大学课程遗传学实验实验四 孚尔根(Feulgen)核染色课件
实验四染色体核型分析课件
臂比（长/ 短）
Arm ratio(L/
S)
类型 Type
1 3.25+0.99=4.24
7.05
2 2.49+0.92=3.41
5.61
3 2.06+1.02=3.08
5.06
4 1.71+1.03=2.74
4.51
5 1.46+0.96=2.42
3.99
6 1.21+0.92=2.13
3.52
L
核型模式图
二、实验原理
不同物种的染色体都有各自特定的形态结构 （包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随 体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳 定的。因此，染色体核型分析是生物种质资源 遗传性研究的重要内容。
染色体核型分析主要包括染色体长度、染色体 臂比、着丝点位置、次缢痕等。
三、实验材料及用品
3.27
st
L
2.70
sm
L
2.03
sm
M2
1.66
m
M2
1.51
m
M1
1.32
m
五、实验方法与步骤
1.用Photoshop图像处理软件，对染色体照片进行适 当的编辑（包括去色、调节反差和对比度）、并对 染色体进行初编号。
2.用Image j 或 Image tool软件，测量每一条染色体 的短臂、长臂的长度，计算其相对长度、臂比值。
核型(karyotype) 是指染色体组在有丝分裂中期的表型,
包括染色体数目、大小、形态特征的总和。 核型模式图(idiogram)
将一个染色体组的全部染色体逐个按 其特征绘制下来, 再按长短、形态等特征排 列起来的图象称为核型模式图,它代表一个 物种的核型模式。
孚尔根染色法
孚尔根染色法DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。
1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。
孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。
实验原理：细胞中的DNA受1NHC1，60℃水解作用以后，核酸中的嘌呤碱很快完全被除掉，使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态。
水解后，组织要经水洗再移至希夫（Schiff）试剂中，希夫试剂即同露出来的醛基发生反应，呈现紫红色。
这个反应是Feulgen在1942年提出来的，是DNA的一个特异性检查法。
水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程，第一，漂呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来，第二，组蛋白和核酸愈来愈多地被除掉。
在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用希夫试剂染色，染色体的染色作用最强。
随着水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的希夫反应增强，而染色体中的希夫应减弱。
最后，第二个过程超过第一过程时，染色体也随之停止反应。
希夫试剂是碱性品红———亚硫酸溶液，呈无色。
与DNA醛基反应后，使碱性品红恢复原来的红色。
二、实验目的：观察蚕豆根尖细胞或其它根尖细胞内染色体中的DNA，以及染色体在有丝分裂中的行为，掌握Feulgen染色方法。
三、实验材料：上次实验制成了石蜡切片。
四、实验准备：1．用具立式染色缸一套，镊子，盖玻片，小漏斗，铁架，毛边纸，玻璃棒，显微镜，恒温水浴锅，温度计，烧杯，棕色瓶，黑纸。
2．玻璃器皿的清洗主要是染色缸的清洗，一般用肥皂粉洗，用水冲净即可，如不能洗净时，要用洗液浸泡后，再冲洗，自来水洗后，再用少量蒸馏水过洗一次。
盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必须干燥，缸盖内缘必须涂以几士林，以防止蒸发和收水分，影响浓度。
染色缸上要贴上标签。
植物染色体的孚尔根染色法
四、实验步骤
1. 希夫试剂的配制
• 将0.5g碱性品红徐徐加入煮沸的 碱性品红徐徐加入煮沸的100ml蒸馏水中 用玻璃棒搅拌 蒸馏水中, 碱性品红徐徐加入煮沸的 蒸馏水中 用玻璃棒搅拌, 使之充分溶解, 待溶液冷却至58°C左右 过滤于棕色瓶中。 使之充分溶解 待溶液冷却至 ° 左右, 过滤于棕色瓶中。 左右 • 当滤液冷却至 °C时, 再加入 当滤液冷却至26° 时 再加入10ml的1M盐酸和 盐酸和0.5g亚硫酸氢钠 的 盐酸和 亚硫酸氢钠 或偏重亚硫酸钠(钾 摇动, 溶解后密封于棕色瓶中, 或偏重亚硫酸钠 钾), 摇动 溶解后密封于棕色瓶中 置于黑暗 低温处。次日检查溶液颜色, 须呈无色透明或淡茶色才可使用。 低温处。次日检查溶液颜色 须呈无色透明或淡茶色才可使用。 • 若稍呈红色可加入 若稍呈红色可加入0.5g活性炭连续摇动 在4°C下静置过夜 然 活性炭连续摇动, 下静置过夜, 活性炭连续摇动 ° 下静置过夜 后过滤脱色。 后过滤脱色。
