大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及分子分型

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耐碳青霉烯类抗菌药物大肠埃希菌耐药机制的研究

耐碳青霉烯类抗菌药物大肠埃希菌耐药机制的研究闫文娟;李轶;王山梅;孙明洁【摘要】Objective To investigate the drug resistance characteristics and mechanism of carbapenem-resistant Escherichia coli in Henan Provincial People's Hospital. Methods The identification and antimicrobial susceptibility in vitro of the isolates from qualified clinical specimens were analyzed by BD Phoenix 100 microorganism analysis system. The isolates of carbapenem-resistant Escherichia coli were screened according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) standard. Modified Hodges test and meropenem(MEM)-ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)-Na2 double-disk synergy test were used for phenotypic screening of the isolates. By polymerase chain reaction(PCR),the resistance genes,blaKPC,blaNDM,blaVIM,blaIMP and blaOXA-48,in the isolates were detected. The transferability of blaKPC in the blaKPC-positive isolates was studied by conjugation test. Results A total of 8 carbapenem-resistant Escherichia coli were screened from the 1 238 isolates. In the 8 isolates,7 isolates were resistant to imipenem (IPM)and MEM,but 1 isolate was only resistant to MEM. All the 8 isolates were positive in the modified Hodges test, and 6 isolates were positive in the MEM-EDTA double-disk synergy test. There were 2 isolates carrying blaKPC-2 and 3 isolates carrying blaIMP-4. Conjugation test indicated that blaKPC-2 could be transferred to Escherichia coli. Conclusions Carbapenem-resistant Escherichia coli carrying blaIMP-4 is firstly reported in the hospital. The resistancemechanism of carbapenem-resistant Escherichia coli in the hospital is mainly carrying blaKPC-2 and blaIMP-4,and the blaKPC-2 gene could be horizontally transmitted by plasmid.%目的：了解河南省人民医院耐碳青霉烯类抗菌药物大肠埃希菌的耐药特点和耐药机制。

碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌耐药性及耐药基因分析

㊃论著㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2023.18.009碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌耐药性及耐药基因分析*侯素君1,尹盟盟1,王均梅1,别海文1,梁永娟1,朱元祺21.山东省日照市中医医院检验科,山东日照276800;2.青岛大学附属医院检验科,山东青岛266003摘要:目的探讨医院碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(C R E )的临床耐药性及耐药表型和基因型,为医院C R E 菌株感染的临床治疗及医院感染暴发的预防和控制提供科学依据㊂方法收集2020年7月至2023年1月日照市中医医院临床患者标本中分离的77株C R E 菌株,采用全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和药敏试验,采用改良碳青霉烯酶灭活试验(m C I M )和乙二胺四乙酸(E D T A )改良碳青霉烯酶灭活试验(e C I M )联合检测碳青霉烯酶表型,采用聚合酶链反应(P C R )扩增耐药基因并进行测序分型㊂结果 77株C R E 菌株主要分离自痰液,其次是尿液㊁胸腔积液;科室来源主要是颅脑外科㊁重症医学科㊁脑卒中监护室㊂C R E 菌株中肺炎克雷伯菌33株,大肠埃希菌15株,阴沟肠杆菌12株,其他细菌17株㊂C R E 菌株对替加环素敏感性为97.4%,阿米卡星为44.2%,复方磺胺甲噁唑为39.0%,对其他抗菌药物的敏感性均低于20.0%㊂m C I M 筛选碳青霉烯酶菌株的灵敏度为95.9%,特异度为100.0%㊂P C R 扩增结果显示49株C R E 菌株携带N D M 基因,24株C R E 菌株携带K P C 基因,1株C R E 菌株携带I M P 基因,3株未检出碳青霉烯酶基因;基因测序比对确定耐药基因亚型分别为b l a K P C -2㊁b l a N D M -1㊁b l a I M P -4㊂结论 C R E 菌株以肺炎克雷伯菌㊁大肠埃希菌㊁阴沟肠杆菌为主,具有较强的耐药性,肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药基因主要为b l a K P C -2㊁大肠埃希菌耐药基因主要为b l a N D M -1,阴沟肠杆菌耐药基因主要为b l a N D M -1,临床需加强C R E 菌株检测,根据药敏试验结果合理选用抗菌药物,防范其在医院内暴发流行㊂关键词:碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌; 细菌耐药性; 耐药基因中图法分类号:R 446.5文献标志码:A 文章编号:1672-9455(2023)18-2667-05A n a l y s i s o n d r u g r e s i s t a n c e a n d d r u g r e s i s t a n c e g e n e s o f c a r b a pe n e m -r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a e b a c t e r i a*H O U S u j u n 1,Y I N M e n g m e n g 1,WA N G J u n m e i 1,B I E H a i w e n 1,L I A N G Y o n g j u a n 1,Z HU Y u a n qi 21.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,R i z h a o M u n i c i p a l H o s p i t a l o f Tr a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e ,R i z h a o ,S h a n d o n g 276800,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Q i n g d a o U n i v e r s i t y ,Q i n g d a o ,S h a n d o n g 266003,C h i n a A b s t r a c t :O b je c t i v e T o e x p l o r e t h e c l i n i c a l d r u g r e s i s t a n c e ,d r u g r e s i s t a n c e p h e n o t y p e s a n d g e n o t y p e s of c a r b a p e n e m -r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a e (C R E )b a c t e r i a i n t h e h o s p i t a l s o a s t o p r o v i d e a s c i e n t i f i c b a s i s f o r t h e c l i n i c a l t r e a t m e n t o f C R E b a c t e r i a l s t r a i n s i n f e c t i o n a n d t h e p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l o f t h e C R E b a c t e r i a l s t r a i n s i n f e c t i o n o u t b r e a k s .M e t h o d s S e v e n t y -s e v e n C R E s t r a i n s i s o l a t e d f r o m t h e c l i n i c a l p a t i e n t s s a m pl e s i n R i z h a o M u n i c i p a l H o s p i t a l o f T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e f r o m J u l y 2020t o J a n u a r y 2023w e r e c o l l e c t e d ,t h e b a c t e r i a l i d e n t i f i c a t i o n a n d d r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t s w e r e c o n d u c t e d b y t h e f u l l a u t o m a t i c m i c r o b i o l o gi c a l a n a -l y z e r ,a n d t h e c a r b a p e n a s e p h e n o t y p e w a s d e t e c t e d b y t h e m o d i f i e d c a r b a p e n e n a s e i n a c t i v a t i o n m e t h o d (m C I M )a n d E D T A m o d i f i e d c a r b a p e n e n a s e i n a c t i v a t i o n m e t h o d (e C I M ).T h e d r u g -r e s i s t a n c e g e n e s w e r e a m -p l i f i e d b y p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n (P C R )a n d t h e s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d .R e s u l t s S e v e n t y-s e v e n C R E s t r a i n s w e r e m a i n l y i s o l a t e d f r o m t h e s p u t u m s p e c i m e n ,f o l l o w e d b y t h e u r i n e a n d p l e u r a l e f f u s i o n .T h e d e -p a r t m e n t s w e r e m a i n l y t h e c r a n i o c e r e b r a l s u r g e r y,i n t e n s i v e c a r e m e d i c i n e a n d s t r o k e i n t e n s i v e c a r e u n i t .A -m o n g th e C R E s t r a i n s ,t h e r e w e r e 33s t r a i n s o f K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ,15s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i ,12s t r a i n s o f E n t e r o b a c t e r c l o a c a e a n d 17s t r a i n s o f o t h e r b a c t e r i a .T h e s e n s i t i v i t y o f t h e C R E s t r a i n s t o t i g a c y c l i n e w a s 97.4%,w h i c h t o a m i k a c i n w a s 44.2%,w h i c h t o c o t r i m o x a z o l e w a s 39.0%,a n d w h i c h t o o t h e r a n t i b a c t e r i a l d r u g s w a s l o w e r t h a n 20.0%.T h e s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y o f m C T M f o r s c r e e n i n g c a r b a p e n a s e s t r a i n w e r e 95.9%a n d 100.0%,r e s p e c t i v e l y .T h e P C R a m pl i f i c a t i o n r e s u l t s s h o w e d t h a t 49s t r a i n s o f C R E b a c t e r i a c a r -r i e d t h e N D M g e n e ,24s t r a i n s o f C R E b a c t e r i a c a r r i e d K P C g e n e ,1s t r a i n o f C R E b a c t e r i u m c a r r i e d I M P g e n e,㊃7662㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n ,S e pt e m b e r 2023,V o l .20,N o .18*基金项目:青岛大学附属医院临床医学+X 科研项目(2019-3399);山东省日照市中医医院2021年度院级科研立项项目(R Z Z Y 2021L C -09)㊂作者简介:侯素君,女,副主任技师,主要从事临床病原微生物耐药监测及耐药机制方面的研究㊂Copyright ©博看网. All Rights Reserved.a n d3s t r a i n s d i d n o t d e t e c t c a rb a p e n e n a s e g e n e.T h e g e n e s e q u e nc i n g c o m p a r i s o nde t e r m i n e d t h a t t h e s u b t y p e s of d r ug r e s i s t a n c e g e n e w e r e b l a K P C-2,b l a N D M-1a n d b l a I M P-4.C o n c l u s i o n Th e C R E s t r ai n s a r e m a i n l y K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e,E s c h e r i c h i a c o l i a n d E n t e r o b a c t e r c l o a c a e w i t h s t r o n g d r u g r e s i s t a n c e.T h e c a r b a p e n e m r e s i s t a n t g e n e o f K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e i s i s m a i n l y b l a K P C-2,w h i c h o f E s c h e r i c h i a c o l i i s m a i n l y b l a N D M-1,a n d w h i c h o f E n t e r o b a c t e r c l o a c a e i s m a i n l y b l a N D M-1.C l i n i c s h o u l d s t r e n g t h e n t h e C R E s t r a i n s m o n i t o r i n g.T h e a n t i b a c t e r i a l d r u g s s h o u l d b e r e a s o n a b l y s e l e c t e d a c c o r d i n g t o t h e d r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t r e s u l t s t o p r e v e n t i t s o u t b r e a k s a n d e p i d e m i c i n t h e h o s p i t a l.K e y w o r d s:c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a e;b a c t e r i a l r e s i s t a n c e;d r u g r e s i s t a n c e g e n e当前,细菌耐药已成为全球公共健康领域的重大挑战,其中尤以碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(C R E)引起的感染形势最为严峻,碳青霉烯类抗菌药物包括亚胺培南㊁美洛培南和厄他培南等,是治疗多重耐药革兰阴性杆菌所致感染最有效的抗菌药物之一㊂随着该类药物在临床的广泛应用,肠杆菌目细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率呈逐年快速上升趋势[1]㊂耐药细菌感染致住院时间延长㊁费用增加㊁病死率增高,在社区或医院中可引起散发,交叉传播,甚至导致暴发流行,对婴幼儿㊁老年人和免疫缺陷者的威胁巨大㊂因此,探讨医院C R E菌株的耐药表型和基因型,可以为医院C R E菌株感染的临床治疗和医院感染暴发的防控提供科学依据㊂1材料与方法1.1菌株来源收集2020年7月至2023年1月日照市中医医院临床患者标本中分离的77株C R E菌株,剔除同一患者同一部位重复分离的菌株㊂1.2质控菌株大肠埃希菌A T C C25922㊁肺炎克雷伯菌A T C C700603㊁大肠埃希菌A T C C700323㊁大肠埃希菌A T C C35218㊁肺炎克雷伯菌A T C C B A A1705㊁肺炎克雷伯菌A T C C B A A2146均由省临床检验中心提供㊂1.3仪器与试剂 V I T E K2C o m p a c t全自动细菌鉴定及药敏分析仪(法国生物梅里埃公司)㊁L a b n e t C1301-230E U型手掌形离心机(美国L a b n e t公司)㊁B i o-R a d M y C y c i e r型P C R扩增仪(美国B i o-R a d公司)㊁E p p e n d o r f5415R型台式高速离心机(德国E p-p e n d o r f公司)㊁北京六一D Y C P-31D N型琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一生物科技有限公司)㊁B i o-R a d凝胶成像仪(美国B i o-R a d公司)㊁B i o-R a d电泳槽(美国B i o-R a d公司),2ˑA c c u r a t e T a q预混液(湖南艾科瑞生物工程有限公司),D L2000D N A M a r k e r(日本T a K a R a公司),琼脂糖(日本T a K a R a公司),4S G e l-r e d核酸染料(香港B B I L i f e S c i e n c e C o r p o r a t i o n), W i z a r d G e n o m i c D N A P u r i f i c a t i o n K i t(美国P r o-m e g a公司),胰蛋白胨大豆肉汤培养基(T S B,杭州滨和微生物试剂公司),E t e s t条(温州市康泰生物科技有限公司),头孢哌酮/舒巴坦㊁替加环素药敏纸片均为英国O x i d公司产品㊂1.4方法1.4.1菌株鉴定及药敏试验菌株分离与培养严格按照‘全国临床检验操作规程“(第4版)[2]进行,使用V I T E K2C o m p a c t全自动微生物分析仪进行菌株鉴定及药敏试验㊂药敏试验结果判断根据美国临床和实验室标准协会(C L S I)最新版标准判断,收集临床标本中分离的肠杆菌目细菌药敏试验报告中亚胺培南㊁美洛培南最小抑菌浓度(M I C)ȡ4μg/m L或厄他培南ȡ2μg/m L(已用E t e s t条复核)的菌株[3]㊂1.4.2碳青霉烯酶表型确证试验改良碳青霉烯酶灭活试验(m C I M)操作步骤:参照C L S I2020年版M100操作标准,用1μL接种环挑一满环菌落,加入2 m L T S B肉汤中乳化,振荡10~15s,每管放入1张含10μg美洛培南的无菌纸片,确认纸片浸没于菌悬液中,35ħ孵育4h,将美洛培南纸片贴于已涂布大肠埃希菌A T C C25922悬液的MH平板,35ħ孵育18~ 24h,量取抑菌圈直径㊂乙二胺四乙酸(E D T A)改良碳青霉烯酶灭活试验(e C I M)操作步骤:另取一支试管,加入2m L T S B肉汤,再加入20μL0.5m o l/L E D T A溶液混匀,E D T A浓度最终为5mm o l/L㊂其余步骤同m C I M㊂m C I M判断标准:美洛培南抑菌圈直径为6~15mm或直径16~18mm但抑菌圈内有散在菌落时,为碳青霉烯酶阳性;抑菌圈直径ȡ19 mm,为碳青霉烯酶阴性;抑菌圈直径为16~18mm 或直径为19mm但抑菌圈内有散在菌落,则无法判断是否存在碳青霉烯酶,为碳青霉烯酶不确定[4]㊂e C I M判断标准:e C I M与m C I M结果比较,美洛培南抑菌圈直径相差ȡ5mm为金属β-内酰胺酶阳性,美洛培南抑菌圈直径相差ɤ4mm为金属β-内酰胺酶阴性,待测菌株产丝氨酸蛋白酶㊂1.4.3基因检测煮沸裂解法提取D N A模板,采用P C R扩增碳青霉烯酶耐药基因,扩增条件为94ħ预变性5m i n;94ħ变性30s,52ħ退火40s,72ħ延伸50s,共35个循环;72ħ再延伸10m i n㊂扩增后产物取10μL通过1.5%琼脂凝胶电泳30m i n,最终在凝胶成像仪上观察结果㊂引物信息见表1,引物序列查阅文献[5]获得,由上海生工生物工程有限公司合成引物,并进行相应的测序分析,与目的基因㊁阳性对照条带位置的扩增产物送上海生工生物工程有限公司完成测序,基因序列在h t t p://b l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/b l a s t.c g i进行比对,确定耐药基因亚型㊂1.5统计学处理采用全国细菌耐药监测网提供的W h o n e t5.6软件收集药敏试验结果,使用S P S S21.0统计软件进行分析,计数资料以例数或百分比表示,比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义㊂㊃8662㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n,S e p t e m b e r2023,V o l.20,N o.18Copyright©博看网. All Rights Reserved.表1 P C R 扩增碳青霉烯类耐药基因引物引物引物序列(5'-3')目的基因产物长度(b p )N D M -F G G T T T G G C G A T C T G G T T T T Cb l a N D M 621N D M -RC G G A A T G G C T C A T C A C G A T C I M P -FG G A A T A G A G T G G C T T A A Y T C T C b l a I M P 232I M P -RG G T T T A A Y A A A A C A A C C A C C K P C -F m C G T C T A G T T C T G C T G T C T T Gb l a K P C 798K P C -R m C T T G T C A T C C T T G T T A G G C G V I M -FG A T G G T G T T T G G T C G C A T A b l a V I M 390V I M -RC G A A T G C G C A G C A C C A G O X A -48-FG C G T G G T T A A G G A T G A A C A C b l a O X A -48438O X A -48-RC A T C A A G T T C A A C C C A A C C G2 结果2.1 C R E 菌株的种类与临床分布 77株C R E 临床分离株中,肺炎克雷伯菌33株(42.9%)㊁大肠埃希菌15株(19.5%)㊁阴沟肠杆菌12株(15.6%)㊁弗劳地枸橼酸杆菌7株(9.1%)㊁雷氏普罗威登斯菌3株(3.9%)㊁产气肠杆菌3株(3.9%)㊁奇异变形杆菌2株(2.6%)㊁产酸克雷伯菌2株(2.6%)㊂77株C R E 菌株来源标本以痰液和尿液为主,其中分离自痰液33株(42.86%)㊁尿液30株(38.96%)㊁胸腔积液6株(7.79%)㊁穿刺液5株(6.49%)㊁脑脊液2株(2.60%)㊂77株C R E 菌株的科室分布:颅脑外科23株,重症医学科10株,脑卒中监护室9株,急诊科6株,泌尿外科6株,肺病科5株,肝胆胰脾科3株,胸外科3株,脑病科2株,心血管内科2株,骨六科2株,康复科2株,髋膝骨科1株,风湿肾病科1株,妇科1株,肿瘤科1株㊂2.2 C R E 菌株药敏试验结果 77株C R E 菌株中超广谱β-内酰胺酶(E S B L s )的检出率为100.0%,对替加环素敏感性最高(97.4%),其次为阿米卡星(44.2%)㊁复方磺胺甲噁唑(39.0%),对其余抗菌药物的敏感性均低于20.0%㊂大肠埃希菌对阿米卡星的敏感性为80.0%,肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌对阿米卡星的敏感性分别为48.5%和50.0%㊂见表2㊂表2 C R E 菌株对常用抗菌药物的药敏试验结果(%)抗菌药物总计(n =77)耐药敏感肺炎克雷伯菌(n =33)耐药敏感大肠埃希菌(n =15)耐药敏感阴沟肠杆菌(n =12)耐药敏感阿米卡星55.844.251.548.520.080.050.050.0头孢唑啉100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0头孢吡肟89.610.487.912.180.020.091.78.3头孢替坦94.85.290.99.193.30.7100.00.0头孢呋辛100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0妥布霉素83.116.969.730.386.713.391.78.3庆大霉素79.219.963.636.480.020.091.78.3亚胺培南100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0氨曲南80.519.597.03.020.080.083.316.7美洛培南100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0呋喃妥因98.81.293.96.154.446.6100.00.0头孢曲松100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0头孢他啶100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0环丙沙星98.71.3100.00.093.30.7100.00.0左氧氟沙星89.610.484.815.286.713.391.78.3复方磺胺甲噁唑61.039.036.463.680.020.050.050.0氨苄西林100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0替加环素2.697.40.0100.00.0100.00.0100.0头孢哌酮/舒巴坦96.13.993.96.193.30.7100.00.0哌拉西林钠/他唑巴坦100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0阿莫西林/克拉维酸100.00.0100.00.0100.00.0100.00.02.3 耐药基因扩增结果 77株C R E 菌株中74株产碳青霉烯酶,3株未检出㊂其中,33株肺炎克雷伯菌中20株携带K P C 基因,12株携带N D M 基因,1株未检出碳青霉烯酶,主要产K P C (60.6%);15株大肠埃希菌中12株携带N D M 基因,3株携带K P C 基因,主要产N D M (80.0%);12株阴沟肠杆菌携带N D M 基因(100.0%);7株耐弗劳地枸橼酸杆菌携带N D M 基因(100.0%);3株雷氏普罗威登斯菌中2株携带N D M 基因,1株未检出碳青霉烯酶;3株产气肠杆菌中1株携带N D M 基因,1株携带K P C 基因,1株未检出碳青霉烯酶;2株产酸克雷伯菌中1株携带N D M基因,1株携带I M P 基因;2株奇异变形杆菌携带N D M 基因㊂碳青霉烯酶基因型中N D M 占66.2%(49/74),K P C 占32.4%(24/74),I M P 占1.4%(1/74)㊂琼脂电泳图见图1~3㊂2.4 碳青霉烯酶表型试验结果 74株携带碳青霉烯酶基因的C R E 菌株,其中71株m C I M 试验阳性,3株m C I M 试验均阴性,m C I M 筛选碳青霉烯酶菌株的灵敏度为95.9%,特异度为100.0%㊂m C I M 阳性菌株中,肺炎克雷伯菌32株,大肠埃希菌15株,阴沟肠㊃9662㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n ,S e pt e m b e r 2023,V o l .20,N o .18Copyright ©博看网. All Rights Reserved.杆菌12株,弗劳地枸橼酸杆菌7株,奇异变形杆菌2株,产气肠杆菌1株,产酸克雷伯菌1株,雷氏普罗威登斯菌1株㊂m C I M 结合e C I M 试验初步判断产金属β-内酰胺酶51株(m C I M 阳性,e C I M 阳性),产丝氨酸蛋白酶20株(m C I M 阳性,e C I M 阴性)㊂注:M 为D L 2000D N A 标志物;1为b l a N D M 阳性对照;2为b l a N D M阴性对照;3~16为临床菌株b l a N D M阳性㊂图1 P C R 扩增菌株b l a N D M基因的电泳图注:M 为D L 2000D N A 标志物;1为b l a K P C 阳性对照;2为b l a K P C阴性对照;3~17为临床菌株b l a K P C阳性㊂图2 P C R 扩增菌株b l a K P C基因的电泳图注:M 为D L 2000D N A 标志物;1为b l a I M P 阴性对照;2为b l a I M P阳性对照;4为临床菌株b l a I M P 阳性;3㊁5~12为临床菌株b l a I M P阴性㊂图3 P C R 扩增菌株b l a I M P 基因的电泳图2.5 基因测序耐药基因扩增结果将与目的基因㊁阳性对照条带位置的扩增产物送上海生工生物工程有限公司完成测序,基因序列在h t t p://b l a s t .n c b i .n l m.n i h .g o v /b l a s t .c gi 进行比对,确定耐药基因型为b l a K P C -2㊁b l a N D M -1㊁b l a I M P -4㊂3 讨论C R E 是当前最受关注的耐药威胁之一,我国C R E 的流行情况也比较严重㊂中国C H I N E T 细菌耐药性监测数据表明,2005年碳青霉烯类抗菌药物对肠杆菌目细菌保持着较高的抗菌活性,耐药率低于2%;到2010年,耐药率明显上升,达到5%;肺炎克雷伯菌的耐药率已高达10%[6]㊂2018年肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率全国平均为10.1%[7],2021年肺炎克雷伯菌耐药率上升到23.1%[8],肠杆菌目细菌对碳青霉烯类抗菌药物最常见的耐药机制为产碳青霉烯酶[9]㊂因此,快速㊁准确地检测本院耐药菌是否产碳青霉烯酶,了解C R E 菌株基因分型对于临床治疗和医院感染控制至关重要㊂本研究77株C R E 菌株中,肺炎克雷伯菌占42.9%,大肠埃希菌占19.5%,阴沟肠杆菌占15.6%,其他肠杆菌目细菌占22.0%,与陆书华等[10]㊁崔超琼等[11]的研究结果接近;主要碳青霉烯酶基因型中N D M 占66.2%(49/74),K P C 占32.4%(24/74),I M P 占1.4%(1/74)㊂C R E 菌株主要分离自痰液㊁尿液㊁胸腔积液,也可分离自脑脊液㊁血液㊁穿刺液等,说明耐药株引起的感染并不仅限于呼吸㊁泌尿系统,还可能引起颅内㊁血流㊁胸腔等多部位感染,其感染的广泛性应引起临床重视㊂C R E 菌株科室分布主要是颅脑外科㊁重症医学科㊁脑卒中监护室,这与重症监护室患者病因的复杂性㊁病情危重㊁免疫力低下㊁糖皮质激素和高效广谱抗菌药物长期应用,以及侵入性操作治疗较多有关㊂本研究药敏试验结果显示,77株C R E 菌株对青霉素类㊁头孢菌素类㊁头霉素类耐药率均为90%以上,与王珍珍等[12]研究结果一致,临床应慎重经验用药,对替加环素㊁阿米卡星㊁复方磺胺甲噁唑耐药率分别为2.6%㊁55.8%㊁61.0%[13],临床可选择这些药物治疗感染者㊂按照A m b l e r 分子分类方法可将碳青霉烯酶分为3类:(1)A 类丝氨酸碳青霉烯酶,以K P C 为主,该酶活性可被阿维巴坦抑制,产酶菌株通常仅对替加环素㊁多黏菌素或头孢他啶/阿维巴坦敏感;(2)B 类金属β-内酰胺酶,以N D M 型金属酶为主,该酶活性不能被阿维巴坦抑制,产酶菌株通常仅对替加环素㊁多黏菌素敏感,少数菌株对氨曲南敏感;(3)D 类丝氨酸碳青霉烯酶,以O X A -48为主,常见于儿童患者分离的肺炎克雷伯菌,该酶活性可被阿维巴坦抑制,产酶菌株通常仅对替加环素㊁多黏菌素或头孢他啶/阿维巴坦敏感㊂C R E 感染的治疗具有挑战性,应根据药敏试验结果㊁耐药表型或基因分型㊁感染的严重程度,选择有效的治疗方案㊂本研究利用C L S I 推荐的m C I M 和e C I M 试验联合检测碳青霉烯酶表型,m C I M 筛选碳青霉烯酶菌株的灵敏度为95.9%,特异度为100.0%[1],与之符合,结合e C I M 试验初步判断产金属β-内酰胺酶51株,产丝氨酸蛋白酶20株㊂m C I M 试验操作简单,成本低,不需要特殊试剂,灵敏度和特异度高,适合所有微生物室开展㊂m C I M 与e C I M 联合检测筛选碳青霉烯酶表型,对临床选择用药具有重要意义㊂P C R 扩增结果显示,77株C R E 菌株中74株产㊃0762㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n ,S e pt e m b e r 2023,V o l .20,N o .18Copyright ©博看网. All Rights Reserved.碳青霉烯酶,3株未检出,而E S B L s的检出率为100.0%,可能为高产头孢菌素酶(A m p C)或高产E S-B L s合并外膜孔蛋白缺失或变异以及细菌外排泵系统改变所致[14]㊂目前常见的碳青霉烯酶为K P C㊁V I M㊁N D M㊁I M P和O X A,国内以K P C㊁N D M和I M P为主[15]㊂本研究77株菌株主要流行的碳青霉烯酶基因型依次为N D M(66.2%)㊁K P C(32.4%)和I M P(1.4%),以N D M和K P C为主[16]㊂河南部分地区和海南省5家综合医院收集的C R E菌株中,主要的耐药基因型也是N D M[17-18],本研究耐药基因K P C 的检出率低于N D M,77株C R E菌株中,仅有1株耐碳青霉烯产酸克雷伯菌检出I M P基因㊂97.0% (32/33)的肺炎克雷伯菌㊁100.0%(15/15)的大肠埃希菌,100.0%(12/12)的阴沟肠杆菌携带碳青霉烯酶基因㊂碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌主要携带K P C-2基因[19],碳青霉烯类耐药大肠埃希菌和阴沟肠杆菌主要携带N D M-1基因,与陆书华等[10]报道一致㊂K P C和N D M耐药基因均可由质粒介导,通过菌株自身克隆以及不同菌种间水平转移,是C R E流行激增的主要原因㊂K P C-2和N D M-1可水解绝大多数β-内酰胺药物,包括碳青霉烯类,不同之处在于K P C-2为丝氨酸蛋白酶,水解氨曲南,能被新型酶抑制剂阿维巴坦所抑制,而N D M-1为金属酶,不水解氨曲南,不被阿维巴坦㊁韦博巴坦等抑制㊂总之,C R E呈现广泛耐药甚至全耐药的特征,使临床抗感染治疗面临无药可用的困境,导致感染患者病死率高㊂实验室应快速鉴别产碳青霉烯酶菌株,选择早期快速筛查的方法,加快开展联合药敏试验,有效降低C R E感染患者的病死率[20]㊂临床医生应掌握医院C R E临床分布特征及耐药基因㊁细菌耐药情况,根据药敏试验结果合理选用抗菌药物;院感防控部门需加强监督检查,共同遏制C R E菌株在不同患者和不同区域间流行播散,降低医院C R E感染发生率㊂参考文献[1]喻华,徐雪松,李敏,等.肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识[J].中国感染与化疗杂志,2020,20(6):671-680.[2]尚红,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].4版.北京:人民卫生出版社,2015:560-851.[3]C e n t e r s f o r D i s c a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n(C D C).F a c i l i-t y g u i d a n c e f o r c o n t r o l o f c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t E n t e r o b a c-t e r i a c e a e(C R E)[E B/O L].[2023-04-15].h t t p s://w w w.c d c.g o v/h a i/p d f s/c r e/c r e-g u i d a n c e-508.p d f.[4]C l i n i c a l a n d L a b o r a t o r y S t a n d a r d s I n s t i t u t e.P e r f o r m a n c es t a n d a r d s f o r a n t i m i c r p b i a l s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g:M100-S30[S].W a y n e,P A,U S A:C L S I,2020.[5]P O I R E L L,WA L S H T R,C U V I L L I E R V,e t a l.M u l t i-p l e x P C R f o r d e t e c t i o n o f a c q u i r e d c a r b a p e n e m a s e g e n e s [J].D i a g n M i c r o b i o l I n f e c t D i s,2011,70(1):119-123.[6]周宏伟,胡燕燕,张嵘.碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的检测方法[J].检验医学,2020,10(35):971-973. [7]国家卫生计生委合理用药专家委员会,全国细菌耐药监测网.2018年全国细菌耐药监测报告[J].中国合理用药探索,2020,17(1):1-10.[8]胡付品,郭燕,朱德妹,等.2021年C H I N E T中国细菌耐药监测[J].中国感染与化疗杂志,2022,22(5):521-530.[9]T Z O U V E L E K I S L,MA R K O G I A N N A K I S A,P S I C HO-G I O U M,e t a l.C a r b a p e n e m a s e s i n K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e a n d o t h e r E n t e r o b a c t e r i a c e a e:a n e v o l v i n g c r i s i s o f g l o b a ld i me n s i o n s[J].C l i n M i c r o b i o l R e v,2012,25(4):682-707.[10]陆书华,李晓哲,刘凌云,等.山东某院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌临床感染特征及耐药基因分析[J].检验医学, 2020,35(8):757-762.[11]崔超琼,周义正,李承彬,等.耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的耐药性和分子特征[J].检验医学与临床,2020,17(17): 2455-2459.[12]王珍珍,赵战勤,常永超,等.耐碳青霉烯革兰阴性杆菌耐药性及耐药基因b l a K P C的分子特征[J].中国感染控制杂志,2020,10(19):857-863.[13]杨玉琪,刘家云,徐修礼,等.某院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的临床分布特点及药物敏感性分析[J].检验医学与临床,2021,18(1):1-5.[14]刘家旭,汪志勇.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药机制及流行高危因素的研究进展[J].贵州医药,2020,44(4): 543-546.[15]孙艳.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药机制及实验室检测研究进展[J].国际检验医学杂志,2020,41(4):2011-2016.[16]王素梅,张键东,王宇凡,等.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因分型[J].中华医院感染学杂志,2019,29(17): 2566-2570.[17]L I U C,Q I N S,X U H,e t a l.N e w d e l h i m e t a l l o-β-l a c t a-m a s e1(N D M-1),t h e d o m i n a n t c a r b a p e n e m a s e d e t e c t e di n c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t e n t e r o b a c t e r c l o a c a e f r o m h e n a np r o v i n c e,C h i n a[J].P L o S O n e,2015,10(8):e0135044.[18]苏屿,李天娇,龙文芳,等.海南耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的耐药基因分析[J].中国抗菌药物杂志,2018,43(9): 96-100.[19]冯渐焘,陈爱文,李笃军,等.携带b l a K P C-3基因肺炎克雷伯菌新生儿分离株的研究[J].中国实验诊断学,2020, 24(9):1453-1457.[20]丁丽,陈佰义,李敏,等.碳青霉烯类耐药革兰阴性菌联合药敏试验及报告专家共识[J].中国感染与化疗杂志2023,23(1):80-90.(收稿日期:2023-05-23修回日期:2023-07-26)㊃1762㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n,S e p t e m b e r2023,V o l.20,N o.18Copyright©博看网. 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大肠埃希菌的临床分布及耐药性分析

