肌肉卫星细胞

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肌卫星细胞的研究进展

肌卫星细胞的研究进展

肌卫星细胞的研究进展作者:李小雷来源:《中国保健营养·中旬刊》2013年第03期【摘要】干细胞研究仍然是当今医学的热点问题,尤其是肌肉干细胞因直接参与骨骼肌分化而备受关注。

胚胎和成人体内都存在肌肉干细胞。

由于肌肉卫星细胞在肌肉的发育和再生中发挥主要作用,目前公认的成人体内肌肉干细胞主要是指肌肉卫星细胞。

近年研究发现,肌卫星细胞在组织工程和疾病研究中都起着比较重要的作用,将为治疗包括帕金森病在内的多种临床退行性疾病提供自体干细胞的新来源。

【关键词】肌干细胞;肌再生;肌肉修复;肌卫星细胞【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2013)03-0141-01肌卫星细胞Mauro[1]等于1961年首次在蛙骨骼肌中发现。

肌卫星细胞是具有增殖和自我更新能力的成肌前体细胞,这种组织特异的祖细胞在出生后骨骼肌的损伤、修复和维持再生中起着重要的作用。

Gussoni等[2]用Hoechest/FACS方法从骨骼肌中分离到多能干细胞,有关性质尚不清楚。

这些肌源干细胞既能形成再生肌纤维,也能有效重建造血系统。

肌源干细胞的这种可塑性,使有关肌卫星细胞的起源、激活与分化的分子调控机制以及肌卫星细胞的干细胞特性等方面的研究成为该领域的热门课题。

1 肌卫星细胞的起源肌卫星细胞属于肌源性细胞谱系,起源仍不完全清楚,目前有两种假说:体节来源和内皮来源。

体节来源假说来自鸡雏鹌鹑异源嵌合体实验,将鹌鹑的胚胎中胚层生肌节移植到宿主鸡的胚胎中,且被移植的鹌鹑细胞有明显的形态特征,可以观察到这些细胞从移植的中胚层生肌节迁徙到胚胎发育的肢体,并组成出生后鸡骨骼肌的肌卫星细胞群。

以后,大量的研究也证明了这一假说。

De Angelis等认为,卫星细胞也有可能是内皮来源的。

从胚胎背侧主动脉分离到的细胞具有与肌卫星细胞相似的形态和基因表达特征,此外,将这种主动脉来源的细胞移植到新生小鼠后,发现这种细胞参与出生后肌肉的生长和再生,并可与中胚层生肌节来源的肌纤维融合。

骨骼肌卫星细胞的研究进展

骨骼肌卫星细胞的研究进展

C
D
C 利用兔ER-β特异性多克隆抗 体孵育细胞 D 苏木精染色细胞核
由图可以看出,对骨骼肌细胞核ERα和ERβ进行免疫组织化学染色显示在来源于 卫星细胞的成肌纤维上显阳性。
X. Li等(2009)以鸡卫星细胞为材料研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对肌肉 细胞的凋亡作用。
由左图可以看出,实验组 细胞凋亡的数量显著高于 对照组,说明TGF-β1能诱 导卫星细胞凋亡。
以体外培养的骨骼肌卫星细胞为材料对 骨骼肌纤维类型进行研究,发现肌纤维的生 长规律,为体外调控肌纤维生长,改善肉品 质提供理论依据。
随着卫星细胞体外培养技术的成熟,以及研究趋 势的变化,细胞水平上的研究将会越来越广泛。未来 以骨骼肌卫星细胞为材料的研究可能会集中在以下几 个方面: 1 建立各物种、品种骨骼肌卫星细胞体外培养体系; 2 细胞水平的各功能基因的研究; 3 体外培养的卫星细胞用于疾病治疗的研究; 4 利用骨骼肌卫星细胞研究动物肌肉生长发育的规律。
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A
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A
B
A、卫星细胞融合成肌管 B、卫星细胞分化为成熟脂肪细胞
二、卫星细胞分离方法的比较
卫星细胞分离方法有两种:组织块法和酶消化法 组织块法:将肌肉组织在无菌条件下剔除血管、脂 肪、肌腱等组织,用眼科剪剪成1mm3的小块,然后 培养在培养瓶中,3天左右卫星细胞就从组织块周围 爬出,待细胞长满培养瓶的70%~80%后就消化传 代得到卫星细胞。
骨骼肌卫星细胞的研究进展
目录
一、基本概念的介绍 二、卫星细胞分离方法的比较 三、卫星细胞纯化方法的比较 四、卫星细胞的鉴定方法 五、卫星细胞在畜禽上的研究进展

肌肉卫星细胞与肌腱干细胞生物学特性检测及其在肌肉和肌腱损伤动物模型上的研究

肌肉卫星细胞与肌腱干细胞生物学特性检测及其在肌肉和肌腱损伤动物模型上的研究

肌肉卫星细胞与肌腱干细胞生物学特性检测及其在肌肉和肌腱损伤动物模型上的研究肌肉卫星细胞与肌腱干细胞生物学特性检测及其在肌肉和肌腱损伤动物模型上的研究摘要:肌肉和肌腱组织受损伤后,肌肉卫星细胞和肌腱干细胞能够参与修复和再生过程,但它们的生物学特性尚未完全了解。

本研究中,我们对肌肉卫星细胞和肌腱干细胞的特性进行了检测,并研究了它们在肌肉和肌腱损伤动物模型中的应用。

通过细胞培养和Western blot检测,我们发现肌肉卫星细胞具有干细胞标志物如CD34、MyoD和Pax7等;而肌腱干细胞则表达了干细胞标志物如CD29、CD44和CD90等。

在肌肉和肌腱损伤动物模型中,我们发现移植的肌肉卫星细胞和肌腱干细胞能够促进组织修复和再生,但肌腱干细胞的效果更佳。

我们认为肌肉卫星细胞和肌腱干细胞在肌肉和肌腱组织修复和再生中具有重要作用,可以作为治疗策略的一部分。

关键词:肌肉卫星细胞,肌腱干细胞,生物学特性,肌肉损伤,肌腱损伤,动物模型Introduction肌肉和肌腱组织是人体运动和支撑系统的重要组成部分。

这些组织容易受到损伤,例如肌肉拉伤和肌腱断裂等。

肌肉卫星细胞和肌腱干细胞是这些组织中的专门细胞类型,它们能够参与组织修复和再生过程。

然而,这些细胞的特性尚未完全了解。

了解这些细胞的特性,有助于我们更好地利用它们来促进组织修复和再生。

Materials and Methods肌肉卫星细胞和肌腱干细胞分别从小鼠肌肉和肌腱中分离得到,通过细胞培养和Western blot检测来检测它们的生物学特性。

对于肌肉和肌腱损伤动物模型,小鼠分别接受肌肉和肌腱损伤,移植肌肉卫星细胞和肌腱干细胞后观察组织修复和再生情况。

Results通过细胞培养和Western blot检测,我们发现肌肉卫星细胞具有干细胞标志物如CD34、MyoD和Pax7等;而肌腱干细胞则表达了干细胞标志物如CD29、CD44和CD90等。

在肌肉和肌腱损伤动物模型中,我们发现移植的肌肉卫星细胞和肌腱干细胞能够促进组织修复和再生,但肌腱干细胞的效果更佳。

肌卫星细胞的名词解释

肌卫星细胞的名词解释

肌卫星细胞的名词解释肌卫星细胞(Myogenic Satellite Cells)是一种存在于骨骼肌组织中的多能干细胞。

它们起到维持和修复肌肉组织的重要作用。

肌卫星细胞处于静止状态,当肌肉组织受到损伤或应激时,它们便会被激活并开始分裂增殖,成为新的肌肉细胞。

肌卫星细胞是在发育早期就存在的一类细胞。

在胚胎发育过程中,它们起源于胚外胚层,并由干细胞细胞团分化而来。

一旦分化为肌卫星细胞,它们便局限于肌肉纤维的表面,默默守候着肌肉组织受损的时刻。

与其他细胞相比,肌卫星细胞具有较高的分裂潜能和自我更新能力。

当肌肉组织受到损伤时,肌卫星细胞会被激活并开始分裂。

激活主要是由于一系列信号分子的作用,例如机械刺激、细胞因子和信号通路的调节。

分裂的肌卫星细胞会经过几轮细胞分裂,其中一部分细胞会继续保持为肌卫星细胞,以备将来再次使用。

其他分裂的细胞则会进一步分化,形成新的肌肉细胞。

这些新形成的肌肉细胞会融合到现有的肌肉纤维中,以修复受损的肌肉组织。

肌卫星细胞对于肌肉修复和再生起到了至关重要的作用。

它们不仅能够提供新的肌肉细胞,还通过释放细胞因子来调节肌肉生长和再生的过程。

肌卫星细胞的存在使得骨骼肌能够在受损后迅速恢复其结构和功能,使得我们能够进行日常活动和运动。

除了肌肉受损修复,肌卫星细胞还参与了肌肉的发育和增长过程。

在儿童和青少年期,肌卫星细胞的数量较多,这也是肌肉的发育和成长期。

随着年龄的增长,肌肉的含量和质量逐渐降低,而肌卫星细胞的数量也减少。

因此,保持良好的骨骼肌健康和促进肌卫星细胞的活性对于预防肌肉退化和老化非常重要。

总结而言,肌卫星细胞是一类在骨骼肌组织中存在的多能干细胞,它们能够维持和修复肌肉组织的健康。

肌卫星细胞的激活和分裂能够产生新的肌肉细胞,以修复受损的肌肉组织。

此外,肌卫星细胞还参与了肌肉的发育和增长过程。

对于保持骨骼肌的健康和预防肌肉退化,保持肌卫星细胞的活性非常关键。

《组蛋白乳酸化在Myostatin基因编辑牛肌卫星细胞分化融合中的作用机制研究》范文

《组蛋白乳酸化在Myostatin基因编辑牛肌卫星细胞分化融合中的作用机制研究》范文

《组蛋白乳酸化在Myostatin基因编辑牛肌卫星细胞分化融合中的作用机制研究》篇一一、引言随着生物技术的飞速发展,基因编辑技术如CRISPR-Cas9系统在动物育种和疾病治疗等领域的应用日益广泛。

Myostatin基因作为肌肉生长的重要调控因子,其编辑技术在改良牛只肌肉生长性能方面具有巨大潜力。

而组蛋白乳酸化作为一种重要的表观遗传修饰方式,对基因的表达具有显著影响。

本研究旨在探讨组蛋白乳酸化在Myostatin基因编辑牛肌卫星细胞分化融合过程中的作用机制。

二、研究背景及意义Myostatin基因是一种负向调控肌肉生长的基因,通过编辑该基因可以实现对牛只肌肉生长性能的改良。

而组蛋白乳酸化作为近年来表观遗传学领域的研究热点,其与基因表达的关系逐渐被揭示。

在肌卫星细胞的分化融合过程中,组蛋白乳酸化可能起到关键作用,影响Myostatin基因的表达,进而影响肌肉生长。

因此,研究组蛋白乳酸化在Myostatin基因编辑牛肌卫星细胞分化融合中的作用机制,对于优化基因编辑技术、提高牛只肌肉生长性能具有重要意义。

三、材料与方法3.1 材料本研究选用健康牛只的肌卫星细胞作为研究对象,通过基因编辑技术对Myostatin基因进行编辑。

同时,收集牛只肌肉组织样本,提取组蛋白进行相关实验。

3.2 方法3.2.1 细胞培养与基因编辑培养牛肌卫星细胞,利用CRISPR-Cas9系统对Myostatin基因进行编辑,构建基因编辑细胞模型。

3.2.2 组蛋白提取与乳酸化检测收集细胞样本,提取组蛋白,检测组蛋白乳酸化程度。

3.2.3 基因表达分析通过荧光定量PCR、Western Blot等技术,分析Myostatin基因及其他相关基因的表达情况。

3.2.4 细胞分化融合实验对基因编辑细胞进行诱导分化融合,观察细胞形态变化,分析组蛋白乳酸化对细胞分化融合的影响。

四、实验结果4.1 组蛋白乳酸化程度检测结果实验结果显示,在Myostatin基因编辑的牛肌卫星细胞中,组蛋白乳酸化程度明显高于未编辑细胞。

《PPAR-α调控fad3小鼠肌卫星细胞能量代谢机制研究》范文

《PPAR-α调控fad3小鼠肌卫星细胞能量代谢机制研究》范文

《PPAR-α调控fad3小鼠肌卫星细胞能量代谢机制研究》篇一一、引言近年来,能量代谢在肌肉生物学和疾病发生机制中的重要性逐渐被揭示。

肌卫星细胞作为肌肉组织的重要组成部分,其能量代谢的调控机制研究成为热点。

PPAR-α作为一种核受体转录因子,对细胞能量代谢起着关键作用。

本论文将研究PPAR-α在Fad3小鼠肌卫星细胞中的调控作用,探索其能量代谢的机制。

二、材料与方法1. 实验动物及模型本研究选用Fad3小鼠作为研究对象,其基因突变导致脂肪酸代谢异常,为研究提供了良好的模型。

2. 细胞培养与处理从Fad3小鼠中分离出肌卫星细胞,进行体外培养。

通过添加PPAR-α激动剂或抑制剂,观察其对肌卫星细胞的影响。

3. 实验方法采用实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫荧光等技术,检测PPAR-α在肌卫星细胞中的表达及对相关基因和蛋白的影响。

三、PPAR-α在肌卫星细胞中的表达及功能通过实时荧光定量PCR和Western Blot实验,我们发现PPAR-α在Fad3小鼠肌卫星细胞中表达较高。

PPAR-α的激活可促进肌卫星细胞的增殖和分化,同时对脂肪酸代谢相关基因的表达有显著影响。

四、PPAR-α调控肌卫星细胞能量代谢的机制1. 脂肪酸代谢途径的改变PPAR-α激活后,肌卫星细胞内的脂肪酸代谢途径发生改变,脂肪酸氧化增加,合成减少。

通过实时荧光定量PCR和Western Blot实验,我们发现脂肪酸氧化相关基因的表达上调,而脂肪酸合成相关基因的表达下调。

2. 能量代谢相关蛋白的变化PPAR-α激活后,肌卫星细胞内的能量代谢相关蛋白发生变化。

例如,线粒体相关蛋白的表达增加,有利于能量的产生和利用。

此外,PPAR-α还可能影响糖代谢相关蛋白的表达,从而影响细胞的能量供应。

五、讨论本研究表明,PPAR-α在Fad3小鼠肌卫星细胞中发挥重要的调控作用,通过改变脂肪酸代谢途径和能量代谢相关蛋白的表达,影响肌卫星细胞的能量代谢。

体外培养的肌卫星细胞在肌肉冻伤模型中的修复作用研究

体外培养的肌卫星细胞在肌肉冻伤模型中的修复作用研究

体外培养的肌卫星细胞在肌肉冻伤模型中的修复作用研究杨成;顾晓明;郭红延;鄢荣曾【期刊名称】《现代口腔医学杂志》【年(卷),期】2009(23)2【摘要】目的研究体外培养的肌肉卫星细胞在冻伤模型中的修复作用.方法使用改良的方法在体外获得高纯度卫星细胞,同时通过冻伤得到C57小鼠腓肠肌的冻伤模型.通过注射方法将卫星细胞移植到3周后的冻伤模型中.不同时间取材,通过组织学观察卫星细胞在冻伤模型中的修复能力.结果移植细胞早期表现为灶型的增殖,增殖的细胞呈现漩涡状扩展,周边的细胞迁移很远.细胞移植4周后的组织学证实卫星细胞已经相互融合形成肌管,肌肉体积增大.6周后出现功能恢复.组织学表现为再生的肌纤维有明确的功能性排列,结构更趋于正常组织.结论体外培养的卫星细胞可以修复冻伤的肌肉,表现出良好的修复能力.【总页数】3页(P159-161)【作者】杨成;顾晓明;郭红延;鄢荣曾【作者单位】100039,北京,武警总医院口腔科;100039,北京,武警总医院口腔科;100039,北京,武警总医院口腔科;武警江西总队医院口腔科【正文语种】中文【中图分类】R780.2【相关文献】1.骨骼肌卫星细胞生物学特性及在肌肉损伤修复中的应用前景 [J], 元虹懿;袁子奥;支晓亮;张明海2.大鼠快肌卫星细胞移植在肌肉钝挫伤模型中的修复作用 [J], 于秋华;朱道立3.运动性损伤后肌肉再生和修复研究——肌肉粗提液对于运动性损伤骨髂肌的作用观察 [J], 刘明菊;李静先;李明4.肌肉组织工程的基础研究-肌肉冻伤模型的建立 [J], 杨成;郭红延;顾晓明5.可溶性载体复合成肌细胞移植对胫前肌深度冻伤的修复作用研究 [J], 黄富国;张斌;林辉;杨志明;解慧琪因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

肌肉卫星细胞

肌肉卫星细胞

肌肉卫星细胞是骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性细胞。

它们在一般情况下是处于静息状态的,当被激活后,具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌细胞的能力。

在那里它们通过形成与肌肉纤维融合的先驱细胞来对损伤做出反应。

有研究报告说,它们能充当干细胞,但卫星细胞群的混合性质意味着,它们的干细胞身份难以证明。

”“最新一期Nature刊登由美国斯坦福大学医学院的Sacco等人的研究结果:研究小组通过利用克隆分析证实卫星细胞的确是干细胞、能够自我更新,从而澄清了相关问题。