2. 染色过程
① 取固定好的根尖, 用水洗2-3分钟, 放入室温条件下的1N HCl处理根尖 材料2-3分钟。 ② 将根尖换入60℃预热的HCl, 置于恒温水浴中, 在60±0.5℃的条件下水 解8-10分钟。 ③ 吸出热HCl, 换入室温1N HCl再处理1-2分钟, 然后水洗2-3次。 ④ 吸净水分, 加入Schiff试剂, 盖上盖子, 在黑暗条件下染色30分钟, 也可 过夜。 ⑤ 用水漂洗, 去掉细胞中残存的一些有色的品红分子。 ⑥ 取根尖置载玻片上, 用镊子夹碎后, 加一滴45%醋酸, 然后盖上盖片。 ⑦ 压片、观察。
玉米染色体核型图(2n=20), Feulgen 染色
玉米染色体核型图(2n=20+2B)
玉米染色体核型图(2n=20+4B) /mnl/79/18rosado.htm
细胞生物学：实验4 feulgen反应显示细胞中的DNA
实验四
Feulgen 反应显示细胞中 的DNA
细胞膜/壁 细胞质
核仁
标题
细胞核
染色方法（放大倍数）
作业：用铅笔绘制一个洋葱根尖细胞并注 明各主要部位的颜色。
绘图的要求见实验ห้องสมุดไป่ตู้告P16。
选取具有普遍性的细胞
线条平滑、点均一、细致
5）弃去schiff试剂，用 1ml 亚硫酸氢钾洗 3 次，每次浸泡 2-3 min；
6）弃去亚硫酸氢钾，用 2ml 左右的蒸馏水漂洗 2 遍；
7）吸取洋葱根尖置于玻片上，稍微吸取水分；滴加 1 滴 4.5％ 醋酸，然后 盖上盖玻片，轻压使根尖散开成单层云雾状；
8）观察：在低倍镜下找到分生区细胞，再高倍镜下观察细胞各部位的染色反 应。
实验目的
• 了解Feulgen反应的基本原理 • 熟悉Feulgen反应的染色方法 • 掌握生物学绘图方式
实验原理
DNA可在酸性条件下水解，嘌呤—脱氧核糖之间的糖苷键 断开，形成醛基(—CHO)，再用显示醛基的特异性试剂Schiff 试剂处理，形成光镜下所见的细胞核内紫红色反应产物。
Schiff试剂的主要成分是碱性品红，碱性品红结构中的醌基是一个发 色基团，经亚硫酸处理后，则醌基两端的双键打开，形成无色品红-硫 酸复合物。
紫红色
Meristem
洋葱根尖
实验步骤
1）取 0.6cm 长的洋葱根尖放到离心管中；
《孚尔根核染色》课件
染色过程
孚尔根核染色包括几个关键步骤：细 胞固定、细胞通透性处理、DNA氧化 、染色和观察。
染色过程需要在弱酸条件下进行，以 促进DNA的氧化和后续的染色反应。
在染色过程中，需要使用特定的染料 ，如Giemsa染料或巴尔巴土染料，这 些染料能够与DNA-蛋白质加合物结 合，产生明显的染色效果。
染色效果
政策支持
政府可以出台相关政策， 支持孚尔根核染色技术的 研发和应用，促进其发展 壮大。
感谢您的观看
THANKS
该技术可用于DNA多态性分析 ，有助于研究基因变异与疾病 的关系。
技术局限性
1 样本量要求
孚尔根核染色技术需要一定量的样本才能进行检测，对 于微量样本可能存在限制。
2 交叉污染风险
孚尔根核染色技术需要一定量的样本才能进行检测，对 于微量样本可能存在限制。
3 假阳性结果
孚尔根核染色技术需要一定量的样本才能进行检测，对 于微量样本可能存在限制。
减少人工操作误差。
降低成本
通过优化试剂和设备， 降低检测成本，使更多 实验室和医疗机构能够
应用该技术。
05
孚尔根核染色技术的未来发展
技术发展趋势
自动化与智能化
随着机器人技术和人工智能的发展，孚尔根 核染色技术将逐渐实现自动化和智能化，提 高染色效率和准确性。
环保与可持续发展
随着环保意识的提高，未来的孚尔根核染色 技术将更加注重环保和可持续发展，减少对 环境的污染和资源消耗。
《孚尔根核染色》PPT课件
目录
• 引言 • 孚尔根核染色技术原理 • 孚尔根核染色技术的应用 • 孚尔根核染色技术的优缺点 • 孚尔根核染色技术的未来发展
01
引言
核染色技术简介
孚尔根反应
实验九 孚尔根反应（Feulgen Reaction）Feulgen反应（Feulgen reaction）是显示DNA的最典型的组织化学反应，是学者Feulgen和Rossenbeck 在1924年首次发明出来的，简称为Feulgen法。
因对DNA的显示反应具有高度专一性，因此常常被用来显示细胞内DNA的分布情况。
实验目的1. 熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法2. 对细胞的免疫组化研究方法有一初步的认识实验原理自Feulgen等发明出显示DNA的Feulgen反应方法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已基本取得共识。