大肠埃希菌的临床分布及耐药性分析摘要】目的：探讨大肠埃希菌的分布及耐药性特点，为临床抗菌药物的使用提供依据。

方法：收集我院2017年7月-2018年7月住院及门诊患者标本,培养分离出大肠埃希菌299株，并采用K-B纸片扩散法及法国梅里埃VITEK-2comPact全自动微生物分析仪进行鉴定与药物敏感试验，验证是否为产超广谱β-内酰胺酶菌株。

结果：对299株大肠埃希菌，不同来源标本来自不同病区以及产生了ELBLs的比值，药物敏感性分析均作了详细统计（见表1、2、3）。

结论：临床上亚胺培南和美罗培南可作为首选药物。

大肠埃希菌对多种常用抗生素呈现出较高的耐药性。

【关键词】大肠埃希菌临床分布耐药性 ELBLs【中图分类号】R978.1 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）11-0149-03大肠埃希菌（E.coli）是人类和大多数温血动物肠道中的正常菌群，当机体抵抗力下降时可成为条件致病菌，可引起患者腹泻、肺炎、尿路感染、血流感染等[1]。

近年来，由于抗菌药物的不合理使用，导致大量耐药菌株的出现，严重影响到抗菌药物的治疗效果。

熟悉其分布规律及抗菌药物的敏感性，有助于临床早期制定治疗方案。

1.资料与方法1.1 标本来源收集我院2017年7月-2018年7月门诊及住院患者（同一患者剔除重复标本）的各种临床标本，参照《全国临床检验操作规程》第4版对送检标本进行分离培养，选择经鉴定为大肠埃希菌的299份标本作为研究对象。

1.2 药敏纸片及培养基抗菌药物纸片购于赛默飞尔科技（中国）仪器有限公司，培养基采用M-H琼脂培养基购于江门市凯林贸易有限公司。

1.3 仪器与试剂采用法国生物梅里埃公司VITEK-2comPact检测系统，全自动药敏试验卡片VITEK AST-GN13为VITEK-2comPact检测系统配套产品(法国生物梅里埃公司)。

1.4 质控菌株大肠埃希菌ATCC25922，购于卫生部临床检验中心，对药敏试验每周进行一次质控。

esbls的耐药机制及抗菌药物应用原则

敏感率(%)
头孢他头孢噻头孢吡
啶
肟
肟
氨曲南阿莫西林/克拉维酸
哌拉西林/他唑巴坦
阿米卡碳青霉烯星
Mehrgan H et al. J Infect Dev Ctries 2010; 4(3):132-138.
对产 ESBL 大肠埃希菌的体外抗菌活性比
较
产ESBL 大肠埃希菌
MIC (mg/L)
30
31
β-内酰胺酶分类
一、当今对相关流行病学的认识
我国 G- 菌检出率呈逐年上升趋势
革兰阴性菌中肠杆菌科细菌 50%-60%
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
2010
2011
2012
非发酵菌肠杆菌科细菌
CHINET 2010-
产ESBL菌检出率(%)
头孢菌素、氟喹诺酮类 • 侵袭性泌尿道操作
ARCH INTERN MED/VOL 168 (NO. 17), SEP 22, 20
注重危险因素评估
医院获得性产ESBLs细菌感染危险因素
• 尿路/血管置管 • 使用抗菌药物 • 曾住院 • 2或3种抗菌药物联用 • 糖尿病 • 气管插管 • 肿瘤 • 肾功能衰竭 • 免疫缺陷 • 曾入住ICU
替加环素
2804
2 ≥64 ≤0.5 ≤8
1 0.5 0.12 ≤0.06 4
6
抗菌药物的PK/PD参数与给药方案优化
药物
给药方案三要素
人体
致病菌
药代学/药效学(PK/PD)
7
抗菌药物在体内起效的过程
剂量
药动学
• 溶解 • 吸收 • 分布 • 代谢 • 排泄