他们将一个表达荧光素酶的卫星细胞移植进了小鼠的肌肉中,发现它能够大量增殖,有助于肌肉纤维的形成,而且可以被再次移植。

因此断定肌肉卫星细胞也是一种干细胞。

”肌肉中肌肉卫星细胞非常多。

我们在进行性肌营养不良的肌肉病变中很容易发现大量的由卫星细胞分化而来的再生细胞。

然而,这些干细胞中缺乏、缺损某些膜蛋白基因。

因此,即使发生再生,也只能再生膜功能缺损肌纤维,免不了肌纤维变性坏死的命运。

我们实验室的研究重点是,如何保护膜蛋白缺损的肌纤维,而不是通过基因治疗,如何根治肌营养不良。

因为目前世界上哪一个实验室也做不到这一点,某些研究成果,即使在动物身上似乎有效,但人身上还是没有得到证实。

在肌肉修复功能当肌肉细胞进行损伤,静止卫星细胞从基底膜下方的释放。

他们被激活,并重新进入细胞周期。

这些分裂的细胞被称为“过境放大池”前接受生肌分化,形成新的肌管(有丝分裂后)。

也有证据表明这些细胞能够与现有的肌纤维融合,促进生长和修复。

肌肉再生的过程,涉及相当大的重塑细胞外基质,并发生了广泛的破坏,是不完整的的。

肌肉存款瘢痕组织成纤维细胞内,这可能削弱肌肉的功能,是一个的重要组成部分肌营养不良症的病理。

卫星细胞增殖肌肉损伤(西尔,等,2003),并形成新的肌纤维,通过对胎儿肌肉的发育(帕克等人,2003年)的过程类似。

经过多次细胞分裂,卫星细胞开始与周边核保险丝损坏的肌管,并进行进一步的分化和成熟,作为标志(帕克等,2003)。

成肌细胞基础知识

成肌细胞基础知识

成肌细胞基础知识1 来源与概念骨骼肌中的肌卫星细胞,长期以来就被认为是出生后骨骼肌生长、修复和维持的单能成肌干细胞。

近年研究发现,肌卫星细胞与内皮细胞共同起源于胚胎血管祖细胞,且成年骨骼肌中存在多能干细胞,这些肌源多能干细胞在适当的微环境中具有多向分化潜能。

从骨骼肌中分离获得的肌卫星细胞在体外分离培养时被统称为成肌细胞。

2 成肌细胞激活与成肌分化的调控成肌细胞的激活和成肌分化受MyoD家族的家族的bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子调节,这些成肌调节因子(Myogenic regulatory factors, MRFs)即包括Myod、Myf5、Myogenin、MRF4。

其中Myod和Myf5决定着成肌细胞是否能激活成为具有成肌特性的肌肉干细胞,而Myogenin和MRF4则发挥着调节肌肉干细胞终末分化为肌管肌纤维的功能。

处于静止状态的成肌细胞不能检测到MRFs 的表达。

成肌细胞的定向分化需要Myod家族的转录因子参与。

在成肌细胞激活前,如果缺乏表达MRFs mRNA,那么此细胞就可以被假设代表一种与成肌细胞不同的干细胞。

3 生长因子对成肌细胞增殖与成肌分化的调节3.1胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor 1, IGF-1)IGF-1是成肌细胞增殖和肌肉干细胞终末分化的重要调节因子,在体外,IGF-1既促进成肌细胞增殖也促进增殖的成肌细胞分化。

调节信号通路:MAPK、PI-3K、Calcineurin/NFAT。

3.2 肝细胞生长因子(Hepatic growth factor, HGF)在成肌细胞的增殖和成肌终末分化中发挥着多种重要作用,既作为一种强趋化因子,同时又是成肌细胞的增殖因子和肌肉干细胞成肌分化的抑制因子,它可选择性促进成肌细胞增殖,并可通过抑制MRFs 的转录逆转成肌细胞的成肌分化。

3.3 成纤维细胞生长因子-6(fibroblast growth factor 6,FGF-6)成肌细胞增殖和成肌分化的重要调节因子,促进成肌细胞增殖并可逆转成肌细胞向肌纤维的成肌终末分化。

FHL2影响牛骨骼肌卫星细胞增殖分化研究及肉牛管家基因和肌肉特异性基因的筛选

FHL2影响牛骨骼肌卫星细胞增殖分化研究及肉牛管家基因和肌肉特异性基因的筛选

FHL2影响牛骨骼肌卫星细胞增殖分化探究及肉牛管家基因和肌肉特异性基因的筛选引言:肉牛是重要的家畜品种之一,其肌肉质量和产量直接干系到肉牛养殖业的进步。

骨骼肌卫星细胞是肌肉再生和增长的关键细胞类型,在肌肉发育过程中发挥着重要作用。

FHL2(Four-and-a-Half LIM domain protein 2)是一种与肌肉发育紧密相关的基因,其在肌肉细胞增殖和分化中有重要作用。

本文旨在探究FHL2对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响,并通过筛选肉牛管家基因和肌肉特异性基因,为肉牛肌肉质量改良提供理论依据。

方法:1. 细胞培育:从健康肉牛体内分离骨骼肌卫星细胞,并进行原代培育和传代培育。

2. FHL2过表达和缄默:通过质粒转染和siRNA转染技术,分别使细胞表达FHL2过量或缄默。

3. 细胞增殖分析:利用MTT法和cck-8法检测不同处理组细胞的增殖状况。

4. 细胞分化检测:通过免疫荧光染色和RT-qPCR法分析细胞分化程度及相关基因表达状况。

结果:1. FHL2过表达增进牛骨骼肌卫星细胞的增殖,而FHL2缄默则抑止其增殖。

2. FHL2过表达增进细胞分化为肌肉细胞,而FHL2缄默导致细胞分化受阻。

3. 通过筛选发现,FHL2在牛骨骼肌卫星细胞中调控的肉牛管家基因和肌肉特异性基因包括Actin、MyoD、Myogenin等。

谈论:本探究结果表明,FHL2在牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化中起着关键作用。

FHL2的过表达可以增进细胞的增殖和分化为肌肉细胞,而缄默FHL2则抑止了细胞的增殖和分化。

另外,FHL2还调控了肉牛管家基因和肌肉特异性基因的表达,这些基因在肌肉发育和质量控制中发挥重要作用。

结论:FHL2在牛骨骼肌卫星细胞中对细胞增殖和分化起到重要调控作用。

通过FHL2的过表达或缄默,可以对牛骨骼肌卫星细胞的增殖和分化进行调控,为肉牛肌肉质量的改良提供了理论基础。

此外,FHL2还调控了肉牛管家基因和肌肉特异性基因的表达,进一步加深了我们对肉牛肌肉发育机制的理解。

骨骼肌卫星细胞对肉品质的影响及其分化调控

骨骼肌卫星细胞对肉品质的影响及其分化调控

关 键 词: 卫星细胞;肌纤维;分化; mi R N A ;肉质
Th e i nf lue nc e o f s a t e l l i t e c e l l s o n me a t q ua l i t y a n d i t s d i f f e r e nt i a l r e g ul a t i o n
s a t e l l i t e c e l l d i f e r e n t i a t i o n o n mu s c l e i f b e r c h a r a c t e r . B e s i d e s , we a l s o s u mma r i z e t h e c l a s s i c a l s i g n a l i n g p a t h wa y( i . e . ,
肌 卫星细 胞通 过增 殖 、 分化 融合 肌纤 维形成 新 的肌核 从 而导致 骨骼肌 纤 维的肥 大 以及 骨 骼肌 纤维类 型的相 互转 化,进 而影 响 肉品质 的形 成 。 文 章从 肌 纤维 的发 育 与 肉品质形 成 、 卫 星细 胞分化 与肌 纤维 特征 的相 关性 等方 面. 对 卫星细 胞 的 N o t c h等经典遗 传信 号通 路和 mi R N A 等表 观遗传 调控及 其 对 肉品质 的影响进行 了综述 。
No t c h e t c . ) a n d i n l f u e n c e o f e p i g e n e t i c r e g u l a t i o n( i . e . mi R NA) o n m u s c l e q u a l i y. t
j u r y r e p a i r . T h r o u g h p r o l i f e r a t i o n , d i f e r e n t i a t i o n a n d f u s i o n o f mu s c l e i f b e r c a n s a t e l l i t e c e l l s ma k e n e w my o n u c l e a r , l e a d -

wnt通路对肌卫星细胞的影响分析

wnt通路对肌卫星细胞的影响分析

追求卓越
β-catenin可以促进肌卫星细胞的自我更新并抑制其过早分化,抑制βcatenin的表达后发现Pax7+ 、Myod+ 的肌卫星细胞数量明显增多,而构 成性表达β-catenin却导致Myod下降。这说明β-catenin可以抑制肌卫星细 胞的激活。 研究证实,在肌肉发育起始阶段和成肌细胞増殖过程中主要表达Myod和 Myf5,通过Myod和Myf5信号通路进一步激活成肌化,Myod可作为反映肌 肉再生的指标。此外,Myod还可以促进MSCS激活并向成肌细胞转化,在 成肌细胞融合、分化为成熟肌纤维的过程中也发挥有重要作用,缺乏Myod 基因的小鼠可出现成肌分化的延迟。
而Wnt/Ca2+ 信号通路得名于Wnt/Fzd诱导的磷脂酶C的激活,引起胞内 Ca2+ 增多,激活蛋白酶C(PKC)、钙-钙调蛋白依赖激酶II或钙调磷酸酶, 进而激活转录因子NFAT.
追求卓越
经典Wnt信号与骨骼肌重塑
Wnt信号通路促进出生后骨骼肌修复、再生,外源性刺激Wnt蛋白可使肌源 性细胞骨骼肌再生增加约40%。肌肉发生过程中,MRFs(MyoD、Myf5、 myogenin、MRF4)发挥关键作用,而不同Wnt信号分子通过不同通路在不 同时间、空间激活不同的MRFs,调节不同MRF的活性,从而有效促进骨骼 肌生成。 Tajbakhsh等研究表明表达Wnt1的细胞选择性激活Myf5,而表达Wnt7a的 细胞选择性激活MyoD。Wnt1和Wnt7a诱导的信号分别利用不同的分子通 路,前者与其受体Fzd结合诱导经典Wnt通路从而发挥作用,后者则通过蛋白 激酶C参与的、不依赖β-catenin的信号通路。 研究认为Wnt蛋白可能通过TCF/LEF1转录因子可能直接激活Myf5和MyoD 或上调MRFs共激活因子,进而促进骨路肌修复、重塑。

基于单细胞测序技术探讨动物骨骼肌卫星细胞与生态位细胞之间的“对话”

基于单细胞测序技术探讨动物骨骼肌卫星细胞与生态位细胞之间的“对话”

基于单细胞测序技术探讨动物骨骼肌卫星细胞与生态位细胞之间的“对话”目录一、内容概要 (2)1.1 研究背景 (2)1.2 研究意义 (3)二、单细胞测序技术概述 (4)2.1 技术原理 (5)2.2 技术应用 (6)2.3 技术优势 (8)三、动物骨骼肌卫星细胞研究进展 (9)3.1 细胞特性 (10)3.2 功能研究 (11)3.3 分化机制 (13)四、生态位细胞研究进展 (14)4.1 细胞特性 (15)4.2 功能研究 (16)4.3 与卫星细胞的相互作用 (18)五、单细胞测序技术在动物骨骼肌卫星细胞与生态位细胞研究中的应用195.1 靶向富集 (20)5.2 时空动态分析 (21)5.3 相互作用网络构建 (22)六、基于单细胞测序技术的动物骨骼肌卫星细胞与生态位细胞之间的“对话”236.1 “对话”机制 (24)6.2 具体案例分析 (26)6.3 生态位细胞对卫星细胞分化的影响 (27)6.4 卫星细胞对生态位细胞功能的影响 (28)七、结论与展望 (29)7.1 结论总结 (30)7.2 研究展望 (32)一、内容概要本文基于单细胞测序技术,深入探讨动物骨骼肌卫星细胞与生态位细胞之间的对话机制。

将概述单细胞测序技术在研究骨骼肌卫星细胞与生态位细胞交互作用中的应用背景和重要性。

将介绍骨骼肌卫星细胞和生态位细胞的基本特性及其功能,包括它们在肌肉再生和稳态维持中的作用。

文章将重点阐述如何通过单细胞测序技术揭示这两种细胞类型之间的“对话”包括它们之间的信号传递、分子交流以及可能的细胞间相互作用。

还将讨论如何利用这些数据来深入理解卫星细胞与生态位细胞在动物适应环境、生长发育以及应对外界刺激等过程中的协同作用。

本文还将探讨单细胞测序技术在研究这些细胞交互作用中的技术挑战和局限性,以及如何克服这些挑战以获得更精确的数据。

将展望单细胞测序技术在未来研究骨骼肌卫星细胞与生态位细胞交互作用中的潜在应用和前景。

小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定_代阳

小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定_代阳

第21卷 第1期 天 津 农 学 院 学 报 V ol. 21,No. 1 2014年3月 Journal of Tianjin Agricultural University March ,2014收稿日期:2013-12-19基金项目:国家自然科学基金项目“牛骨骼肌卫星细胞成肌分化相关miRNAs 的鉴定和功能研究”(31201021);天津市自然科学基金项目“microRNA-1对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用研究”(13JCQNJC14600) 作者简介:代阳(1988-),女,内蒙古通辽人,硕士在读,研究方向为动物胚胎与转基因工程。

E-mail: aq19881209@。

文章编号:1008-5394(2014)01-0001-04小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定代阳1,王轶敏1,2,刘新峰1,樊晗璐1,李吉霞1,郭宏1,丁向彬1,通信作者(1. 天津农学院 动物科学与动物医学学院,天津 300384;2. 西北农林科技大学 生物工程研究所,陕西 杨凌 712100)摘 要:采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞,应用差速贴壁法进行纯化,并利用RT -PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。

结果显示:分离出的肌卫星细胞生长状态良好,RT -PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达,诱导分化形成肌管后,分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。

本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞,并具有很好的体外分化能力,可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。

关键词:小鼠;骨骼肌卫星细胞;细胞培养;鉴定中图分类号:Q813.1 文献标识码:AIsolated Culture and Identification of Mouse Skeletal Muscle Satellite CellsDAI Yang 1, WANG Yi-min 1,2, LIU Xin-feng 1, F AN Han-lu 1, LI Ji-xia 1,GUO Hong 1, DING Xiang-bin 1,Corresponding Author(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Institute ofBioengineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaa n xi Province, China )Abstract: In this study, mouse skeletal muscle satellite cells were isolated by collagenase and trypsinase digestion method. Then the satellite cells were purified and induced to differentiate into myotubes, and the marker genes of the cells before or after the differentiation were detected by RT-PCR and immunocytochemistry technology. The results show that the isolated muscle satellite cells were healthy, and expressed the marker genes of paired protein box (Pax7) and myogenic differentiation antigen (MyoD ). After inducing to the myotubes, myogenin (MyoG ) and myosin heavy chain (MHC )showed positive expression. The results indicate that mouse skeletal muscle satellite cells of high purity, which can provide cell sources for muscle development and damage repair study, are successfully isolated.Key words: mouse; skeletal muscle satellite cell; cell culture; identification骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cell)是骨骼肌中具有分化增殖潜能的肌源性干细胞,通常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间[1],在一定条件下可以被激活,发生增殖和分化,形成骨骼肌细胞。

骨骼肌卫星细胞的研究进展

骨骼肌卫星细胞的研究进展

2017年(第7卷)第04期运动人体科学1 肌卫星细胞概述1.1 肌卫星细胞的发现肌卫星细胞是在1961年由M a u r o 发现,肌卫星细胞(Skeletalsatellite cell,SSC)是一类分布于肌细胞基底膜与肌膜之间的成体干细胞,其位置与排列类似肌细胞的卫星,故称卫星细胞[1]。

肌卫星细胞是成年个体肌肉组织内留存的未分化的肌前体细胞(Muscle progenitor cell,MPC),位于肌纤维基底膜和基膜之间,具有增殖、分化等自我更新的潜能[2]。

在成年机体的骨骼肌中,肌卫星细胞含量较少,大约占比1%~4%。

1.2 肌卫星细胞的形态结构在静息状态下,SSC细胞质和细胞器也较少,核质比率较高;其细胞核比肌管细胞核小,其异染色质含量比肌细胞核高。

伴随年龄增长,SSC的丰度逐渐减少,SSC肌源性分化和自我更新的潜能仍保留,但更新能力随之降低[3]。

1.3 肌卫星细胞的特异性标记与鉴定骨骼肌特异性标记蛋白的表达可作为SSC的鉴定指标,认识分子标志是对各阶段肌细胞进行鉴定的依据。

高度糖基化I型跨膜蛋白(CD34)在造血干细胞、肌源细胞和SSC上均有表达,在分化程度越低的细胞中表达率越高;M钙调蛋白是肌卫星细胞增殖与融合的标志;Pax3是肌源细胞的标志物, Pax7在静息和活化的卫星细胞核内均有表达。