其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。
Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。
也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。
其反应机制如下图所示。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3实验用品一、材料 香柏油5瓶，擦镜纸5本，镊子5把，盖玻片20片，用carnoy's固定液固定的肝脏和精巢切片20片。
二、试剂1. schiff氏试剂将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5min 使之充分溶解，冷却至50℃时过滤，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃时，加入0.5g偏重亚硫酸钠(Na2S2O3)无水亚硫酸钠(NaHSO3)，在室温冷暗处至少放置24h(有时需2~3天)，使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。
在使用前加入0.5g活性碳, 摇1min, 用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。
2. 亚硫酸水(洗涤剂) 用200ml普通自来水(不要用蒸馏水, 以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。
孚尔根(FEULGEN) 染色
Schiff 试剂的配置
称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶）， 时时振荡，继续煮 5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然 后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1N HCl，冷却至 25℃时，加入0.5g Na2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡 后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需2～3天）， 使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟， 最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应 为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。如有白色沉淀，就不 能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之 再转变为无色时，仍可再用
反应原理
样品经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤 碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛 基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应， 形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色 团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经 稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用， 可与无色品红结合形成紫红色化合物，从 而显示出DNA的分布。
操作方法及步骤
以Feulgen染色法观察洋葱根尖有丝分裂为例
•1．将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1N HCl中， 加热到60℃水解8～10 min。 • 2．蒸馏水水洗。 •3．Schiff试剂遮光染色30min。 •4．用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次 1min。 • 5．水洗5min。 •6．将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖 玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。 • 7．显微镜检查。 结果：细胞中凡有DNA的部 位应呈现紫红色的阳性反应。
孚尔根染色法的反应原理主要与Schiff试剂的化学性质有关，此试剂的基本 成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是 三氨基三苯甲烷氯化物。
