对肌卫星细胞的激活起着关键作用。骨骼肌在受到刺激后可通过相应机制增加一氧化氮合酶（ＮＯＳ）数量或活性，然后合成并释放ＮＯ，成为卫星细胞激活的起始信号；ＮＯ介导ＨＧＦ及ｃ－ＭＥＴ在卫星细胞的共同定位作用［２；ＨＧＦ一方面与其受体ｃ－ＥＴ结合，Ｍ引发磷脂酰肌醇３一激酶（ＰＢＫ）和丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）等相关基因转录和细胞分裂的多个信号通路，另一方面下调保持肌卫星细胞静息状态的肌肉生长抑制素（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）水平，从而激活肌卫星细胞ｌ３］。

《mTOR信号通路对山羊骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响》范文

《mTOR信号通路对山羊骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响》篇一摘要：本文旨在探讨mTOR信号通路对山羊骨骼肌卫星细胞的增殖及分化的影响。

通过研究mTOR信号通路激活与山羊骨骼肌卫星细胞增殖、分化之间的关系，以期为山羊肌肉生长与发育的调控提供理论依据。

一、引言山羊作为重要的畜牧业动物，其肌肉生长与发育对于提高肉品质和产量具有重要意义。

骨骼肌卫星细胞作为肌肉生长和再生的关键细胞，其增殖及分化过程受到多种信号通路的调控。

mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）信号通路作为细胞生长和增殖的重要调控因子，在肌肉生长中发挥着重要作用。

因此，研究mTOR信号通路对山羊骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响，有助于揭示肌肉生长的分子机制。

二、mTOR信号通路及其作用机制mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞生长和增殖的关键调控因子。

mTOR信号通路包括mTORC1和mTORC2两种复合物，通过调控蛋白质合成、细胞周期进程以及自噬等过程，影响细胞的生长和增殖。

在肌肉组织中，mTOR信号通路对肌肉蛋白质合成和肌肉生长具有重要作用。

三、mTOR信号通路对山羊骨骼肌卫星细胞的影响1. 增殖过程：研究表明，激活mTOR信号通路可以促进山羊骨骼肌卫星细胞的增殖。

通过添加mTOR激活剂雷帕霉素可以观察到卫星细胞的增殖速度加快，细胞周期缩短。

这表明mTOR信号通路在山羊骨骼肌卫星细胞的增殖过程中发挥了重要作用。

2. 分化过程：mTOR信号通路对山羊骨骼肌卫星细胞的分化也具有重要影响。

激活mTOR信号可以促进卫星细胞的成肌分化，提高肌纤维的数量和质量。

此外，mTOR信号还可以调控肌肉相关基因的表达，进一步促进肌肉的生长和发育。

四、研究方法及实验结果本研究采用山羊骨骼肌卫星细胞为研究对象，通过激活和抑制mTOR信号通路，观察其对卫星细胞增殖及分化的影响。

实验结果表明，激活mTOR信号通路可以促进山羊骨骼肌卫星细胞的增殖和分化，而抑制mTOR信号通路则会导致细胞增殖和分化的抑制。

骨骼肌卫星细胞

体外模仿卫星细胞的微环境，培养能够保持再生潜能的卫星细胞
在不久的将来，通过卫星细胞移植治愈肌肉衰减症，让萎缩的肌肉恢复青春
神话传说中有“不老泉”，我们可以积极追求尚未发现的外源性或内源性的“青春因子”
谢谢！请大家批评指正
卫星细胞
70-90年代，研究主要集中在体外培养和活体的细胞跟踪证明卫星细胞在体内外都有向生肌分化和自我更新能力
2012年研究发现Hippo通路中的转录因子Yap在决定卫星细胞的分化和增殖
命运中起重要作用
2007年Thomas对卫星细胞的起源、激活、自我更新、增殖分化及运用做了深入的探讨
2014年《Science》评选的十大科学突破之一
来自年轻小鼠的血液中的一个叫做GDF11的因子—能够让老年小鼠的肌肉和大脑“返老还童”
Rejuvenation of muscle stem cells by heterochronic pals of GDF11 are reduced in aged mice
50岁之后，肌肉质量每年减少1%到2%，肌力每年减少约1.5%;60岁之后肌力每年减少约3%
60-70岁人群中肌肉衰减的发病率为5%-13%，80岁以上人群可达11%-50%
骨骼肌卫星细胞：主要的骨骼肌干细胞
骨骼肌生长、发育、损伤和修复主要依赖于卫星细胞的激活、增殖和分化
二、研究进展
文献阅读
目录
研究背景研究进展
展望
一、研究背景
老龄化相关概念
老年人（elderly ）
国际----65岁及以上的人中国----60岁及以上的人
老龄化社会
一个国家60岁以上老年人达到总人数的10%，或65岁以上老年人达到总人口的7%

骨骼肌卫星细胞体外培养及鉴定方法进展

几天后卫星细胞开始从肌纤维上爬出，当数量足够多时再将肌纤维去除，用胰蛋白酶消化后将肌卫星细胞进行传代。１．２．４纯化：当卫星细胞释放下来之后，纯化也是一个关键性的问题，即如何去除肌纤维碎片和非肌源性细胞，这里的非肌源性细胞大多是成纤维细胞。用适当的离心力可以将部分细
骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中具有增殖分化潜能的干细胞，耗材少，成本低，培养的细胞较易存活，但是此方法不可避免的混有成纤维细胞样细胞、红细胞、骨骼肌细胞和血管平滑肌细
它是在１９６１年由Ｍｕａｏｒ首次从青蛙骨骼肌纤维中分离出来的。肌组织作为人体的最大组织，同其他组织相比具有来源丰富，取材方便的优势。大量研究证实卫星细胞对骨骼肌受创伤后肌纤维的再生和修复起着重要作用，并且在治疗心血管疾病中有广阔的临床前景。但是骨骼肌细胞中卫星细胞所占的比例较少，为１％一５％，因此在体外如何获得足够数量，并将高
足量的卫星细胞提供了保障。
１．２分离方法包括骨骼肌卫星细胞的释放和纯化。卫星细
胞位于肌纤维和基底膜之间，细胞连接紧密，可抵抗一般消化酶的作用。在实验中以前常规的方法是先用一定浓度的Ｉ、 Ⅱ、 Ⅳ型胶原酶消化，然后再用一定浓度的胰蛋白酶或链蛋白酶消化，称为逐步消化法，如今常用的方法如下。１．２．１肌束分离法或称为联合酶消化法：无菌条件下取肌肉
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１７８・

骨骼肌卫星细胞的研究进展

2017年(第7卷)第04期运动人体科学1 肌卫星细胞概述1.1 肌卫星细胞的发现肌卫星细胞是在1961年由M a u r o 发现,肌卫星细胞(Skeletalsatellite cell,SSC)是一类分布于肌细胞基底膜与肌膜之间的成体干细胞,其位置与排列类似肌细胞的卫星,故称卫星细胞[1]。