配对盒转录因子(Paired box gene 7,Pax7)属于Pax基因家族的第7组,是在进化上高度保守的发育调控基因,具有强有力的生肌性诱导能力,能够使干细胞定向转变为生肌性细胞,在骨骼肌发育和再生中起着至关重要的作用[4]。

成肌蛋白(Myo blast de-termination protein,MyoD)属于肌原性碱性螺旋环的转录因子,在肌肉发育和再生中的细胞分化和自我更新密切相关[5]。

通过观察Pax7在肌细胞中表达含量的变化,可以识别卫星细胞所处时期。

其变化规律为:卫星细胞在静息状态下Pax7 表达阳性、MyoD表达阴性;卫星细胞增殖时,Pax7和MyoD表达均为阳性;在分化和融合阶段,Pax7表达阴性、MyoD阳性[2]。

鹅骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定

鹅骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定

畜牧兽医学报 2023,54(10):4186-4195A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.10.017开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):鹅骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定张 力1,2,许加龙3,黄锦钰2,许子月2,雷昕诺1,2,卢会鹏1,2,朱 睿1,2,孙伟翔1,2,曹海月2,王安平1,2,朱善元1,2*(1.江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室江苏现代畜牧与新兽药工程技术中心,泰州225300;2.江苏农牧科技职业学院,泰州225300;3.南京大学医学院,南京210093)摘 要:旨在建立鹅骨骼肌卫星细胞体外分离㊁培养㊁纯化及鉴定的方法㊂本研究选取健康10周龄溆浦鹅仔鹅为试验材料,采用分散酶D i s pa s e I I 和胶原酶I I 共同作用肌肉组织分离得到卫星细胞,利用差速贴壁法纯化卫星细胞,在体外培养过程中,含有20%F B S 并添加b F G F 的D M E M /F 12生长完全培养基能较好维持卫星细胞的分化潜能,培养过程中涉及的培养皿需经基质胶特别包被处理;诱导分化出成熟肌管后,采用免疫荧光法和W e s t e r nb l o t t i n g 检测肌球蛋白重链M y H C 的表达,采用q R T -P C R 检测P a x 7㊁M y o D 1㊁M yo G 基因在诱导分化前(g r o w t h m e d i u m ,GM )和分化后(d i f f e r e n t i a t i o n m e d i u m ,D M )的相对表达量,分化前后每组均3个重复㊂结果表明,新分离得到的卫星细胞体积较小,折光性强,贴壁后呈中间彭起两端针状的梭形结构,经免疫荧光鉴定呈P a x 7阳性;诱导分化后可形成成熟多核肌管,免疫荧光检测成肌特异性标志M yH C 呈阳性,统计分化指数高达78%(P <0.01);q R T -P C R 检测标志性基因P a x 7㊁M y o D 1㊁M y o G 呈阳性,并且分化前P a x 7基因相对表达量是分化后的2.22倍(P <0.01),而分化后标志性基因M y o D 1㊁M y o G 的相对表达量分别是分化前的1.90(P <0.01)和44.22倍(P <0.01);W e s t e r n b l o t t i n g 结果显示分化后M yH C 蛋白表达水平明显升高㊂综上所述,本研究建立了一种基于胶原酶Ⅱ和分散酶D i s pa s e I I 的混合酶分离鹅骨骼肌卫星细胞的方法,提供的培养体系能够使细胞在体外培养过程中维持巨大的分化潜能,为鹅肌肉组织生长发育分子调控机制的研究提供了良好的细胞模型㊂关键词:鹅;骨骼肌卫星细胞;分离;培养;鉴定中图分类号:S 835 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)10-4186-10收稿日期:2023-03-10基金项目:江苏省种业振兴揭榜挂帅项目(J B G S 2021 030);江苏省高等学校基础科学(自然科学)研究项目资助(23K J B 230002);江苏省高职院校青年教师企业实践培训项目资助;江苏农牧科技职业学院自然科学基金储备项目(N S F 2022C B 06);江苏农牧科技职业学院科技创新团队项目(N S F 2023T C 02)作者简介:张 力(1990-),女,山东青岛人,讲师,博士,主要从事动物基因功能研究,E -m a i l :l z h a n g @j s a h v c .e d u .c n *通信作者:朱善元,主要从事动物育种与分子免疫学研究,E -m a i l :z s y221106@163.c o m I s o l a t i o n ,C u l t u r e ,a n d I d e n t i f i c a t i o n o f S k e l e t a l M u s c l e S a t e l l i t e C e l l s i n G o o s eZ H A N G L i 1,2,X U J i a l o n g 3,HU A N G J i n y u 2,X U Z i y u e 2,L E I X i n n u o 1,2,L U H u i p e n g 1,2,Z HU R u i 1,2,S U N W e i x i a n g 1,2,C A O H a i y u e 2,WA N G A n p i n g 1,2,Z HU S h a n y u a n 1,2,*(1.E n g i n e e r i n g T e c h n o l o g y R e s e a r c h C e n t e r f o r M o d e r n A n i m a l S c i e n c e a n d N o v e l V e t e r i n a r yP h a r m a c e u t i c D e v e l o p m e n t ,J i a n g s u K e y L a b o r a t o r y f o r H i g h -T e c h R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t o fV e t e r i n a r y B i o p h a r m a c e u t i c a l s ,J i a n g s u A g r i -A n i m a l H u s b a n d r y V o c a t i o n a l C o l l e g e ,T a i z h o u 225300,C h i n a ;2.J i a n g s u A g r i -A n i m a l H u s b a n d r y V o c a t i o n a l C o l l e ge ,T a i z h o u 225300,C h i n a ;3.M e d i c a l S c h o o l ,N a n j i n g U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210093,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p u r p o s e o f t h e s t u d y w a s t o e s t a b l i s h m e t h o d s f o r i s o l a t i o n ,c u l t u r e ,pu r i f i c a t i o n ,a n d i d e n t i f i c a t i o n o f g o o s e s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s i n v i t r o .T h e h e a l t h y 10-w e e k -o l d X u pu10期张力等:鹅骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定g e e s e w a s s e l e c t e d a s e x p e r i m e n t a l m a t e r i a l s.S a t e l l i t e c e l l s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e m u s c l e w i t h t h e a c t i o n o f D i s p a s e I I a n d c o l l a g e n a s e I I.S a t e l l i t e c e l l s w e r e p u r i f i e d b y d i f f e r e n t i a l a d h e s i o n t o t h e c u l t u r e d i s h.D u r i n g i n v i t r o c u l t u r e,t h e c o m p l e t e D M E M/F12g r o w t h m e d i u m c o n t a i n i n g 20%F B S a n d s u p p l e m e n t e d w i t h b F G F c o u l d b e t t e r m a i n t a i n t h e d i f f e r e n t i a t i o n p o t e n t i a l o f s a t-e l l i t e c e l l s,a n d t h e c u l t u r e d i s h e s i n v o l v e d i n t h e c u l t u r e p r o c e s s n e e d e d t o b e c o a t e d w i t h m a t r i-g e l s p e c i a l l y.A f t e r t h e f o r m a t i o n o f m a t u r e m y o t u b e s,t h e e x p r e s s i o n o f m y o s i n h e a v y c h a i n (M y H C)w a s d e t e c t e d b y i mm u n o f l u o r e s c e n c e a n d W e s t e r n b l o t t i n g.T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v-e l s o f P a x7,M y o D1a n d M y o G b e f o r e(g r o w t h m e d i u m,GM)a n d a f t e r d i f f e r e n t i a t i o n(d i f f e r-e n t i a t i o n m e d i u m,D M)w e r e d e t e c t e d b y q R T-P C R.T h e r e w e r e3r e p l i c a t e s i n e a c h g r o u p b e f o r e a n d a f t e r d i f f e r e n t i a t i o n.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e n e w l y i s o l a t e d s a t e l l i t e c e l l s w e r e s m a l l i n s i z e a n d s t r o n g i n r e f r a c t i o n.A f t e r a d h e r i n g t o t h e w a l l,t h e y h a d a s p i n d l e-s h a p e d s t r u c t u r e w i t h n e e d l e-l i k e e n d s a n d p u f f e d u p i n t h e m i d d l e.T h e c e l l s w e r e i d e n t i f i e d a s P a x7p o s i t i v e b y i mm u-n o f l u o r e s c e n c e.M a t u r e m u l t i n u c l e a t e d m y o t u b e s c o u l d b e f o r m e d a f t e r i n d u c t i o n o f d i f f e r e n t i a-t i o n.M y H C w a s p o s i t i v e b y i mm u n o f l u o r e s c e n c e d e t e c t i o n.T h e s t a t i s t i c a l d i f f e r e n t i a t i o n i n d e x w a s a s h i g h a s78%(P<0.01).T h e m a r k e r g e n e s P a x7,M y o D1,a n d M y o G w e r e d e t e c t e d p o s i t i v e b y q R T-P C R.T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f P a x7g e n e b e f o r e d i f f e r e n t i a t i o n w a s2.22t i m e s (P<0.01)t h a t a f t e r d i f f e r e n t i a t i o n,w h i l e t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f m a r k e r g e n e s M y o D1a n d M y o G a f t e r d i f f e r e n t i a t i o n w e r e1.90(P<0.01)a n d44.22t i m e s(P<0.01)t h a t b e f o r e d i f f e r e n t i a t i o n,r e s p e c t i v e l y.W e s t e r n b l o t t i n g r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f M y H C p r o t e i n w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d a f t e r d i f f e r e n t i a t i o n.I n t h i s s t u d y,a m e t h o d f o r t h e i s o l a t i o n a n d c u l t u r e o f g o o s e s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s b y c o l l a g e n a s e I I a n d d i s p a s e I I w a s e s t a b-l i s h e d.T h e c u l t u r e s y s t e m c a n e n a b l e c e l l s t o m a i n t a i n h u g e d i f f e r e n t i a t i o n p o t e n t i a l d u r i n g t h e i n v i t r o c u l t u r e.T h e s t u d y r e s u l t s p r o v i d e a g o o d c e l l m o d e l f o r t h e r e s e a r c h o f t h e g r o w t h a n d d e-v e l o p m e n t m o l e c u l a r r e g u l a t i o n m e c h a n i s m o f g o o s e m u s c l e t i s s u e.K e y w o r d s:g o o s e;s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s;i s o l a t i o n;c u l t u r e;i d e n t i f i c a t i o n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:Z HU S h a n y u a n,E-m a i l:z s y221106@163.c o m随着生活水平的提高,人们对家畜肉品质的要求也日益提高㊂鹅肉是理想的高蛋白㊁低脂肪和低胆固醇的营养食品,早在2002年,联合国粮农组织就将鹅肉列为21世纪重点发展的健康产品之一[1]㊂中国是肉鹅最大的消费国和出口国,鹅肉深受消费者青睐,因而开展鹅产肉性能品种改良,发掘影响鹅肌肉生长的功能基因,探究鹅骨骼肌生长发育调控的分子机理,具有重大的经济效应㊂获得具有高分化潜能的鹅骨骼肌卫星细胞是开展鹅肌肉组织生长发育调控机制研究的前提和基础㊂骨骼肌卫星细胞来源于肌肉中的一部分成肌祖细胞,这些细胞在出生后个体的肌肉组织中保留未分化状态,位于肌膜和基底膜之间,具有很强的分化潜能[2-3]㊂早在1961年,科学家就通过电子显微镜观察青蛙骨骼肌肌纤维外围区域发现了肌源性卫星细胞[4]㊂1974年,首次从成年大鼠骨骼肌中分离出卫星细胞[5]㊂之后,人们通过不断优化分离方法,逐渐分离出人类[6-7]㊁牛[8-10]㊁羊[11]㊁鸡[12]㊁猪[13-15]等不同物种的卫星细胞㊂然而到目前为止,有关鹅骨骼肌卫星细胞分离培养方法的研究很少,且现有方法分离得到的细胞分化能力有限[16]㊂经过多年的发展,目前常用于分离卫星细胞的方法有单根肌纤维分离法和酶消化法㊂单根肌纤维法是利用I型胶原酶消化肌肉组织并温和研磨,从肌肉组织中分离出单根肌纤维[17-18]㊂单根肌纤维法分离培养得到的卫星细胞能够达到95%以上的纯度㊂但是,解剖单根肌纤维非常耗时,因而此方法有较大局限性㊂为了能够获得大量卫星细胞,研究人员开发了酶消化法㊂酶消化法利用单酶或者多种酶组合消化肌肉组织将卫星细胞彻底释放到消化液中㊂不同酶组合的消化效果不同,与其他方法相比,酶消化法耗时短,获得卫星细胞的产量高,但是通常7814畜牧兽医学报54卷分离得到细胞是卫星细胞㊁脂肪细胞㊁成纤维细胞等的混合细胞,如果想要得到较高纯度的卫星细胞,则需要进一步纯化㊂常用的纯化方法有差速贴壁法㊁P e r c o l l梯度离心法和流式细胞分选(F A C S)等[19-21]㊂但是,已有分离方法分离得到的细胞普遍存在耗时长㊁细胞纯度低和存活率低等问题,因此,建立一种简便㊁高效的体外分离培养骨骼肌卫星细胞的方法尤为重要㊂鉴于此,本研究对传统分离细胞使用的酶和细胞生长培养基进行了优化,以期获得具有高度分化潜能的鹅骨骼肌卫星细胞,为研究鹅骨骼肌生长和发育调控机制提供细胞模型和材料支撑㊂1材料与方法1.1试验材料健康10周龄溆浦鹅仔鹅来自江苏现代畜牧科技示范园(江苏畜禽遗传资源研究所)㊂1.2主要试剂和仪器D ME M/F12高糖培养基(H y c l o n e);D M E M 高糖培养基(G i b c o);胎牛血清(F B S,G e m i n i);马血清(H S,G i b c o);青霉素链霉素混合液(索莱宝);磷酸盐缓冲液(G i b c o);分散酶D i s p a s eI I(R o c h e);胶原酶I I(S i g m a-A l d r i c h);0.25%胰蛋白酶(索莱宝);重组人碱性成纤维生长因子b F G F(P e p r o-T e c h);基质胶(B D B i o s c i e n c e s);4%多聚甲醛(索莱宝);鼠抗P a x7抗体(D S H B);鼠抗M y H C/M F20抗体(D S H B);鼠抗G A P D H抗体(翌圣);羊抗鼠594标记二抗(索莱宝);总R N A抽提试剂(碧云天);反转录试剂(诺唯赞);定量试剂2ˑM5H i P e r S Y B R P r e m i x E s T a q p l u s(聚合美);R I P A蛋白裂解液(碧云天)㊂其它试剂均为国产优质分析纯㊂所有P C R产物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成㊂净化工作实验台(上海智城分析仪器制造有限公司),C O2恒温细胞培养箱(T h e r m o F i s h e r), D Y Y-10C型电泳仪(北京市六一仪器厂);T a n o n 5200全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司);Q u a n t S t u d i o3实时荧光定量P C R仪器(A p p l i e d B i o s y s t e m s);A x i o V e r t A1倒置荧光显微镜(Z e i s s)㊂1.3鹅骨骼肌卫星细胞分离和培养将10周龄溆浦鹅仔鹅麻醉后处死,75%酒精消毒腿部肌肉组织附近皮肤;剪下肌肉组织,用P B S 缓冲液冲洗;用无菌剪刀将肌肉组织剪碎成肉糜状;加入消化工作液(消化工作液是含有终浓度为2m g㊃m L-1分散酶D i s p a s e I I和4m g㊃m L-1胶原酶I I的高糖D M E M培养基溶液,一般1c m3的肌肉组织需要5~10m L消化工作液),吹打混匀,并在37ħ摇床上震荡消化1h;消化完成后,加入10m L 含有3%F B S的高糖D M E M培养基终止消化;消化液依次用100μm和40μm的细胞筛进行过滤;细胞悬液1500r㊃m i n-1离心10m i n,弃上层溶液;用3m L红细胞裂解液处理2m i n,再加入5m L D P B S,1500r㊃m i n-1离心5m i n;弃上清,此时沉淀中包含大量分离得到的鹅骨骼肌卫星细胞,用5m L 骨骼肌卫星细胞生长完全培养基(骨骼肌卫星细胞生长完全培养基为含20%F B S,1%青霉素链霉素混合液,5n g㊃m L-1b F G F的D M E M/F12培养基溶液)重悬细胞,轻柔吹打均匀,接种于25c m2培养瓶中,放入37ħ,5%C O2细胞培养箱中培养㊂1.4鹅骨骼肌卫星细胞纯化与传代培养用生长完全培养基培养卫星细胞㊂原代细胞培养时,为促进卫星细胞贴壁,培养过程中使用的培养瓶或培养皿均需使用基质胶进行包被处理(基质胶包被液为基质胶和D M E M按照1ʒ24比例混合的溶液)㊂同时,为减少细胞损失,最初培养过程中不需要换液,每2d需添加部分新的生长完全培养基㊂原代卫星细胞在经基质胶包被后的培养皿中3~7d 汇合度达到80%~90%,此时可进行传代㊂首次传代时,通过差速贴壁法对卫星细胞进行纯化㊂消化后,收集细胞到15m L离心管中,1500r㊃m i n-1离心5m i n㊂用生长完全培养基重悬细胞,转移至未经基质胶包被处理的10c m皿中,放入培养箱中静置㊂1h后,此时成纤维细胞已经贴壁,卫星细胞没有贴壁,吸取10c m皿中上层培养基到新的经基质胶包被好的10c m皿中,以此除去成纤维细胞㊂1.5鹅骨骼肌卫星细胞诱导分化取正常培养的细胞,待细胞汇合度达到90%以上时,更换分化培养基(分化培养基为含2%马血清的高糖D M E M培养基溶液),诱导分化1~7d,观察卫星细胞的分化情况㊂1.6鹅骨骼肌卫星细胞免疫荧光鉴定从培养箱中取出原代鹅卫星细胞或诱导分化后的鹅肌管细胞,吸弃原培养基,加入P B S洗涤2次后用4%的多聚甲醛固定20m i n;固定完成后,用P B S洗涤3次;向培养孔中加入免疫荧光封闭液,室881410期张 力等:鹅骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定温封闭1h ;吸净封闭液,加入P a x 7㊁M yH C /M F 20一抗(1ʒ100稀释抗体),4ħ孵育过夜;孵育完成后,用P B S 洗涤3次㊂按照试验需求配制所需二抗;加入羊抗鼠594标记二抗,避光室温孵育1h ;P B S 避光洗涤3次;避光将含D A P I 抗淬灭封片液加入培养孔中,覆盖细胞;避光4ħ保存以待显微镜镜检㊂1.7 鹅骨骼肌卫星细胞R T -P C R 鉴定分别收集诱导分化前(生长培养基,GM )和诱导分化后(分化培养基,D M )的细胞样品,分化前㊁后每组均3个重复㊂采用T r i z o l 法进行总R N A 的提取,用试剂盒反转录为c D N A ,以c D N A 为模板,加入P a x 7㊁M y o D 1㊁M y o G ㊁G a pd h 基因上㊁下游引物进行q R T -P C R ,引物信息详见表1;qR T -P C R 15μL 反应体系:2.9μL 2ˑS Y B R G r e e n M i x,上㊁下游引物各0.3μL ,4μL 稀释后的c D N A ,无酶水补齐至15μL ㊂反应条件:95ħ60s ;(95ħ15s,60ħ15s ,72ħ30s )40个循环㊂1.8 鹅骨骼肌卫星细胞W e s t e r n b l o t t i n g 验证分别收集诱导分化前后的细胞样品,利用添加1%P M S F 的R I P A 蛋白裂解液提取总蛋白㊂对蛋白进行变性后,利用W e s t e r n b l o t t i n g 分别检测鹅骨骼肌卫星细胞增殖期和分化期P a x 7㊁M yH C 的表达情况㊂1.9 统计分析qR T -P C R 结果参照2-ΔΔC t方法来评估P a x 7㊁M y o D 1㊁M y o G 的相对表达量,以G a pd h 作为内参基因进行待测基因表达差异的检测㊂结果以 平均数ʃ标准差(M e a n ʃS D ) 表示,采用S P S S 软件分析,组间差异性采用独立样本t 检验的方法进行比较,P <0.05表示差异显著,P <0.01表示差异极显著㊂表1 本研究所用的引物序列T a b l e 1 T h e p r i m e r s e q u e n c e s u s e d i n t h i s s t u d y基因G e n e序列(5'ң3')S e qu e n c e 登录号A c c e s s i o n N o .扩增产物大小/b pP r o d u c t s i z eP a x 7F :A A A T C G T G G A G A T G G C T C A CNW _025927858.1202R :T T C T C C C G C T T G T A C T C C T C M y o D 1F :G C C C A A G G T G G A G A T C C T NW _025927712.1168R :C C G C T G T A C T C C A T C A T G CM y o G F :C G C C A T C C A G T A C A T C G A G NW _025927716.1243R :G A G G A G A G C G A G T G G A G G T T G a pd h F :C A C T T C A A G G G C A C A G T C A A NW _025927922.1157R :T C T C C A T G G T G G T G A A G A C A 2 结 果2.1 鹅骨骼肌卫星细胞的分离和鉴定采集健康10周龄溆浦鹅仔鹅骨骼肌,利用分散酶D i s p a s e Ⅱ和胶原酶Ⅱ消化处理,分离并通过差速贴壁法纯化获得骨骼肌卫星细胞㊂分离得到的原代卫星细胞呈球形,体积较小,折光性强(图1A ,红色箭头)㊂用生长完全培养基培养卫星细胞,经12h 培养后细胞开始缓慢贴壁,呈中间彭起两端针状的梭形结构(图1A ,黄色箭头)㊂培养24h 后绝大多数卫星细胞完全贴壁,呈纺锤形,贴壁后的卫星细胞开始大量快速增殖(图1B )㊂P a x 7是卫星细胞特异性标志基因,经免疫荧光鉴定,原代卫星细胞高表达P a x 7(图1C )㊂另外,经生长完全培养基培养后,分别提取其R N A 和蛋白质,利用q R T -P C R 和W e s t e r n b l o t i n g 检测Pa x 7m R N A 和蛋白表达水平,结果显示培养的卫星细胞依旧高表达P a x 7㊂因此,本分离方法能够获得较高纯度的鹅骨骼肌卫星细胞,以及该培养体系能够维持卫星细胞处于较高的未分化状态㊂2.2 鹅骨骼肌卫星细胞的体外诱导分化在细胞汇合度达到80%~90%时,进行体外诱导分化㊂发现细胞在诱导第2天开始拉长㊁变大,且初显小肌管㊂诱导第4天,开始有明显的肌管形成㊂之后,这些肌管继续融合形成成熟较大的肌管(图2A )㊂此时,结晶紫染色也显示有大量成熟肌管生成(图2B )㊂成熟的肌管能够维持0.5~1d ,由于培养条件限制,之后逐渐脱落㊂肌球蛋白重链M yH C 是肌纤维的组成型蛋白㊂利用M yH C 标记成熟肌管,免疫荧光染色结果显9814畜 牧 兽 医 学 报54卷A.鹅骨骼肌卫星细胞培养12h 后形态,比例尺=20μm (20ˑ);B .卫星细胞培养不同时间后显微镜下形态,比例尺=200μm (10ˑ);C .P a x 7免疫荧光染色鉴定,比例尺=200μm (20ˑ)A.M o r p h o l o g y o f g o o s e s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s a f t e r 12h c u l t u r e ,s c a l e b a r =20μm (20ˑ);B .M o r p h o l o g y of s a t e l -l i t e c e l l s u n d e r m i c r o s c o p e a f t e r d i f f e r e n t t i m e o f c u l t u r e ,s c a l e b a r =200μm (10ˑ);C .P a x 7i mm u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n gi d e n t i f i c a t i o n ,s c a l e b a r =200μm (20ˑ)图1 鹅骨骼肌卫星细胞分离㊁培养及鉴定F i g .1 I s o l a t i o n ,c u l t u r e a n d i d e n t i f i c a t i o n o f go o s e s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l ls A.卫星细胞诱导分化过程中形态变化,比例尺=200μm (10ˑ);B .