孚尔根核染色25页PPT
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
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孚尔根核染色
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴
《DNAFeulgen染色》课件
添加标题
应用：DNAFeulgen染色技术广泛应用于细胞生物学、遗传学、病理学等领域，用于观 察DNA的分布和形态，研究DNA的结构和功能。
DNAFeulgen染色技术的优势
高灵敏度：能够检测出极低浓度的DNA，提高了检测的准确性。 特异性高：只与DNA中的碱基结合，不受其他物质干扰。 染色效果好：染色后细胞核颜色鲜艳，易于观察和分辨。 稳定性好：染色后颜色稳定，不易褪色，有利于长期保存。
染色步骤：严格按照操作规程进行染色， 避免遗漏或错误操作
染色后处理：染色完成后，及时进行后处 理，如清洗、脱水、封片等
安全防护：操作过程中注意个人防护，避 免接触有害物质
染色后的注意事项
染色后立即用清水冲洗，避免染色过度 染色后应立即观察，避免染色时间过长导致染色效果不佳 染色后应立即进行后续实验，避免染色效果随时间变化 染色后应避免阳光直射，避免染色效果受到破坏
染色前的注意事项
确保实验环境清洁，避免污染 准备足够的染色试剂，避免中途中断 确保实验材料新鲜，避免变质 严格按照实验步骤操作，避免错误
染色过程中的注意事项
染色时间：根据样本类型和染色目的，选 择合适的染色时间
染色温度：保持稳定的染色温度，避免过 高或过低
染色剂浓度：根据样本类型和染色目的， 选择合适的染色剂浓度
域进一步拓展应用
DNAFeulgen染色技术在未来医学和生物学研究中的应用 前景
细胞生物学研究：用于研究细胞结构、 功能及基因表达等
药物研发：用于研究药物作用机制、药 物筛选等
遗传学研究：用于研究遗传病、基因突 变等
生物技术：用于基因工程、细胞工程等
肿瘤学研究：用于研究肿瘤的发生、发 展及治疗等
环境科学：用于研究环境污染、生物多 样性等
DNA的孚尔根反应PPT教学课件
一、实验目的
掌握孚尔根（Feulgen）反应的原理和 方法，观察了解DNA在细胞内的分布。
二、实验器材及试剂
显微镜、染色缸、剪刀、镊子、培养皿等；
1M HCl、席夫试剂、亚硫酸水溶液等。
2020/12/09
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三、实验材料 洋葱
四、实验原理
孚尔根反应是 Feulgen 和 Rosserbeck于1924 年发现的,是鉴定细胞内DNA特殊有效的方法。其 原理一般认为：稀酸（1M HCl,60℃)水解DNA，打 开DNA分子上嘌呤碱和脱氧核糖连接的键，从而使 脱氧核糖中的醛基释放出来，然后再与席夫试剂 （Schiff试剂，无色品红）反应，由于醛基的氧 化作用，使之与无色品红结合成紫红色的化合物。 细胞内凡有DNA的地方都呈阳性反应。
2020/12/09
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PPT精品课件
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2020/12/09
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五、实验方法
1、将洋葱鳞茎内表皮放在1mol/l的HCl中， 加热到60℃水解8-10分钟。
2、蒸馏水水洗。 3、入席夫试剂 6、将鳞茎内表皮放在载玻片上，盖好盖玻片
，用吸水纸吸去玻片上多余的溶液，置显微 镜下检查，细胞内凡有DNA的地方都呈阳性 反应（玫瑰红色）。
Feulgen染色
Feulgen反应的基本原理：
稀HCl水解DNA，破坏嘌呤和 脱氧核糖间的配糖键，并在脱 氧核糖C1端形成游离的醛基， 醛基和Schiff试剂结合，形成 紫红色的化合物。因此在有 DNA的部位，就会呈现除紫 红色阳性反应。
三、实验步骤 核酸的显示——Feulgen反应
1. 取鸭血，血涂片，室温凉干，甲醇室温固定5 min，凉干; 2. 蒸馏水过一下； 3. 1 mol/L 盐酸(600C )水解8-10 min; 4. 1 mol/L 盐酸（室温）1 min; 5. 蒸馏水稍洗； 6. 置Schiff试剂中室温染色1小时左右； 7. 亚硫酸盐溶液洗3次，总时间为6 min; 8. 自来水流水冲洗5 min，蒸馏水过一下； 9. 用1%亮绿水溶液复染5-10秒； 10. 自来水流水冲洗2 min; 11. 蒸馏水稍洗； 12. 甘油/PBS封片剂封片；显微镜观察。
四、注意事项
1. 使用Schiff试剂时要注意不小心染色; 2. 盐酸水解时要注意温度及处理时间.