肌卫星细胞是成年个体肌肉组织内留存的未分化的肌前体细胞(Muscle progenitor cell,MPC),位于肌纤维基底膜和基膜之间,具有增殖、分化等自我更新的潜能[2]。

在成年机体的骨骼肌中,肌卫星细胞含量较少,大约占比1%～4%。

1.2 肌卫星细胞的形态结构在静息状态下,SSC细胞质和细胞器也较少,核质比率较高;其细胞核比肌管细胞核小,其异染色质含量比肌细胞核高。

伴随年龄增长,SSC的丰度逐渐减少,SSC肌源性分化和自我更新的潜能仍保留,但更新能力随之降低[3]。

1.3 肌卫星细胞的特异性标记与鉴定骨骼肌特异性标记蛋白的表达可作为SSC的鉴定指标,认识分子标志是对各阶段肌细胞进行鉴定的依据。

高度糖基化I型跨膜蛋白(CD34)在造血干细胞、肌源细胞和SSC上均有表达,在分化程度越低的细胞中表达率越高;M钙调蛋白是肌卫星细胞增殖与融合的标志;Pax3是肌源细胞的标志物, Pax7在静息和活化的卫星细胞核内均有表达。

配对盒转录因子(Paired box gene 7,Pax7)属于Pax基因家族的第7组,是在进化上高度保守的发育调控基因,具有强有力的生肌性诱导能力,能够使干细胞定向转变为生肌性细胞,在骨骼肌发育和再生中起着至关重要的作用[4]。

成肌蛋白(Myo blast de-termination protein,MyoD)属于肌原性碱性螺旋环的转录因子,在肌肉发育和再生中的细胞分化和自我更新密切相关[5]。

通过观察Pax7在肌细胞中表达含量的变化,可以识别卫星细胞所处时期。

其变化规律为:卫星细胞在静息状态下Pax7 表达阳性、MyoD表达阴性;卫星细胞增殖时,Pax7和MyoD表达均为阳性;在分化和融合阶段,Pax7表达阴性、MyoD阳性[2]。

猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展

中国畜牧兽医 2022,49(8):2931-2942C h i n aA n i ma lH u sb a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展喻宗岗1,马海明1,2(1.湖南农业大学动物科学技术学院,长沙410128;2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室,广州510640)摘要:猪骨骼肌是动物机体重要的运动组织及人类主要的肉食来源,也是研究肌肉生长发育和疾病的良好模型㊂猪出生后,骨骼肌的生长发育㊁损伤修复都需要肌卫星细胞的参与,体外分离培养猪骨骼肌卫星细胞是深入研究骨骼肌生长发育及疾病发生机理的基础,是在细胞水平进行分子功能验证的前提㊂随着肌肉发育和病理分子机制研究的不断深入,猪骨骼肌卫星细胞的体外分离培养技术也迅速发展起来㊂背最长肌㊁后腿肌和半腱肌常用于分离骨骼肌卫星细胞,1日龄猪背最长肌的分离效果最好㊂常用于分离骨骼肌卫星细胞的酶包括链酶蛋白酶㊁胶原酶㊁胰蛋白酶㊁胶原蛋白酶等,各酶及酶联合消化的时间不同,最优的过滤方式是200目+400目联合过滤,3次离心法可获得纯度较高的细胞㊂常使用的培养基为D M E M /F 12+10%胎牛血清(F B S )+1%青-链霉素(P /S )㊂骨骼肌肌卫星细胞常见标记物有配对盒基因3(P A X 3)㊁P A X 7㊁生肌决定因子5(M y f 5)㊁M y f 4㊁肌分化因子(M y o D )㊁肌细胞生成素(M y o G )等㊂作者通过对猪骨骼肌肌卫星细胞的分离㊁培养及鉴定等方面进行综述,梳理出各步骤中最佳参数,为建立规范猪骨骼肌卫星细胞分离程序提供参考,以期为肌肉发育和疾病研究提供理论及技术支持㊂关键词:猪;骨骼肌卫星细胞;分离;体外培养;酶消化法中图分类号:S 828文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2022.08.009 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2022-03-27基金项目:岭南现代农业实验室科研项目(N T 2021005);宁乡花猪基础研究(5026401-0315069)联系方式:喻宗岗,E -m a i l :s t u d y 236@163.c o m ㊂通信作者马海明,E -m a i l :m a h a i m i n g2000@163.c o m R e s e a r c hP r o gr e s s o n I s o l a t i o n a n dC u l t u r e o f P o r c i n e S k e l e t a lM u s c l e S a t el l i t e C e l l s i n v i t r o Y UZ o n g g a n g 1,MA H a i m i n g1,2(1.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,H u n a nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,C h a n g s h a 410128,C h i n a ;2.G u a n g d o n g L a b o r a t o r y o f L i n g n a nM o d e r n A g r i c u l t u r a l S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,G u a n gz h o u 510640,C h i n a )A b s t r a c t :P o r c i n e s k e l e t a lm u s c l e i s a n i m p o r t a n tm o v e m e n t o r g a n i z a t i o n o f a n i m a l b o d y,t h em a i n m e a ts o u r c eo fh u m a nb e i n gs ,a n da g o o d m o d e l f o rm u s c l e g r o w t ha n dd i s e a s er e s e a r c h .A f t e r b i r t h ,p i g n e e d st h e p a r t i c i p a t i o n o f m u s c l es a t e l l i t ec e l l si nt h e g r o w t ha n d d e v e l o pm e n to f s k e l e t a lm u s c l e ,a n dt h ed a m a g er e pa i r .I s o l a t i o na n dc u l t u r eo f p o r c i n es k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t e c e l l s i n v i t r o i s t h eb a s i s f o r i n -d e p t h s t u d y o n t h e g r o w t h a n d d e v e l o pm e n t o f s k e l e t a lm u s c l e a n d t h e p a t h o ge n e s i so fd i s e a s e s ,a n dt h e p r e m i s ef o r m o l e c u l a r f u n c t i o nv e r i f i c a t i o na t t h ec e l l u l a r l e v e l .W i t ht h ed e e p e n i ng o fth er e s e a r c h o n m u s c l ed e v e l o p m e n ta n d p a t h o l o gi c a l m o l e c u l a r m e c h a n i s m ,t h e t e c h n o l o g y of i s o l a t i o na n dc u l t u r eo f s a t e l l i t e c e l l so f p o r c i n e s k e l e t a lm u s c l e i n v i t r o h a sd e v e l o p e dr a p i d l y .T h el o ng i s s i m u sd o r s im u s c l e ,hi n dl e g m u s c l ea n ds e m i t e n d i n o s u s m u s c l e a r ec o m m o n l y u s e dt oi s o l a t es k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t ec e l l s ,a n dt h el o n gi s s i m u sd o r s i m u s c l eo f1-d a y -o l d p i g l e t sh a v et h eb e s ti s o l a t i o ne f f e c t .E n z y m e sc o m m o n l y us e dt oi s o l a t e s k e l e t a lm u s c l e s a t e l l i t e c e l l s i n c l u d e p r o n a s e ,c o l l a g e n a s e ,t r y p s i n ,c o l l a g e n a s e ,e t c .,a n d t h e t i m e o f d i g e s t i o no fe a c he n z ym ea n di t sc o m b i n a t i o ni sd i f f e r e n t .T h eb e s t f i l t r a t i o n m e t h o di s200m e s h +400m e s hc o m b i n e df i l t r a t i o n ,a n d h i g h p u r i t y c e l l sc a n b eo b t a i n e d b y th r e et i m e s c e n t r i f u ga t i o n .T h eu s u a l m e d i u m i s D M E M /F 12+10%f e t a lb o v i n e s e r u m (F B S )+1%中国畜牧兽医49卷p e n i c i l l i n-s t r e p t o m y c i n(P/S).C o m m o n m a r k e r so f s k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t ec e l l s i n c l u d e p a i r i n g b o x g e n e3(P A X3),P A X7,M y o-g e n i cd e t e r m i n a n t5(M y f5),M y f4,M y o-d i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r (M y o D),m y o g e n i n(M y o G)a