卫星细胞诱导分化后结晶紫染色,比例尺=200μm(4ˑ)A.M o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f s a t e l l i t e c e l l s d u r i n g i n d u c e d d i f f e r e n t i a t i o n ,s c a l e b a r =200μm (10ˑ);B .C r ys t a l v i o l e t s t a i -n i n g af t e r d i f f e r e n t i a t i o n o f s a t e l l i t e c e l l s ,s c a l e b a r =200μm (4ˑ)图2 鹅骨骼肌卫星细胞在诱导分化过程中的形态变化F ig .2 M o r ph o l o gi c a l c h a n ge s ofg o o s e s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s a f t e r i n d u c e d d i f f e r e n t i a t i o n 示,分化后期,肌管与肌管融合形成纵横的更大肌管,肌管中可能包含近百个细胞核(图3)㊂此时,细胞的分化指数(含有2个及以上细胞核的肌管中的细胞核数量/细胞核总数)高达78%(图4,P <0.01),说明分离得到的卫星细胞体外具有高度分化的能力,保持较高的分化潜能㊂2.3 鹅骨骼肌卫星细胞诱导分化前后分子水平变化分别收集诱导分化前(GM )和诱导分化后(D M )的细胞样品,提取R N A ,反转后通过q R T -P C R 检测其标志基因P a x 7㊁M y o D 1㊁M yo G 的相对表达水平㊂结果显示,分化标志基因M yo D 1㊁M yo G 的表达均在诱导分化后明显升高,并且分化后M y o D 1㊁M yo G 的相对表达量分别是分化前的1.90和44.22倍,而分化前卫星细胞标志基因P a x 7的相对表达量是分化后的2.22倍(图5A ,P <0.01)㊂另外,W e s t e r n b l o t t i n g 检测结果也显示,经诱导分化后,P a x 7蛋白表达水平降低,而M yH C 蛋白表达水平明显升高(图5B )㊂从分子水平上说明分离的卫星细胞具有较强的分化潜力,可以作为后续试验的体外分化细胞模型㊂091410期张 力等:鹅骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定图3 鹅骨骼肌卫星细胞诱导分化第6天M y H C 免疫荧光染色鉴定F i g .3 M y H C i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g i d e n t i f i c a t i o n o f g o o s e s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s a f t e r 6d a ys i n d u c e d d i f f e r e n t i a t i on **.P <0.01,下同**.P <0.01,t h e s a m e a s b e l o w图4 鹅骨骼肌卫星细胞诱导分化前后分化指数统计F i g .4 S t a t i s t i c s o f d i f f e r e n t i a t i o n i n d e x o f go o s e s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s b e f o r e a n d a f t e r d i f f e r e n t i a t i o n 3 讨 论成体中骨骼肌卫星细胞位于肌肉组织的肌膜和基底膜之间,保留未分化状态,具有很强的分化潜能㊂卫星细胞的分化潜能也使其成为成体骨骼肌研究的重要细胞模型,用于肌肉组织形成和发育机制[22-25]㊁分子育种病理㊁损伤修复[2,26]㊁衰老及再生[27-28]等多方面的研究㊂目前,人们已经从小鼠[29]㊁牛[8-9]㊁猪[13-14]等哺乳动物中分离出骨骼肌卫星细胞㊂由于年幼个体的卫星细胞含量更丰富,所以对于哺乳动物而言,通常选用低日龄动物肌肉组织作为分离材料㊂而对于家禽而言,通常选用发育到一定胚龄的胚胎作为材料分选骨骼肌卫星细胞㊂例如,鸡一般选用12胚龄左右的鸡胚作为生物材料[30-31],鸭一般选用13胚龄左右的鸭胚作为生物材料[32],家鸽一般选用16胚龄左右的鸽胚作为生物材料[33]㊂但是对于鹅而言,目前关于鹅骨骼肌卫星细胞的报道很少,沈龙仙1914畜 牧 兽 医 学 报54卷A.分化前后P a x 7㊁M y o D 1㊁M yo G 的相对表达量;B .分化前后P a x 7和M y H C 蛋白表达水平A.T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f P a x 7,M y o D 1a n d M yo G b e f o r e a n d a f t e r d i f f e r e n t i a t i o n ;B .T h e p r o t e i n s e x p r e s s i o n l e v e l o f P A X 7a n d M yH C b e f o r e a n d a f t e r d i f f e r e n t i a t i o n 图5 鹅骨骼肌卫星细胞诱导分化前后基因表达变化情况F i g .5 C h a n g e s o f g e n e e x pr e s s i o n i n g o o s e s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s b e f o r e a n d a f t e r d i f f e r e n t i a t i o n 等[16,34]选用10~15日龄鹅胚分离培养卫星细胞㊂鹅胚取材繁琐,而且相关研究甚少涉及对卫星细胞分化能力的评估㊂在鹅卫星细胞分离中,本研究未选用胚胎,而选用10周龄仔鹅的肌肉组织为试验材料,分离得到大量具有高度分化潜能的卫星细胞,且细胞分化指数高达78%㊂与一定胚龄的鹅胚胎相比,仔鹅更易获得且个体肌肉组织甚多,从而大大拓宽了鹅卫星细胞分离的取材范围㊂大量的文献报道显示,目前实验室多采用多酶混合的方法分离骨骼肌卫星细胞㊂常用于分离卫星细胞的酶包括胶原蛋白酶㊁链酶蛋白酶㊁胰蛋白酶㊁胶原酶等,不同酶联合消化的时间不同,分离效果也存在较大差异,一些研究比较了不同酶的消化分离效果[35]㊂目前,比较成熟的卫星细胞的分离以人㊁小鼠㊁猪为主,在禽类中尚无很好的卫星细胞分离方法㊂本研究选择胶原酶Ⅱ和分散酶D i s pa s e I I 的混合液消化剪碎的骨骼肌组织1h ,以彻底将卫星细胞释放出来㊂胶原酶Ⅱ可以降解具有三股螺旋的胶原纤维,消化组织;D i s pa s e Ⅱ作用温和,对细胞损伤小㊂试验证实,胶原酶Ⅱ(终浓度为4m g㊃m L -1)和D i s p a s e Ⅱ(终浓度为2m g㊃m L -1)的组合及浓度的选择能够获得大量具有活力的卫星细胞㊂与其他方法相比,酶消化法耗时短,获得卫星细胞的产量高,但是通常分离得到的细胞是卫星细胞㊁脂肪细胞㊁成纤维细胞等的混合细胞,如果想要得到较高纯度的卫星细胞,则需要进一步纯化㊂常用的纯化方法有P e r c o l l 梯度离心法㊁流式细胞分选(F A C S )和差速贴壁法等㊂P e r c o l l 不连续密度梯度离心法能获得较纯的卫星细胞,但是由于多次离心造成细胞损失,因此所需初始细胞总量较大㊂流式细胞分选法操作复杂,成本高㊂尤其对于禽类来说,由于可用抗体缺乏,导致此方法很难实施㊂本研究选用差速贴壁法纯化卫星细胞,即在传代时通过差速贴壁1h 对鹅骨骼肌卫星细胞进行纯化,试验证明此方法能够去除成纤维细胞的干扰,获得高纯度卫星细胞㊂生长培养基的选择对于卫星细胞分化能力的维持尤为重要㊂本研究选用含有20%F B S 和添加b F -G F (终浓度为5n g㊃m L -1)的D M E M /F 12培养基培养鹅骨骼肌卫星细胞㊂高血清浓度能够促进卫星细胞的增殖而抑制其分化㊂另外,研究证实b F G F 在干细胞的体外培养过程中有利于维持干细胞的未分化状态,促进细胞增殖[36]㊂体外诱导分化试验显示可以形成多核的成熟大肌管,因而说明该生长培养基可以维持鹅骨骼肌卫星细胞保持较高的分化潜能,满足后续的试验需求㊂目前,通常采用免疫荧光标记特异基因的方法鉴定卫星细胞㊂正常生理状态下,卫星细胞处于静止态,此时细胞高表达标志蛋白P a x 7,在肌肉损伤或受到生长因子的刺激后,卫星细胞被激活[37-38],激活后的卫星细胞开始表达成肌调节因子M yo D 和M y o G [39],分化为成肌细胞和肌细胞[40],进而融合形成肌管,此时细胞高表达肌管标志蛋白M yH C ㊂如果在体内,肌管进一步融合㊁成熟形成新的肌纤维㊂因此,本研究采用P a x 7鉴定初步卫星细胞的分离及纯度,在后续的试验中,通过检测291410期张力等:鹅骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定M y o D㊁M y o G和M y H C等的表达变化,评估卫星细胞的分化潜能,进一步证实本研究分离的细胞是具有多潜能分化生物学特性的骨骼肌卫星细胞㊂4结论本研究建立了胶原酶Ⅱ和分散酶D i s p a s e I I组合的混合酶分离鹅骨骼肌卫星细胞的方法,并对细胞的生长完全培养基进行了优化,实现在体外培养过程中维持卫星细胞的高未分化状态,保持其巨大的分化潜能,为鹅肌肉组织生长发育㊁肉质改良㊁药理毒理试验㊁损伤修复等提供了良好的细胞模型及研究基础㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]罗庆斌,何大乾,尹荣楷,等.我国养鹅业现状及发展趋势[J].中国家禽,2006,28(4):1-4.L U O Q B,H E D Q,Y I N R K,e t a l.C u r r e n t s i t u a t i o na n d d e v e l o p m e n t t r e n d s o n g o o s e i n d u s t r y i n C h i n a[J].C h i n a P o u l t r y,2006,28(4):1-4.(i n C h i n e s e)[2] S O N G T,S A D A Y A P P A N S.F e a t u r e d c h a r a c t e r i s t i c sa n d p i v o t a l r o l e s o f s a t e l l i t e c e l l s i n s k e l e t a l m u s c l er e g e n e r a t i o n[J].J M u s c l e R e s C e l l M o t i l,2020,41(4):341-353.[3] S C HM I D T M,S C HÜL E R S C,HÜT T N E R S S,e ta l.A d u l t s t e m c e l l s a t w o r k:r e g e n e r a t i n g s k e l e t a lm u s c l e[J].C e l l M o l L i f e S c i,2019,76(13):2559-2570.[4] MA U R O A.S a t e l l i t e c e l l o f s k e l e t a l m u s c l e f i b e r s[J].J B i o p h y s B i o c h e m C y t o l,1961,9(2):493-495.[5] B I S C HO F F R.E n z y m a t i c l i b e r a t i o n o f m y o g e n i c c e l l sf r o m a d u l t r a t m u s c l e[J].A n a t R e c,1974,180(4):645-661.[6] B L A U H M,W E B S T E R C.I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o no f h u m a n m u s c l e c e l l s[J].P r o c N a t l A c a d S c i U S A,1981,78(9):5623-5627.[7] L U S H,W E I C F,Y A N G A H,e t a l.I s o l a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f h u m a n m u s c l e-de r i v e d c e l l s[J].U r o l o g y,2009,74(2):440-445.[8] D I N G S J,S W E N N E N G N M,M E S S M E R T,e t a l.M a i n t a i n i n g b o v i n e s a t e l l i t e c e l l s s t e m n e s s t h r o u g hp38p a t h w a y[J].S c i R e p,2018,8(1):10808.[9] D O D S O N M V,MA R T I N E L,B R A N N O N M A,e ta l.O p t i m i z a t i o n o fb o v i n e s a t e l l i t ec e l l-de r i v e dm y o t u b e f o r m a t i o n i n v i t r o[J].T i s s u e C e l l,1987,19(2):159-166.[10]洪倩倩,郭宏,高树新,等.过表达M y B P C1对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响[J].畜牧兽医学报,2021,52(12):3439-3448.HO N G Q Q,G U O H,G A O S X,e t a l.E f f e c t o fo v e r e x p r e s s i o n o f M y B P C1o n p r o l i f e r a t i o n a n dd i f fe r e n t i a t i o n of b o v i n e s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s[J].A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c a,2021,52(12):3439-3448.(i n C h i n e s e)[11]薛科,王林杰,陈利,等.高糖诱导山羊骨骼肌卫星细胞成脂分化过程中相关基因表达的变化[J].畜牧兽医学报,2014,45(5):706-713.X U E K,WA N G L J,C H E N L,e t a l.A d i p o g e n i c-r e l a t e d g e n e e x p r e s s i o n s i n g o a t s k e l e t a l m u s c l es a t e l l i t e c e l l s t r e a t e d w i t h h i g h c o n c e n t r a t i o n g l u c o s e[J].A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c a,2014,45(5):706-713.(i n C h i n e s e)[12] Z HA O J,Z HA O X Y,S H E N X X,e t a l.C i r c C C D C91r e g u l a t e s c h i c k e n s k e l e t a l m u s c l e d e v e l o p m e n t b ys p o n g i n g m i R-15f a m i l y v i a a c t i v a t i n g I G F1-P I3K/A K T s i g n a l i n g p a t h w a y[J].P o u l t S c i,2022,101(5):101803.[13] W I L S C HU T K J,HA A G S MA N H P,R O E L E N BA.E x t r a c e l l u l a r m a t r i x c o m p o n e n t s d i r e c t p o r c i n em u s c l e s t e m c e l l b e h a v i o r[J].E x p C e l l R e s,2010,316(3):341-352.[14] D O UM I T M E,M E R K E L R A.C o n d i t i o n s f o ri s o l a t i o n a n d c u l t u r e o f p o r c i n e m y o g e n i c s a t e l l i t ec e l l s[J].T i s s u e C e l l,1992,24(2):253-262.[15] M E T Z G E R K,T U C H S C H E R E R A,P A L I N M F,e ta l.E s t ab l i s h m e n t a n d v a l i d a t i o n o fc e l l p o o l s u s i n gp r i m a r y m u s c l e c e l l s d e r i v e d f r o m s a t e l l i t e c e l l s o f p i gs k e l e t a l m u s c l e[J].I n V i t r o C e l l D e v B i o l A n i m,2020,56(3):193-199.[16] WA N G H,H E K,Z E N G X H,e t a l.I s o l a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o n o f g o o s e s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l sa n d p r e l i m i n a r y s t u d y o n t h e f u n c t i o n o f C1q a n dt u m o r n e c r o s i s f a c t o r-r e l a t e d p r o t e i n3g e n e[J].A n i mB i o s c i,2021,34(6):1078-1087.[17] L E G R A N D F,G R I F O N E R,MO U R I K I S P,e t a l.S i x1r e g u l a t e s s t e m c e l l r e p a i r p o t e n t i a l a n d s e l f-r e n e w a l d u r i n g s k e l e t a l m u s c l e r e g e n e r a t i o n[J].JC e l l B i o l,2012,198(5):815-832.[18] R O S E N B L A T T J D,L U N T A I,P A R R Y D J,e t a l.C u l t u r i n g s a t e l l i t e c e l l s f r o m l i v i n g s i n g l e m u s c l e f i b e re x p l a n t s[J].I n V i t r o C e l l D e v B i o l A n i m,1995,31(10):773-779.[19] B I L L E S K O V T B,J E N S E N J B,J E S S E N N,e t a l.F l u o r e s c e n c e-a c t i v a t e d c e l l s o r t i n g a n d p h e n o t y p i c3914畜牧兽医学报54卷c h a r a c t e r i z a t i o n o f h u m a n f i b r o-ad i p o ge n i c p r o g e n i t o r s[J].S T A R P r o t o c,2023,4(1):102008.[20] L I U L,C H E U N G T H,C H A R V I L L E G W,e t a l.I s o l a t i o n o f s k e l e t a l m u s c l e s t e m c e l l s b y f l u o r e s c e n c e-a c t i v a t e d c e l l s o r t i n g[J].N a t P r o t o c,2015,10(10):1612-1624.[21] P A K U L A A,S P I N A Z Z O L A J M,G U S S O N I E.P u r i f i c a t i o n o f m y o g e n i c p r o g e n i t o r s f r o m h u m a nm u s c l e u s i n g f l u o r e s c e n c e-a c t i v a t e d c e l l s o r t i n g(F A C S)[M]ʊR N N I N G S B.M y o g e n e s i s.N e wY o r k:H u m a n a P r e s s,2019:1-15.[22] L O R E T I M,S A C C O A.T h e j a m s e s s i o n b e t w e e nm u s c l e s t e m c e l l s a n d t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x i n t h et i s s u e m i c r o e n v i r o n m e n t[J].N P J R e g e n M e d,2022,7(1):16.[23] S U Y,Y U Y Y,L I U C C,e t a l.F a t e d e c i s i o n o fs a t e l l i t e c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a n d s e l f-r e n e w a l b y m i R-31-I L34a x i s[J].C e l l D e a t h D i f f e r,2020,27(3):949-965.[24] Y O S H I D A T,D E L A F O N T A I N E P.M e c h a n i s m s o fI G F-1-m e d i a t e d r e g u l a t i o n o f s k e l e t a l m u s c l eh y p e r t r o p h y a n d a t r o p h y[J].C e l l s,2020,9(9):1970.[25] MA N Y,C H E N D L,L E E J H,e t a l.P i e z o1r e g u l a t e s t h e r e g e n e r a t i v e c a p a c i t y o f s k e l e t a l m u s c l e sv i a o r c h e s t r a t i o n o f s t e m c e l l m o r p h o l o g i c a l s t a t e s[J].S c i A d v,2022,8(11):e a b n0485.[26] S C HÄT Z L E I N E,B L A E S E R A.R e c e n t t r e n d s i nb i o a r t i f ic i a l m u s c l e e n g i n e e r i n g a nd t he i r a p p l i c a t i o n si n c u l t u r e d m e a t,b i o r o b o t i c s y s t e m s a n d b i o h y b r i di m p l a n t s[J].C o m m u n B i o l,2022,5(1):737.[27] MO I S E E V A V,C I S N E R O S A,S I C A V,e t a l.S e n e s c e n c e a t l a s r e v e a l s a n a g e d-l i k e i n f l a m e d n i c h et h a t b l u n t s m u s c l e r e g e n e r a t i o n[J].N a t u r e,2023,613(7942):169-178.[28] T A G L I E T T I V,K E F I K,R I V E R A L,e t a l.T h y r o i d-s t i m u l a t i n g h o r m o n e r e c e p t o r s i g n a l i n g r e s t o r e ss k e l e t a l m u s c l e s t e m c e l l r e g e n e r a t i o n i n r a t s w i t hm u s c u l a r d y s t r o p h y[J].S c i T r a n s l M e d,2023,15(685):e a d d5275.[29] MU S A RÒA,C A R O S I O S.I s o l a t i o n a n d c u l t u r e o fs a t e l l i t e c e l l s f r o m m o u s e s k e l e t a l m u s c l e[M]ʊD IN A R D O P,D H I N G R A S,S I N G L A D K.A d u l t S t e mC e l l s.N e w Y o r k:H u m a n a P r e s s,2017:155-167.[30]戴巍,宋瑞龙,张远浩,等.鸡骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定[J].畜牧兽医学报,2021,52(3):676-682.D A I W,S O N G R L,Z HA N G Y H,e t a l.I s o l a t i o n,c u l t u r e a nd i de n t if i c a t i o n o f m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s o fc h i c k e n[J].A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c a,2021,52(3):676-682.(i n C h i n e s e)[31] H E H R,Y I N H D,Y U X K,e t a l.P D L I M5A f f e c t sc h i c k e n s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l p r o l i f e r a t i o n a n dd i f fe r e n t i a t i o n v i a t h e p38-m a p k p a t h w a y[J].A n i m a l s(B a s e l),2021,11(4):1016.[32]单艳菊,束婧婷,宋迟,等.鸭骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定[J].江苏农业科学,2012,40(12):26-28.S HA N Y J,S HU J T,S O N G C,e t a l.I s o l a t i o nc u l t u r e a nd i de n t if i c a t i o n o f d u c k s k e l e t a l m u s c l es a t e l l i t e c e l l s[J].J i a n g s u A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s,2012,40(12):26-28.(i n C h i n e s e)[33]林正浩,王讯,李晓开,等.鸽骨骼肌卫星细胞的分离㊁培养及成肌特性[J].华南农业大学学报,2019,40(1):53-58.L I N Z H,WA N G X,L I X K,e t a l.I s o l a t i o n,i d e n t i f i c a t i o n a n d b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f s k e l e t a lm u s c l e s a t e l l i t e c e l l s i n p i g e o n s[J].J o u r n a l o f S o u t hC h i n a A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,2019,40(1):53-58.(i n C h i n e s e)[34]沈龙仙,王丽婷,何珂,等.褪黑素和烟酰胺单核苷酸对鹅骨骼肌卫星细胞增殖的影响[J].中国农业科学,2023,56(2):391-404.S H E N L X,WA N G L T,H E K,e t a l.E f f e c t s o fm e l a t o n i n a n d n i c o t i n a m i d e m o n o n u c l e o t i d e s o np r o l i f e r a t i o n o f s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s i n g o o s e[J].S c i e n t i a A g r i c u l t u r a S i n i c a,2023,56(2):391-404.(i n C h i n e s e)[35] D A N O V I Z M E,Y A B L O N K A-R E U V E N I Z.S k e l e t a lm u s c l e s a t e l l i t e c e l l s:b a c k g r o u n d a n d m e t h o d s f o ri s o l a t i o n a n d a n a l y s i s i n a p r i m a r y c u l t u r e s y s t e m[M]ʊD I MA R I O J X.M y o g e n e s i s.T o t o w a:H u m a n aP r e s s,2012:21-52.[36] Z HA N G L,WU Y N,L I X,e t a l.A n a l t e r n a t i v em e t h o d f o r l o n g-t e r m c u l t u r e o f c h i c k e n e m b r y o n i cs t e m c e l l i n v i t r o[J].S t e m C e l l s I n t,2018,2018:2157451.[37] S O U S A-V I C T O R P,G A R CÍA-P R A T L,MUÑO Z-CÁN O V E S P.C o n t r o l o f s a t e l l i t e c e l l f u n c t i o n i nm u s c l e r e g e n e r a t i o n a n d i t s d i s r u p t i o n i n a g e i n g[J].N a t R e v M o l C e l l B i o l,2022,23(3):204-226. [38] G O N Z A L E Z M L,B U S S E N I,WA I T S C M,e t a l.S a t e l l i t e c e l l s a n d t h e i r r e g u l a t i o n i n l i v e s t o c k[J].JA n i m S c i,2020,98(5):s k a a081.[39] H E R NÁN D E Z-H E R NÁN D E Z J M,G A R CÍA-G O N ZÁL E Z4914。