五、作业与思考题
简述Feulgen反应和PAS反应的原理， 并描述显微观察到的实验现象。
思考题: Schiff试剂的主要作用是什么?
PAS反应的基本原理：
利用强氧化剂使多糖产生游离的 醛基，醛基和Schiff试剂结合， 形成紫红色的化合物。因此在有 多糖的部位，就会呈现除紫红色 阳性反应。
二、试剂与器材
青蛙、鸭子 剪刀、载玻片、盖玻片、吸管、甲醇、1 mol/L 盐 酸、Schiff试剂、亚硫酸盐溶液、1%亮绿水溶液、 1%过碘酸、苏木精、甘油/PBS封片剂 普通光学显微镜
糖类的显示——PAS反应
feulgen染色法
feulgen染色法Feulgen染色法是一种细胞核染色的技术，是由德国生物学家弗朗西斯·费尔根（Robert Feulgen）在1914年发明的。
该技术的主要原理是利用増感反应特异性亲合性使DNA成为已知物质之一的二硫化物发生比较强的发色反应，因而得名 Feulgen 染色法。
Feulgen染色法以弗洛分离作为基础原理，对细胞内的核酸进行染色，并通过显微镜观察、分析和研究细胞发生分裂的相关特征。
该方法能够比较准确的区分细胞核与其他成分，尤其是有机质成分。
因此，Feulgen染色法在细胞学、细胞遗传学、组织学等领域中都有广泛的应用。
下面是 Feulgen 染色法的步骤：1. 细胞固定将要检测的细胞固定于载玻片上， Feulgen 染色法通常使用3.7%的甲醛作为固定液，使DNA在细胞和载玻片上不再发生运动和变化。
2. 酸解样品的酸解可以利用鹰嘴豆素和酸来进行。
这一步旨在剥离细胞的蛋白质并让核酸暴露在表面上，使其改变成醛基结构，以便接下来的染色成分与核酸相互作用。
3. 饱和无水硝酸样品用饱和无水硝酸处理，以去除酸中不必要的离子，同时也可以使其完成DNA的醛基反应。
4. Feulgen 组合液染色细胞样品将在染色溶液中放置2至10分钟，然后被放置于高氯酸中洗涤。
洗后，样品将被去水、除脂和用玻片覆盖。
5. 显微镜下观察使用荧光显微镜观察样品，利用目镜下特殊荧光物质的作用，可以使核酸发亮，显露出来并被直接观察到。
总的来说，Feulgen 染色法是一种快速、准确的核酸染色方法，可用于在细胞组织学、细胞遗传学和生物亚细胞学等领域中快速、准确地检测DNA的含量，为对生命现象的研究提供了有效的工具。
实验四 孚尔根(FEULGEN)反应
9．封片：中性树胶封片
10．贴标签，镜检
组织切片
鱼血涂片 95％乙醇固定 Feulgen反应 日期 姓名
五：实验结果
细胞核呈紫红色，细胞质呈浅绿色，对 照片只呈浅绿色。
六、作业
简述Feulgen反应的原理及关键步骤。
二、实验用品
1. 器材：显微镜、盖玻片、染色缸、眼科剪、解 剖刀、镊子、水浴锅
2. 试剂： 95％乙醇（固定液）、Schiff氏试剂、 1N盐酸、亚硫酸水、1%亮绿甲苯、酒精、中 性树胶
3. 材料：鸡血或鱼血涂片
三、实验原理
细胞中DNA经1N60℃盐酸水解后， DNA双螺旋结构中的嘌呤与脱氧核糖之间的 连接打开，并在脱氧核糖的一端形成潜在的 醛基。这些醛基与Schiff氏试剂作用，形成 紫红色的三苯甲烷衍生物。
四、实验方法
1．血涂片放入90％乙醇中固定1’30l’ink’ 2．放入70%酒精1’, 放入蒸溜水1’ 3．稀酸水解：1N HCl (室温) 1’
1N HCl 60℃水浴 8’ 1N HCl (室温) 1’ 蒸馏水 1’ 对照片以5%三氯醋酸90℃水浴l5’抽提核酸 后，再经稀酸水解。
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实验四feulgen反应孚尔根光镜标本制作一实验目的?了解dna的显示原理并掌握其操作过程
实验四 孚尔根 （Feulgen）反应
光镜标本制作
切片法： 取材 固定 切片 贴片
非切片法： 1. 涂片法 2. 磨片法 3. 分离法等
脱水 染色
透明 包埋 封片 观察
一、实验目的
了解DNA的显示原理并掌握其操作过程。
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4．染色： Schiff氏试剂30’-40’
5．分色 ：亚硫酸水I、Ⅱ、Ⅲ 各 2’
实验4 Feulgen反应制作细胞DNA定性、定量测量样品
恒温水浴锅两台
四、实验方法
2019/7/4
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每人做三片：①样品；②对照