n ds oo n.I nt h i s p a p e r,t h e i s o l a t i o n,c u l t u r ea n d i d e n t i f i c a t i o no f m u s c l e s a t e l l i t e c e l l so f p o r c i n es k e l e t a lm u s c l ew e r er e v i e w e d,a n dt h eb e s t p a r a m e t e r s i ne a c h s t e p w e r es o r t e do u t,w h i c h p r o v i d e dr e f e r e n c e sf o re s t a b l i s h i n g as t a n d a r d i z e d p r o c e d u r ef o r i s o l a t i n gp o r c i n es k e l e t a l m u s c l es a t e l l i t ec e l l s,i n o r d e rt o p r o v i d et h e o r e t i c a la n dt e c h n i c a l s u p p o r t f o rm u s c l e d e v e l o p m e n t a n dd i s e a s e r e s e a r c h.K e y w o r d s:p i g s;m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s;i s o l a t i o n;i n v i t r o c u l t u r e;e n z y m e d i g e s t i o nm e t h o d猪的解剖结构和生理特征与人相似,因此可以作为人类疾病研究的模型[1]㊂为比较病理模型的优劣,研究发现,猪假性肥大肌营养不良症(d u c h e n n e m u s c u l a r d y s t r o p h y,D M D)模型的病理状态比鼠模型中更接近于人[2-3]㊂因此,猪肌肉疾病模型比小鼠模型更有优势㊂骨骼肌卫星细胞在出生后机体骨骼肌发育㊁维持和再生等生命活动中都发挥着重要的作用[4]㊂骨骼肌卫星细胞不仅是肌纤维细胞核的来源,而且能促进纤维的肥大[5-6]㊂被激活的骨骼肌卫星细胞可以诱导肌细胞增殖㊁分化,并促使肌细胞与肌纤维融合[7]㊂骨骼肌卫星细胞不仅有增殖分化的潜能,而且可被招募参与骨骼肌运动[8],在肌纤维损伤修复和再生过程中发挥重要作用[9-10]㊂因此,骨骼肌卫星细胞也可以作为肌肉生长发育的良好体外研究模型[11]㊂骨骼肌卫星细胞最早由M a u r o[12]于1961年在青蛙腿肌上分离获得,它位于肌纤维质膜和基底膜之间[13],主要分布于慢肌纤维中[14]㊂之后陆续建立了细胞自然贴壁培养法㊁荧光激活细胞分选法和磁珠激活分选法等方法㊂自然贴壁法耗时㊁低效,荧光激活分选法依赖昂贵的仪器,磁珠法获得的细胞活力低[15]㊂通过添加酶可以适当缩短分离时间,并获得高纯度㊁高活力的细胞,但是目前酶消化法仍存在酶使用种类㊁剂量㊁消化时间不统一,离心过滤时离心力和滤径大小不一㊁离心过滤次数不一致等问题㊂作者通过对分离骨骼肌卫星细胞的取材㊁消化㊁过滤㊁离心㊁体外培养㊁鉴定等基本步骤进行综述,期望为体外获得高纯度㊁高活力的猪骨骼肌卫星细胞,建立规范有效的分离方法提供参考㊂1骨骼肌卫星细胞分离1.1取材1.1.1取材部位骨骼肌卫星细胞分离有直接分离法和肌纤维分离法2种㊂D o u m i t等[16]于1992年利用直接分离法首次从4~8周龄猪的半膜肌中分离出肌源卫星细胞;B e k o f f等[17]于1997年利用肌纤维分离法在小鼠骨骼肌中分离获得肌源卫星细胞㊂W i l s c h u t等[18]于2010年建立猪单纤维分离法,自此陆续从岗上肌[19]㊁趾长伸肌[20]㊁三角肌群[21]㊁背最长肌[22-24]㊁半腱肌㊁半膜肌[24-25]㊁股二头肌[26-27]㊁腓肠肌[28]㊁三头肌[29]㊁后腿肌㊁菱形肌[11,30]㊁第三腓骨肌[28]㊁胫骨前肌[4]等肌肉组织中分离出了猪骨骼肌卫星细胞(图1A)㊂因背最长肌相较四肢的小肌群更大,取材最容易,常被用于分离骨骼肌卫星细胞㊂1.1.2取材时期分离猪骨骼肌卫星细胞的材料可取自胎儿期至幼龄期,如60胚龄[31-32]㊁1日龄[4,33]㊁3日龄[19,27]㊁4日龄[26,28]㊁5日龄[24]㊁7日龄[34]㊁4~6周龄[23]㊁1月龄[19]㊁2月龄[35]㊁5月龄[36]和25周龄[34](图1B)㊂其中最常用的是出生后1日龄猪,并且1~7日龄猪占到85%以上,最大日龄为25周龄㊂猪日龄越大肌肉的体积越大,取材相对越容易,然而,随着时间的延长肌肉中骨骼肌卫星细胞的数量越少,其增殖分化潜能也会越低,因此要获得足够数量且分化潜能高的骨骼肌卫星细胞应取材于1日龄猪背最长肌㊂另外,即使取自同时期的同一部位,不同品种骨骼肌卫星细胞的增殖能力也存在差别[37],如中国大蒲莲猪骨骼肌卫星细胞的增殖能力高于长白猪[7]㊂1.2消化根据分离猪骨骼肌卫星细胞使用酶的种类,将分离方法分为单酶消化法和多酶消化法,单酶有链酶蛋白酶[38-39]㊁胶原酶D[34]㊁蛋白酶[24,27,40-41]㊁蛋白酶ⅩⅣ[31,42]㊁胰蛋白酶[25,43-44]㊁Ⅰ型胶原蛋白酶[45-52]㊁Ⅱ型胶原蛋白酶[7,29,53-63](图2)㊂Ⅱ型胶原蛋白酶是最常用的酶,不同的酶有最佳的使用方法㊂Ⅱ型胶原蛋白酶能有效消化肌肉组织中的结缔组织,用0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶消化2h最佳(图3A㊁3D)㊂Ⅰ型胶原蛋白酶最佳使用方法是0.2%消化1~2h(图3B㊁3E)㊂蛋白酶使用量有4种规格(图3C),最佳消化时间是1h(图3F)㊂23928期喻宗岗等:猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展联合使用2种酶的方法有胶原酶+Ⅹ型胰蛋白酶[19]㊁Ⅰ型胶原酶+胰蛋白酶[4,23,64-65]㊁Ⅱ型胶原酶+胰蛋白酶[66]㊁蛋白酶+Ⅺ型胶原蛋白酶[67-68](图2),其中,0.1%~0.2%Ⅰ型胶原酶+0.25%胰蛋白酶应用最多,也有联合使用胰蛋白酶+胶原酶+D N A 酶3种酶分离骨骼肌卫星细胞的[11,24]㊂罗桂芬等[21]比较了链霉蛋白酶㊁胰酶及胶原酶消化法的分离效果,发现链酶蛋白酶消化法与其他酶消化法相比,可获得数量最多的骨骼肌卫星细胞,但细胞活力没有差异㊂因为不同的酶作用于不同的底物,胶原蛋白酶主要作用于肌束,链酶蛋白酶和胰蛋白酶作用于基底膜和肌膜,促使骨骼肌卫星细胞的释放[69]㊂联合使用多种酶消化肌肉组织中的异质物,虽然能有效去除杂质,但是延长了消化时间㊂1日龄猪肌肉组织中含有最多的是结缔组织,因此使用Ⅱ型胶原蛋白酶是最有效的分离方法㊂p60d ,60胚龄;d ,出生后天数;w ,出生后周龄;m o n ,出生后月龄p 60d ,60e m b r y o a g e ;d ,D a y s a f t e r b i r t h ;w ,W e e k s a f t e r b i r t h ;m o n ,M o n t h s a f t e r b i r t h 图1 肌肉组织取样部位(A )和时期(B )及其使用百分率F i g .1 S a m p l i n g s i t e (A )a n d p e r i o d (B )o fm u s c l e t i s s u e s a n d t h e i r p e r c e n t a g e o f u se 图2 消化酶及其使用百分率F i g .2 D i g e s t i v e e n z y m e s a n d t h e i r p e r c e n t a ge of u s e 1.3 过滤和离心骨骼肌中包含血管㊁神经等结缔组织(图4),分离肌卫星细胞时需要过滤和离心除去结缔组织以获得高纯度的细胞㊂分离猪骨骼肌卫星细胞有不过滤㊁过滤1次和过滤多次3种方式(图5A )㊂1次过滤有20μm [19,26]㊁40μm [35,41,68]㊁70μm [4]㊁100μm [27,70]㊁100目[70]和300m m [46]等多种滤径参数(图5B )㊂2次过滤有100μm+40μm [34,67,71]㊁100μm+70μm [11,30,57]㊁200目+400目[55-56,59,66]㊁200m m +50m m [53,60,62]㊁200μm +70μm [45]㊁70μm+40μm [31,42]㊁76μm+37μm [72]㊁500μm+53μm [38]7种(图5C ),其中200目+400目在2次过滤中应用最广泛㊂3次过滤有100μm+70μm+40μm [29,48,58,61,64]和100目+200目+400目[73]2种;其中100μm+70μm+40μm 是3次过滤的最佳方式(图5C )㊂1次过滤虽然省时,但可能因过滤不足得到的细胞不纯;3次过滤不仅延长了时间,还可能因过度过滤损伤细胞而降低细胞活力㊂因此,最优的过滤方式是200目+400目2次过滤法㊂普通离心和密度梯度离心是骨骼肌卫星细胞常见的2种分离方式㊂普通离心有1次离心和多次离心2种,多次离心有多次单一离心力和多次不同离心力2种㊂300ˑg 离心5mi n (2次)[35]比1000r /m i n 离心10m i n 然后1000r /m i n 离心5m i n [47](图5D )时间短,相同分离效果下更为简便㊂多次不同离心力中(图5E ),2000r /m i n 离心5m i n 后1000r /m i n 离心10m i n [74]比300ˑg 离心6m i n 后800ˑg 再离心10m i n [39]用时少,故而更简捷㊂在用时上,3次离心中,1500ˑg 离心10m