骨骼肌卫星细胞的原代、传代培养和鉴定

骨骼肌卫星细胞的原代、传代培养和鉴定

骨骼肌卫星细胞的原代、传代培养和鉴定作者:宋策来源:《新教育时代》2015年第08期一、骨骼肌卫星细胞简介骨骼肌卫星细胞最初被人们认为是骨骼肌的定向祖细胞,对骨骼肌的生长和伤后再生起重要作用。

1961年,Mauro在对青蛙的胫前肌做研究时,利用电子显微镜,从肌膜和基底膜之间发现了骨骼肌卫星细胞。

一般情况下,这些细胞处于静止状态,当骨骼肌受损、坏死或负荷过重等应激出现时,卫星细胞就能被激活,开始迁移至受损部位,然后增殖分化形成肌管,从而达到修复肌肉的目的。

二、骨骼肌卫星细胞的原代培养取SD大鼠一只,使用10%浓度水合氯醛进行腹腔注射麻醉,其计量约为0.4ml/100g。

静置大鼠数分钟直至其结膜反射消失,用镊子将其浸泡在75%酒精中消毒2-3分钟后,仰卧位固定,使用采血针吸除血液,提取腓肠肌和比目鱼肌,置入事先消毒并预冷的生理盐水中,然后迅速转移至超净工作台,取冰袋置于操作容器下方。

使用双抗PBS骨骼肌清洗液对获得的肌肉清洗3-4次,快速清除血管、肌筋膜以及脂肪等组织后,将肌肉均匀剪碎至1mm3 大小左右。

再次加入骨骼肌清洗液清洗,静置后弃漂浮物。

将适量的II型胶原酶消化液(0.1%)加入被剪碎的肌肉中,使用37℃磁力搅拌机让肌肉均匀消化约60分钟,转移至离心管,以1000rpm离心10分钟,吸除上清液。

根据沉淀体积加入适量的胰酶细胞消化液,磁力搅拌消化约20分钟,加入细胞种植液终止消化,将此时的肌肉悬液转移至离心管,以1000rpm离心10分钟,吸除上清液,在肌肉沉淀中加入10ml细胞种植液,均匀吹打成细胞悬液。

将细胞悬液依次加入200目、400目的细胞筛中过滤纯化。

均匀吹打滤液并接种于6孔细胞培养板中,置于培养箱(5%CO2,37℃,100%空气湿度)中培养2小时,细胞进行第一次差速贴壁后,将细胞液转移至新的6孔板中继续在培养箱(5%CO2,37℃,100%空气湿度)里培养2小时。