固定→酸解→水洗→避光染色→ 亚硫酸水漂洗→水洗→压片→镜检
2019/7/4
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介绍：RNA显色——Brachet反应
甲基绿-派洛宁为碱性染料，它能分 别于细胞内的DNA和RNA结合而呈现不 同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料 时，甲基绿与染色质中的DNA选择性结 合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞 质中的RNA选择结合显示红色。其原因 可能是两种染料的混合染液中有竞争作用， 同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合 程度有所不同。甲基绿易于聚合程度高的 DNA结合呈现绿色，而派洛宁则与聚合 程度较低的RNA结合呈现红色，但解聚 的DNA也能与派洛宁结合呈现红色。总 的说来，RNA对派洛宁亲和力大，被染 成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被 染成蓝绿色。
二、实验原理
2019/7/4
3
HCl+Na2S2O5→ →亚硫酸根 亚硫酸根+碱性品红→ →无色的亚硫酸品红—Schiff试剂 DNA在60℃，1 mol/L HCl溶液作用下形成半缩醛羟基，
与Schiff试剂反应，形成紫红色化合物。
2019/7/4
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三、实验器具与药品
•每组学生
复式显微镜（带油浸物镜）；擦镜纸；记号笔；小片 滤纸；载玻片；镊子；Carnoy固定液；Schiff试剂； 1mol/L HCl；自来水；香柏油、二甲苯；甲基绿
实验 4
2019/7/4
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Feulgen反应制作细胞
DNA定性、定量测量样品
一、实验目的
1．掌握临时制片法。 2．熟悉Feulgen反应的原理及操作步骤。 3．观察细胞中DNA的分布
孚尔根反应
孚尔根反应实验目的1. 熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法2. 对细胞的免疫组化研究方法有一初步的认识实验原理标本中DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与Schiff试剂中无色品红结合形成紫红色化合物（含醌基），从而显示出细胞中DNA的分布。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3实验用品一、器材显微镜、立式染色缸、水浴锅二、材料香柏油，擦镜纸，镊子，盖玻片，用carnoy's固定液固定的肝脏切片。
三、试剂1. schiff氏试剂2. 亚硫酸水(洗涤剂，现配现用) 用200ml普通自来水(不要用蒸馏水, 以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合。
3. 1mol/L HCl(水解用) 取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成(应将盐酸缓缓加入水中)。
4. 1%亮绿(light green) 亮绿1g，溶于100ml蒸馏水中。
5. 30%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度酒精及二甲苯。
实验方法1. 取材与固定2. 脱水3. 制片（已完成）4. 脱蜡将制片经二甲苯I(20 min)和二甲苯II(分别10 min、12min、14min)将石蜡脱净，再经100%、95%、85%、70%、50%、30%的酒精5各min，最后放入蒸馏水中（10 min）。
5. 水解先将制片放入一盛有1 mol/L HCl的染色缸内，清洗一下，然后将载片放入已温浴至60℃的1 mol/L HCl溶液中水解8 min。
水解后很快将标本取出，放入室温1 mol/L HCl 溶液中。