i n ㊁800ˑg 离心10m i n㊁800ˑg 离心5m i n 比100ˑg 离心5m i n ㊁1000ˑg离心5m i n (2次)[34]用时长,比1200ˑg 离心15m i n ㊁300ˑg 离心5m i n ㊁1200g 离心15m i n [27]用时短,但是先高离心力能有效去除大块碎屑,再低离心力去除细微杂质,还不至损伤细胞,造成细胞活3392中国畜牧兽医49卷力下降,是最好的3次离心法㊂P e r c o l l 密度梯度离心有3种70%㊁50%㊁40%[26,43],70%㊁50%㊁40%㊁25%[26,44]和60%㊁20%[11,30](图5F ),其中60%㊁20%密度梯度离心法因为成分较其他2种更简单,因此最简便㊂1次和2次离心虽能去除大部分被消化的结缔组织,但是仍有残留,所获的细胞不纯,因此,要有效去除杂质,3次离心法是最佳选择㊂A ㊁D ,分别为Ⅱ型胶原蛋白酶的使用浓度和消化时间使用百分率;B ㊁E ,分别为Ⅰ型胶原蛋白酶的使用浓度和消化时间使用百分率;C ㊁F ,分别为蛋白酶的使用浓度和消化时间使用百分率Aa n dD ,T h ec o n c e n t r a t i o no ft y p e Ⅱc o l l a g e n a s ea n dt h e p e r c e n t a g eo fd i g e s t i o nt i m er e s p e c t i v e l y ;Ba n d E ,T h eu s a g e p e r c e n t a g e o f c o n c e n t r a t i o na n dd i g e s t i o n t i m eo f t y p e Ⅰc o l l a g e n a s e ,r e s p e c t i v e l y ;Ca n dF ,T h eu s a g e p e r c e n t a g eo f p r o t e a s e c o n c e n t r a t i o na n dd i g e s t i o n t i m e ,r e s p e c t i v e l y 图3 3种常用单酶使用条件F i g .3 A p p l i c a t i o n c o n d i t i o n s o f t h r e e c o m m o n s i n g l e e n z ym es 图4 骨骼肌结构模式图[33]F i g .4 S k e l e t a lm u s c l e s t r u c t u r em o d e l d i a gr a m [33]43928期喻宗岗等:猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展A ,过滤次数使用百分率;B ,1次过滤使用百分率;C ,多次过滤使用百分率;D ,1次离心使用百分率;E ,多次离心使用百分率;F ,密度梯度离心使用百分率A ,T h e p e r c e n t a g e o f f i l t e r i n g t i m e s ;B ,T h e p e r c e n t a g e o f s i n g l e f i l t r a t i o n ;C ,T h e u s a g e p e r c e n t a g e o fm u l t i pl e f i l t r a t i o n ;D ,T h e p e r c e n t a g eo fs i n g l ec e n t r i f u g a t i o n ;E ,T h e p e r c e n t a g eo f m u l t i p l ec e n t r i f u g a lu s e ;F ,T h e p e r c e n t a g eo fd e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u ga t i o n 图5 过滤和离心程序及其使用百分率F i g .5 F i l t r a t i o na n d c e n t r i f u g a t i o n p r o c e d u r e s a n d t h e i r p e r c e n t a ge of u s e 2 骨骼肌卫星细胞培养根据分离目标分为成肌细胞㊁骨骼肌卫星细胞分离法和单纤维分离法㊂常用成肌细胞㊁骨骼肌卫星细胞分离法来获得原代细胞㊂有研究比较了单核成肌细胞分离法和单纤维分离法获得骨骼肌卫星细胞的优劣,结果发现单核成肌细胞分离法无法得到同质性高的成肌细胞,且其中的肌卫星细胞数量少,再生能力差;单纤维分离法得到的卫星细胞细胞增殖能力更强,且可以了解骨骼肌卫星细胞初始位置和迁移转化等过程[20]㊂也有通过共培养骨骼肌卫星细胞和基质血管细胞来获得骨骼肌卫星细胞的方法[75]㊂离心后的细胞中含有成肌细胞和骨骼肌卫星细胞,为获得单一的骨骼肌卫星细胞还需进一步分离纯化㊂成肌纤维细胞贴壁早于肌卫星细胞,利用差速贴壁的特性,即可以获得成肌细胞和肌卫星细胞[75-76]㊂体外培养猪肌卫星细胞的培养液包含基础培养基㊁血清㊁抗生素和其他添加物等多种物质㊂对46篇文献的培养液分析归纳获得如下结果㊂猪肌卫星细胞的培养基有6种,使用频次最高的是D M E M /F 12(图6A )㊂血清因其中含有细胞生长必需的成分常被添加在培养基中,常见的添加方式有添加1种血清和添加2种血清㊂添加10%胎牛血清(F B S )比添加20%F B S 更经济㊂10%F B S+10%马血清(H S )和10%F B S +10%猪血清(P S )使用较少(图6B )㊂为防止外源微生物的污染,常在培养基中添加抗生素㊂在46篇研究中只有7篇未添加抗生素,抗生素使用率达到84%以上(图6C )㊂在添加抗生素的报道中,1%青-链霉素(P /S )是必需成分,也有同时添加了青-链霉素和两性菌素[11,26,28-30,43,47,49],还有同时添加了青-链霉素㊁两性菌素和庆大霉素[44]㊂在培养液中添加谷氨酰胺和谷氨酰胺丙氨酸二肽可提高细胞的活性㊁促进细胞生长㊂部分还添加了基础成肌纤维细胞生长因子(b F G F )㊁鸡胚提取物(C E E )㊁氨基酸(A A )㊁4-羟乙基哌嗪乙磺酸(H E P E S )和表皮生长因子(E G F )等物质(图6D~6H ),其中b F G F ㊁C E E 和E G F 可提高细胞的贴壁率,A A 为细胞生长提供营养,5392中国畜牧兽医49卷H E P E S 保证细胞生长的缓冲能力㊂在培养液中添加胞外基质(如明胶㊁鼠尾胶原㊁多聚赖氨酸㊁层黏连蛋白和纤维黏连蛋白)可有效提高细胞的贴壁率[77]㊂对于没有损伤的细胞,有自然贴壁的能力,不用添加促贴壁的物质,增加添加物后细胞渗透压和缓冲力会改变还需要添加缓冲液,因此,D M E M/F 12+10%F B S +1%P /S 是猪骨骼肌卫星细胞培养的最佳培养液㊂①A ,基础培养基使用百分率;B ,血清使用百分率;C ,抗生素使用百分率;D ,谷氨酰胺使用百分率;E ,基础纤维生长因子使用百分率;F ,鸡胚提取物使用百分率;G ,氨基酸使用百分率;H ,其他添加物的使用百分率㊂②D M E M ,杜氏改良伊戈尔培养基;F B S ,胎牛血清;H S ,马血清;P S ,猪血清;F C S ,小牛血清;P S ,青-链霉素;A m p ,两性菌素;G TM ,庆大霉素;b F G F ,基础成肌纤维细胞生长因子;C E E ,鸡胚提取物;N E A A ,非必需氨基酸;A A ,氨基酸;H E P E S ,4-羟乙基哌嗪乙磺酸;E G F ,表皮生长因子;N o n e ,在46篇文献中未使用该物质①A ,T h eu s e d p e r c e n t a g e o f b a s i cm e d i u m ;B ,T h e u s e d p e r c e n t a g e o f s e r u m ;C ,T h e u s e d p e r c e n t a ge of a n t i b i o t i c s ;D ,T h e u s e d p e r c e n t ag eo f g l u t a m i n e ;E ,Th eu s e d p e r c e n t a g e o f b a si c f i b e r g r o w t h f a c t o r ;F ,T h e u s e d p e r c e n t a g e o f c h i c k e n e m b r yo e x t r a c t ;G ,T h eu s e d p e r c e n t a g eo fa m i n oa c i d s ;H ,T h eu s e d p e r c e n t a g eo fo t h e ra d d i t i v e s .