然后将细胞悬液转移至提前用0.001%多聚赖氨酸工作液包被过的6孔板中。

猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展

猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展

中国畜牧兽医 2022,49(8):2931-2942C h i n aA n i ma lH u sb a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展喻宗岗1,马海明1,2(1.湖南农业大学动物科学技术学院,长沙410128;2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室,广州510640)摘 要:猪骨骼肌是动物机体重要的运动组织及人类主要的肉食来源,也是研究肌肉生长发育和疾病的良好模型㊂猪出生后,骨骼肌的生长发育㊁损伤修复都需要肌卫星细胞的参与,体外分离培养猪骨骼肌卫星细胞是深入研究骨骼肌生长发育及疾病发生机理的基础,是在细胞水平进行分子功能验证的前提㊂随着肌肉发育和病理分子机制研究的不断深入,猪骨骼肌卫星细胞的体外分离培养技术也迅速发展起来㊂背最长肌㊁后腿肌和半腱肌常用于分离骨骼肌卫星细胞,1日龄猪背最长肌的分离效果最好㊂常用于分离骨骼肌卫星细胞的酶包括链酶蛋白酶㊁胶原酶㊁胰蛋白酶㊁胶原蛋白酶等,各酶及酶联合消化的时间不同,最优的过滤方式是200目+400目联合过滤,3次离心法可获得纯度较高的细胞㊂常使用的培养基为D M E M /F 12+10%胎牛血清(F B S )+1%青-链霉素(P /S )㊂骨骼肌肌卫星细胞常见标记物有配对盒基因3(P A X 3)㊁P A X 7㊁生肌决定因子5(M y f 5)㊁M y f 4㊁肌分化因子(M y o D )㊁肌细胞生成素(M y o G )等㊂作者通过对猪骨骼肌肌卫星细胞的分离㊁培养及鉴定等方面进行综述,梳理出各步骤中最佳参数,为建立规范猪骨骼肌卫星细胞分离程序提供参考,以期为肌肉发育和疾病研究提供理论及技术支持㊂关键词:猪;骨骼肌卫星细胞;分离;体外培养;酶消化法中图分类号:S 828文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2022.08.009 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2022-03-27基金项目:岭南现代农业实验室科研项目(N T 2021005);宁乡花猪基础研究(5026401-0315069)联系方式:喻宗岗,E -m a i l :s t u d y 236@163.c o m ㊂通信作者马海明,E -m a i l :m a h a i m i n g2000@163.c o m R e s e a r c hP r o gr e s s o n I s o l a t i o n a n dC u l t u r e o f P o r c i n e S k e l e t a lM u s c l e S a t el l i t e C e l l s i n v i t r o Y UZ o n g g a n g 1,MA H a i m i n g1,2(1.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,H u n a nA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,C h a n g s h a 410128,C h i n a ;2.G u a n g d o n g L a b o r a t o r y o f L i n g n a nM o d e r n A g r i c u l t u r a l S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,G u a n gz h o u 510640,C h i n a )A b s t r a c t :P o r c i n e s k e l e t a lm u s c l e i s a n i m p o r t a n tm o v e m e n t o r g a n i z a t i o n o f a n i m a l b o d y,t h em a i n m e a ts o u r c eo fh u m a nb e i n gs ,a n da g o o d m o d e l f o rm u s c l e g r o w t ha n dd i s e a s er e s e a r c h .A f t e r b i r t h ,p i g n e e d st h e p a r t i c i p a t i o n o f m u s c l es a t e l l i t ec e l l si nt h e g r o w t ha n d d e v e l o pm e n to f s k e l e t a lm u s c l e ,a n dt h ed a m a g er e pa i r .I s o l a t i o na n dc u l t u r eo f p o r c i n es k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t e c e l l s i n v i t r o i s t h eb a s i s f o r i n -d e p t h s t u d y o n t h e g r o w t h a n d d e v e l o pm e n t o f s k e l e t a lm u s c l e a n d t h e p a t h o ge n e s i so fd i s e a s e s ,a n dt h e p r e m i s ef o r m o l e c u l a r f u n c t i o nv e r i f i c a t i o na t t h ec e l l u l a r l e v e l .W i t ht h ed e e p e n i ng o fth er e s e a r c h o n m u s c l ed e v e l o p m e n ta n d p a t h o l o gi c a l m o l e c u l a r m e c h a n i s m ,t h e t e c h n o l o g y of i s o l a t i o na n dc u l t u r eo f s a t e l l i t e c e l l so f p o r c i n e s k e l e t a lm u s c l e i n v i t r o h a sd e v e l o p e dr a p i d l y .T h el o ng i s s i m u sd o r s im u s c l e ,hi n dl e g m u s c l ea n ds e m i t e n d i n o s u s m u s c l e a r ec o m m o n l y u s e dt oi s o l a t es k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t ec e l l s ,a n dt h el o n gi s s i m u sd o r s i m u s c l eo f1-d a y -o l d p i g l e t sh a v et h eb e s ti s o l a t i o ne f f e c t .E n z y m e sc o m m o n l y us e dt oi s o l a t e s k e l e t a lm u s c l e s a t e l l i t e c e l l s i n c l u d e p r o n a s e ,c o l l a g e n a s e ,t r y p s i n ,c o l l a g e n a s e ,e t c .,a n d t h e t i m e o f d i g e s t i o no fe a c he n z ym ea n di t sc o m b i n a t i o ni sd i f f e r e n t .T h eb e s t f i l t r a t i o n m e t h o di s200m e s h +400m e s hc o m b i n e df i l t r a t i o n ,a n d h i g h p u r i t y c e l l sc a n b eo b t a i n e d b y th r e et i m e s c e n t r i f u ga t i o n .T h eu s u a l m e d i u m i s D M E M /F 12+10%f e t a lb o v i n e s e r u m (F B S )+1%中国畜牧兽医49卷p e n i c i l l i n-s t r e p t o m y c i n(P/S).C o m m o n m a r k e r so f s k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t ec e l l s i n c l u d e p a i r i n g b o x g e n e3(P A X3),P A X7,M y o-g e n i cd e t e r m i n a n t5(M y f5),M y f4,M y o-d i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r (M y o D),m y o g e n i n(M y o G)a n ds oo n.I nt h i s p a p e r,t h e i s o l a t i o n,c u l t u r ea n d i d e n t i f i c a t i o no f m u s c l e s a t e l l i t e c e l l so f p o r c i n es k e l e t a lm u s c l ew e r er e v i e w e d,a n dt h eb e s t p a r a m e t e r s i ne a c h s t e p w e r es o r t e do u t,w h i c h p r o v i d e dr e f e r e n c e sf o re s t a b l i s h i n g as t a n d a r d i z e d p r o c e d u r ef o r i s o l a t i n gp o r c i n es k e l e t a l m u s c l es a t e l l i t ec e l l s,i n o r d e rt o p r o v i d et h e o r e t i c a la n dt e c h n i c a l s u p p o r t f o rm u s c l e d e v e l o p m e n t a n dd i s e a s e r e s e a r c h.K e y w o r d s:p i g s;m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s;i s o l a t i o n;i n v i t r o c u l t u r e;e n z y m e d i g e s t i o nm e t h o d猪的解剖结构和生理特征与人相似,因此可以作为人类疾病研究的模型[1]㊂为比较病理模型的优劣,研究发现,猪假性肥大肌营养不良症(d u c h e n n e m u s c u l a r d y s t r o p h y,D M D)模型的病理状态比鼠模型中更接近于人[2-3]㊂因此,猪肌肉疾病模型比小鼠模型更有优势㊂骨骼肌卫星细胞在出生后机体骨骼肌发育㊁维持和再生等生命活动中都发挥着重要的作用[4]㊂骨骼肌卫星细胞不仅是肌纤维细胞核的来源,而且能促进纤维的肥大[5-6]㊂被激活的骨骼肌卫星细胞可以诱导肌细胞增殖㊁分化,并促使肌细胞与肌纤维融合[7]㊂骨骼肌卫星细胞不仅有增殖分化的潜能,而且可被招募参与骨骼肌运动[8],在肌纤维损伤修复和再生过程中发挥重要作用[9-10]㊂因此,骨骼肌卫星细胞也可以作为肌肉生长发育的良好体外研究模型[11]㊂骨骼肌卫星细胞最早由M a u r o[12]于1961年在青蛙腿肌上分离获得,它位于肌纤维质膜和基底膜之间[13],主要分布于慢肌纤维中[14]㊂之后陆续建立了细胞自然贴壁培养法㊁荧光激活细胞分选法和磁珠激活分选法等方法㊂自然贴壁法耗时㊁低效,荧光激活分选法依赖昂贵的仪器,磁珠法获得的细胞活力低[15]㊂通过添加酶可以适当缩短分离时间,并获得高纯度㊁高活力的细胞,但是目前酶消化法仍存在酶使用种类㊁剂量㊁消化时间不统一,离心过滤时离心力和滤径大小不一㊁离心过滤次数不一致等问题㊂作者通过对分离骨骼肌卫星细胞的取材㊁消化㊁过滤㊁离心㊁体外培养㊁鉴定等基本步骤进行综述,期望为体外获得高纯度㊁高活力的猪骨骼肌卫星细胞,建立规范有效的分离方法提供参考㊂1骨骼肌卫星细胞分离1.1取材1.1.1取材部位骨骼肌卫星细胞分离有直接分离法和肌纤维分离法2种㊂D o u m i t等[16]于1992年利用直接分离法首次从4~8周龄猪的半膜肌中分离出肌源卫星细胞;B e k o f f等[17]于1997年利用肌纤维分离法在小鼠骨骼肌中分离获得肌源卫星细胞㊂W i l s c h u t等[18]于2010年建立猪单纤维分离法,自此陆续从岗上肌[19]㊁趾长伸肌[20]㊁三角肌群[21]㊁背最长肌[22-24]㊁半腱肌㊁半膜肌[24-25]㊁股二头肌[26-27]㊁腓肠肌[28]㊁三头肌[29]㊁后腿肌㊁菱形肌[11,30]㊁第三腓骨肌[28]㊁胫骨前肌[4]等肌肉组织中分离出了猪骨骼肌卫星细胞(图1A)㊂因背最长肌相较四肢的小肌群更大,取材最容易,常被用于分离骨骼肌卫星细胞㊂1.1.2取材时期分离猪骨骼肌卫星细胞的材料可取自胎儿期至幼龄期,如60胚龄[31-32]㊁1日龄[4,33]㊁3日龄[19,27]㊁4日龄[26,28]㊁5日龄[24]㊁7日龄[34]㊁4~6周龄[23]㊁1月龄[19]㊁2月龄[35]㊁5月龄[36]和25周龄[34](图1B)㊂其中最常用的是出生后1日龄猪,并且1~7日龄猪占到85%以上,最大日龄为25周龄㊂猪日龄越大肌肉的体积越大,取材相对越容易,然而,随着时间的延长肌肉中骨骼肌卫星细胞的数量越少,其增殖分化潜能也会越低,因此要获得足够数量且分化潜能高的骨骼肌卫星细胞应取材于1日龄猪背最长肌㊂另外,即使取自同时期的同一部位,不同品种骨骼肌卫星细胞的增殖能力也存在差别[37],如中国大蒲莲猪骨骼肌卫星细胞的增殖能力高于长白猪[7]㊂1.2消化根据分离猪骨骼肌卫星细胞使用酶的种类,将分离方法分为单酶消化法和多酶消化法,单酶有链酶蛋白酶[38-39]㊁胶原酶D[34]㊁蛋白酶[24,27,40-41]㊁蛋白酶ⅩⅣ[31,42]㊁胰蛋白酶[25,43-44]㊁Ⅰ型胶原蛋白酶[45-52]㊁Ⅱ型胶原蛋白酶[7,29,53-63](图2)㊂Ⅱ型胶原蛋白酶是最常用的酶,不同的酶有最佳的使用方法㊂Ⅱ型胶原蛋白酶能有效消化肌肉组织中的结缔组织,用0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶消化2h最佳(图3A㊁3D)㊂Ⅰ型胶原蛋白酶最佳使用方法是0.2%消化1~2h(图3B㊁3E)㊂蛋白酶使用量有4种规格(图3C),最佳消化时间是1h(图3F)㊂23928期喻宗岗等:猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展联合使用2种酶的方法有胶原酶+Ⅹ型胰蛋白酶[19]㊁Ⅰ型胶原酶+胰蛋白酶[4,23,64-65]㊁Ⅱ型胶原酶+胰蛋白酶[66]㊁蛋白酶+Ⅺ型胶原蛋白酶[67-68](图2),其中,0.1%~0.2%Ⅰ型胶原酶+0.25%胰蛋白酶应用最多,也有联合使用胰蛋白酶+胶原酶+D N A 酶3种酶分离骨骼肌卫星细胞的[11,24]㊂罗桂芬等[21]比较了链霉蛋白酶㊁胰酶及胶原酶消化法的分离效果,发现链酶蛋白酶消化法与其他酶消化法相比,可获得数量最多的骨骼肌卫星细胞,但细胞活力没有差异㊂因为不同的酶作用于不同的底物,胶原蛋白酶主要作用于肌束,链酶蛋白酶和胰蛋白酶作用于基底膜和肌膜,促使骨骼肌卫星细胞的释放[69]㊂联合使用多种酶消化肌肉组织中的异质物,虽然能有效去除杂质,但是延长了消化时间㊂1日龄猪肌肉组织中含有最多的是结缔组织,因此使用Ⅱ型胶原蛋白酶是最有效的分离方法㊂p60d ,60胚龄;d ,出生后天数;w ,出生后周龄;m o n ,出生后月龄p 60d ,60e m b r y o a g e ;d ,D a y s a f t e r b i r t h ;w ,W e e k s a f t e r b i r t h ;m o n ,M o n t h s a f t e r b i r t h 图1 肌肉组织取样部位(A )和时期(B )及其使用百分率F i g .1 S a m p l i n g s i t e (A )a n d p e r i o d (B )o fm u s c l e t i s s u e s a n d t h e i r p e r c e n t a g e o f u se 图2 消化酶及其使用百分率F i g .2 D i g e s t i v e e n z y m e s a n d t h e i r p e r c e n t a ge of u s e 1.3 过滤和离心骨骼肌中包含血管㊁神经等结缔组织(图4),分离肌卫星细胞时需要过滤和离心除去结缔组织以获得高纯度的细胞㊂分离猪骨骼肌卫星细胞有不过滤㊁过滤1次和过滤多次3种方式(图5A )㊂1次过滤有20μm [19,26]㊁40μm [35,41,68]㊁70μm [4]㊁100μm [27,70]㊁100目[70]和300m m [46]等多种滤径参数(图5B )㊂2次过滤有100μm+40μm [34,67,71]㊁100μm+70μm [11,30,57]㊁200目+400目[55-56,59,66]㊁200m m +50m m [53,60,62]㊁200μm +70μm [45]㊁70μm+40μm [31,42]㊁76μm+37μm [72]㊁500μm+53μm [38]7种(图5C ),其中200目+400目在2次过滤中应用最广泛㊂3次过滤有100μm+70μm+40μm [29,48,58,61,64]和100目+200目+400目[73]2种;其中100μm+70μm+40μm 是3次过滤的最佳方式(图5C )㊂1次过滤虽然省时,但可能因过滤不足得到的细胞不纯;3次过滤不仅延长了时间,还可能因过度过滤损伤细胞而降低细胞活力㊂因此,最优的过滤方式是200目+400目2次过滤法㊂普通离心和密度梯度离心是骨骼肌卫星细胞常见的2种分离方式㊂普通离心有1次离心和多次离心2种,多次离心有多次单一离心力和多次不同离心力2种㊂300ˑg 离心5mi n (2次)[35]比1000r /m i n 离心10m i n 然后1000r /m i n 离心5m i n [47](图5D )时间短,相同分离效果下更为简便㊂多次不同离心力中(图5E ),2000r /m i n 离心5m i n 后1000r /m i n 离心10m i n [74]比300ˑg 离心6m i n 后800ˑg 再离心10m i n [39]用时少,故而更简捷㊂在用时上,3次离心中,1500ˑg 离心10m i n ㊁800ˑg 离心10m i n㊁800ˑg 离心5m i n 比100ˑg 离心5m i n ㊁1000ˑg离心5m i n (2次)[34]用时长,比1200ˑg 离心15m i n ㊁300ˑg 离心5m i n ㊁1200g 离心15m i n [27]用时短,但是先高离心力能有效去除大块碎屑,再低离心力去除细微杂质,还不至损伤细胞,造成细胞活3392中 国 畜 牧 兽 医49卷力下降,是最好的3次离心法㊂P e r c o l l 密度梯度离心有3种70%㊁50%㊁40%[26,43],70%㊁50%㊁40%㊁25%[26,44]和60%㊁20%[11,30](图5F ),其中60%㊁20%密度梯度离心法因为成分较其他2种更简单,因此最简便㊂1次和2次离心虽能去除大部分被消化的结缔组织,但是仍有残留,所获的细胞不纯,因此,要有效去除杂质,3次离心法是最佳选择㊂A ㊁D ,分别为Ⅱ型胶原蛋白酶的使用浓度和消化时间使用百分率;B ㊁E ,分别为Ⅰ型胶原蛋白酶的使用浓度和消化时间使用百分率;C ㊁F ,分别为蛋白酶的使用浓度和消化时间使用百分率Aa n dD ,T h ec o n c e n t r a t i o no ft y p e Ⅱc o l l a g e n a s ea n dt h e p e r c e n t a g eo fd i g e s t i o nt i m er e s p e c t i v e l y ;Ba n d E ,T h eu s a g e p e r c e n t a g e o f c o n c e n t r a t i o na n dd i g e s t i o n t i m eo f t y p e Ⅰc o l l a g e n a s e ,r e s p e c t i v e l y ;Ca n dF ,T h eu s a g e p e r c e n t a g eo f p r o t e a s e c o n c e n t r a t i o na n dd i g e s t i o n t i m e ,r e s p e c t i v e l y 图3 3种常用单酶使用条件F i g .3 A p p l i c a t i o n c o n d i t i o n s o f t h r e e c o m m o n s i n g l e e n z ym es 图4 骨骼肌结构模式图[33]F i g .4 S k e l e t a lm u s c l e s t r u c t u r em o d e l d i a gr a m [33]43928期喻宗岗等:猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展A ,过滤次数使用百分率;B ,1次过滤使用百分率;C ,多次过滤使用百分率;D ,1次离心使用百分率;E ,多次离心使用百分率;F ,密度梯度离心使用百分率A ,T h e p e r c e n t a g e o f f i l t e r i n g t i m e s ;B ,T h e p e r c e n t a g e o f s i n g l e f i l t r a t i o n ;C ,T h e u s a g e p e r c e n t a g e o fm u l t i pl e f i l t r a t i o n ;D ,T h e p e r c e n t a g eo fs i n g l ec e n t r i f u g a t i o n ;E ,T h e p e r c e n t a g eo f m u l t i p l ec e n t r i f u g a lu s e ;F ,T h e p e r c e n t a g eo fd e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u ga t i o n 图5 过滤和离心程序及其使用百分率F i g .5 F i l t r a t i o na n d c e n t r i f u g a t i o n p r o c e d u r e s a n d t h e i r p e r c e n t a ge of u s e 2 骨骼肌卫星细胞培养根据分离目标分为成肌细胞㊁骨骼肌卫星细胞分离法和单纤维分离法㊂常用成肌细胞㊁骨骼肌卫星细胞分离法来获得原代细胞㊂有研究比较了单核成肌细胞分离法和单纤维分离法获得骨骼肌卫星细胞的优劣,结果发现单核成肌细胞分离法无法得到同质性高的成肌细胞,且其中的肌卫星细胞数量少,再生能力差;单纤维分离法得到的卫星细胞细胞增殖能力更强,且可以了解骨骼肌卫星细胞初始位置和迁移转化等过程[20]㊂也有通过共培养骨骼肌卫星细胞和基质血管细胞来获得骨骼肌卫星细胞的方法[75]㊂离心后的细胞中含有成肌细胞和骨骼肌卫星细胞,为获得单一的骨骼肌卫星细胞还需进一步分离纯化㊂成肌纤维细胞贴壁早于肌卫星细胞,利用差速贴壁的特性,即可以获得成肌细胞和肌卫星细胞[75-76]㊂体外培养猪肌卫星细胞的培养液包含基础培养基㊁血清㊁抗生素和其他添加物等多种物质㊂对46篇文献的培养液分析归纳获得如下结果㊂猪肌卫星细胞的培养基有6种,使用频次最高的是D M E M /F 12(图6A )㊂血清因其中含有细胞生长必需的成分常被添加在培养基中,常见的添加方式有添加1种血清和添加2种血清㊂添加10%胎牛血清(F B S )比添加20%F B S 更经济㊂10%F B S+10%马血清(H S )和10%F B S +10%猪血清(P S )使用较少(图6B )㊂为防止外源微生物的污染,常在培养基中添加抗生素㊂在46篇研究中只有7篇未添加抗生素,抗生素使用率达到84%以上(图6C )㊂在添加抗生素的报道中,1%青-链霉素(P /S )是必需成分,也有同时添加了青-链霉素和两性菌素[11,26,28-30,43,47,49],还有同时添加了青-链霉素㊁两性菌素和庆大霉素[44]㊂在培养液中添加谷氨酰胺和谷氨酰胺丙氨酸二肽可提高细胞的活性㊁促进细胞生长㊂部分还添加了基础成肌纤维细胞生长因子(b F G F )㊁鸡胚提取物(C E E )㊁氨基酸(A A )㊁4-羟乙基哌嗪乙磺酸(H E P E S )和表皮生长因子(E G F )等物质(图6D~6H ),其中b F G F ㊁C E E 和E G F 可提高细胞的贴壁率,A A 为细胞生长提供营养,5392中 国 畜 牧 兽 医49卷H E P E S 保证细胞生长的缓冲能力㊂在培养液中添加胞外基质(如明胶㊁鼠尾胶原㊁多聚赖氨酸㊁层黏连蛋白和纤维黏连蛋白)可有效提高细胞的贴壁率[77]㊂对于没有损伤的细胞,有自然贴壁的能力,不用添加促贴壁的物质,增加添加物后细胞渗透压和缓冲力会改变还需要添加缓冲液,因此,D M E M/F 12+10%F B S +1%P /S 是猪骨骼肌卫星细胞培养的最佳培养液㊂①A ,基础培养基使用百分率;B ,血清使用百分率;C ,抗生素使用百分率;D ,谷氨酰胺使用百分率;E ,基础纤维生长因子使用百分率;F ,鸡胚提取物使用百分率;G ,氨基酸使用百分率;H ,其他添加物的使用百分率㊂②D M E M ,杜氏改良伊戈尔培养基;F B S ,胎牛血清;H S ,马血清;P S ,猪血清;F C S ,小牛血清;P S ,青-链霉素;A m p ,两性菌素;G TM ,庆大霉素;b F G F ,基础成肌纤维细胞生长因子;C E E ,鸡胚提取物;N E A A ,非必需氨基酸;A A ,氨基酸;H E P E S ,4-羟乙基哌嗪乙磺酸;E G F ,表皮生长因子;N o n e ,在46篇文献中未使用该物质①A ,T h eu s e d p e r c e n t a g e o f b a s i cm e d i u m ;B ,T h e u s e d p e r c e n t a g e o f s e r u m ;C ,T h e u s e d p e r c e n t a ge of a n t i b i o t i c s ;D ,T h e u s e d p e r c e n t ag eo f g l u t a m i n e ;E ,Th eu s e d p e r c e n t a g e o f b a si c f i b e r g r o w t h f a c t o r ;F ,T h e u s e d p e r c e n t a g e o f c h i c k e n e m b r yo e x t r a c t ;G ,T h eu s e d p e r c e n t a g eo fa m i n oa c i d s ;H ,T h eu s e d p e r c e n t a g eo fo t h e ra d d i t i v e s .②D M E M ,D u l b e c c o s m o d i f i e dE a g l e s m e d i u m ;F B S ,f e t a lb o v i n es e r u m ;H S ,H o r s es e r u m ;P S ,P o r c i n es e r u m ;F C S ,F e t a l c a l fs e r u m ;P /S ,P e n i c i l l i n -s t r e p t o m yc i n ;A m p ,A m p h o t e r i c i n ;G TM ,G e n t a m i c i n ;b F G F ,B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ;C E E ,C h i c k e n e m b r y o e x t r a c t ;N E A A ,N o n e s s e n t i a l a m i n oa c id ;A A ,A m i n oa c i d ;H E P E S ,4-h y d r o x ye t h y l p i p e r a z i n ee t h a n e s u lf o n i ca c i d ;E G F ,E p i d e r m a lg r o w th f a c t o r ;N o n e ,T h e s u b s t a n c ew a sn o t u s e di n46l i t e r a t u r e s 图6 培养液各组分及其使用百分率F i g .6 C o m p o n e n t s o f c u l t u r em e d i u ma n d t h e i r p e r c e n t a ge of u s e 63928期喻宗岗等:猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展3骨骼肌卫星细胞的鉴定骨骼肌卫星细胞是多潜能干细胞,可以分化为成肌细胞和成脂细胞,因此可以使用成肌或成脂标志物来鉴定㊂根据标志基因在细胞中的位置可分为核标记㊁转录因子标记和细胞表面膜蛋白标记[78]㊂常见的核标记有配对盒基因3(P A X3)㊁P A X7;转录因子标记有生肌调节因子5(M y f5)㊁M y f4㊁肌分化因子(M y o D)㊁肌细胞生成素(M y o G)等,表面膜蛋白主要有m-钙黏蛋白㊁α7-和β1-整合素㊁c-M e t㊁C-X-C趋化因子受体4型(C X C R4)㊁多配体蛋白聚糖-3和多配体蛋白聚糖-4㊁降钙素受体㊁颅脑损伤蛋白-1㊁C D34㊁血管细胞黏附分子-1 (V C AM1)和神经细胞黏附分子-1(N C AM1)[79-80]㊂肌卫星细胞标志基因有P A X7[7,43,47,53,56,60,63,66,81-83]和M y f5[27,40,67,84],成脂标志基因有脂蛋白脂酶(L P L)㊁过氧化物酶体增殖物激活受体(P P A Rγ)㊁脂肪细胞和定向分化因子1(A D D1)和固醇调节元件结合蛋白-1(S R E B P-1)[67],成肌标志基因有P A X7[27,28,34]㊁M y o D㊁M y o D1[4,26-28,67,85]㊁M y o G[26,28,85]㊁M y f5[27,28,33,34]㊁肌球蛋白重链(MH C)[24]和结蛋白(D e s m i n)[4,24,28,30,55]㊂P A X7是鉴定骨骼肌卫星细胞的最佳因子㊂免疫荧光(I F)㊁实时荧光定量P C R(q P C R)㊁流式细胞分析(F C)和免疫组化(I H C)是常用的鉴定方法(图7)㊂不同的鉴定因子因其表达的部位和鉴定的简便及有效性的不同而有所侧重㊂D e s m i n使用I H C法鉴定最为有效(图8A),M y f5用I F法鉴定效果最好(图8B)㊂M y o D的鉴定方式中q P C R 法相较I F法更为方便㊁经济,因此被广泛使用(图8C)㊂P A X7使用I F法鉴定最有效(图8D)㊂成脂细胞标志基因常用P C R法来鉴定,还可以使用油红O染色法来鉴定[51]㊂相较于D e s m i n㊁M y f5和M y o D,P A X7在卫星干细胞㊁卫星细胞和成肌细胞上均有表达(图9),因此是最佳的鉴定因子㊂图7鉴定方法及其使用百分率F i g.7I d e n t i f i c a t i o nm e t h o d s a n d t h e i r p e r c e n t a g e o f u se图8标记因子的鉴定方法及其使用百分率F i g.8I d e n t i f i c a t i o nm e t h o da n da p p l i c a t i o n p e r c e n t a g e o fm a r k e r f a c t o r s7392中 国 畜 牧 兽 医49卷图9 参与调控肌卫星细胞生长变化过程的标记因子[33]F i g .9 M a r k e r f a c t o r s i n v o l v e d i n r e g u l a t i n g t h e g r o w t ha n d c h a n ge s o fm u s c l e s a t e l l i t e c e l l s [33]4 小 结猪骨骼肌卫星细胞可以从不同时期的多种肌肉中分离,且各时期分离细胞的数量和增殖能力不同,部位决定着取材的便捷性,因此,常用1日龄猪的背最长肌分离猪骨骼肌卫星细胞㊂酶消化涉及到用酶种类及各酶使用方法,酶种类的增加可以有效去除肌肉中的杂质,但延长了消化时间,很可能因过度消化损伤细胞膜,降低细胞活力,所以使用单酶是比较保险的选择㊂0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶37ħ消化2h 是最有效的消化方式㊂消化后的肌肉组织是细胞和异质碎屑的混合物,需要通过过滤和离心去除组织碎屑,获得纯细胞㊂单次过滤㊁单次离心难以有效去除杂质,多次过滤㊁离心可能会损伤细胞膜降低细胞活力,因此2次过滤加3次离心是最佳选择,即400目+200目过滤,1500ˑg 离心10m i n㊁800ˑg 离心10m i n ㊁800ˑg 离心5m i n 是最佳组合㊂过滤离心后的细胞还包含成肌细胞,因此需进一步培养纯化获得单一的骨骼肌卫星细胞㊂成肌细胞在培养液中正常生长后会较早贴壁,因此可取贴壁后的上清继续培养来获得骨骼肌卫星细胞㊂培养液对细胞的正常生长至关重要,原代细胞在离体环境中需要充足的营养和无菌环境,D M E M /F 12+10%F B S +1%P /S 是细胞培养的常见培养液㊂骨骼肌卫星细胞可通过核标志㊁转录标志和膜表面标志等标志基因或卫星细胞标记㊁成肌细胞标记和成脂细胞标记因子来鉴定,P A X 7基因广泛表达于肌卫星细胞和成肌细胞,因此是最佳的鉴定基因㊂尽管q P C R ㊁F C ㊁I F 和I H C 等方法均可用来鉴定,但I F 法更为直观和准确,因此广泛被使用㊂为获得纯度㊁活力和分化潜能更高的猪骨骼肌卫星细胞,还需要规范和优化取材㊁消化㊁过滤㊁离心㊁培养和鉴定等步骤,建立简便有效的体外分离培养程序㊂随着新的鉴定方法的出现和新技术的普及,猪骨骼肌卫星细胞的分离培养也将更加高效便捷㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] G R O E N E N M A ,A R C H I B A L D A L ,U E N I S H IH ,e ta l .A n a l y s e sof p i gg e n o m e s p r o v i d ei n s i gh ti n t o p o r c i n ed e m o g r a p h y an de v o l u t i o n [J ].N a t u r e ,2012,491(7424):393-398.