注意: 这个步骤非常重要，必须用1 mol/L稀盐酸冲洗，因为它可以洗去贴在切片上的试剂的痕迹。
如用蒸馏水冲洗，则试剂本身也可以水解，所释放出的碱性品红，可以使切片内一切嗜碱性物质皆染色从而引起严重的错误。
若切片较厚，可延长其水解时间，而且每次均需更换洗涤剂。
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1N HCl 60℃
酸解使DNA醛基暴露
醛基与Schiff试剂发生显色反应
孚尔根核染色法是Feulgen和Rossonbek于1924 年提出的鉴定细胞中DNA的组织化学方法。其 优点是制片清洁、染色体清晰、组织软化好， 易于压片。但对小型染色体（如玉米、水稻） 效果较差。在切片、涂片上研究核和染色体时， 能减少细胞质着色对观察的影响。在细胞学研 究中普遍采用
材料：大蒜根尖、洋葱根尖
1mol/L 盐酸(常温和60℃) Schiff试剂 45%醋酸或亮绿
实验步骤
预处理的目的及方法
目的：改变细胞质粘度，破坏和抑制纺锤体 的形成，使染色体适度缩短和分散。
方法： 0.04-0.2%秋水仙素溶液2-4小时。 对二氯苯饱和溶液3-5小时。 0.002M (或0.03%)8-羟基喹啉1.5-2小时以
黑暗条件下染色。 要保证细胞呈单层，使染色体在一个平面上，
根尖的切片尽量要薄，压片必须用力适度，压 片的实验台面要平坦。
实验作业
绘制你所观察到的图象，并说明是有丝 分裂的哪一个时期，并注明放大倍数。
前期、中期、后期、末期
思考题
为什么要严格掌握DNA的水解条件？ 为什么实验材料从60℃盐酸中倒出后，
实验原理
有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，在植物根尖或茎尖的 分生组织中可清晰观察。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很 大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规 律地进行。各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的， 并随科属种的不同而具有一定的特征。大蒜体细胞中有8对共 16条染色体，在有丝分裂过程中，每个染色体能复制一份， 然后分配到两个子细胞中，所以两个子细胞与母细胞所含的染 色体在数目、形态和性质上都是相同的。在细胞遗传学研究中， 人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就 是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。
Carnoy’s固定液： 冰醋酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6 改良Carnoy’s固定液： 冰醋酸:无水乙醇=1:3
分组：6人一组
1、取材: 每人2-3个根尖置于eppendorf管—— dH2O洗2-3次——1N HCl，室温2分钟。
2、水解 :倒掉HCL，换入60O预热的HCl——60O 水浴10’。去掉热HCl，再换冷HCl，1分 钟，——蒸馏水洗2次
Schiff试剂 的组成及配制
Schiff试剂 ：即无色亚硫酸品红。 配制方法：溶解1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸
水中，轻轻摇动，继续煮5min使其完全溶解， 冷却至55-50℃时过滤到棕色带塞子的玻璃瓶中， 加入1N HCl 20 ml，继续冷却至25 ℃左右，再 加入1g偏重亚硫酸钠，摇动使之溶解，置黑暗低 温处或冰箱内18-24小时后检查，试剂如透明无 色或淡黄色即可使用。
3、染色: 吸净水分，加入Schiff试剂,盖上盖子， 暗处染色30’——漂洗液漂洗2次，2分钟/次
4、取根尖置于载玻片上，用镊子夹碎后，再加 一滴45%的醋酸，软化5min，压片镜检。
HE XI UNIVERSITY
根尖形态与结构
成熟区 伸长区
分生区 根冠
注意事项
Schiff试剂小心取放，及时清洗吸取Schiff试剂 的吸管。
实验 四
植物有丝分裂的孚尔根 (Feulgen)核染色观察
实验目的
掌握孚尔根核染色的方法。 了解孚尔根染色的原理。 有丝分裂
实验原理
孚尔根染色法是鉴别细胞中DNA的组织 化学方法.