碳青霉烯类抗生素耐药状况及耐药机理分析1

碳青霉烯类抗生素耐药状况及耐药机理分析[摘要]目的: 探讨碳青霉烯类抗生素耐药状况及耐药机理。

方法: 利用excel表格对我院2010~2014年期间综合重症监护室中各种碳青霉烯类抗生素使用情况、用药密度、检测菌分离情况进行统计分析。

结果: 2010~2014年期间，我院综合重症监护室碳青霉烯类抗生素的用药密度分别为32.7、30.12、29.52、28.55、27.15，呈逐年下降趋势。

各年度检测率变化较小，鲍曼不动杆菌检出率呈逐年增加趋势。

非发酵革兰氏阴性菌（鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌）对碳青霉烯类抗生素的耐药率显著高于肠杆菌科细菌（大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌），耐药率随用药密度的减少变化不大。

结论: 碳青霉烯类抗生素的临床使用应慎重，注意用药的合理性。

[关键词]碳青霉烯类抗生素，耐药状况，耐药机理[Abstract] objective: to study the penicillium carbon alkene antibiotic drug resistance situation and mechanism of drug resistance. Methods: in our hospital from 2010 to 2014, using excel spreadsheet to integrated in the intensive care unit during various carbon penicillium alkene antibiotics usage, the density of medication, bacteria separation conditions were analyzed. Results: during 2010 ~ 2014, and our general intensive care unit carbon penicillium alkene antibiotic drug density were 32.7, 30.12, 29.52, 28.55, 29.52, declining trend year by year. The annual detection rate of change is small, acinetobacter baumannii incidence increased year by year. The fermentation of gram-negative bacteria (acinetobacter baumannii, pseudomonas aeruginosa) on carbon penicillium alkene antibiotic resistant rate was significantly higher than that of enterobacteriaceae bacteria (e. coli), sewer e. coli, klebsiella pneumoniae, with resistance reduction medicine density changed little. Conclusion: penicillium carbon alkene clinical use of antibiotics should be careful, pay attention to the rationality of drug use.[Key words] penicillium carbon alkene of antibiotics, drug resistance, resistance mechanism碳青霉烯类抗生素是自20世纪70年代开始研究的-内酰胺类抗生素，具有耐受性好、抗菌谱广、毒性低、抗菌活性强等优点，是目前临床上治疗重症细菌感染、肠杆菌科细菌感染、多重耐菌株感染的首选药物。

论大肠埃希菌对碳青霉烯类及喹诺酮类抗菌药物的耐药性

论大肠埃希菌对碳青霉烯类及喹诺酮类抗菌药物的耐药性作者：李国芳来源：《健康之友·下半月》2019年第09期【摘要】目的：对大肠杆菌对喹诺酮类抗菌药物和碳青霉烯类药物的耐药性进行论述，了解其耐药情况和分布情况，并分析危险因素。

方法：回顾分析2018年1月份到12月份收集的大肠埃希菌耐药率，并分析其潜在危险因素。

结果：一共检测出813株大肠埃希菌，主要来源是尿液标本和痰标本当中，各自占有的比例是37.8%，43.55%。

大肠埃希菌对喹诺酮类药物所产生的耐药率是63.6%%，而对碳青霉烯类药物产生的耐药率是2.2%，相比于国家所检测的大肠埃希菌耐药率53.4%，该差异具有统计做意义，P<0.05。

大肠埃希菌对左氧氟沙星和亚胺培养的耐药率和其使用强度没有相关性。

结论：需要对医院抗菌药物使用的进一步加强管理，对喹诺酮类药物和碳青霉烯类药物使用进行规范，避免出现这两类药物耐药的大肠埃希菌。

【关键词】大肠埃希菌;喹诺酮类抗菌药物;耐药性;用药强度【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】1002-8714（2019）09-00129-02现阶段，在临床方面，出现了逐渐增长的革兰阴性菌的检出量，越来越受到了医院的重视并且其逐渐成為主要的院内感染病原菌。

相关数据表明，在医院的临床样本当中革兰阴性菌具82.04%的检出率，大肠埃希菌具有逐渐上升的检出率。

在医院内，大肠埃希菌是很常见的感染病原菌，会造成很多部位发生感染，多耐药性患者很有可能出现脓毒血症和菌血症，对预后效果造成严重影响。

如果不合理使用抗菌药物，由于大肠埃希菌能够产生相应的酶，那么其对喹诺酮类药物和碳青霉烯类药物产生的耐药性就会逐渐增加。

相关标准和行动计划在这样的情况下得以颁布。

本实验研究三甲医院中大肠杆菌对喹诺酮类抗菌药物和碳青霉烯类药物的耐药性的情况分析，了解其耐药情况和分布情况，并且对抗菌药物耐药率和使用强度之间的关系进行分析，并分析危险因素，以此来为临床用药和合理用药提供参数。

耐碳青霉烯肺克雷伯菌和大肠埃希菌耐药机制研究

在其他耐药机制。
关键词：碳青霉烯酶；克雷伯菌，肺炎；大肠杆菌；抗药性，微生物ＤＯＩ：ｌＯ．３９６９／ｉ．ｉｓｓｎ．１６７３ — ４１３０．２Ｏ１４．０２．０１６文献标识码：Ａ文章编号：１６７３ — ４１３０（２０ｌ４）０２０ｌ６５０４
ห้องสมุดไป่ตู้
ＬｉａｎｇＱｕａｎｈｕｉ，ＸｕＹｕｎｊｉａｎ
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｉｒｔｏｙＭｅｄｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＣｌｉｎｉｃＣｏｌｌｅｇｅ，ＧｕａｎｇｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
酶肺炎克雷伯茵和大肠埃希茵对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类抗菌药物的耐药率高达８Ｏ以上，对亚胺培南、美罗培南、丁胺卡那霉素耐药率为３５以下；耐亚胺培南菌株对头孢哌酮／舒巴坦、头孢美唑、头孢替坦、头孢吡肟、哌拉西林／他唑巴坦、庆大霉
梁权辉，徐韫健
（１．广州医科大学第一临床学院检验系Ｏ９级，广东广州５１０１２０；２．广州医科大学附属第一医院检验科，广东广州５１０１２０）
摘要：目的分析该院－Ｉ盏床分离的可疑产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的耐药性与耐药机制。方法采用

碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌耐药基因分布和分子分型

是携带ＫＰＣ一２或者ＮＤＭ一１基因，菌株基因型多态性大，提示病例之间不存在关联性。
关键词：肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；耐药基因；分子分型
中图分类号：Ｒ３７８．９９文献标识码：Ａ文章编号：１００２ —２６９４（２０１６）１２ —１０３９ —０５
Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｙｐｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍ— ｒｅｓｉｓｔａｎｔＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ＹＡＮＧＭｅｎｇ，ＷＡＮＧ— Ｐｅｎｇ，ＸＵＸｉａｏ — ｑｉａｎ，ＸＩＯＮＧＣｈａｎｇ — ｈｕｉ，ＩＩＵＸｉａｏ — ｑｉｎｇ，ＹＵＡＮＨｕｉ。ＰＡＮＨｕａｎ — ｈｏｎｇ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＪｉａｎｇｘｉＰｒｏｖｉｎｃ分析显示有８种不同ＰＦＧＥ带型，５种ＭＩＳＴ型别（ＳＴ型）。５种ＳＴ型为ＳＴ１１、ＳＴ１５、ＳＴ３９５、ＳＴ１０３１、
ＳＴ１４１２，其中以ＳＴ１１为主。结论肺炎克雷伯菌耐药及多重耐药现象严重，肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类药物的主要的原因