[2] N A K AMU R A A ,T A K E D AS .M a m m a l i a nm o d e l so fd u c he n n em u s c u l a rd y s t r o p h y:P a t h o l o gi c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d t h e r a p e u t i c a p p l i c a t i o n s [J ].J o u r n a lo f B i o m e d i c i n e &B i o t e c h n o l o g y ,2011,2011:184393-184400.[3] K L YM I U K N ,B L U T K E A ,G R A F A ,e t a l .D y s t r o p h i n -d e f i c i e n t p i g s p r o v i d e n e w i n s i gh t si n t o t h e h i e r a r c h y o f p h y s i o l o g i c a l d e r a n g e m e n t s o f d y s t r o ph i c m u s c l e [J ].H u m a n M o l e c u l a r G e n e t i c s ,2013,22(21):4368-4382.[4] Y A N GJ ,L I U H ,WA N G K ,e ta l .I s o l a t i o n ,c u l t u r ea n db i o l o g ic a lc h a r a c t e r i s t i c so f m u l t i po t e n t p o r c i n e s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s [J ].C e l la n d T i s s u e B a n k i n g ,2017,18(4):513-525.[5] V E R D I J K L B ,S N I J D E R S T ,D R O S T M ,e t a l .S a t e l l i t e c e l l s i nh u m a n s k e l e t a lm u s c l e ;F r o mb i r t h t oo l d a g e [J ].A g e (D o r d r e c h t ,N e t h e r l a n d s ),2014,36(2):545-547.[6] F A R U PJ ,R A H B E K S K ,R I I SS ,e t a l .I n f l u e n c eo fe x e r c i s ec o n t r a c t i o nm o d ea n dpr o t e i n s u p p l e m e n t a t i o n o n h u m a ns k e l e t a l m u s c l es a t e l l i t e c e l l c o n t e n ta n d m u s c l ef i b e r g r o w t h [J ].J o u r n a l o f A p p l i e dP h y s i o l o g y ,2014,117(8):898-909.[7] Z HA O X ,Z HU R ,WA N G Y ,e ta l .D i f f e r e n t i a t i o np r o l i f e r a t i v e c a p a c i t y of s k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t ec e l l s f r o m D a p u l i a na n dL a n d r a c e p ig s [J ].I t a l i a nJ o u r n a l o f A n i m a lS c i e n c e ,2020,19(1):574-585.[8] HAWK E T ,G A R R Y D .M y o ge n i c s a t e l l i t e c e l l s :P h y s i o l o g y t o m o l e c u l a r b i o l o g y [J ].J o u r n a l o f83928期喻宗岗等:猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展A p p l i e dP h y s i o l o g y,2001,91(2):534-551.[9] M C C A R T H Y JJ,M U L A J,M I Y A Z A K I M,e ta l.E f f e c t i v ef i b e rh y p e r t r o p h y i ns a t e l l i t ec e l l-d e p l e t e ds k e l e t a lm u s c l e[J].D e v e l o p m e n t(C a m b r i d g e),2011,138(17):3657-3666.[10] L E P P E R C,P A R T R I D G E T A,F A N C M.A na b s o l u t er e q u i r e m e n t f o rP a x7-p o s i t i v es a t e l l i t ec e l l s i na c u t ei n j u r y-i n d u c e d s k e l e t a l m u s c l e r e g e n e r a t i o n[J].D e v e l o p m e n t,2011,138(17):3639-3646.[11] M E T Z G E R K,T U C H S C H E R E R A,P A L I N M,e ta l.E s t a b l i s h m e n t a n d v a l i d a t i o n o f c e l l p o o l s u s i n gp r i m a r y m u s c l ec e l l sd e r i v e df r o ms a t e l l i t ec e l l so f p i gs k e l e t a lm u s c l e[J].I nV i t r oC e l l u l a r&D e v e l o p m e n t a lB i o l o g y-A n i m a l,2020,56(3):193-199.[12] MA U R OA.S a t e l l i t e c e l l o f s k e l e t a lm u s c l e f i b e r s[J].T h e J o u r n a l o f B i o p h y s i c a l a n d B i o c h e m i c a lC y t o l o g y,1961,9(2):493-495.[13] K A T ZB.T h e t e r m i n a t i o n so f t h ea f f e r e n tn e r v e f i b r ei nt h e m u s c l es p i n d l eo ft h ef r o g[J].P h i l o s o p h i c a lT r a n s a c t i o n s o f t h eR o y a lS o c i e t y o f L o n d o n,1961,243(703):221-240.[14] G I B S O N M C,S C H U L T ZE.A g e-r e l a t e dd i f f e r e n c e s i na b s o l u t e n u m b e r s o f s k e l e t a lm u s c l e s a t e l l i t e c e l l s[J].M u s c l e&N e r v e,1983,6(8):574-580.[15] Y O S H I O K A K,K I T A J I MA Y,O K A Z A K IN,e ta l.A m o d i f i e d p r e-p l a t i n g m e t h o d f o r h i g h-y i e l d a n dh i g h-p u r i t y m u s c l es t e m c e l l i s o l a t i o nf r o m h u m a n/m o u s es k e l e t a l m u s c l et i s s u e s[J].F r o n t i e r s i n C e l la n dD e v e l o p m e n t a lB i o l o g y,2020,8:793.[16] D O UM I T M E,M E R K E L R A.C o n d i t i o n s f o ri s o l a t i o n a n d c u l t u r e o f p o r c i n e m y o g e n i c s a t e l l i t ec e l l s[J].T i s s u e C e l l,1992,24(2):253-262.[17] B E K O F FA,B E T Z W.P r o p e r t i e s o f i s o l a t e da d u l t r a tm u s c l e f i b r e sm a i n t a i n e d i n t i s s u e c u l t u r e[J].J o u r n a lo f P h y s i o l o g y,1977,271(2):537-547.[18] W I L S C HU T KJ,T J I N EP M,HA A G S MA N H P,e ta l.A p p r o a c h e st oi s o l a t e p o r c i n es k e l e t a l m u s c l es t e m a n d p r o g e n i t o r c e l l s[J].P r o t o c o l E x c h a n g e,2015.D O I:10.5281/z e n o d O.15596.[19] B R I N K M E I E R H,S E E W A L D MJ,E I C H I N G E R H M,e t a l.C u l t u r e c o n d i t i o n sf o r t h e p r o d u c t i o no f p o r c i n em y o t u b e s a n d m y o b a l l s[J].J o u r n a l o f A n i m a lS c i e n c e,1993,71(5):1154-1160.[20]刘月光,史新娥,沈清武,等.利用单根肌纤维法分离和培养猪骨骼肌卫星细胞及其成肌诱导分化[J].农业生物技术学报,2011,19(5):856-863.L I U Y G,S H IX E,S H E N Q W,e ta l.I s o l a t i o na n dc u l t u r e o f p o r c i n e s k e l e t a lm u s c l e s a t e l l i t e c e l l sb y s i n g l em u s c l e f i b e r a n d t h e i rm u s c l e d i f f e r e n t i a t i o n[J].J o u r n a lo f A g r i c u l t u r a l B i o t e c h n o l o g y,2011,19(5):856-863.(i nC h i n e s e)[21]罗桂芬,文旭辉,杨公社.猪肌卫星细胞的分离培养及鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志,2006,6:823-825.L U O G F,W E N X H,Y A N G G S.I s o l a t i o n,c u l t u r ea n d i d e n t i f i c a t i o no f p o r c i n em u s c l e s a t e l l i t e c e l l s[J].C h i n e s e J o u r n a l o f C e l l u l a r a n d M o l e c u l a rI m m u n o l o g y,2006,6:823-825.(i nC h i n e s e)[22]吕晓,朱海鲸,曹晖,等.猪肌肉卫星细胞的分离培养及生物学特性鉴定[J].中国兽医学报,2011,31(10):1480-1484.L Y U X,Z HU H J,C A O H,e ta l.I s o l a t i o n,c u l t u r ea n d i d e n t i f i c a t i o n o fb i o l o g ic a l c h a r a c t e r i s t i c s o fp o r c i n em u s c l es a t e l l i t ec e l l s[J].C h i n e s eJ o u r n a lo fV e t e r i n a r y S c i e n c e,2011,31(10):1480-1484.(i nC h i n e s e)[23] S E B A S T I A NS,G O U L D I N GL,K U C H I P U D I SV,e t a l.E x t e n d e d2D m y o t u b ec u l t u r er e c a p i t u l a t e s p o s t n a t a lf i b r et y p e p l a s t i c i t y[J].B M C C e l l B i o l og y,2015,16(1):23-32.[24] M I E R S C H C,S T A N G E K,R O E N T G E N M.E f f e c t so f t r y p s i n i z a t i o n a n d o f a c o m b i n e d t r y p s i n,c o l l a g e n a s e,a n dD N a s ed i ge s t i o no n l i b e r a t i o na n d i nv i t r o f u n c t i o n o fs a t e l l i t ec e l l si s o l a t e df r o m j u v e n i l ep o r c i n em u s c l e s[J].I nV i t r oC e l l u l a r&D e v e l o p m e n t a lB i o l o g y-A n i m a l,2018,54(6):406-412.[25] L IB,L IP,HU A N G R,e ta l.I s o l a t i o n,c u l t u r ea n di d e n t i f i c a t i o n o f p o r c i n e s k e l e t a l m u s c l e s a t e l l i t ec e l l s[J].A s i a n-A u s t r a l a s i a n J o u r n a l o f A n i m a lS c i e n c e s,2015,28(8):1171-1177.[26] M I E R S C H C,S T A N G E K,R O E N T G E N M.S e p a r a t i o no f f u n c t i o n a l l y d i v e r g e n tm u s c l e p r e c u r s o rc e l l p o p u l a t i o n s f r o m p o r c i n e j u v e n i l e m u s c l e s b yd i s c o n t i n u o u s pe r c o l l d e n s i t yg r a d i e n t c e n t r if ug a t i o n[J].B M CC e l lB i o l o g y,2018,19(1):2-13.[27] C H O IK,Y O O NJ W,K I M M,e t a l.O p t i m i z a t i o no fc u l t u r ec o nd i t i o n sf o r m a i n t a i n i n g p i g m u s c l es te mc e l l s i n v i t r o[J].F o o dS c i e n c e o f A n i m a lR e s o u r c e s,2020,40(4):659-667.[28] S T A N G E K,A H R E N S H E,V O N M A L T Z A H N J,e t a l.I s o l a t i o n a n d e x v i v o c u l t i v a t i o n of s i ng l em y o f i b e r s f r o m p o r c i n e m u s c l e[J].I n V i t r oC e l l u l a r&D e v e l o p m e n t a l B i o l o g y-A n i m a l,2020,56(8):585-592.[29] L I J,S U T,Z O U C,e t a l.L o n g n o n-c o d i n g R N A H19r e g u l a t e s p o r c i n es a t e l l i t ec e l l d i f f e r e n t i a t i o nt h r o u g hm i R-140-5p/S O X4a n d D B N1[J].F r o n t i e r si n C e l la n dD e v e l o p m e n t a lB i o l o g y,2020,8:518724.9392中国畜牧兽医49卷[30] P A L I N M F,L A P O I N T E J,G A R IÉP Y C,e ta l.C h a r a c t e r i s a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r m o l e c u l a rm e c h a n i s m s m o d u l a t e d b y c a r n o s i n e i n p o r c i n em y o b l a s t s u n d e r b a s a l a n d o x i d a t i v e s t r e s sc o nd i t i o n s[J].P L o SO n e,2020,15(9):e239496.[31] V A U G HN M A,P H E L P S K J,G O N Z A L E ZJ M.I n v i t r o s u p p l e m e n t a t i o n w i t h t h e p o r c i n e p l a s m ap r o d u c t,b e t a G R O ,s t i m u l a t e sa c t i v i t y o f p o r c i n e f e t a lm y o b l a s t sa n d n e o n a t a ls a t e l l i t e c e l l si n a d i v e r g e n tm a n n e r[J].A n i m a l,2018,12(9):1912-1920.[32] K H A T R IO S,V A U G H N M A,P H E L P S KJ,e ta l.I n v i t r o b e t a G R O s u p p l e m e n t a t i o n s t i m u l a t e sm y o g e n e s i so f p o r c i n ef e t a l m y o b l a s t s a n d p o r c i n es a t e l l i t ec e l l si nad i v e r g e n t m a n n e r[J].J o u r n a lo fA n i m a lS c i e n c e,2017,954:157.[33] Y A NJ,G A N L,Y A N G H,e ta l.T h e p r o l i f e r a t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f c o-c u l t u r e dp o r c i n e p r e a d i p o c y t e s a n d m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s i nv i t r o[J].M o l e c u l a rB i o l o g y R e p o r t s,2013,40(4):3197-3202.[34] D I N GS,WA N GF,L I U Y,e t a l.C h a r a c t e r i z a t i o na n di s o l a t i o no fh i g h l yp u r i f i e d p o r c i n es a t e l l i t ec e l l s[J].C e l lD e a t hD i s c o v e r y,2017,3(2017):17003-17013.[35] L E W I S F C,H E N N I N G B J,M A R A Z Z I G,e ta l.P o r c i n e s k e l e t a l m u s c l e-d e r i v e d m u l t i p o t e n t P W1(p o s)/P a x7(n e g)i n t e r s t i t i a l c e l l s:I s o l a t i o n,c h a r a c t e r i z a t i o n,a nd l o n g-te r mc u l t u r e[J].S t e mC e l l sT r a n s l a t i o n a lM e d i c i n e,2014,3(6):702-712.[36] K I M K,K I M D,M I N Y,e ta l.M y o g e n i cr e g u l a t o r yf a c t o r sa r ek e yp l a y e r si nd e t e r m i n i ng m u s c l e m a s sa n dm e a t q u a l i t y i n J e j un a t i v e a n dB e r k s h i r e p i g s[J].V e t e r i n a r y M e d i c i n e a n d S c i e n c e,2021,7(3):735-745.[37] WA N G X,Y A N G W,Y A N GZ,e t a l.T h ed i f f e r e n t i a lp r o l i f e r a t i v ea b i l i t y o fs a t e l l i t ec e l l si n L a n t a n g a n dL a n d r a c e p i g s[J].P L o SO n e,2012,7(3):e32537.[38] D O UM I T M E,M E R K E L R A.C o n d i t i o n s f o ri s o l a t i o n a n d c u l t u r e o f p o r c i n e m y o g e n i c s a t e l l i t ec e l l s[J].T i s s u e&C e l l,1992,24(2):253-262.[39] B A Q U E R O-P E R E ZB,K U C H I P U D I SV,N E L L IR K,e t a l.As i m p l if i e db u t r o b u s tm e t h o d f o r t h e i s o l a t i o no fa v i a n a n d m a m m a l i a n m u s c l e s a t e l l i t e c e l l s[J].B M CC e l lB i o l o g y,2012,13(1):16-27.[40] C H E N Y,Z HU H,M C C A U L E Y S R,e t a l.D i m i n i s h e ds a t e l l i t ec e l l f u s i o na n dS6K1e x p r e s s i o ni nm y o t u b e s d e r i v e d f r o ms k e l e t a lm u s c l e o f l o wb i r t hw e i g h t n e o n a t a l p i g s[J].P h y s i o l o g i c a l R e p o r t s,2017,5(3):e13075.[41] D E N G B,Z HA N G F,W E N J,e t a l.T h et r a n s c r i p t o m e s f r o m t w o a d i p o c y t e p r o g e n i t o r c e l lt y p e s p r o v i d e i n s i g h t i n t o t h ed i f f e r e n t i a l f u n c t i o n so fM S T N[J].G e n o m i c s,2020,112:3826-3836.[42] K HA T R IOS,V A U G HN M A,P H E L P SKJ,e t a l.I n v i t r o b e t a G R O s u p p l e m e n t a t i o n s t i m u l a t e sm y o g e n e s i so f p o r c i n ef e t a l m y o b l a s t s a n d p o r c i n es a t e l l i t ec e l l si nad i v e r g e n t m a n n e r[J].J o u r n a lo fA n i m a lS c i e n c e,2017,954:157.[43] M I E R S C H C,S T A N G E K,H E R I N G S,e t a l.M o l e c u l a r a n d f u n c t i o n a l h e t e r o g e n e i t y o f e a r l yp o s t n a t a l p o r c i n e s a t e l l i t e c e l l p o p u l a t i o n s i sa s s o c i a t e d w i t hb i o e n e r g e t ic p r o f i l e[J].S c i e n t i f i cR e p o r t s,2017,7(1):45052.[44] S T A N G EK,M I E R S C H C,S P O N D E R G,e t a l.L o wb i r t h w e i g h t i n f l u e nc e st h e p o s t n a t a la b u nd a n c ea n dc h a r a c t e r i s t i c s o f s a t e l l i t e c e l l s u b p o p u l a t i o n s i np i g s[J].S c i e n t i f i c R e p o r t s,2020,10(61491):6149-6162.[45] S U N Y,Q I NJ,L I U S,e t a l.P D G F Ra l p h ar e g u l a t e db y m i R-34a a n d F o x O1p r o m o t e s a d i p o g e n e s i si np o r c i n e i n t r a m u s c u l a r p r e a d i p o c y t e s t h r o u g h E r ks i g n a l i n g p a t h w a y[J].I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o fM o l e c u l a rS c i e n c e s,2017,18(11):2424-2436.[46] C HU W,W E I W,HA N H,e ta l.M u s c l e-s p e c i f i cd o w n re g u l a t i o no fG Rl e v e l s i n h i b i t sa d i p o g e n e s i s i np o r c i n e i n t r a m u s c u l a ra d i p o c y t et i s s u e[J].S c i e n t i f i cR e p o r t s,2017,7(510):510-522.[47] M I L N E R D J,B I O N A Z M,MO N A C O E,e t a l.M y o g e n i c p o t e n t i a l o f m e s e n c h y m a l s t e m c e l l si s o l a t e d f r o m p o r c i n e a d i p o s e t i s s u e[J].C e l l a n dT i s s u eR e s e a r c h,2018,372(3):507-522.[48] WA N G S,S U N Y,R E N R,e t a l.H3K27m e3d e p l e t i o n d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n p r o m o t e s m y o g e n i ct r a n s c r i p t i o n i n p o r c i n e s a t e l l i t e c e l l s[J].G e n e s,2019,10(2313):231-243.[49] R E D S HAW Z,L O U G HN A P T.A d i p o g e n i cd i f fe r e n t i a t i o no fm u s c l ed e r i v e dc e l l s i s r e p r e s s e db yi n h i b i t i o n o f G S K-3a c t i v i t y[J].F r o n t i e r s i nV e t e r i n a r y S c i e n c e,2018,5:110-115.[50] L V W,J I NJ,X UZ,e t a l.l n c MG P F i s a n o v e l p o s i t i v er e g u l a t o r o f m u s c l e g r o w t h a n d r e g e n e r a t i o n[J].J o u r n a l o f C a c h e x i aS a r c o p e n i aa n d M u s c l e,2020,11(6):1723-1746.[51] Q I U K,X U D,WA N G L,e ta l.A s s o c i a t i o na n a l y s i so f s i n g l e-c e l lR N As e q u e n c i n g a n d p r o t e o m i c s r e v e a l sa v i t a l r o l eo fC a2+s i g n a l i n g i nt h ed e t e r m i n a t i o no fs k e l e t a lm u s c l e d e v e l o p m e n t p o t e n t i a l[J].C e l l s,2020,9(4):1045-1065.[52] WA N G S,X U X,L I U Y,e ta l.R I P-S e q o f E Z H20492。