②D M E M ,D u l b e c c o s m o d i f i e dE a g l e s m e d i u m ;F B S ,f e t a lb o v i n es e r u m ;H S ,H o r s es e r u m ;P S ,P o r c i n es e r u m ;F C S ,F e t a l c a l fs e r u m ;P /S ,P e n i c i l l i n -s t r e p t o m yc i n ;A m p ,A m p h o t e r i c i n ;G TM ,G e n t a m i c i n ;b F G F ,B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ;C E E ,C h i c k e n e m b r y o e x t r a c t ;N E A A ,N o n e s s e n t i a l a m i n oa c id ;A A ,A m i n oa c i d ;H E P E S ,4-h y d r o x ye t h y l p i p e r a z i n ee t h a n e s u lf o n i ca c i d ;E G F ,E p i d e r m a lg r o w th f a c t o r ;N o n e ,T h e s u b s t a n c ew a sn o t u s e di n46l i t e r a t u r e s 图6 培养液各组分及其使用百分率F i g .6 C o m p o n e n t s o f c u l t u r em e d i u ma n d t h e i r p e r c e n t a ge of u s e 63928期喻宗岗等:猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展3骨骼肌卫星细胞的鉴定骨骼肌卫星细胞是多潜能干细胞,可以分化为成肌细胞和成脂细胞,因此可以使用成肌或成脂标志物来鉴定㊂根据标志基因在细胞中的位置可分为核标记㊁转录因子标记和细胞表面膜蛋白标记[78]㊂常见的核标记有配对盒基因3(P A X3)㊁P A X7;转录因子标记有生肌调节因子5(M y f5)㊁M y f4㊁肌分化因子(M y o D)㊁肌细胞生成素(M y o G)等,表面膜蛋白主要有m-钙黏蛋白㊁α7-和β1-整合素㊁c-M e t㊁C-X-C趋化因子受体4型(C X C R4)㊁多配体蛋白聚糖-3和多配体蛋白聚糖-4㊁降钙素受体㊁颅脑损伤蛋白-1㊁C D34㊁血管细胞黏附分子-1 (V C AM1)和神经细胞黏附分子-1(N C AM1)[79-80]㊂肌卫星细胞标志基因有P A X7[7,43,47,53,56,60,63,66,81-83]和M y f5[27,40,67,84],成脂标志基因有脂蛋白脂酶(L P L)㊁过氧化物酶体增殖物激活受体(P P A Rγ)㊁脂肪细胞和定向分化因子1(A D D1)和固醇调节元件结合蛋白-1(S R E B P-1)[67],成肌标志基因有P A X7[27,28,34]㊁M y o D㊁M y o D1[4,26-28,67,85]㊁M y o G[26,28,85]㊁M y f5[27,28,33,34]㊁肌球蛋白重链(MH C)[24]和结蛋白(D e s m i n)[4,24,28,30,55]㊂P A X7是鉴定骨骼肌卫星细胞的最佳因子㊂免疫荧光(I F)㊁实时荧光定量P C R(q P C R)㊁流式细胞分析(F C)和免疫组化(I H C)是常用的鉴定方法(图7)㊂不同的鉴定因子因其表达的部位和鉴定的简便及有效性的不同而有所侧重㊂D e s m i n使用I H C法鉴定最为有效(图8A),M y f5用I F法鉴定效果最好(图8B)㊂M y o D的鉴定方式中q P C R 法相较I F法更为方便㊁经济,因此被广泛使用(图8C)㊂P A X7使用I F法鉴定最有效(图8D)㊂成脂细胞标志基因常用P C R法来鉴定,还可以使用油红O染色法来鉴定[51]㊂相较于D e s m i n㊁M y f5和M y o D,P A X7在卫星干细胞㊁卫星细胞和成肌细胞上均有表达(图9),因此是最佳的鉴定因子㊂图7鉴定方法及其使用百分率F i g.7I d e n t i f i c a t i o nm e t h o d s a n d t h e i r p e r c e n t a g e o f u se图8标记因子的鉴定方法及其使用百分率F i g.8I d e n t i f i c a t i o nm e t h o da n da p p l i c a t i o n p e r c e n t a g e o fm a r k e r f a c t o r s7392中国畜牧兽医49卷图9 参与调控肌卫星细胞生长变化过程的标记因子[33]F i g .9 M a r k e r f a c t o r s i n v o l v e d i n r e g u l a t i n g t h e g r o w t ha n d c h a n ge s o fm u s c l e s a t e l l i t e c e l l s [33]4 小结猪骨骼肌卫星细胞可以从不同时期的多种肌肉中分离,且各时期分离细胞的数量和增殖能力不同,部位决定着取材的便捷性,因此,常用1日龄猪的背最长肌分离猪骨骼肌卫星细胞㊂酶消化涉及到用酶种类及各酶使用方法,酶种类的增加可以有效去除肌肉中的杂质,但延长了消化时间,很可能因过度消化损伤细胞膜,降低细胞活力,所以使用单酶是比较保险的选择㊂0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶37ħ消化2h 是最有效的消化方式㊂消化后的肌肉组织是细胞和异质碎屑的混合物,需要通过过滤和离心去除组织碎屑,获得纯细胞㊂单次过滤㊁单次离心难以有效去除杂质,多次过滤㊁离心可能会损伤细胞膜降低细胞活力,因此2次过滤加3次离心是最佳选择,即400目+200目过滤,1500ˑg 离心10m i n㊁800ˑg 离心10m i n ㊁800ˑg 离心5m i n 是最佳组合㊂过滤离心后的细胞还包含成肌细胞,因此需进一步培养纯化获得单一的骨骼肌卫星细胞㊂成肌细胞在培养液中正常生长后会较早贴壁,因此可取贴壁后的上清继续培养来获得骨骼肌卫星细胞㊂培养液对细胞的正常生长至关重要,原代细胞在离体环境中需要充足的营养和无菌环境,D M E M /F 12+10%F B S +1%P /S 是细胞培养的常见培养液㊂骨骼肌卫星细胞可通过核标志㊁转录标志和膜表面标志等标志基因或卫星细胞标记㊁成肌细胞标记和成脂细胞标记因子来鉴定,P A X 7基因广泛表达于肌卫星细胞和成肌细胞,因此是最佳的鉴定基因㊂尽管q P C R ㊁F C ㊁I F 和I H C 等方法均可用来鉴定,但I F 法更为直观和准确,因此广泛被使用㊂为获得纯度㊁活力和分化潜能更高的猪骨骼肌卫星细胞,还需要规范和优化取材㊁消化㊁过滤㊁离心㊁培养和鉴定等步骤,建立简便有效的体外分离培养程序㊂随着新的鉴定方法的出现和新技术的普及,猪骨骼肌卫星细胞的分离培养也将更加高效便捷㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] G R O E N E N M A ,A R C H I B A L D A L ,U E N I S H IH ,e ta l .A n a l y s e sof p i gg e n o m e s p r o v i d ei n s i gh ti n t o p o r c i n ed e m o g r a p h y an de v o l u t i o n [J ].N a t u r e ,2012,491(7424):393-398.[2] N A K AMU R A A ,T A K E D AS .M a m m a l i a nm o d e l so fd u c he n n em u s c u l a rd y s t r o p h y:P a t h o l o gi c 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r l a n d s ),2014,36(2):545-547.[6] F A R U PJ ,R A H B E K S K ,R I I SS ,e t a l .I n f l u e n c eo fe x e r c i s ec o n t r a c t i o nm o d ea n dpr o t e i n s u p p l e m e n t a t i o n o n h u m a ns k e l e t a l m u s c l es a t e l l i t e c e l l c o n t e n ta n d m u s c l ef i b e r g r o w t h [J ].J o u r n a l o f A p p l i e dP h y s i o l o g y ,2014,117(8):898-909.[7] Z HA O X ,Z HU R ,WA N G Y ,e ta l .D i f f e r e n t i a t i o np r o l i f e r a t i v e c a p a c i t y of s k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t ec e l l s f r o m D a p u l i a na n dL a n d r a c e p ig s [J ].I t a l i a nJ o u r n a l o f A n i m a lS c i e n c e ,2020,19(1):574-585.[8] HAWK E T ,G A R R Y D .M y o ge n i c s a t e l l i t e c e l l s :P h y s i o l o g y t o m o l e c u l a r b i o l o g y [J ].J o u r n a l o f83928期喻宗岗等:猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展A p p l i e dP h y s i o l o g y,2001,91(2):534-551.[9] M C C A R T H Y JJ,M U L A J,M I Y A Z A K I M,e ta l.E f f e c t i v ef i b 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基于单细胞测序技术探讨动物骨骼肌卫星细胞与生态位细胞之间的“对话”