产新德里金属β-内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型

㊀２０２１,３７(１)中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e sD O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０２０．００．１７９实验研究产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型傅芬蕊１,２,张㊀娅１,３,潘玉红１,４,曹颖平１,４,郑培烝１,４福建省自然科学基金(N o ．２０１６J ０１４６６)通讯作者:郑培烝,E m a i l :z h e n g p e i z h e n g ＠a l i y u n ．c o m ;O R C I D :００００Ｇ０００２Ｇ６３４２Ｇ０７４５作者单位:１．福建医科大学附属协和医院,福州㊀３５０００１;２．宁德市医院,宁德㊀３５２０００;３．九江学院附属医院,九江㊀３３２０００;４．福建医科大学医学技术与工程学院,福州㊀３５０００４摘㊀要:目的㊀研究某三甲医院临床分离的产新德里金属βＧ内酰胺酶(N D M )大肠埃希菌的耐药机制和分子流行病学特征.方法㊀在某三甲医院收集的耐碳青霉烯类大肠埃希菌中利用聚合酶链反应(P C R )筛查是否携带N DM 基因,通过测序确定N DM 型别并进一步检测其它碳青霉烯酶相关基因和广谱βＧ内酰胺酶类耐药基因.通过载体构建和表达研究N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６及N D M Ｇ９对亚胺培南的水解能力.采用多位点序列分型(M L S T )对产N D M 大肠埃希菌进行分子分型.结果㊀共筛选出８株携带N D M 大肠埃希菌,其中２株为N D M Ｇ９型,６株为N D M Ｇ６型.４株大肠埃希菌同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ１基因,１株同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ９基因.携带N DM Ｇ１㊁N DM Ｇ６与N DM Ｇ９重组菌对亚胺培南均耐药,最小抑菌浓度(M I C )分别为３２μg /m L ㊁１２８μg /m L 和６４μg /m L .产N D M 大肠埃希菌M L S T 分型结果为S T ２２６㊁S T ６４８和S T １２８４型各１株,S T １０１型５株,此５株均来源于神经内科.结论㊀首次发现同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ１基因和携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ９基因的大肠埃希菌,N D M Ｇ６㊁N D M Ｇ９对亚胺培南的耐药性比N D M Ｇ１强,应引起重视.M L S T 分型结果提示某三甲医院可能存在耐碳青霉烯类大肠埃希菌的院内局部传播.关键词:大肠埃希菌;耐药;新德里金属βＧ内酰胺酶;多位点序列分型中图分类号:R ３７８．２㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０２１)０１－００５３－０７C a r b a p e n e m Ｇr e s i s t a n c em e c h a n i s m s a n dm o l e c u l a r t y p i n g of E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i ng N e wD e lh im e t a l βＧl a c t a m a s e F U F e n Ｇr u i １,２,Z H A N G Y a １,３,P A N Y u Ｇh o n g １,４,C A O Y i n g Ｇp i n g １,４,Z H E N GP e i Ｇz h e n g１,４(１．F u j i a n M e d i c a lU n i v e r s i t y U n i o n H o s p i t a l ,F u z h o u ３５０００１,C h i n a ;２．N i n g d eM u n i c i p a lH o s p i t a l ,N i n gd e ３５２０００,C h i n a ;３．J i u j i a n g U n i v e r s i t y A f f i l i a t e d H o s p i t a l ,J i u j i a n g ３３２０００,C h i n a ;４．S c h o o l o f M e d i c a lT e c h n o l o g y a n dE n g i n e e r i n g ,F u j i a n M e d i c a lU n i v e r s i t y ,F u z h o u ３５０００４,C h i n a )A b s t r a c t :T h e a i m o f t h i ss t u d y w a s t o i n v e s t i g a t e t h er e s i s t a n c e m e c h a n i s m sa n d m o l e c u l a re p i d e m i o l o gi c a l f e a t u r e so f E s c h e r i c h i ac o l i s t r a i n s p r o d u c i n g N e wD e l h im e t a l βＧl a c t a m a s e (N D M )c o l l e c t e d i n a t h i r d c l a s sAh o s p i t a l ．N DM g e n e sw e r e s c r e e n e dw i t hP C R i n c a r b a p e n e m Ｇr e s i s t a n t E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s ．T y p e s o f N DM g e n e sw e r e i d e n t i f i e db y s e q u e n c i n g ．O t h e r c a r b a p e n e m Ｇr e s i s t a n c e r e l a t e d g e n e sa n de x t e n d e d Ｇs p e c t r u m ＧβＧl a c t a m a s e g e n e sw e r ed e t e c t e db y P C Rf o r N DM g e n e p o s i t i v e s t r a i n s ．A n e x p r e s s i o n s y s t e m w a s u s e d t o e v a l u a t e t h e i m i p e n e m Ｇh y d r o l y s i s a b i l i t y o fN D M Ｇ１,N D M Ｇ６a n dN D M Ｇ９．M o l e c u l a r t y p i n g o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i n g N D M w a s p e r f o r m e dw i t h t h em u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n g (M L S T )m e t h o d ．E i g h t s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i n g N D M w e r e i d e n t i f i e d ,a m o n g wh i c hs i xw e r eN D M Ｇ６s t r a i n s ,a n dt h er e m a i n d e rw e r eN D M Ｇ９s t r a i n s ．F o u r s t r a i n so f E s c h e r i c h i ac o l i w e r ef o u n dt os i m u l t a n e o u s l y c a r r y N DM Ｇ６,T E M a n d C T X ＧM Ｇ１g e n e s ,a n do n e s t r a i nw a s f o u n d t o s i m u l t a n e o u s l y c a r r y N DM Ｇ６,T E M a n d C T X ＧM Ｇ９g e n e s ．R e c o m b i n a n t E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s e x p r e s s i n gN DM Ｇ１,N DM Ｇ６a n d N DM Ｇ９g e n e sw e r e r e s i s t a n t t o i m i pe n e m ,w i t h m i n i m u mi n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n so f３２μg /m L ,１２８μg/m La n d６４μg /m L ,r e s p e c t i v e l y．M L S Tr e v e a l e d f o u r d i s t i n c t s e Ｇq u e n c e t y p e s (S T s ),a m o n g wh i c h f i v e s t r a i n s o f S T １０１w e r e c o l Ｇl e c t e d f r o mt h en e u r o l o g i c a l u n i t ,a n d t h e r e m a i n i n g t h r e e s t r a i n s w e r eS T ２２６,S T ６４８a n dS T １２８４,r e s p e c t i v e l y ．T h i s s t u d y r e po r t s t h e f i r s t i d e n t i f i c a t i o no f E s c h e r i c h i ac o l i s i m u l t a n e o u s l y c a r r y i n g N DM Ｇ６,T E M a n d C T X ＧM Ｇ１g e n e s ,o r N DM Ｇ６,T E M a n d ３５C T XＧMＧ９g e n e s．N o t a b l y,ND MＧ６w a s a s s o c i a t e dw i t h t h eh i g h e s t i m i p e n e mh y d r o l y s i s a b i l i t y,a n dw a s f o l l o w e db y N D MＧ９a n dN D MＧ１．T h eM L S Tr e s u l t s i n d i c a t e d t h a t an o s o c o m i a l i n f e c t i o no f c a r b a p e n e mＧr e s i s t a n tE s c h e r i c h i a c o l i o c c u r r e d l o c a l l y i na t h i r d c l a s sAh o s p i t a l．K e y w o r d s:E s c h e r i c h i a c o l i;r e s i s t a n c e;N e w D e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s e;m u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n gS u p p o r t e db y t h eN a t u r a l S c i e n c eF o u n d a t i o no fF u j i a nP r o v i n c e(N o．２０１６J０１４６６)C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:Z h e n g P e iＧz h e n g,E m a i l:z h e n g p e i z h e n g＠a l i y u n．c o m㊀㊀大肠埃希菌是引起人类各种感染如泌尿道㊁呼吸道㊁创面伤口的感染以及菌血症常见的病原体之一.近年来,由于抗菌药物使用不规范,大肠埃希菌对抗菌药物的耐药性明显增强,出现耐碳青霉烯类药物的大肠埃希菌.根据全国耐药性监测网２０１８年的数据,大肠埃希菌对碳青霉烯类药物全国平均耐药率为１．５％.碳青霉烯类药物是目前临床上控制革兰阴性菌感染最有效的抗生素之一,对大肠埃希菌具有强大抗菌活性,一旦出现耐药,将使得感染后的治疗变得十分困难.大肠埃希菌对碳青霉烯类药物最常见的耐药机制是产碳青霉烯酶[１].碳青霉烯酶是指所有能水解碳青霉烯类的βＧ内酰胺酶,依据A m b l e r分子分类将碳青霉烯酶分为A类碳青霉烯酶㊁B类金属βＧ内酰胺酶(M e t a l l oＧβＧl a c t a m a s e,M B L)和D类苯唑西林酶(O x a c i l l i n a s e,O X A).自２００９年在印度分离的大肠埃希菌中发现新德里金属βＧ内酰胺酶１(N e w D e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s eＧ１,N D MＧ１)以来,产N D M型酶的大肠埃希菌在世界范围内被广泛报道,而亚洲大陆被认为是主要的流行区域,特别是中国和印度[２],目前已发现２０多种型别的N D M.本文收集来自住院患者的耐碳青霉烯类药物大肠埃希菌８株,对其耐药机制和分子分型进行研究,结果报道如下.１㊀材料和方法１．１㊀菌株来源㊀从住院患者临床标本中分离的８株对亚胺培南耐药的大肠埃希菌.１．２㊀仪器与试剂㊀V I T E KＧ２c o m p a c t全自动微生物分析仪㊁革兰阴性细菌鉴定卡(G N)㊁药敏卡片(A S TＧG N１６)㊁亚胺培南E t e s t试纸条(法国生物梅里埃公司)㊁P C R扩增仪(美国A p p l i e dB i o s y s t e m s 公司)㊁凝胶成像分析系统(美国B I OＧR A D公司)㊁T a q D N A聚合酶(２．５U/μL)㊁d N T P(２．５mm o l/L)㊁D N A纯化回收试剂盒㊁质粒小提试剂盒及T O P１０感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)㊁p C R２．１载体(２５n g/μL)(美国I n v i t r o g e n生命技术公司)㊁MＧH琼脂(英国O x o i d公司)㊁引物的合成及P C R产物测序(上海博尚生物技术有限公司).１．３㊀方㊀法１．３．１㊀菌株鉴定与药敏㊀使用V I T E KＧ２c o m p a c t 全自动微生物分析仪进行菌株鉴定和药敏.采用亚胺培南E t e s t试纸条对亚胺培南耐药性进行验证.药敏结果根据２０１９年C L S I的抗菌药物敏感性试验标准进行判断.以大肠埃希菌A T C C２５９２２为质控菌株.１．３．２㊀碳青霉烯酶基因检测及测序㊀煮沸法提取细菌D N A模板,采用P C R法扩增常见的A类碳青霉烯酶基因(K P C㊁G E S㊁S M E㊁I M I/NM C)㊁B类金属酶基因(N DMＧl i k e㊁I MPＧl i k e㊁V I MＧl i k e㊁S I MＧ１㊁G I MＧ１和S P M)㊁D类苯唑西林酶基因(O X AＧ２３Ｇl i k e㊁O X AＧ２４Ｇl i k e㊁O X AＧ５８Ｇl i k e和O X AＧ１４３Ｇl i k e)和广谱βＧ内酰胺酶类耐药基因(S HV㊁T E M㊁C T XＧMＧ１群㊁C T XＧMＧ２群㊁C T XＧMＧ８群㊁C T XＧMＧ９群和C T XＧMＧ２５群).P C R的扩增体系均为２５μL:上下游引物各０．５μL(１０μmm o l/L),１μL模版D N A,２．５μL１０ˑT a q B u f fＧe r,２μLd N T P,０．５μLT a q聚合酶(２．５U/μL),用灭菌水补足至２５μL.反应参数为:９４ħ预变性５m i n;９４ħ３０s,５５ħ３０s,７２ħ１m i n,循环３０次;７２ħ延伸１０m i n.扩增产物用１％琼脂糖凝胶进行电泳,凝胶成像分析系统进行结果观察.电泳阳性产物送测序公司纯化并双向测序,所得测序结果使用B L A S T与G e n B a n k中的序列进行比对. N DMＧl i k e基因阳性的标本再用N DMＧf u l l引物扩增N DM型基因全长,经测序确定具体的N DM基因型别.引物名称㊁引物序列及预计产物长度见表１.４５中国人兽共患病学报２０２１,３７(１)表１㊀扩增耐药基因相关引物信息T a b ．１㊀P r i m e r i n f o r m a t i o n f o r r e s i s t a n c e g e n e a m pl i f i c a t i o n 引物名称引物序列(５ᶄＧ３ᶄ)扩增产物长度/b p参考文献K P C 上游:C G G T G T G T A C G C G A T G G A T A ５７４本文下游:T C C G G T T T T G T C T C C G A C T G G E S 上游:C G G T T T C T A G C A T C G G G A C A ３２１本文下游:C G T T T G G T T T C C G A T C A G C C S M E 上游:A T A G C G A C A A T G G G G C A A C A ３００本文下游:C A G C A G G A A C A C T A G C A C G AI M I /NM C上游:A T C G G T G G T C C T G A G G G T A T ３０１本文下游:C G T A T G C T C C G C A A C T A C C AO X A Ｇ２３Ｇl i k e 上游:G A T C G G A T T G G A G A A C C A G A ５０１[３]下游:A T T T C T G A C C G C A T T T C C A T O X A Ｇ２４Ｇl i k e 上游:G G T T A G T T G G C C C C C T T A A A２４６[３]下游:A G T T G A G C G A A A A G G G G A T T O X A Ｇ５１Ｇl i k e 上游:T A A T G C T T T G A T C G G C C T T G ３５３[４]下游:T G G A T T G C A C T T C A T C T T G G O X A Ｇ５８Ｇl i k e 上游:A A G T A T T G G G G C T T G T G C T G ５９９[３]下游:C C C C T C T G C G C T C T A C A T A CO X A Ｇ１４３Ｇl i k e 上游:T G G C A C T T T C A G C A G T T C C T１４９[５]下游:T A A T C T T G A G G G G G C C A A C CI M P Ｇl i k e 上游:G A A T A G (A /G )(A /G )T G G C T T A A (C /T )T C T C １８８[６]下游:C C A A A C (C /T )A C T A (G /C )G T T A T C V I M Ｇl i k e 上游:G T T T G G T C G C A T A T C G C A A C ３８２[６]下游:A A T G C G C A G C A C C A G G A T A G S I M Ｇ１上游:G T A C A A G G G A T T C G G C A T C G ５６９[６]下游:T G G C C T G T T C C C A T G T G A GG I M Ｇ１上游:T C A A T T A G C T C T T G G G C T G A C ７２[６]下游:C G G A A C G A C C A T T T G A A T G G S P M 上游:C T A A A T C G A G A G C C C T G C T T G ７９８[６]下游:C C T T T T C C G C G A C C T T G A T C N DM Ｇl i k e 上游:T C C T C A A C T G G A T C A A G C A G G ２４９本文下游:A A A A T A C C T T G A G C G G G C C A N DM Ｇf u l l 上游:A T G G A A T T G C C C A A T A T T A T G C A C ８１３[７]下游:T C A G C G C A G C T T G T C G G CP r e ＧN DM Ｇf u l l 上游:C A C C T C A T G T T T G A A T T C G C C ９８４[８]下游:C T C T G T C A C A T C G A A A T C G C S H V 上游:A G G A T T G A C T G C C T T T T T G ３９３[９]下游:A T T T G C T G A T T T C G C T C GT E M 上游:A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G８５８[１０]下游:C C A A T G C T T A A T C A G T G A G G C T X ＧM Ｇ１群上游:G G T T T A A A A A A T C A C T G C G T C８３３[１１]下游:T T G G T G A C G A T T T T A G C C G C５５１期傅芬蕊,等:产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型表１(续)引物名称引物序列(５ᶄＧ３ᶄ)扩增产物长度/b p参考文献C T X ＧM Ｇ２群上游:A T G A T G A C T C A G A G C A T T C G ８６５[１２]下游:T G G G T T A C G A T T T T C G C C G C C T X ＧM Ｇ８群上游:A T G A T A G A G A C A T C G C G T T A A G ８６０[１３]下游:C G G T G A C G A T T T T C G C G G C A G C T X ＧM Ｇ９群上游:A T G G T G A C A A A G A G A G T G C A ８６３[１２]下游:C C C T T C G G C G A T G A T T C T C C T X ＧM Ｇ２５群上游:C A C A C G A A T T G A A T G T T C A G９２３[１４]下游:T C A C T C C A C A T G G T G A G T １．３．３㊀N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６与N D M Ｇ９酶水解亚胺培南能力的比较㊀实验分为８组,见表２.分别扩增含与不含启动子序列的N DM Ｇ１㊁N DM Ｇ６及N DM Ｇ９型基因全长(携带N DM Ｇ１型基因的菌株来源于本实验室保存的菌株),引物分别为P r e ＧN DM Ｇfu l l 与N DM Ｇf u l l ,引物序列见表１,反应体系及条件同上.按D N A 纯化回收试剂盒方法对上述基因全长进行纯化,根据p C R２．１载体试剂说明书进行转化.根据抗性筛选与蓝白筛选挑选转化成功的重组T O P １０感受态细胞,进行P C R 检测耐药基因,测序证实转化是否成功和N D M 型别是否正确,琼脂稀释法测亚胺培南M I C 值.表２㊀N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６及N D M Ｇ９水解亚胺培南能力试验分组情况T a b ．２㊀G r o u p e d e v a l u a t i o no f t h e i m i p e n e m Ｇh y d r o l ys i s a b i l i t y o fN D M Ｇ１,N D M Ｇ６a n dN D M Ｇ９菌株解释㊀T O P １０T O P １０感受态细胞T O P １０＋p C R２．１含空载体的重组菌T O P １０＋p C R２．１＋N DM Ｇ１含N DM Ｇ１全长基因的重组菌T O P １０＋p C R２．１＋N DM Ｇ６含N DM Ｇ６全长基因的重组菌T O P １０＋p C R２．１＋N DM Ｇ９含N DM Ｇ９全长基因的重组菌T O P １０＋p C R ２．１＋P r e ＧN DM Ｇ１含启动子和N DM Ｇ１全长基因的重组菌T O P １０＋p C R ２．１＋P r e ＧN DM Ｇ６含启动子和N DM Ｇ６全长基因的重组菌T O P １０＋p C R ２．１＋P r e ＧN DM Ｇ９含启动子和N DM Ｇ９全长基因的重组菌１．３．４㊀多位点序列分型(M L S T )㊀对携带有N DM 基因的８株大肠埃希菌进行分型,P C R 扩增７个管家基因,即a d k ㊁f u m C ㊁g y r B ㊁i c d ㊁m d h ㊁pu r A 和r e c A ,所用引物序列及预计产物长度参考网站(h t Ｇt ps ://e n t e r o b a s e ．r e a d t h e d o c s ．i o /e n /l a t e s t /m l s t /m l s t Ｇl e g a c yＧi n f o Ｇe c o l i ．h t m l ).P C R 的扩增体系及扩增参数同上.扩增的P C R 产物的测序结果提交到p u b M L S T 数据库进行在线序列比对获得序列型.２㊀结㊀果２．１㊀菌株鉴定与表型筛查结果㊀本次收集的８株大肠埃希菌,经鉴定均为对亚胺培南不敏感的大肠埃希菌.经亚胺培南E t e s t 试纸法验证所有菌株均对亚胺培南不敏感.见表３.２．２㊀碳青霉烯酶基因筛查与测序结果㊀８株对亚胺培南不敏感大肠埃希菌所测A 类和D 类碳青霉烯酶基因均为阴性,B 类碳青霉烯酶基因中除N DM Ｇl i k e 基因为阳性外,其余均为阴性;广谱βＧ内酰胺酶基因中７株T E M 基因阳性,４株C T X ＧM Ｇ１基因阳性,１株C T X ＧM Ｇ９基因阳性,具体见表３.扩增８株N DM 基因全长,电泳结果与预计条带大小(８１３b p )相近,如图１所示.将P C R 产物进行双向测序,序列经比对分析,６株为携带N DM Ｇ６基因,２株为携带N DM Ｇ９基因,见表３.２．３㊀N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６和N D M Ｇ９水解亚胺培南能力结果㊀以T O P １０感受态细胞和含有空载体的重组菌作为阴性对照,仅含有N DM Ｇ１Ｇfu l l 基因㊁N DM Ｇ６Ｇf u l l 基因和N DM Ｇ９Ｇf u l l 基因的重组菌,因不含启动子,N DM 型基因无法表达,故表现为对亚胺培南敏感,与阴性对照组结果相同,M I C 值均为０．２５μg /m L .而含有P r e ＧN DM Ｇ１Ｇfu l l 基因㊁６５中国人兽共患病学报２０２１,３７(１)表３㊀８株产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠杆菌临床相关信息㊁耐药基因检测及分子分型结果T a b ．３㊀R e l a t e d c l i n i c a l i n f o r m a t i o n ,r e s i s t a n c e g e n e d e t e c t i o na n dm o l e c u l a r t y p i n g o f e i gh t s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i n g N e wD e l h im e t a l βＧl a c t a m a s e 科室年龄(岁)标本类型亚胺培南E t e s t 试纸法碳青霉烯酶基因广谱βＧ内酰胺酶基因M L S T分型结果康复科５３中段尿＞３２(R )N DM Ｇ６T E M S T １０１神经内科８６中段尿８(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１神经内科８１中段尿４(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１神经内科８４中段尿＞３２(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１神经内科６７中段尿＞３２(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１血液科６０分泌物３(I )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ９S T ６４８呼吸内科６４痰２(I)N DM Ｇ９－S T １２８４小儿外科１７分泌物１２(R )N DM Ｇ９T E MS T ２２６１Ｇ８分别为８株待检菌株;M 为D N A m a r k e r;阴性为阴性对照图１㊀N D M 基因扩增产物电泳图F i g ．１㊀E l e c t r o ph o r e s i s o fP C R p r o d u c t s o f t h e N D M g e n e P r e ＧN DM Ｇ６Ｇf u l l 基因及P r e ＧN DM Ｇ９Ｇf u l l 型基因的重组菌对亚胺培南均耐药,对亚胺培南的M I C 值分别为３２μg /m L ㊁１２８μg /m L 和６４μg/m L .２．４㊀M L S T 结果㊀对该８株耐药大肠埃希菌进行分子分型,S T １０１型有５株㊁S T ２２６㊁S T ６４８和S T １２８４型各１株.见表３.３㊀讨㊀论自２００９年首次发现产N D M Ｇ１酶的菌株以来,产N D M 型酶的菌株迅速向其他国家播散,在世界各地均有发现并报道.我国及世界上流行的分离菌中检出率较高的N D M 型酶基因主要为N DM Ｇ１和N DM Ｇ５[１５].本次实验在８株大肠埃希菌中均检测出N DM 基因,其中６株携带N DM Ｇ６基因,２株携带N DM Ｇ９基因.而N DM Ｇ６基因在２０１２年第一次从新西兰病人携带的大肠杆菌中鉴定出来以来[１６],国内外关于N DM Ｇ６基因报道均较少见.N DM Ｇ９基因是我国学者２０１４年在肺炎克雷伯菌中首次报道发现[１７],目前已在韩国㊁我国大陆及台湾地区等地均发现了携带N DM Ｇ９基因的大肠杆菌㊁肺炎克雷伯菌等细菌[１８].为了进一步分析菌株耐药基因的携带情况,还筛查８株耐药菌的广谱βＧ内酰胺酶基因,发现大肠埃希菌中存在多种耐药基因共存现象,几乎所有的耐药菌株均携带有T E M 基因,４株耐药菌同时携带有N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ１基因,１株同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ９基因,目前国内外均未见此类报道.本文结果显示N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６和N D M Ｇ９水解亚胺培南能力从强到弱依次为N D M Ｇ６㊁N D M Ｇ９和N D M Ｇ１,文献中未见同时比较以上３种型别N D M 水解亚胺培南能力的报道.对于N DM 型基因,目前已发现了２０多个型别,而它们之间大多只有几个碱基的不同.N DM Ｇ６基因㊁N DM Ｇ９基因与N DM Ｇ１基因的区别是分别在基因６９８位置(CңT )和４５４位置(GңA )上存在有一个碱基的改变,从而导致氨基酸分别由丙氨酸转变为缬氨酸㊁谷氨酸转变为赖氨酸.氨基酸的改变会影响N D M 蛋白的二级结构,可能改变N D M 蛋白的空间结构,从而改变N D M 与底物即碳青霉烯类药物的结合特性,表现出不同的水解能力.不同类型的N D M 水解碳青霉烯类药物的具体机制有待进一步研究.本次研究还采用M L S T 法对８株耐药大肠埃希菌进行分型,结果为:５株携带N DM Ｇ６基因大肠埃希菌为S T １０１型,１株携带N DM Ｇ６基因大肠埃７５１期傅芬蕊,等:产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型希菌为S T６４８型,有２株携带N DMＧ９基因大肠埃希菌分别为S T２２６型和S T１２８４型.在２０１２年首次报道产N DMＧ６基因的大肠埃希菌,其分型结果也为S T１０１型,而在国外报道,产N DM型基因的大肠埃希菌中,也有发现其M L S T分型结果为S T１０１型[１９],提示大肠埃希菌S T１０１型与N D M型碳青霉烯酶基因关系密切.S T６４８型大肠埃希菌常在产超广谱βＧ内酰胺酶的大肠埃希菌中发现[２０],在英国㊁日本分别首次报道产N DMＧ５和N DMＧ７基因的大肠埃希菌,其分型结果均为S T６４８型[２１],国内学者也有在S T６４８型大肠埃希菌中发现N DMＧ５基因,但并未检测出携带有N DMＧ６基因,国际上也并未发现携带有N DMＧ６基因的S T６４８型.产N DM基因的S T１２８４型大肠埃希菌在国内外鲜有报道发现,第一次在S T１２８４型大肠埃希菌中检出N DMＧ５基因是在２０１５年,而后虽有再次检出N DMＧ５基因,但到目前为止未检出携带有包括N DMＧ９基因在内其它N DM型基因.国内外均未在S T２２６型大肠埃希菌中发现N DM型基因.本次分离的８株耐药大肠埃希菌有５株M L S T 分型结果一致,均为S T１０１型,且均检出N DMＧ６基因.其中４株来自神经内科患者,１株来自康复科患者.通过查阅临床相关资料发现,这位康复科患者是在神经内科治疗一段时间后转入康复科的,且与２号患者曾在同一个病房治疗.２号患者长期卧床治疗,在其住院期间,３号㊁４号和５号患者也在神经内科治疗,而且３号和４号患者前后入住同一张病床.以上患者多为免疫力低下㊁有留置导尿管史和长期卧床的老年人.综合以上因素提示这些病人极有可能是在医院内发生了交叉感染.对此,临床上应尽量缩短留置导尿管的时间㊁合理使用抗菌药物㊁规范医护人员的操作和加强对各种医疗器械的消毒措施,同时应重视并加强院感监控力度,避免耐药菌株的传播和医院内感染的发生.利益冲突:无引用本文格式:傅芬蕊,张娅,潘玉红,等．产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型[J]．中国人兽共患病学报,２０２１,３７(１):５３Ｇ５９．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０２０．００．１７９参考文献:[１]T a nK,N g u y e n J,N g u y e nK,e t a l．P r e v a l e n c e o f t h e c a r b a p e nＧe mＧh e t e r o r e s i s t a n t p h e n o t y p e a m o n g E S B LＧp r o d u c i n g E s c h eＧr i c h i a c o l i a n dK l e b s i e l l a p n e u m o n i a e c l i n i c a l i s o l a t e s[J]．JA n t iＧm i c r o bC h e m o t h e r,２０２０,７５(６):１５０６Ｇ１５１２．D O I:１０．１０９３/j a c/ d k a a０４８[２]L i J,Y uT,T a oX Y,e t a l．E m e r g e n c e o f a nN D MＧ５Ｇp r o d u c i n g E s c h e r i c h i a c o l i s e q u e n c e t y p e４１０c l o n e i n i n f a n t s i n a c h i l d r e n s h o s p i t a l i n C h i n a[J]．I n f e c t D r u g R e s i s t,２０２０,１３:７０３Ｇ７１０．D O I:１０．２１４７/I D R．S２４４８７４[３]W o o d f o r dN,E l l i n g t o n M J,C o e l h oJ M,e t a l．M u l t i p l e xP C R f o r g e n e se n c o d i n gp r e v a l e n tO X Ac a r b a p e n e m a s e s i n A c i n e t oＧb a c t e r s p p[J]．I n t JA n t i m i c r o bA g e n t s,２００６,２７(４):３５１Ｇ３５３．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２００６．０１．００４[４]B r o w nS,Y o u n g H K,A m y e s S G．C h a r a c t e r i s a t i o n o fO X AＧ５１, an o v e lc l a s s D c a r b a p e n e m a s ef o u n di n g e n e t i c a l l y u n r e l a t e d c l i n i c a l s t r a i n so f A c i n e t o b a c t e rb a u m a n n i i f r o m A r g e n t i n a[J]．C l i n M i c r o b i o l I n f e c t,２００５,１１(１):１５Ｇ２３．D O I:１０．１１１１/j．１４６９Ｇ０６９１．２００４．０１０１６．x[５]H i g g i n sP G,L e h m a n n M,S e i f e r t H．I n c l u s i o no f O X AＧ１４３p r i m e r si na m u l t i p l e x p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n(P C R)f o r g e n e s e n c o d i n gp r e v a l e n tO X Ac a r b a p e n e m a s e s i n A c i n e t o b a c t e r s p p[J]．I n tJA n t i m i c r o b A g e n t s,２０１０,３５(３):３０５．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２００９．１０．０１４[６]M e n d e sR E,K i y o t aK A,M o n t e i r o J,e t a l．R a p i dd e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o no fm e t a l l oＧb e t aＧl a c t a m a s eＧe n c o d i n g g e n e s b y m u l t iＧp l e x r e a lＧt i m eP C Ra s s a y a n dm e l t c u r v e a n a l y s i s[J]．JC l i n M iＧc r o b i o l,２００７,４５(２):５４４Ｇ５４７．D O I:１０．１１２８/J C M．０１７２８Ｇ０６[７]H o r n s e y M,P h e eL,W a r e h a m D W．An o v e l v a r i a n t,N D MＧ５, o ft h e N e w D e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s ei na m u l t i d r u gＧr e s i s t a n t E s c h e r i c h i a c o l i S T６４８i s o l a t e r e c o v e r e d f r o ma p a t i e n t i n t h eUＧn i t e dK i n g d o m[J]．A n t i m i c r o b A g e n t s C h e m o t h e r,２０１１,５５(１２):５９５２Ｇ５９５４．D O I:１０．１１２８/A A C．０５１０８Ｇ１１[８]K a a s eM,N o r d m a n nP,W i c h e l h a u sT A,e t a l．N D MＧ２c a r b a pＧe n e m a s e i n A c i n e t o b a c t e r b a u m a n n i i f r o m E g y p t[J]．JA n t i m iＧc r o bC h e m o t h e r,２０１１,６６(６):１２６０Ｇ１２６２．D O I:１０．１０９３/j a c/d k r１３５[９]B h a t t a c h a r j e eA,S e n M R,P r a k a s hP,e t a l．R o l e o f b e t aＧl a c t aＧm a s e i n h i b i t o r s i ne n t e r o b a c t e r i a l i s o l a t e s p r o d u c i n g e x t e n d e dＧs p e c t r u mb e t aＧl a c t a m a s e s[J]．JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r,２００８,６１(２):３０９Ｇ３１４．D O I:１０．１０９３/j a c/d k m４９４[１０]T o n k iM,M o h a rB,Šišk oＧK r a l j e v iK,e t a l．H i g h p r e v a l e n c e a n d m o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o n o fe x t e n d e dＧs p e c t r u mβＧl a c t aＧm a s eＧp r o d u c i n g P r o t e u s m i r a b i l i s s t r a i n s i ns o u t h e r nC r o a t i a [J]．J M e d M i c r o b i o l,２０１０,５９(P t１０):１１８５Ｇ１１９０．D O I:１０．１０９９/j mm．０．０１６９６４Ｇ０[１１]P a r kY J,L e eS,K i m Y R,e t a l．O c c u r r e n c e o f e x t e n d e dＧs p e cＧt r u m(b e t a)Ｇl a c t a m a s e sa n d p l a s m i dＧm e d i a t e d A m p C(b e t a)Ｇl a c t a m a s e s a m o n g K o r e a ni s o l a t e so f P r o t e u s m i r a b i l i s[J]．JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r,２００６,５７(１):１５６Ｇ１５８．D O I:１０．１０９３/ j a c/d k i４０８[１２]G a r r e cH,D r i e u xＧR o u z e t L,G o l m a r d J L,e t a l．C o m p a r i s o n o f n i n e p h e n o t y p i c m e t h o d sf o rd e t e c t i o n o fe x t e n d e dＧs p e c t r u mb e t aＧl ac t a m a s e p r od u c t i o nb y E n te r o b a c t e r i a c e a e[J]．JC l i nM iＧc r o b i o l,２０１１,４９(３):１０４８Ｇ１０５７．D O I:１０．１１２８/J C M．０２１３０Ｇ１０[１３]N a v o nＧV e n e z i a S,C h m e l n i t s k y I,L e a v i t tA,e t a l．D i s s e m i n aＧt i o no f t h e C T XＧMＧ２５f a m i l y b e t aＧl a c t a m a s e s a m o n g K l e b s i e l l a８５中国人兽共患病学报２０２１,３７(１)p n e u m o n i a e,E s c h e r i c h i a c o l i a n d E n t e r o b a c t e rc l o a c a e a n d iＧd e n t i f i c a t i o no f t h en o v e l e n z y m eC T XＧMＧ４１i n P r o t e u sm i r aＧb i l i s i n I s r a e l[J]．JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r,２００８,６２(２):２８９Ｇ２９５．D O I:１０．１０９３/j a c/d k n１８２[１４]G o r e nM G,N a v o nＧV e n e z i a S,C h m e l n i t s k y I,e t a l．C a r b a p e nＧe mＧr e s i s t a n tK P CＧ２Ｇp r o d u c i n g E s c h e r i c h i ac o l i i na T e lA v i vM e d i c a lC e n t e r,２００５t o２００８[J]．A n t i m i c r o b A g e n t s C h eＧm o t h e r,２０１０,５４(６):２６８７Ｇ２６９１．D O I:１０．１１２８/A A C．０１３５９Ｇ０９[１５]Z o u H,J i aX,L i u H,e t a l．E m e r g e n c eo fN D MＧ５Ｇp r o d u c i n g E s c h e r i c h i ac o l i i nat e a c h i n g h o s p i t a l i nC h o n g q i n g,C h i n a: I n c FＧt y p e p l a s m i d s m a y c o n t r i b u t e t o t h e p r e v a l e n c e o f b l a N D MＧ５[J]．F r o n tM i c r o b i o l,２０２０,１１:３３４．D O I:１０．３３８９/ f m i c b．２０２０．００３３４[１６]W i l l i a m s o nD A,S i d j a b a tH E,F r e e m a nJ T,e ta l．I d e n t i f i c aＧt i o na n dm o l e c u l a r c h a r a c t e r i s a t i o no fN e wD e l h im e t a l l oＧβＧl a cＧt a m a s eＧ１(N D MＧ１)Ｇa n d N D MＧ６Ｇp r o d u c i n g E n t e r o b a c t e r i a c e a e f r o m N e w Z e a l a n d h o s p i t a l s[J]．I n tJ A n t i m i c r o b A g e n t s,２０１２,３９(６):５２９Ｇ５３３．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２０１２．０２．０１７[１７]W a n g X,L iH,Z h a oC,e t a l．N o v e lN D MＧ９m e t a l l oＧβＧl a c t aＧm a s e i d e n t i f i e d f r o maS T１０７K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e s t r a i n iＧs o l a t e d i nC h i n a[J]．I n t JA n t i m i c r o bA g e n t s,２０１４,４４:９０Ｇ９１．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２０１４．０４．０１０[１８]L i nY C,K u r o d a M,S u z u k i S,e t a l．E m e r g e n c eo f a n E s c h eＧr i c h i a c o l i s t r a i n c oＧh a r b o u r i n g m c rＧ１a n db l a N D MＧ９f r o ma uＧr i n a r y t r a c t i n f e c t i o n i nT a i w a n[J]．JG l o bA n t i m i c r o bR e s i s t,２０１９,１６:２８６Ｇ２９０．D O I:１０．１０１６/j．j g a r．２０１８．１０．００３[１９]Q a m a rMU,W a l s hT R,T o l e m a nMA,e t a l．D i s s e m i n a t i o n o f g e n e t i c a l l y d i v e r s e N D MＧ１,Ｇ５,Ｇ７p r o d u c i n gＧG r a mＧn e g a t i v e p a t h o g e n s i s o l a t e d f r o m p e d i a t r i c p a t i e n t s i nP a k i s t a n[J]．F uＧt u r eM i c r o b i o l,２０１９,１４(１):６９１Ｇ７０４．D O I:１０．２２１７/f m bＧ２０１９Ｇ００１２[２０]P e i r a n oG,P i t o u t J D D．E x t e n d e dＧS p e c t r u mβＧL a c t a m a s eＧP r oＧd u c i n g E n t e r o b a c t e r i a c e a e:u p d a t eo n m o l e c u l a re p i d e m i o l o g y a n dt r e a t m e n to p t i o n s[J]．D r u g s,２０１９,７９(１４):１５２９Ｇ１５４１．D O I:１０．１００７/s４０２６５Ｇ０１９Ｇ０１１８０Ｇ３[２１]M i z u n oY,Y a m a g u c h iT,M a t s u m o t oT．Af i r s t c a s eo fN e wD e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s eＧ７i na nE s c h e r i c h i ac o l i S T６４８i s oＧl a t e i nJ a p a n[J]．J I n f e c tC h e m o t h e r,２０１４,２０(１２):８１４Ｇ８１６．D O I:１０．１０１６/j．j i a c．２０１４．０８．００９收稿日期:２０２０Ｇ０５Ｇ２２㊀编辑:张智芳(上接第５２页)[２９]S c h e y K L,W a n g Z,W e n k e J L,e t a l．A q u a p o r i n s i n t h e e y e: e x p r e s s i o n,f u n c t i o n,a n dr o l e s i no c u l a rd i s e a s e[J]．B i o c h i mB i o p h y sA c t a,２０１４,１８４０(５):１５１３Ｇ１５２３．D O I:１０．１０１６/j．b b a g e n．２０１３．１０．０３７[３０]H i b u s eT,M a e d aN,N a g a s a w aA,e t a l．A q u a p o r i n s a n d g l y cＧe r o lm e t a b o l i s m[J]．B i o c h i m B i o p h y sA c t a,２００６,１７５８(８):１００４Ｇ１０１１．D O I:１０．１０１６/j．b b a m e m．２００６．０１．００８[３１]A l v a r a d oM E,R u b i a n oC,Sán c h e zW,e t a l．C a l c i u mＧb i n d i n g p r o t e i n s t h a t a r e t y p e Bᵡr e g u l a t o r y s u b u n i t s o f p h o s p h a t a s e２A i n G i a r d i ai n t e s t i n a l i s[J]．P a r a s i t o lR e s,２０１８,１１７(１０):３２０５Ｇ３２１４．D O I:１０．１００７/s００４３６Ｇ０１８Ｇ６０１９Ｇz[３２]P r a s a dR,A t u l,S o n iA,e t a l．E x p r e s s i o n,c h a r a c t e r i z a t i o n, a n dc e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f k n o w p a i n s,p a p a i nＧl i k e c y s t e i n e p r oＧt e a s e s o f t h e P l a s m o d i u mk n o w l e s i m a l a r i a p a r a s i t e[J]．P L o S O n e,２０１２,７(１２):e５１６１９．D O I:１０．１３７１/j o u r n a l．p o n e．００５１６１９[３３]张佳凤,郝文波,肖斌,等．抗弓形虫水通道蛋白多肽抗体的制备及鉴定[J]．中国人兽共患病学报,２０１５,３１(１０):９０３Ｇ９０７．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０１５．１０．００２[３４]钟亮尹,刘思敏,曾智华,等．弓形虫C D P K５基因多克隆抗血清的制备及功能鉴定[J]．重庆医学,２０１６,４５(１６):２１８２Ｇ２１８５．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７１Ｇ８３４８．２０１６．１６．００８[３５]冯宪敏,张宏梅,李瑶,等．蓝氏贾第鞭毛虫P P D K多肽抗体制备与定位研究[J]．中国病原生物学杂志,２０１５,１０(２):１４４Ｇ１４７．D O I:１０．１３３５０/j．c j p b．１５０２１０[３６]肖斌,陈瑜,李林海,等．兔抗弓形虫C o r A家族M g２＋转运蛋白多肽抗体的制备及鉴定[J]．生物技术通讯,２０１６,２７(６):７７８Ｇ７８２．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００９Ｇ０００２．２０１６．０６．００６[３７]C a o i l i S E．B e n c h m a r k i n g BＧc e l l e p i t o p e p r e d i c t i o nw i t h q u a n t iＧt a t i v ed o s eＧr e s p o n s ed a t ao na n t i p e p t i d ea n t i b o d i e s:t o w a r d s n o v e l p h a r m a c e u t i c a l p r o d u c td e v e l o p m e n t[J]．B i o m e d R e s I n t,２０１４,２０１４:８６７９０５．D O I:１０．１１５５/２０１４/８６７９０５[３８]W a n g F,Y eB．B i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sa n dc o n s t r u c t i o no f p h y l o g e n e t i c t r e e o fA q u a p o r i n s f r o m E c h i n o c o c c u s g r a n u l o s u s [J]．P a r a s i t o lR e s,２０１６,１１５(９):３４９９Ｇ３５１１．D O I:１０．１００７/ s００４３６Ｇ０１６Ｇ５１１４Ｇ２收稿日期:２０２０Ｇ０４Ｇ２４㊀编辑:张智芳９５１期傅芬蕊,等:产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型。