DNA—１ＮHCl,60OC水解,部分地破坏核 糖与嘌呤之间的糖苷键—嘌呤碱脱掉—核 糖的C1上的醛基呈游离态—与Schiff试剂 的无色亚硫酸品红分子反应——呈现为紫 红色的化合物。
材料从60℃的盐酸倒出后温度还相当高，如 果直接转入Schiff试剂中，则会使Schiff试剂发 生分解影响效果。所以我们首先要把材料转入 室温的盐酸溶液中，做一个缓冲以避免Schiff 试 剂分解。
为什么RNA在此过程中不会着色？
由于在酸解条件下，RNA较DNA分子更 加稳定，它的醛基难以游离，所以在用 Schiff试剂染色时RNA分子不会着色。
前期（prophase)
染色体逐渐变得清晰可辨，缩短变粗，收缩成 螺旋状，核仁逐渐消失，核膜开始破裂，核质 和细胞质融为一体。
前中期（premetaphase)
纺锤体逐渐明显，在核区形成 ，着丝粒附着在纺锤 丝上。
中期（metaphase)
后期（anaphase)
着丝粒纵裂为二，姐妹染色单体彼此分离，各自移向 一极，染色体的两臂由着丝粒拖曳移动。
使组织内各种物质成分产生不同的折射率，便 于鉴定、观察。
使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于 染色。
防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结 构。
固定液
简单固定液：如乙醇、甲醛、冰醋酸、 升汞等。
混合固定液：如Carnoy’s固定液、AF液 （乙醇:甲醛=9:1)
Carnoy’s固定液
漂洗液——200ml水+10ml 1 M HCl+1g偏 亚硫酸钾（钠）
背背景景知知识识
有丝分裂（mitosis）是细胞分裂的方式，每个 子细胞精确地具有和亲代细胞在数目上及形态上完 全相同的染色体，以保证子细胞含有与母细胞相等 的遗传信息。有丝分裂时，染色体呈现连续的、动 态的变化，一般分为间期、前期、中期、后期和末 期5个时期。从间期到前期和中期，每条染色体为 两条染色单体。从后期到末期，直到下一个细胞周 期的G1期，其染色体实质上只是一条染色单体。在 光学显微镜下，可根据染色体的收缩程度、集结等 特征来确定一个细胞所处的分裂时期。
细胞类型
体细胞
生殖细胞
DNA复制 细胞分裂次数
染色体数目
一次
一次
一次
二次
不变（2n 2n） 减半（2n n）
DNA含量由4c 2c DNA含量由4c c
联会、互换
无
有
实验原理
有丝分裂是一个复杂的连续过程，细胞 内发生了一系列的变化，最主要的是细胞核 内的染色质形成了染色体。经过复制，每条 染色体复制成为两条。有规则地平均分配到 两个子细胞中去
还要放入室温的盐酸中呢？ 为什么RNA在此过程中不会着色？
为什么要严格掌握DNA的水解条件？
温度过低，时间过短：则DNA的水解不 够彻底，醛基暴露不充分，染色会过浅。
温度过高，时间过长：则DNA过度水解， 游离的核苷酸会漂移到细胞质中，造成 染色浅或不均一 。
为什么要在实验材料从60℃盐酸中倒 出后，再放入室温的盐酸中呢？
上，室温。 低温：1-4℃处理24小时。
固定：将新鲜的活组织从生物体取下后， 立即投入固定剂中，借助化学药品的作 用，使细胞保持原有形态结构的一种手 段。
固定的目的
迅速防止细胞的死后变化，防止自溶、腐败， 尽量保持生长状态结构。
使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变 为不溶性物质，以保持生前状态。
末期（telophase)
子细胞的染色体凝 缩为一个新核，在核的 四周核膜重新形成，染 色体又变为均匀的染色 质，核仁又重新出现。 纺锤体被降解，细胞质 被新的细胞膜分隔成两 部分，结果产生2个子 细胞，其染色体和原来 细胞中完全一样。
减
数
分期Ⅰ
分
中期Ⅱ
中期
裂
的
后期Ⅱ
后期
比
较
有丝分裂 减数分裂