基于单细胞测序技术探讨动物骨骼肌卫星细胞与生态位细胞之间的“对话”目录一、内容概要 (2)1.1 研究背景 (2)1.2 研究意义 (3)二、单细胞测序技术概述 (4)2.1 技术原理 (5)2.2 技术应用 (6)2.3 技术优势 (8)三、动物骨骼肌卫星细胞研究进展 (9)3.1 细胞特性 (10)3.2 功能研究 (11)3.3 分化机制 (13)四、生态位细胞研究进展 (14)4.1 细胞特性 (15)4.2 功能研究 (16)4.3 与卫星细胞的相互作用 (18)五、单细胞测序技术在动物骨骼肌卫星细胞与生态位细胞研究中的应用195.1 靶向富集 (20)5.2 时空动态分析 (21)5.3 相互作用网络构建 (22)六、基于单细胞测序技术的动物骨骼肌卫星细胞与生态位细胞之间的“对话”236.1 “对话”机制 (24)6.2 具体案例分析 (26)6.3 生态位细胞对卫星细胞分化的影响 (27)6.4 卫星细胞对生态位细胞功能的影响 (28)七、结论与展望 (29)7.1 结论总结 (30)7.2 研究展望 (32)一、内容概要本文基于单细胞测序技术，深入探讨动物骨骼肌卫星细胞与生态位细胞之间的对话机制。