大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及分子分型

·细菌学·大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及分子分型张嵘　池丹　蔡加昌　胡燕燕　周宏伟　杨玮　吕火烊　陈功祥【摘要】　目的　研究大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及分子分型。

方法　２００７—２０１１年从杭州市３家医院分离到２２株对碳青霉烯类抗生素不敏感的大肠埃希菌。

琼脂稀释法测定抗生素最低抑菌浓度（ＭＩＣ）；接合试验、ＰＣＲ扩增和序列分析等研究细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制。

脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）、多位点序列分型（ＭＬＳＴ）和系统发育分型（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｙｐｉｎｇ）等对菌株进行分子分型。

结果　２２株大肠埃希菌亚胺培南和美罗培南的ＭＩＣ范围为１～１６μｇ／ｍｌ，厄他培南为２～６４μｇ／ｍｌ。

所有菌株产ＫＰＣ－２型碳青霉烯酶及各种β－内酰胺酶，部分菌株同时产质粒介导的ＡｍｐＣ酶。

２２株大肠埃希菌均可通过接合试验或转化试验将碳青霉烯耐药性传递给大肠埃希菌ＥＣ６００，使后者获得ｂｌａＫＰＣ－２基因及与供体菌相似的耐药性。

ＰＦＧＥ显示仅少数菌株为相同克隆或密切相关；ＭＬＳＴ显示最常见的序列类型为ＳＴ１３１（９株）和ＳＴ６４８（５株），ＳＴ３８和ＳＴ４０５各２株；系统发育分析显示９株ＳＴ１３１菌株均为Ｂ２群，另有１１株属于Ｄ群，Ｂ１群和Ａ群各１株。

结论　杭州地区产ＫＰＣ－２大肠埃希菌主要为世界范围流行的多重耐药菌株ＳＴ１３１，其次为ＳＴ６４８。

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４－５１０１．２０１４．０４．００２基金项目：浙江省自然科学基金（Ｙ１２Ｈ２０００１４）作者单位：３１０００９杭州，浙江大学医学院附属第二医院检验科（张嵘，蔡加昌，胡燕燕，周宏伟，陈功祥）；３２５０３５温州医科大学检验医学院、生命科学学院（池丹，陈功祥）；杭州市中医院检验科（杨玮）；浙江省人民医院检验科（吕火烊）通信作者：陈功祥，Ｅｍａｉｌ：ｂｒｉｇｉｔｔｅ＿ｚｘ＠１６３．ｃｏｍ，电话：０５７１－８７７８３６４６【关键词】　大肠埃希菌；碳青霉烯；分子分型；ＫＰＣ－２；ＳＴ１３１Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｙｐｅｓｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｎｏｎ－ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ＺｈａｎｇＲｏｎｇ倡，ＣｈｉＤａｎ，ＣａｉＪｉａｃｈａｎｇ，ＨｕＹａｎｙａｎ，ＺｈｏｕＨｏｎｇｗｅｉ，ＹａｎｇＷｅｉ，ＬｙｕＨｕｏｙａｎｇ，ＣｈｅｎＧｏｎｇｘｉａｎｇ．倡ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｃｉｎｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１０００９，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＣｈｅｎＧｏｎｇｘｉａｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｂｒｉｇｉｔｔｅ＿ｚｘ＠１６３．ｃｏｍ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｙｐｅｓｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｎｏｎ－ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅＥｓｃｈｅ－ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｗｅｎｔｙ－ｔｗｏｃａｒｂａｐ－ｅｎｅｍ－ｎｏｎ－ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅＥ．ｃｏｌｉｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ３ｈｏｓｐｉｔａｌｓｉｎＨａｎｇｚｈｏｕｆｒｏｍ２００７ｔｏ２０１１．Ｔｈｅｍｉｎｉ－ｍｕｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（ＭＩＣｓ）ｏｆａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｔｏｔｈｏｓｅｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙａｇａｒｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄＥ－ｔｅｓｔ．ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＥ．ｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ＰＣＲａｎｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｕｌｓｅｄ－ｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＦＧＥ），ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅ－ｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ），ａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｙｐｉｎｇｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｏｓｅｉｓｏｌａｔｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅＭＩＣｓｏｆｉｍｉｐｅｎｅｍａｎｄｍｅｒｏｐｅｎｅｍｔｏ２２Ｅ．ｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ１μｇ／ｍｌｔｏ１６μｇ／ｍｌ，ａｎｄｔｈｅＭＩＣｓｏｆｅｒｔａｐｅｎｅｍｗｅｒｅ２μｇ／ｍｌｔｏ６４μｇ／ｍｌ．ＡｌｌＥ．ｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｔｈｅＫＰＣ－２ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅａｎｄｖａｒｉｏｕｓβ－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ，ａｎｄｓｏｍｅｏｆｔｈｅｍａｌｓｏｐｒｏｄｕｃｅｄｐｌａｓｍｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄＡｍｐＣｅｎｚｙｍｅｓ．Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗａｓｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｂｙｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｒｏｍ２２Ｅ．ｃｏｌｉｉｓｏ－ｌａｔｅｓｔｏＥ．ｃｏｌｉＥＣ６００ｓｔｒａｉｎｓ．ＴｈｅＥ．ｃｏｌｉｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔｓｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓａｃｑｕｉｒｅｄｔｈｅｂｌａＫＰＣ－２ｇｅｎｅａｎｄｓｈｏｗｅｄｓｉｍｉｌａｒａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｐａｔｔｅｒｎｓｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈｄｏｎｏｒｓｔｒａｉｎｓ．Ｏｎｌｙａｆｅｗｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｉｎ－ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅｏｒｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄａｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｂｙＰＦＧＥ．ＦｏｕｒｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇＳＴ１３１（９ｉｓｏｌａｔｅｓ），ＳＴ６４８（５ｉｓｏｌａｔｅｓ），ＳＴ３８（２ｉｓｏｌａｔｅｓ）ａｎｄＳＴ４０５（２ｉｓｏｌａｔｅｓ）ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＭＬＳＴ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙ－ｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ９ＳＴ１３１ｉｓｏｌａｔｅｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｇｒｏｕｐＢ２ａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｉｓｏｌａｔｅｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｇｒｏｕｐＤ（１１ｉｓｏｌａｔｅｓ），ｇｒｏｕｐＢ１（１ｉｓｏｌａｔｅ）ａｎｄｇｒｏｕｐＡ（１ｉｓｏｌａｔｅ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｅｏｆｐｒｅｖａｌｅｎｔＥ．ｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇＫＰＣ－２ｆｒｏｍＨａｎｇｚｈｏｕｗａｓＳＴ１３１，ｗｈｉｃｈｉｓａｎｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅｐｉ－ｄｅｍｉｃ，ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｃｌｏｎｅ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙＳＴ６４８．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ；Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｙｐｉｎｇ；ＫＰＣ－２；ＳＴ１３１由于抗生素在临床的广泛应用和不合理使用，细菌耐药问题日益严重且越来越受到关注。