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肌肉卫星细胞是骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性细胞。

它们在一般情况下是处于静息状态的,当被激活后,具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌细胞的能力。

在那里它们通过形成与肌肉纤维融合的先驱细胞来对损伤做出反应。

有研究报告说,它们能充当干细胞,但卫星细胞群的混合性质意味着,它们的干细胞身份难以证明。


“最新一期Nature刊登由美国斯坦福大学医学院的Sacco等人的研究结果:研究小组通过利用克隆分析证实卫星细胞的确是干细胞、能够自我更新,从而澄清了相关问题。

他们将一个表达荧光素酶的卫星细胞移植进了小鼠的肌肉中,发现它能够大量增殖,有助于肌肉纤维的形成,而且可以被再次移植。

因此断定肌肉卫星细胞也是一种干细胞。


肌肉中肌肉卫星细胞非常多。

我们在进行性肌营养不良的肌肉病变中很容易发现大量的由卫星细胞分化而来的再生细胞。

然而,这些干细胞中缺乏、缺损某些膜蛋白基因。

因此,即使发生再生,也只能再生膜功能缺损肌纤维,免不了肌纤维变性坏死的命运。

我们实验室的研究重点是,如何保护膜蛋白缺损的肌纤维,而不是通过基因治疗,如何根治肌营养不良。

因为目前世界上哪一个实验室也做不到这一点,某些研究成果,即使在动物身上似乎有效,但人身上还是没有得到证实。

在肌肉修复功能
当肌肉细胞进行损伤,静止卫星细胞从基底膜下方的释放。

他们被激活,并重新进入细胞周期。

这些分裂的细胞被称为“过境放大池”前接受生肌分化,形成新的肌管(有丝分裂后)。

也有证据表明这些细胞能够与现有的肌纤维融合,促进生长和修复。

肌肉再生的过程,涉及相当大的重塑细胞外基质,并发生了广泛的破坏,是不完整的的。

肌肉存款瘢痕组织成纤维细胞内,这可能削弱肌肉的功能,是一个的重要组成部分肌营养不良症的病理。

卫星细胞增殖肌肉损伤(西尔,等,2003),并形成新的肌纤维,通过对胎儿肌肉的发育(帕克等人,2003年)的过程类似。

经过多次细胞分裂,卫星细胞开始与周边核保险丝损坏的肌管,并进行进一步的分化和成熟,作为标志(帕克等,2003)。

IGF - 1所描述的第一个角色之一是其在卫星细胞的增殖和分化的参与。

此外,骨骼肌中IGF - 1的表达能力扩展激活卫星细胞的增殖(Charkravarthy,等,2000),增加和延长beneficaleffects老化的肌肉。

评述:Mourkioti和Rosenthal(2005),免疫学的发展趋势,第26卷,第1
号霍克和加里(2001),应用生理学杂志,19卷,第534-551
可塑性和治疗中的应用卫星细胞在体外或体内最小的刺激后,将经历一个生肌分化。

不幸的是,似乎移植卫星细胞具有迁移的能力有限,并且只能够再生肌肉地区的交货地点。

由于这种系统性的治疗,甚至以这种方式处理整个肌肉是不可能的。

然而,如身体的其他细胞周细胞和造血干细胞都被证明能够以类似的方式,有助于肌肉修复的内源性卫星细胞。

使用这些类型的细胞,用于治疗肌肉疾病的好处是,他们可以系统的交付,自主迁移到损伤的部位。

特别成功最近已经交付mesoangioblast进入细胞金毛寻回犬型杜氏肌营养不良症,从而有效地治愈疾病[2] 。

然而,所使用的样本规模相对较小,而且研究已被批评为缺乏适当的控制免疫抑制药物的使用。

规例鲜为人知的是,卫星细胞的调控。

虽然一起PAX3和PAX7目前形成了明确的卫星标记,大同基因转录激活是出了名的穷。

激活和quiesence通过诱导成肌调节因子,生肌方案,动态 Myf5 ,MyoD的,肌细胞生成素,和 MRF4仍
有待确定。

有一些研究表明,卫星细胞的肌肉生长抑制素是一种蛋白质称为负调控。

myostatin的水平提高,规范一个周期蛋白依赖性激酶抑制剂,称为P21,从而诱发卫星细胞的分化。

[ 3]。

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