将概述单细胞测序技术在研究骨骼肌卫星细胞与生态位细胞交互作用中的应用背景和重要性。

将介绍骨骼肌卫星细胞和生态位细胞的基本特性及其功能，包括它们在肌肉再生和稳态维持中的作用。

文章将重点阐述如何通过单细胞测序技术揭示这两种细胞类型之间的“对话”包括它们之间的信号传递、分子交流以及可能的细胞间相互作用。

还将讨论如何利用这些数据来深入理解卫星细胞与生态位细胞在动物适应环境、生长发育以及应对外界刺激等过程中的协同作用。

本文还将探讨单细胞测序技术在研究这些细胞交互作用中的技术挑战和局限性，以及如何克服这些挑战以获得更精确的数据。

将展望单细胞测序技术在未来研究骨骼肌卫星细胞与生态位细胞交互作用中的潜在应用和前景。

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C
D
C 利用兔ER-β特异性多克隆抗体孵育细胞 D 苏木精染色细胞核
由图可以看出，对骨骼肌细胞核ERα和ERβ进行免疫组织化学染色显示在来源于卫星细胞的成肌纤维上显阳性。
X. Li等（2009）以鸡卫星细胞为材料研究转化生长因子-β1（TGF-β1）对肌肉细胞的凋亡作用。
由左图可以看出，实验组细胞凋亡的数量显著高于对照组，说明TGF-β1能诱导卫星细胞凋亡。
以体外培养的骨骼肌卫星细胞为材料对骨骼肌纤维类型进行研究，发现肌纤维的生长规律，为体外调控肌纤维生长，改善肉品质提供理论依据。
随着卫星细胞体外培养技术的成熟，以及研究趋势的变化，细胞水平上的研究将会越来越广泛。未来以骨骼肌卫星细胞为材料的研究可能会集中在以下几个方面： 1 建立各物种、品种骨骼肌卫星细胞体外培养体系； 2 细胞水平的各功能基因的研究； 3 体外培养的卫星细胞用于疾病治疗的研究； 4 利用骨骼肌卫星细胞研究动物肌肉生长发育的规律。
织卫中星的细分胞布在组
A
B
星刚细分胞离图的片卫
C
D
星贴细壁胞后的卫
的长细满胞瓶形底态时
A
B
A、卫星细胞融合成肌管 B、卫星细胞分化为成熟脂肪细胞
二、卫星细胞分离方法的比较
卫星细胞分离方法有两种：组织块法和酶消化法组织块法：将肌肉组织在无菌条件下剔除血管、脂肪、肌腱等组织，用眼科剪剪成1mm3的小块，然后培养在培养瓶中，3天左右卫星细胞就从组织块周围爬出，待细胞长满培养瓶的70%～80%后就消化传代得到卫星细胞。
骨骼肌卫星细胞的研究进展
目录
一、基本概念的介绍二、卫星细胞分离方法的比较三、卫星细胞纯化方法的比较四、卫星细胞的鉴定方法五、卫星细胞在畜禽上的研究进展
一、卫星细胞基本概念的介绍
卫星细胞：骨骼肌卫星细胞位于肌膜和基底膜之间，一般情况下这些细胞处于静止状态，当肌细胞受到损伤刺激或诱导时，卫星细胞才被激活、增殖，并与原有的骨骼肌细胞相互融合，形成新的肌纤维细胞。总结卫星细胞的功能，可以得出以下几个要点： 1 位于肌膜和基底膜之间，起源于中胚层干细胞,是一种肌源性干细胞； 2 一般情况下处于静止状态，当肌细胞受到损伤刺激或诱导时才被激活； 3 卫星细胞具有分化功能，在一定条件下可以向成心肌细胞、成脂细胞以及成骨细胞等方向分化。
参考文献：中文15篇，英文37篇近5年文献：48篇
这些试验结果为我们研究肌肉生长的调节提供了基本依据。
由以上几篇文章可以看出，在骨骼肌卫星细胞上进行的功能基因的研究主要是研究基因的表达水平和功能，为后续的深入研究（如基因功能调控）和生产实践（如调节生长发育）提供理论依据。
4 利用骨骼肌卫星细胞进行肌纤维类型转换的研究进展
J.M. Gonzalez等（2007）为了研究雷托巴胺盐酸盐（RAC）和群勃龙醋酸酯（TBA）对背最长肌纤维横截面积（CSA）、直径和卫星细胞数的影响。
两种纯化法的比较
表2 单位面积内两组细胞增殖情况（n=10
x±s ）
单位面积内细胞个数（个/mm2）组别 2d 3d 4d 5d 6d
贴壁组 27±10 39±13 51±13 71±12 93±19 梯度组 29±12 35±12 43±11 67±17 91±22
注：同一时刻每两组之间比较均为P>0.05。由上表可以看出，两种纯化方法对卫星细胞的增殖无显著性差异。
胰酶
胶原酶
aP＜
1.47±0.09
0.006±0.001
93.00±3.00
93.00±4.30
0.05
三、卫星细胞纯化方法的比较
卫星细胞纯化方法最常用的包括差速贴壁法、 Percoll液梯度离心法。差速贴壁法：关键是利用成纤维细胞贴壁能力比卫星细胞强而先贴壁的原理来分离细胞。成纤维细胞的贴壁时间一般为30～60min，因此在此时间段内转出上清液于一新培养瓶，重复3次即可完成细胞的纯化。 Percoll液梯度离心法：先将离心管壁用牛血清湿润，除去多余血清，将600mL· L -1和200mL，加入重悬后的细胞悬液3mL，1000r· min-1离 25min，取交界面的细胞，即为卫星细胞。
猪
消化方法
胶原酶和胰酶混合消化
纯化方法
差速贴壁法
培养基
含10%或15%FBS培养基
参考文献
何波等（2006）高琦等（2006）李冲等（2007）
鸡
Ⅰ型胶原酶和胰酶两步消化
机械法和酶消化法相结合链霉蛋白酶
差速贴壁法
含10%FBS培养基
陈岩等（2006）李芳华等（2010）郑素月等（2011）
卫星细胞分化为肌管
卫星细胞分化为脂肪细胞
阮井玲等（2008）以体外培养的猪骨骼肌卫星细胞为实验材料，利用RNAi技术，以Smad3为靶基因进行干扰研究，研究干扰前后猪骨骼肌卫星细胞增殖情况的变化。下图可以看出干扰后猪骨骼肌卫星细胞增殖速度与正常细胞相比较快（Ｐ＜0.05）。X. Li等（2008）以鸡骨骼肌卫星细胞为对象也证明Smad3依赖的信号通路可能涉及到卫星细胞增值和分化的管理。
表3 两组卫星细胞融合率比较（组别贴壁组梯度组 n 10 10
）
成肌细胞融合率（%） 20.6±5.3 33.2±8.9a
注：与贴壁组比较，aP﹤0.01. 从统计结果可以看出，梯度离心纯化法培养的卫星细胞融合率明显比差速贴壁法的细胞融合率要高，差异极显著（P＜0.01)，证明这种方法获得的细胞纯度更高。
酶消化法：酶消化法就是向组织块中加入适量的酶，在37℃恒温水浴锅中消化一段时间，然后加入含血清的培养基终止消化，最后进行分离培养。酶消化法所使用的酶主要有胶原蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶三种。
链霉蛋白酶、胰酶和胶原酶消化猪骨骼肌对比实验结果如下表：表1 各种消化酶消化细胞所得的细胞数和存活率比较消化酶链霉蛋白酶细胞数（×106个） 2.83±0.24a 存活率（%） 95.00±3.50
S. E. Ouellette等（2009）为了鉴定LEK1的功能，通过细胞转染技术抑制 LEK1蛋白（ΔLEK1(991) 和ΔLEK1(911)）评估细胞增殖情况。
由图可以看出，经转染以后，Ki67的表达量降低，说明LEK1起到协调肌原性细胞增殖的作用。
A. K. Tripathi等（2011）通过体外培养的成肌细胞，利用了实时荧光定量PCR 检测了肌肉抑制素，卵泡抑素，核心蛋白聚糖和三种特殊的肌肉转录因子在成年山羊肌管中的mRNA表达水平。
由表中数据显示TBA和RAC对Ⅰ型纤维的作用效果要明显。
黄金秀等（2010）研究不同浓度共轭亚油酸（conjugated linoleic acid， CLA）对体外培养的猪骨骼肌肌纤维类型组成的影响规律。以体外培养的原代猪骨骼肌卫星细胞为材料，在卫星细胞向肌纤维转化时添加不同水平 CLA 。分别采用相对定量RT-PCR测定肌纤维中MyHCⅠ、MyHC2a、 MyHC2b、MyHC2x4种MyHC基因表达。
Pax7是静息期的特异性标志， MyoD 和Desmin是增殖期的特异性标志。
五、卫星细胞在畜禽上的研究进展
1 畜禽卫星细胞体外培养体系建立的研究进展
从卫星细胞第一次被发现至今，关于体外培养体系建立的研究已经取得了很大的进展，技术也很成熟，下面就简要介绍一下各物种在这方面的研究进展。
表4 畜禽卫星细胞体外培养体系建立的研究进展动物
庄新杰等（2009）
牛
差速贴壁法
含10%犊牛血清培养基 10%FBS培养基
山羊
梯度离心法
Keitaro YAMANOUCHI等（2007）
2 骨骼肌卫星细胞增殖分化的研究进展
E. K. Sissom等（2006）研究美仑孕酮醋酸盐(MGA)或黄体酮(P4)对牛骨骼肌卫星细胞的影响。
Keitaro YAMANOUCHI等（2007）为了检验山羊骨骼肌细胞在体外具有向成肌细胞和成脂细胞分化的能力。
影响细胞增殖和分化的因素很多，如上文提到的外源添加的黄体酮可影响细胞增殖，同时也受基因的调控如Smad3等。卫星细胞在体外分化同样受到环境的控制，生长密度大或培养在含胰岛素、转铁蛋白的培养基中，细胞就会向成肌或成脂方向分化。
3 在骨骼肌卫星细胞中开展功能基因的研究进展
Claudia Kalbe等（2007）从蛋白质水平研究雌激素受体（ERα和ERβ）是否在从半膜肌（SM）得到的卫星细胞中表达。 A B A 利用老鼠ER-α特异性单克隆抗体孵育细胞 B 苏木精染色细胞核
四、卫星细胞的鉴定方法
A B C A：Pax7 在细胞核中呈阳性表达； B：应用DAPI 对细胞核进行染色； C：A 与B 叠加图。
D
E
F
D：MyoD 在细胞核中呈阳性表达； E：应用DAPI 对细胞核进行染色； F：D 与E 叠加图片。
G
H
I
G：Desmin 在细胞质中呈阳性表达； H：应用PI 对细胞核进行染色； I：G 与H 叠加图片。