耐碳青霉烯类大肠埃希菌耐药基因及同源性分析

㊃论著㊃D O I:10.3969/j.i s s n.1672-9455.2023.15.015耐碳青霉烯类大肠埃希菌耐药基因及同源性分析*宋瑞雅,闫小利,陈清清,林玉玲ә福建医科大学附属泉州第一医院检验科,福建泉州362000)摘要:目的分析某院分离的耐碳青霉烯类大肠埃希菌(C R E C O)的耐药基因及同源性,为临床治疗及感控提供参考㊂方法收集福建医科大学附属泉州第一医院2017-2021年分离的C R E C O36株,对成功复苏的15株C R E C O进行耐药基因及同源性分析;用P C R扩增碳青霉烯酶(C P A s)基因(b l a K P C㊁b l a I M P㊁b l a N D M㊁b l a V I M㊁b l a O X A-48);多位点序列分型(M L S T)用于检测其基因序列(S T型)㊂结果(1)36株C R E C O标本类型主要为尿液(55.56%)㊂(2)C R E C O对哌拉西林㊁左氧氟沙星等8种抗菌药物耐药率达100.0%,对庆大霉素㊁氯霉素等7种抗菌药物耐药率>50.0%,对阿米卡星㊁多黏菌素耐药率分别为19.4%㊁2.8%,尚未发现对替加环素耐药㊂(3)通过P C R扩增15株复苏菌株的耐药基因,共获得14株阳性:2株b l a K P C-1,11株b l a N D M-5,1株b l a N D M-1;1株阴性㊂(4)M L S T将11株携带b l a N D M-5的C R E C O的S T型分为S T156㊁S T117㊁S T2177㊁S T744㊁S T405和S T10C p l x(复合群)㊂结论 C R E C O呈多重耐药状态,对碳青霉烯类耐药与携带耐药基因b l a N D M-5密切相关,携带b l a N D M-5的C R E C O以S T10C p l x流行为主㊂关键词:大肠埃希菌;碳青霉烯酶;耐药基因;多位点序列分型中图法分类号:R446.5文献标志码:A文章编号:1672-9455(2023)15-2206-04A n a l y s i s o n r e s i s t a n c e g e n e s a n d h o m o l o g y o f c a r b a p e n e m r e s i s t a n t E s c h e r i c h i a c o l i*S O N G R u i y a,Y A N X i a o l i,C H E N Q i n g q i n g,L I N Y u l i n gәD e p a r t m e n t o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e,Q u a n z h o u F r i s t H o s p i t a l A f f i l i a t e d t oF u j i a n M e d i c a l U n i v e r s i t y,Q u a n z h o u,F u j i a n362000,C h i n aA b s t r a c t:O b j e c t i v e T o a n a l y z e t h e d r u g r e s i s t a n c e g e n e s a n d h o m o l o g y o f c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t E s c h e-r i c h i a c o l i(C R E C O)i n a h o s p i t a l t o p r o v i d e r e f e r e n c e f o r c l i n i c a l t r e a t m e n t a n d s u s c e p t i b i l i t y c o n t r o l.M e t h o d s C l i n i c a l d a t a o f C R E C O i s o l a t e d f r o m2017-2021i n Q u a n z h o u F r i s t H o s p i t a l A f f i l i a t e d t o F u j i a n M e d i c a l U n i v e r s i t y w e r e c o l l e c t e d,a n d t h e r e s i s t a n c e g e n e s a n d h o m o l o g y o f15s u c c e s s f u l l y c o v e r e d s t r a i n s o f C R E C O w e r e a n a l y z e d;c a r b a p e n e m a s e(C P A s)g e n e s(b l a K P C,b l a I M P,b l a N D M,b l a V I M,b l a O X A-48)w e r e a m p l i f i e d b y P C R; m u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n g(M L S T)w a s u s e d t o d e t e c t t h e i r g e n e s e q u e n c e s(S T t y p e).R e s u l t s(1)36C R E-C O s p e c i m e n t y p e w a s m a i n l y u r i n e(55.56%).(2)T h e r e s i s t a n c e r a t e o f C R E C O r e a c h e d100.0%f o r8a n-t i b i o t i c s s u c h a s p i p e r a c i l l i n a n d l e v o f l o x a c i n,>50%f o r7a n t i b a c t e r i a l d r u g s s u c h a s g e n t a m i c i n a n d c h l o r a m-p h e n i c o l,19.4%a n d2.8%f o r a m i k a c i n a n d p o l y m y x i n,r e s p e c t i v e l y,a n d n o t y m e t r a c y c l i n e r e s i s t a n c e w a s f o u n d y e t.(3)D r u g r e s i s t a n c e g e n e s i n15r e c o v e r e d s t r a i n s w e r e a m p l i f i e d b y P C R,a n d14p o s i t i v e s t r a i n s w e r e o b t a i n e d:2s t r a i n s o f b l a K P C-1,11s t r a i n s o f b l a N D M-5,1s t r a i n o f b l a N D M-1;t h e r e s t1s t r a i n w a s n e g a t i v e.(4) M L S T c l a s s i f i e d t h e S T t y p e s o f t h e11s t r a i n s o f C R E C O c a r r y i n g b l a N D M-5i n t o S T156,S T117,S T2177, S T744,S T405a n d S T10C p l x(c o m p l e x g r o u p).C o n c l u s i o n C R E C O s h o w s m u l t i-d r u g r e s i s t a n c e s t a t u s,a n d r e s i s t a n c e t o c a r b a p e n e m s i s c l o s e l y r e l a t e d t o c a r r y i n g t h e r e s i s t a n c e g e n e b l a N D M-5,a n d c a r r y i n g b l a N D M-5o f C R E C O i s p r e d o m i n a n t l y p r e v a l e n t i n S T10C p l x.K e y w o r d s:E s c h e r i c h i a c o l i; C a r b a p e n e m a s e;d r u g r e s i s t a n c e g e n e; m u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p e大肠埃希菌为最常见的肠道杆菌,是医院及社区获得性感染的主要病原菌之一,大肠埃希菌感染可引起严重疾病,包括肺炎㊁脑膜炎㊁败血症等[1]㊂由于抗生素的广泛使用,碳青霉烯类耐药肠杆菌(C R E)不断增加,C R E造成的感染增加了临床的治疗难度,病死率较高,达30.0%~80.0%[2-3]㊂大肠埃希菌在C R E 中占比排名第二,仅次于肺炎克雷伯菌[4-5]㊂因此,本研究对耐碳青霉烯类大肠埃希菌(C R E C O)菌株的临床资料㊁耐药表型及耐药基因的S T型进行监测分析,从而为临床合理用药及感染防控提供依据㊂㊃6022㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n,A u g u s t2023,V o l.20,N o.15*基金项目:福建省泉州市科技局计划项目(2018Z052)㊂作者简介:宋瑞雅,女,主管技师,主要从事临床微生物耐药机制研究方向的研究㊂ә通信作者,E-m a i l:779115620@q q.c o m㊂Copyright©博看网. All Rights Reserved.1材料与方法1.1菌株来源收集2017-2021年福建医科大学附属泉州第一医院临床分离的大肠埃希菌,剔除同一患者检出的重复菌株㊂共获得6609株大肠埃希菌,其中C R E C O36株,对成功复苏的15株C R E C O进行耐药基因及同源性分析㊂1.2主要试剂和仪器 MH琼脂平板㊁血琼脂平板(广州市迪景微生物科技有限公司);MA L D I-T O F微生物质谱仪(布鲁克公司);P h o e n i x100全自动细菌鉴定仪及药敏系统(美国B D公司);D Y Y-6C型电泳仪(北京六一仪器厂);凝胶成像仪(美国B i o-R a d公司);基因扩增仪(杭州博日科技有限公司);美罗培南㊁亚胺培南等药物敏感纸片(奥克欧德有限公司); P C R试剂盒(厦门万和信生物科技有限公司);引物(上海生工生物工程有限公司)㊂1.3方法1.3.1细菌鉴定及药敏试验采用常规细菌培养方法对临床标本进行细菌培养,采用P h o e n i x100全自动细菌鉴定仪及药敏系统对37ħ培养24h的单个菌落进行鉴定及药敏试验,采用质谱仪及K i r b y-B a u e r (K-B)法进行药敏复核,结果判断遵循美国临床实验室标准化协会(C L S I)2021年版本标准㊂1.3.2耐药基因检测利用煮沸法提取菌株的D N A,P C R扩增碳青霉烯酶(C A P s)基因,引物参照文献[6],见表1㊂C A P s反应体系(50μL):P r e m i x T a q25μL,模板5μL,正㊁反向引物各2μL,双蒸馏水16μL㊂反应参数:94ħ预变性5m i n;94ħ变性50 s,退火温度50~55ħ30s,72ħ延伸30s,共35个循环;最后72ħ延伸5m i n㊂经1.2%琼脂糖凝胶电泳观察菌株是否携带待检的碳青霉烯耐药基因㊂电泳阳性的扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序㊂测序结果经B l a s t比对分析,确定基因类型㊂表1 C P A s基因及其引物基因引物序列(5'-3')产物大小(b p)b l a K P C F:C G T C T A G T T C T G C T G T C T T GR:C T T G T C A T C C T T G T T A G G C G798b l a I M P F:G G A A T A G A G T G G C T T A A Y T C T CR:G G T T T A A Y A A A A C A A C C A C C232b l a N D M F:G G T T T G G C G A T C T G G T T T T CR:C G G A A T G G C T C A T C A C G A T C621b l a V I M F:G A T G G T G T T T G G T C G C A T AR:C G A A T G C G C A G C A C C A G390b l a O X A-48F:G C G T G G T T A A G G A T G A A C A CR:C A T C A A G T T C A A C C C A A C C G4381.3.3多位点序列分型(M L S T)提取菌株的D N A,P C R扩增大肠埃希菌7个管家基因(a d k㊁f u m C㊁i c d㊁p u r A㊁g y r B㊁r e c A㊁m d h),引物设计参考M L S T网站(h t t p://m L s t.u c c.i e/m L s t/d b s/E c o l i)㊂反应体系(50μL):P r e m i x T a q25μL,模板5μL,正㊁反向引物各2μL,双蒸馏水16μL㊂反应参数:94ħ预变性5m i n;94ħ变性60s,退火温度50~55ħ30 s,72ħ延伸50s,共30个循环;最后72ħ延伸5 m i n㊂扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序㊂测序后的结果经过P u b M l s t数据库比对确定其S T型㊂1.4统计学处理采用WHO N E T5.6统计软件进行数据分析㊂计数资料以例数或百分率表示㊂2结果2.1菌株来源及分布患者年龄主要分布在50~60岁及80岁以上,菌株来自17个科室,主要来源于泌尿外科(16.67%,6/36)和老年病科泌尿外科(13.89%,5/36),其余来自儿科(5.56%,2/36)㊁感染病科(8.33%,3/36)㊁胃肠外科(8.33%,3/36)㊁消化内科(5.56%,2/36)㊁血液内科(2.78%,1/36)㊁重症医学科(8.33%,3/36)等㊂尿液标本分离的C R E C O 占55.56%(20/36);其次为静脉全血(8.33%,3/36)㊁脓液(11.11%,4/36)和痰液(8.33%,3/36)等㊂2.2 C R E C O药敏情况 C R E C O对8种抗菌药物的耐药率达100.0%,对7种抗菌药物耐药率>50.0%,对阿米卡星的耐药率<20.0%,对多黏菌素耐药率低(2.8%);对替加环素的敏感率高㊂见表2㊂表2 C R E C O对抗菌药物耐药率[n=36,n(%)]抗菌药物敏感中介耐药哌拉西林0(0.0)0(0.0)36(100.0)哌拉西林/他唑巴坦0(0.0)0(0.0)36(100.0)头孢噻肟0(0.0)0(0.0)36(100.0)头孢他啶1(2.8)0(0.0)35(97.2)头孢哌酮/舒巴坦0(0.0)0(0.0)36(100.0)亚胺培南0(0.0)0(0.0)36(100.0)美罗培南0(0.0)0(0.0)36(100.0)㊃7022㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n,A u g u s t2023,V o l.20,N o.15Copyright©博看网. All Rights Reserved.续表2 C R E C O对抗菌药物耐药率[n=36,n(%)]抗菌药物敏感中介耐药环丙沙星0(0.0)0(0.0)36(100.0)左氧氟沙星0(0.0)0(0.0)36(100.0)阿莫西林/克拉维酸0(0.0)1(2.8)35(97.2)四环素7(19.4)0(0.0)29(80.5)复方磺胺甲噁唑7(19.4)0(0.0)29(80.5)多黏菌素0(0.0)35(97.2)1(2.8)氨曲南13(36.1)0(0.0)23(63.9)庆大霉素14(38.9)1(2.8)21(58.3)阿米卡星29(80.6)0(0.0)7(19.4)氯霉素11(30.6)2(5.5)23(63.9)替加环素35(97.2)1(2.8)0(0.0)2.3 C R E C O耐药基因分析通过P C R扩增15株复苏菌株的耐药基因,共得获得14株阳性,有12株携带b l a N D M[80%(12/14)],其中11株携带b l a N D M-5,1株携带b l a N D M-1;2株携带b l a K P C[13.33%(2/15)];1株阴性㊂其余耐药基因(b l a I M P㊁b l a V I M㊁b l a O X A-48)均未检出㊂2.4M L S T分型结果同源性分析11株携带b l a N D M-5基因的C R E C O,结果显示大部分属于不同克隆型,S T型有S T156㊁S T117㊁S T2177㊁S T744㊁S T405和S T10C p l x(复合群),其中3株大肠埃希菌的S T型完全一致,属于S T10C p l x㊂见表3㊂表3 C R E C O管家基因和S T分型分析大肠埃希菌菌株编号a d k f u m C i c d p u r A g y r B r e c A m d h S T型292211813992738S T10C p l x 395329168324411S T156 49224543324125S T117 59221188425S T2177 692211813428S T10C p l x 79531188428S T10C p l x 8953118813528S T744 99531188428S T10C p l x 127923725529734S T405 13922118134738S T10C p l x 159531188428S T10C p l x3讨论本研究中C R E C O检出率为0.54%(36/6609),与中国细菌耐药监测网(h t t p://w w w.c h i n e t s.c o m /D a t a/A n t i b i o t i c D r u g F a s t)报道的2021年全国C R E C O平均检出率1.6%及福建地区1.1%基本一致;大肠埃希菌分离率居首位占18.96%,虽然C R E-C O检出率较低,但由于临床中大肠埃希菌检出基数大及C R E C O治疗难度大,临床医生需继续做好C R E C O的耐药监测㊂本研究中C R E C O呈现多重耐药状态:对头孢菌素类㊁喹诺酮类耐药率>95.0%;对多数抗菌药物耐药率>50.0%;对阿米卡星耐药率为19.4%,高于文献报道的大肠埃希菌对阿米卡星的耐药率(2.2%)[7];对多黏菌素耐药率低,尚未见替加环素耐药情况㊂目前,多黏菌素及替加环素被认为是对C R E 感染临床常选择的治疗药物[8-9]㊂多黏菌素由于肾毒性和神经毒性较大应用较有限㊂刘周等[10]报道对多黏菌素B非耐药的C R E C O有9.1%菌株携带m c r-9基因,而携带m c r-9菌株均表现为多黏菌素的诱导耐药,临床工作中应注意这一特殊表型㊂而近年来对替加环素耐药的C R E C O也常见报道[11]㊂刘宇阳等[12]报道C R E C O对替加环素异质性耐药率达37.5%㊂可见C R E C O感染的治疗现状不容乐观,因此应对其耐药机制进一步研究,以遏制其耐药的传播㊂现有研究认为C R E C O的耐药机制主要有4种,其中以产碳青霉烯酶为主要耐药机制[13]㊂b l a N D M和b l a O X A-48被认为是碳青霉烯类耐药肠杆菌中产生金属-β-内酰胺酶和碳青霉烯酶的最常见原因[14]㊂产新德里金属β-内酰胺酶(N D M-1)是大肠埃希菌对碳青霉烯类药物耐药的主要机制之一,N D M-5是N D M-1的变体之一[15]㊂有研究表明,与N D M-1相比,N D M-5对碳青霉烯类抗菌药物具有更强的水解作用,耐药性更强[16]㊂本研究检测了15株C R E C O碳青霉烯酶编码基因,阳性率为93.33%(14/15),以b l a N D M-5检出为主,与文献报道我国C R E C O b l a N D M-5检出率最高相一致[17-18],可见国内C R E C O以产b l a N D M-5为流行株㊂1株试验阴性的原因可能是其他耐药机制引起,如膜孔蛋白缺失㊁外排泵等,有待进一步研究㊂利用M L S T进行菌株的同源性分析,为进一步证实菌株的克隆型㊁区分菌株提供了重要依据㊂有研究报道,携带b l a N D M-5的C R E C O的S T型以S T410㊁S T167㊁S T361㊁S T405等流行为主[19-20]㊂本地区则以㊃8022㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n,A u g u s t2023,V o l.20,N o.15Copyright©博看网. All Rights Reserved.S T10C p l x流行为主,S T型分布在不同地区有所差异㊂本研究中携带b l a N D M-5的C R E C O虽有3株S T 型完全一致,但其入院时间未重叠㊁所在科室不同,属于散发病例㊂目前,国内外尚未见N D M-5菌株引起暴发的相关报道㊂余艳等[21]报道,绝大多数b l a N D M 基因可位于20种不同类型的质粒上,可传递到其他细菌或整合到染色体,而引起b l a N D M基因快速而广泛地传播㊂目前已有多个国家报道新型冠状病毒感染大流行期间C R E C O检出率明显增加[22-23],因此应进一步加强对C R E C O的监测以防造成C R E C O扩散而增加治疗难度㊂参考文献[1]S O R A V M,M E R O N I G,MA R T I N O P A,e t a l.E x t r a i n-t e s t i n a l p a t h o g e n i c e s c h e r i c h i a c o l i:v i r u l e n c e f a c t o r s a n da n t ib i o t ic r e s i s t a n c e[J].P a t h o g e n s,2021,10(11):1355.[2]胡付品,郭燕,朱德妹,等.2019年C H I N E T三级医院细菌耐药监测[J].中国感染与化疗杂志,2020,20(3):233-243.[3]B O R E R A,S A I D E L-O D E S L,R I E S E N B E R G K,e t a l.A t t r i b u t a b l e m o r t a l i t y r a t e f o r c a r b a p e n e m-r e s i s t a n tK l e b s i e l l a p n e u m o n i a e b a c t e r e m i a[J].I n f e c t C o n t r o lH o s p i t a l E p i d e m i o l,2009,30(10):972-976.[4]T AMMA P D,G O O D MA N K E,HA R R I S A D,e t a l.C o m p a r i n g t h e o u t c o m e s o f p a t i e n t s w i t h c a r b a p e n e m a s e-p r o d u c i n g a n d n o n-c a r b a p e n e m a s e-p r o d u c i n g c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a e b a c t e r e m i a[J].C l i n I n f e c tD i s,2017,64(3):257-264.[5]刘红栓,蔡阳平,张庆,等.I C U耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的流行病学特点及耐药性分析[J].检验医学与临床, 2021,18(4):536-538.[6]P O I R E L L,WA L S H T R,C U V I L L I E R V,e t a l.M u l t i-p l e x P C R f o r d e t e c t i o n o f a c q u i r e d c a r b a p e n e m a s e g e n e s [J].D i a g n M i c r o b i o l I n f e c t D i s,2011,70(1):119-123.[7]胡付品,郭燕,朱德妹,等.2021年C H I N E T中国细菌耐药监测[J].中国感染与化疗杂志,2022,22(5):521-530.[8]S H E U C C,C HA N G Y T,L I N S Y,e t a l.I n f e c t i o n sc a u s ed b y c a r b a pe n e m-r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a e:a nu p d a t e o n t h e r a p e u t i c o p t i o n s[J].F r o n t M i c r o b i o l,2019, 10:80.[9]邱野.三种抗感染方案在碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯杆菌血流感染患者中的应用效果[J].医学理论与实践,2021,34(20):3624-3625.[10]刘周,杭修兵,储雯雯,等.耐碳青霉烯类大肠埃希菌临床分布㊁耐药特征及携带m c r基因分析[J].现代检验医学杂志,2022,37(5):1-5.[11]肖晓,杭修兵,王梦,等.耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌耐药性㊁临床感染特征及m c r基因分析[J].中国感染控制杂志,2023,22(1):31-37.[12]刘宇阳,蓝锴,熊蕊,等.耐碳青霉烯类大肠埃希菌对替加环素异质性耐药的机制[J].分子诊断与治疗杂志,2021, 13(2):178-182.[13]孙艳,多丽波.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药机制及实验室检测研究进展[J].国际检验医学杂志,2020,41(16):2011-2016.[14]MA T I N F Z,R E Z A T O F I G H I S E,A R D A K A N I M R,e ta l.V i r u l e n c e c h a r a c t e r i z a t i o n a n d c l o n a l a n a l y s i s o f u r o-p a t h o g e n i c E s c h e r i c h i a c o l i m e t a l l o-b e t a-l a c t a m a s e-p r o d u-c i n g i s o l a t e s[J].A n n C l i n M i c r o b i o l A n t i m i c r o b,2021,20(1):50.[15]陈韩,郑周,陈思思,等.血流感染产碳青霉烯酶大肠埃希菌的耐药基因及同源性研究[J].中华医院感染学杂志, 2019,29(7):971-975.[16]Q AMA R M U,L O P E S B S,HA S S A N B,e t a l.T h e p r e s-e n t d a n g e r of N e w D e l h i m e t a l l o-β-l a c t a m a s e:a t h r e a t t op u b l i c h e a l t h[J].F u t u r e M i c r o b i o l,2021,15(1):1759-1778.[17]L I F T,Y E K,L I X,e t a l.G e n e t i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f C a r-b a p e n e m-R e s i s t a n t E sc h e r i c h i a c o l i f r o m C h i n a,2015-2017[J].B M C M i c r o b i o l,2021,21(1):248. [18]冯渐焘.碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌耐药机制及其基因环境的研究[D].青岛:青岛大学,2021.[19]P E I R A N O G,C H E N L,N O B R E G A D,e t a l.G e n o m i ce p i d e m i o l o g y ofg l o b a l c a r b a p e n e m a s e-p r o d u c i n g e s ch e-r i c h i a c o l i,2015-2017[J].E m e r g I n f e c t D i s,2022,28(5):924-931.[20]王倩.产N D M-5大肠埃希菌的同源性分析㊁传播机制及基因环境研究[D].郑州:郑州大学,2021. [21]余艳,刘淑敏,杜艳.携带b l a N D M-1基因阴沟肠杆菌研究进展[J].中国感染与化疗杂志,2021,21(2):225-229.[22]C HA T T E R J E E N,N I RWA N P K,S R I V A S T A V A S,e ta l.T r e n d s i n c a rb a p e n e m r e s i s t a nc e i n P r e-C O V I D a n dC O V ID t i m e s i n a t e r t i a r y c a r e h o s p i t a l i n N o r t h I n d i a[J].A n n C l i n M i c r o b i o l A n t i m i c r o b,2023,22(1):1.[23]LÓP E Z-JÁC OM E L E,F E R NÁN D E Z-R O D RÍG U E Z D,F R A N C O-C E N D E J A S R,e t a l.I n c r e m e n t a n t i m i c r o b i a lr e s i s t a n c e d u r i n g t h e C O V I D-19p a n d e m i c:r e s u l t s f r o m t h e i n v i f a r n e t w o r k[J].M i c r o b D r u g R e s i s t,2022,28(3): 338-345.(收稿日期:2022-12-16修回日期:2023-05-08)㊃9022㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n,A u g u s t2023,V o l.20,N o.15Copyright©博看网. All Rights Reserved.。

肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药最重要的机制

肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药最重要的机制
肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药的最重要机制通常涉及以下几个方面：
1. β-内酰胺酶产生：肠杆菌科细菌可以产生一种称为β-内酰胺酶的酶，它能够降解碳青霉烯类药物，使其失去抗菌活性。

这些酶的产生可以通过基因突变、水平传递或垂直传递等方式获得。

2. 碳青霉烯类药物的靶点变异：肠杆菌科细菌可以通过突变其外膜的脂多糖结构，从而降低碳青霉烯类药物通过外膜进入细胞的能力。

同时，它们还可以改变药物的结合位点，降低药物与靶点之间的亲和力。

3. 外膜通道变化：肠杆菌科细菌可以调节其外膜通道的表达和功能，从而限制碳青霉烯类药物通过外膜通道进入细胞的能力。

4. 外胞蛋白泵的表达：肠杆菌科细菌通过上调外胞蛋白泵（也称为泌尿系统）的表达来增加碳青霉烯类药物从细胞内的排出，从而减少药物在细胞内的积累和抗菌活性。

5. 外源酶的产生：肠杆菌科细菌可以产生其他酶，如磷酸二酯酶和碳酸酯酶等，这些酶可以降解碳青霉烯类药物，减少其在细胞内的浓度。

碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌的耐药机制探讨

摘要：目的探讨本院存在的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药机制。方法临床检出碳青霉烯类抗菌药物非敏感肠杆
菌科细菌６。改￣Ｈｏｇ实验、ＥＴ株ｄｅＤＡ协同试验检、改良三维实验检测其耐药表型；引物特异性ＰＲ法检测其碳青霉烯酶耐药Ｃ
基因及外膜蛋白基因存在情况。结果１大肠埃希菌中改￣Ｈｏｇ实验弱阳性，ＥＴ株ｄｅＤＡ协同试验阳性，改良三维实验结果可被ＣＡ单独抑制，ＰＲ扩增结果Ｉ４ＬＣＭＰ碳青霉烯酶基因阳性。５产气肠杆菌改￣Ｈｄｅ验，阴性３，阳性两株，ＥＡ协同试验株ｏｇ实株ＤＴ
培南、美罗培南、厄他培南纸片由美国默沙东制药公
司赠送。溴化乙锭（Ｂ购自Ｓｇ公司，琼脂糖购自Ｅ）ｉｍａＢＯＳ公司，Ｐｅｉ购ＡＴＫＲ生物技术公司。ＩＷＥＴｒｍｘａａａ
Ｄｒｅ（Ｌ２０）白ＴＫａａＮＡＭａｒ．００购ｋＤａＲ生物技术公司。
ｉｈｓｈｓｉ１Ｍｅｈｄ６ｓｒｉｓｏａｂｐｎｍｎｉａｔｒａｒｇｎｎｓｎｉｖｎｅｏａｔｒｃａａｔｒａｎｔｉｏｐｔ．ａｔｏｓｔａｎｆｃｒａｅｅａｔｃｅｉｌｄｕｏ —ｅｓｔｅＥｔｒｂｃｅｉｅｅｂｃｅｉｂｉａ
ｔｅｐｅｅｃ；ｏｙｒｓｈｉｒａｔｎ（Ｃ）ｏｄｔｃｇｎｓｏｅｃｒａｅｅｓｓｎｕｅｍｂａｅｐｏｅ．ｈｒｓｎｅｐｌｍｅａｅｃａｅｃｉＰＲｔｅｔｅｅｆｈａｂｐｎｍａｅｄｏｔｒｎｏｅｔａｍｅｒｎｒｔｉｎ

耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的耐药性及分子机制研究

耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的耐药性及分子机制研究安童童;赵志军;李刚;康宇婷;刘学雷;杨宁爱;贾伟【摘要】目的探讨耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的耐药性及其分子机制.方法采用WHONET 5.6软件对某三甲综合教学医院2014-2016年分离的肠杆菌科中耐亚胺培南的细菌进行初筛,采用肉汤稀释法检测碳青霉烯类抗生素对细菌的最低抑菌浓度(MIC),用PCR方法检测blaNDM、blaKPC-2、blaCTX-M-15、blaOXA-48等耐药基因;利用测序方法鉴定blaNDM亚型.结果共筛选出92株耐药菌,标本来源主要为胆汁、痰和无菌中段尿,92株耐药菌主要分离自肝胆外科、ICU和血管外科.药敏试验表明92株耐药菌对阿米卡星的敏感率最高(88％),对其他抗生素敏感率均较低,对头孢呋辛、头孢唑啉和亚胺培南的敏感率低至0.应用PCR检测耐药基因,其中blaNDM、blaCTX-M-15、blaTEM和blaSHV检出率较高,分别为64.1％、64.1％、91.3％和72.8％;blaKPC-2和blaVIM阳性率较低,分别为13.0％和3.3％,未检测出blaOXA-48耐药基因;测序发现59株blaNDM阳性菌中有35株为blaNDM-1,24株为blaNDM-5.结论耐碳青霉烯的肠杆菌科细菌耐药基因检出率高;宁夏地区首次发现blaNDM-5亚型;blaNDM型耐药基因的阳性率高,应加强对基因的监测,控制其在医院内的传播流行.%Objective To explore the molecular epidemiology and mechanism of bacteria resistant to carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Methods The WHONET5.6 software was used to screen the imipenem-resistant bacteria in Enterobacteriaceae isolated from a comprehensive teaching hospitalin2014-2016. The positive strains were tested for the minimum inhibitory concentration of carbapenem by broth dilution method. The blaNDM, blaKPC, blaCTX-M-15 and blaOXA-48 resistance genes were detected byPCR.NDM subtypes were identified by sequencing. Results A total of 92 resistant strains were screened. The main sources of samples were bile, sputum and aseptic midstream urine. 92 strains of resistant bacteria were mainly isolated from hepatobiliary surgery, ICU and vascular surgery. Drug susceptibility test showed that 92 resistant strains had the highest sensitivity to amikacin (88％), lower sensitivity to other antibiotics, and the susceptibility to cefuroxime, cefazolin and imipenem was as low as 0. PCR was used to detect drug resistance genes. The detection rates of blaNDM, blaCTX-M-15, blaTEM and blaSHV were 64.1％, 64.1％, 91.3％ and72.8％, respectively. The positive rates of blaKPC-2 and blaVIM were 13.0％ and 3.3％, respectively. No blaOXA-48 resistant genes were detected. 35 of 59 blaNDM-positive strains were blaNDM-1 and 24 were blaNDM-5. Conclusion Detection rates of resistance genes in Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae were very high which may cause nosocomial infections. blaNDM-5 subtype was found in Ningxia for the first time, and the positive rate of blaNDM type resistance gene was high. We should strengthen the monitoring of blaNDM type drug-resistant strains to control their spread in the hospital.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】5页(P19-23)【关键词】肠杆菌科;碳青霉烯酶;新德里金属-β-内酰胺酶-1;耐药基因【作者】安童童;赵志军;李刚;康宇婷;刘学雷;杨宁爱;贾伟【作者单位】宁夏医科大学临床医学院, 银川 750004;宁夏医科大学总医院医学实验中心, 银川 750004;宁夏病原微生物重点实验室, 银川 750004;宁夏医科大学总医院医学实验中心, 银川 750004;宁夏病原微生物重点实验室, 银川 750004;宁夏医科大学临床医学院, 银川 750004;宁夏医科大学临床医学院, 银川 750004;宁夏医科大学临床医学院, 银川 750004;宁夏医科大学总医院医学实验中心, 银川750004;宁夏病原微生物重点实验室, 银川 750004【正文语种】中文【中图分类】R378.2肠杆菌科细菌分布广泛，多数为肠道正常菌群，部分为致病菌，在某些情况下，尤其是免疫缺陷、粒细胞缺乏患者易引起各种严重感染，如下呼吸道、消化道、泌尿道、手术切口等多部位感染，故称为条件致病菌，是医院感染性疾病最重要的致病菌，已成为医学界共同关注的问题[1]。

碳青霉烯类抗生素耐药及治疗挑战

碳青霉烯类抗生素耐药及治疗挑战聂署萍;陆学东【摘要】碳青霉烯类抗生素曾被认为是临床治疗革兰阴性杆菌感染的最后一道防线。

随着一系列碳青霉烯酶的出现，临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药菌日益增多，并且这些病原菌常同时携带其他多种耐药基因，几乎对所有抗生素耐药，其所引起的感染有很高的病死率。

本文对碳青霉烯类抗生素耐药现状、耐药机制及相关感染的治疗进行综述。

%Carbapenems were once considered the last line of defense against serious infections with gram-negative pathogens. As carbapenemases are spreading, the incidence of carbapenem-resistant isolates is increasing. The rise of carbapenem resistance in these pathogens carrying additional resistance genes to multiple antibiotic classes has created a generation of organisms nearly resis-tant to all available therapy and the infections caused by these pathogens have been associated with high mortality rates. This review focuses on the current status and mechanisms of carbapenem resistance, and the treatment of related infections.【期刊名称】《传染病信息》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】5页(P134-138)【关键词】青霉属;抗菌药;药物耐受性;治疗学【作者】聂署萍;陆学东【作者单位】518033 深圳，广东医学院附属福田医院检验医学部;518033 深圳，广东医学院附属福田医院检验医学部【正文语种】中文【中图分类】R379碳青霉烯类抗生素是目前抗菌谱最广的一类非典型β-内酰胺抗生素，通过抑制细胞壁粘肽合成酶即青霉素结合蛋白合成细胞壁粘肽，导致细菌胞壁缺损、胞内渗透压改变和细菌溶解，从而发挥抗菌作用。

大肠埃希菌的临床分布及耐药性分析

大肠埃希菌的临床分布及耐药性分析作者：江晓红来源：《中国实用医药》2010年第36期【摘要】目的了解我院近2年来大肠埃希菌标本的来源构成及耐药情况，以指导临床合理用药。

方法对我院2008年3月至2010年5月间的各类临床标本进行分离培养，用天地人微生物分析系统生化试验卡鉴定，并用天地人微生物分析系统相配套的药敏试验卡进行药敏试验。

结果共分离大肠埃希菌285株；主要来源于中段尿标本(48﹒77%)；连续2年对亚胺培南无耐药株，耐药率低的其次是阿米卡星(10.18%)和阿莫西林/克拉维酸(12.28%)；对氨苄西林耐药率最高为81.40%。

大肠埃希菌ESBLs阳性率为33.68％，产ESBLs大肠埃希菌的耐药率远远高于非产ESBLs的菌株。

结论亚胺培南是治疗产ESBLs大肠埃希菌的首选药物。

应采取相应措施控制大肠埃希菌导致的医院感染流行及产ESBLs菌株的产生。

【关键词】大肠埃希菌；超广谱β内酰胺酶；抗菌药物大肠埃希菌是临床常见病原菌，可引起机体多部位、多脏器感染。

近年来，随着广谱抗菌药物应用，产β内酰胺酶的大肠埃希菌检出率不断增加［1］，给临床治疗带来困难。

为此，笔者对我院临床分离的大肠埃希菌进行了耐药性监测及统计学分析，现报告如下。

1 材料与方法1.1 菌株来源与鉴定收集本院2008年3月至2010年5月临床标本分离鉴定285株大肠埃希菌。

菌种的分离培养严格按照《全国临床检验操作规程》［2］进行，所有菌株鉴定采用天地人微生物分析系统鉴定至种。

1.2 药敏试验采用天地人微生物分析系统相配套的药敏试验卡测试，所测抗生素包括：氨苄西林、环丙沙星、复方新诺明、庆大霉素、妥布霉素、氨苄西林/舒巴坦、头孢曲松、头孢唑啉、亚胺培南、头孢噻肟、头孢他啶、阿米卡星、左氟沙星、氨曲南、阿莫西林/克拉维酸等15种。

1.3 产超广谱β一内酰胺酶(ESBLs)的检测采用NCCLS/CLSI推荐的ESBLs双纸片协同法和确证试验。

产碳青霉烯酶大肠埃希菌的耐药机制研究进展

酶还可水解青霉素类、头孢菌素类、单酰胺类。同其他的Ａ类Ｂ一内酰胺酶，Ａ类碳青霉烯酶可被克拉维酸和他唑巴坦抑制。成熟的Ａ类碳青霉烯酶为单体酶，含２６５个一２６９个氨基酸残基，分子量为２５ｋＤ一３２ｋＤ，ｐＩ为５．８～９．７［５１。目前在大肠埃希菌属已经发现的Ａ类碳青霉烯酶有ＫＰＣ、ＧＥＳ、ＩＭＩ等。．ＫＰＣ：ＫＰＣ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｅａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ）是Ｙｉｇｉｔ等首次从肺炎克雷伯菌中分离得到并于２００１年在美国报道命名的（作者已于２００８年纠正，６一和６ＫＰｃ一２序列一致，ＫＰＣ一１即ＫＰＣ一２）］，其和ＳＭＥ一１（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓｅｎｚｙｍｅ）的氨基酸序列存在４５％的一致性。之后多个国家包括我国均有产６型菌株感染的报道。多数研究表明］，ＫＰＣ的基因位于可移动的质粒上，极易在不同菌种之间传播，甚至造成局部暴发和流行，这也是ＫＰＣ型碳青霉烯酶迅速在世界范围内扩散的原因之一。也有怀疑携带６ＫＰ基因的细菌对碳青霉烯类药物并没有产生耐药性，而只是敏感性降低＿９。目前在大肠埃希菌中分离得到的ＫＰＣ包括ＫＰＣ一２、ＫＰＣ一３、ＫＰＣ一９，

大肠埃希菌药物耐药机制的分子生物学研究

大肠埃希菌药物耐药机制的分子生物学研究大肠埃希菌是人类常见的肠道细菌之一，同时也是引起腹泻和肠道感染的主要病原菌之一。

然而，随着抗生素的过度使用和滥用，大肠埃希菌的耐药性不断加强，传统的抗生素治疗大肠埃希菌感染逐渐失效。

因此，探究大肠埃希菌的耐药机制以及寻找新的治疗方法成为当前迫切的问题。

大肠埃希菌的耐药机制大肠埃希菌的耐药机制主要包括基因突变、水平基因转移和表观遗传学等方面。

基因突变是大肠埃希菌产生耐药性的主要途径之一。

一些基因突变会导致大肠埃希菌获得对抗生素的抵抗能力。

例如，一些基因突变可以使大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素不敏感，从而产生相应的抵抗能力。

水平基因转移也是大肠埃希菌产生耐药性的重要途径之一。

水平基因转移是指细菌通过吸收外源性的DNA片段来获得外源性基因。

大肠埃希菌可以通过共享质粒、嗜菌体和碎片DNA等渠道来获得外源性基因，从而获得相应的耐药性。

例如，暴露在抗生素中的大肠埃希菌会产生β-内酰胺酶，这种酶可以分解β-内酰胺类抗生素，从而使大肠埃希菌获得相应的抗药性。

表观遗传学是指没有改变DNA序列而改变DNA表达方式的一类机制。

表观遗传学机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等方面。

一些表观遗传学机制会影响细胞对抗生素的敏感性。

例如，组蛋白修饰可以影响细胞对β-内酰胺类抗生素的敏感性，从而导致大肠埃希菌产生相应的抗药性。

分子生物学研究为了更好地探究大肠埃希菌的耐药机制，分子生物学研究成为非常有必要的方法之一。

分子生物学是研究生物大分子（主要是核酸和蛋白质）结构和功能的学科。

分子生物学的研究方法包括PCR、基因克隆、蛋白质表达和纯化等方面。

PCR是聚合酶链式反应的缩写。

PCR技术具有高特异性、高敏感性和快速等特点。

PCR技术可以用于扩增特定的DNA序列，从而探究大肠埃希菌的耐药机制。

基因克隆是将DNA序列插入到质粒或噬菌体中，从而进行分子生物学研究的重要方法之一。

基因克隆可以用于获得大肠埃希菌耐药相关基因的表达载体，从而进行抗药性相关的功能研究。

耐碳青霉烯大肠埃希菌分子特征和同源性分析

耐碳青霉烯大肠埃希菌分子特征和同源性分析摘要：耐碳青霉烯大肠埃希菌（Carbapenem-resistant Escherichia coli，CRE）是一种严峻的抗生素耐药菌，已成为医疗机构感染控制的重要难题。

探究CRE分子特征和同源性对于深度了解该菌的分子机制和进一步探究其治疗方案具有重要意义。

本文通过对已公开的CRE菌株数量较多、分布区域较广、伴随临床感染病例较多的3个亚种（E. coli O157：H7、E. coli K12、E. coli B）进行基因组序列分析，探究其分子特征和同源性。

结果显示，这三个亚种中，多数菌株表现出CRE的耐药特征和β-内酰胺类酶产生能力，其中最主要的酶类为KPC、NDM、VIM和IMP。

此外，在这些亚种中也发现了一些共同的抗菌基因和质粒。

基于这些结果，我们认为，CRE的分子特征和同源性表明，该菌株可能源自多个分支，且不同地理区域间存在着分布不均和菌株多样性的现象。

因此，在控制CRE感染和研发新药时，需要依据其分子特征和同源性进行更加有针对性的探究。

关键词：耐碳青霉烯大肠埃希菌；分子特征；同源性分析；β-内酰胺酶；质除了已经报道过的KPC、NDM、VIM和IMP酶外，CRE还可以通过多种机制表现出耐药性，例如通过改变外膜蛋白、使用外泌体和细胞间信号传递等方式。

同时，CRE也可能带有多种抗菌基因和质粒，这些基因和质粒也可能参与CRE的耐药机制。

同源性分析显示CRE在遗传结构上存在较高的多样性，可能源自不同的遗传分支并在不同的地理区域产生分布不均。

因此，在防治CRE方面，需要思量其分子特征和同源性的差异，并制定相应的针对性策略。

例如，在临床上可以通过对不同类型的CRE分子特征的分子诊断和分子分型，以及依据不同抗菌基因和质粒的分析来针对CRE耐药机制进行精准治疗。

此外，研发新型抗生素或利用已有的抗生素联合应用也可能是控制CRE的有效手段之一。

总之，深度探究CRE的分子特征和同源性，对于预防和治疗CRE感染有着重要的意义此外，在控制CRE感染方面，预防是最为重要的措施。

大肠埃希菌对碳青霉烯类药物的耐药机制研究

大肠埃希菌对碳青霉烯类药物的耐药机制研究蒯守刚;邵海枫;王卫萍;范明;黄梅【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2010(030)009【摘要】目的研究我院普外科重症监护病房(ICU)出现的对碳青霉烯类抗菌药物耐药的大肠埃希菌分子流行病学特征和碳青霉烯耐药机制.方法采用琼脂稀释法检测分离株的抗菌药物敏感性,采用脉冲场琼脂糖凝胶电泳(PFGE)研究碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌分子流行病学机制,采用特异性PCR、DNA测序分析、接合试验、质粒提取和质粒转化试验、外膜蛋白分析等技术研究碳青霉烯耐药的分子机制.结果我院分离的14株碳青霉烯耐药菌分别属于10个流行克隆型,均表现对包括亚胺培南和美罗培南在内多种抗菌药物耐药,碳青霉烯类耐药基因扩增显示均携带KPC-2型碳青霉烯酶基因,质粒提取与转化试验显示KPC-2定位于约56 kb大小的质粒上,SDS-PAGE分析发现耐药株多出现外膜蛋白的改变.结论我院出现多个流行克隆型的碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌,质粒型碳青霉烯酶KPC-2是我院泛耐型大肠埃希菌介导对碳青霉烯类耐药的主要原因,外膜孔蛋白改变参与介导大肠埃希菌对碳青霉烯类高度耐药.%Objective To investigate the molecular epidemiology and mechanism of carbapenem resistance of Escherichia coli collected from intensive care units(ICUs)of general surgery.Methods Agardilution were carried out to confirmed the drug-susceptibility,pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)were performed to analyze the molecular epidcmiology of carbapenem-resistance isolates.Specific PCR,DNA sequencing,conjugation experiments,plasmids extraction,plasmidtransformation assays and SDS-PAGE of outer membraneproteins(OMPs)were carried to confirm genotype of carbapenemase and its transmission mechanism.Results PFGE showed the isolates belonged to 10 clonotype,and a ll the clinical isolates were resistant to β-lactams including imipenem and meropenem,but uncertain to aminoglycosides,specific PCR and DNA sequencing revealed that all isolates encoded carbapenem-hydrolyzing enzyme gene,KPC-2.Plasmid DNA extraction and plasmid transformation assays from some isolates comfirmed that KPC-2 encoded on a 56 kb plasmid.SDS-PAGE analysis confirmed that there are alterations in OMPs of Escherichia coli.Conclusion Escherichia coli isolates with carbapenem resistance are collected from our hospital,production of KPC-2 carbapenemase mainly contributed to reduced susceptibility of carbapenem in Escherichia coli,the alterations in OMPs may as a cofactor in high-level drug-resistance in Escherichia coli.【总页数】5页(P829-833)【作者】蒯守刚;邵海枫;王卫萍;范明;黄梅【作者单位】210002,南京军区南京总医院解放军检验医学研究所临床中心实验科;无锡市传染病医院;210002,南京军区南京总医院解放军检验医学研究所临床中心实验科;210002,南京军区南京总医院解放军检验医学研究所临床中心实验科;210002,南京军区南京总医院解放军检验医学研究所临床中心实验科;210002,南京军区南京总医院解放军检验医学研究所临床中心实验科【正文语种】中文【相关文献】1.耐碳青霉烯肺克雷伯菌和大肠埃希菌耐药机制研究2.1株血标本分离的碳青霉烯类、磷霉素耐药大肠埃希菌耐药机制研究3.ST131型产NDM-1型碳青霉烯酶大肠埃希菌的耐药机制研究4.大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制研究5.胆道感染大肠埃希菌的耐药性及喹诺酮类药物的耐药机制研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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方法　２００７—２０１１年从杭州市３家医院分离到２２株对碳青霉烯类抗生素不敏感的大肠埃希菌。

琼脂稀释法测定抗生素最低抑菌浓度（ＭＩＣ）；接合试验、ＰＣＲ扩增和序列分析等研究细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制。

脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）、多位点序列分型（ＭＬＳＴ）和系统发育分型（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｙｐｉｎｇ）等对菌株进行分子分型。

结果　２２株大肠埃希菌亚胺培南和美罗培南的ＭＩＣ范围为１～１６μｇ／ｍｌ，厄他培南为２～６４μｇ／ｍｌ。

所有菌株产ＫＰＣ－２型碳青霉烯酶及各种β－内酰胺酶，部分菌株同时产质粒介导的ＡｍｐＣ酶。

结论　杭州地区产ＫＰＣ－２大肠埃希菌主要为世界范围流行的多重耐药菌株ＳＴ１３１，其次为ＳＴ６４８。

碳青霉烯类抗生素被认为是目前临床上控制革兰阴性菌感染最有效的抗生素，早期对碳青霉烯类耐药的革兰阴性菌主要为铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌等非发酵菌，但近年来肠杆菌科细菌对碳青霉烯类的耐药问题逐渐成为临床抗感染治疗中的一个重要问题。

肠杆菌科细菌最常见的碳青霉烯耐药机制为碳青霉烯酶的产生，其中最引人注目的是ＫＰＣ型碳青霉烯酶［１－２］。

目前报道ＫＰＣ在多种肠杆菌科细菌和非发酵菌中均有检出，其中以肺炎克雷伯菌最为常见，在大肠埃希菌中较为少见，以色列［３］、美国［４－６］、法国［７］和巴西［８］等国均有分离到产ＫＰＣ大肠埃希菌。

我院最早在２００７年检出产ＫＰＣ－２的黏质沙雷菌，随后又陆续分离到大量产ＫＰＣ－２的其他肠杆菌科细菌［９－１１］，其中多数为肺炎克雷伯菌，大肠埃希菌菌株数量较少但有逐年增加的趋势。

２００７至２０１１年，我院共分离到１２株产ＫＰＣ－２大肠埃希菌，２０１１年分离的菌株占半数。

此外，杭州的另外两家医院也分离到了产ＫＰＣ－２大肠埃希菌，其中杭州市中医院分离到９株产ＫＰＣ－２大肠埃希菌（２０１１年６株），浙江省人民医院在２００７年也分离到１株产ＫＰＣ－２大肠埃希菌。

本研究对这３家医院共２２株对碳青霉烯类抗生素不敏感的大肠埃希菌进行研究，以了解这些产ＫＰＣ－２型碳青霉烯酶大肠埃希菌株之间的遗传关系。

材料和方法菌株来源：２００７至２０１１年从杭州市３家医院收集到２２株对碳青霉烯类抗生素不敏感的大肠埃希菌，其中１２株分离自浙江大学医学院附属第二医院，９株分离自杭州市中医院，１株分离自浙江省人民医院。

按年份统计，２００７年分离到４株，２００８年无，２００９年２株，２０１０年４株，２０１１年增加至１２株。

大部分患者为患有心脑血管疾病或呼吸系统疾病的老年人，２２位患者中１７位来自重症监护病房（ＩＣＵ）。

约有一半菌株（１２／２２）分离自痰标本，其余分离自无菌体液或分泌物。

菌株分离前两周，有半数患者使用过碳青霉烯类抗生素，半数患者使用过抗革兰阳性菌药物如万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺（表１）。

表１　产ＫＰＣ－２大肠埃希菌患者相关临床资料Ｔａｂｌｅ１．ＣｌｉｎｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＫＰＣ－２－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＥ．ｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓ医院菌株分离时间病房标本来源菌株分离前两周所用抗生素性别／年龄（岁）患者基础疾病浙江大学医学院Ｅ１２００７－０１脑科ＩＣＵ痰液哌拉西林／他唑巴坦男／５６脑出血、多发性骨折、肺挫伤附属第二医院Ｅ２２００７－０４脑科ＩＣＵ血液头孢哌酮／舒巴坦、环丙沙星、美罗培南、万古霉素女／６８小脑出血　Ｅ３２００７－１０脑科ＩＣＵ痰液头孢呋辛男／８４脑出血　Ｅ４２００９－０６中心ＩＣＵ引流液亚胺培南、替考拉宁、阿米卡星女／６３直肠癌　Ｅ５２０１０－０３脑科ＩＣＵ尿液头孢吡肟、替考拉宁女／８５脑梗塞、冠心病、尿路感染　Ｅ６２０１０－０３外科引流液帕尼培南、拉氧头孢男／６３胃癌　Ｅ７２０１１－０８神经内科尿液无女／４７脑出血、高血压病　Ｅ８２０１１－０９中心ＩＣＵ尿液环丙沙星、替考拉宁男／８７脑梗塞、高血压病、冠心病、肺炎　Ｅ９２０１１－１０呼吸内科痰液无男／７５肺炎、高血压病　Ｅ１０２０１１－１１中心ＩＣＵ尿液呋喃西林、亚胺培南、左氧氟沙星、替考拉宁男／７３肺炎、糖尿病　Ｅ１１２０１１－１２中心ＩＣＵ血液亚胺培南、男／６８ＡＥＣＯＰＤ、急性冠脉综合征、高血压病　Ｅ１２２０１１－１２呼吸内科痰液头孢哌酮／舒巴坦女／６３肺炎杭州市中医院Ｅ１３２００９－１２中心ＩＣＵ痰液万古霉素、阿米卡星、美罗培南、头孢哌酮／舒巴坦男／８０脑梗塞、ＡＥＣＯＰＤ、冠心病　Ｅ１４２０１０－０９中心ＩＣＵ创面分泌物万古霉素、亚胺培南、头孢哌酮／舒巴坦、利奈唑胺男／８６ＡＥＣＯＰＤ、多器官衰竭　Ｅ１５２０１０－１２急诊ＩＣＵ痰液头孢西丁、哌拉西林／他唑巴坦、莫西沙星男／８３肺炎、冠心病　Ｅ１６２０１１－０１急诊ＩＣＵ痰液无男／８４ＡＥＣＯＰＤ、冠心病　Ｅ１７２０１１－０１急诊ＩＣＵ痰液美罗培南、左氧氟沙星、替考拉宁女／７５脑出血、高血压病、糖尿病、肺炎　Ｅ１８２０１１－０２呼吸内科痰液莫西沙星、哌拉西林／他唑巴坦女／５９ＣＯＰＤ、高血压病　Ｅ１９２０１１－０２急诊ＩＣＵ痰液替考拉宁、美罗培南、莫西沙星男／７４高血压病、糖尿病、肺炎　Ｅ２０２０１１－０２中心ＩＣＵ尿液美罗培南、头孢吡肟、替考拉宁女／７９ＣＯＰＤ、冠心病、高血压病　Ｅ２１２０１１－０３急诊ＩＣＵ痰液头孢吡肟男／７８脑梗塞、糖尿病浙江省人民医院Ｅ２２２００７－０８中心ＩＣＵ痰液万古霉素、美罗培南、环丙沙星男／７２高血压病、糖尿病注：ＡＥＣＯＰＤ：慢性阻塞性肺病急性发作；ＣＯＰＤ：慢性阻塞性肺病仪器和试剂：Ｖｉｔｅｋ２ｃｏｍｐａｃｔ细菌鉴定仪：法国ＢｉｏＭéｒｉｅｕｘ公司；ＰＣＲ扩增仪、ＲｏｔａｐｈｏｒＳｙｓｔｅｍ６畅０脉冲场凝胶电泳仪、ＵＶＩＢａｎｄＰＦＧＥ图像分析软件及紫外成像系统：德国Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司；细菌多点接种仪：日本ＯｒｉｅｎｔａｌＭｏｔｏｒ公司；Ｔａｑ酶及ＰＣＲ反应相关试剂：日本ＴａＫａＲａ公司；细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒：美国Ａｘｙｇｅｎ公司；ＤＹＹ－１１型水平电泳仪：北京市六一仪器厂；高效感受态细胞制备试剂盒：上海捷瑞生物工程有限公司。