大学课程遗传学实验实验四 孚尔根(Feulgen)核染色课件

1N HCl 60℃
酸解使DNA醛基暴露
醛基与Schiff试剂发生显色反应
孚尔根核染色法是Feulgen和Rossonbek于1924 年提出的鉴定细胞中DNA的组织化学方法。其 优点是制片清洁、染色体清晰、组织软化好， 易于压片。但对小型染色体（如玉米、水稻） 效果较差。在切片、涂片上研究核和染色体时， 能减少细胞质着色对观察的影响。在细胞学研 究中普遍采用
材料：大蒜根尖、洋葱根尖
1mol/L 盐酸(常温和60℃) Schiff试剂 45%醋酸或亮绿
实验步骤
预处理的目的及方法
目的：改变细胞质粘度，破坏和抑制纺锤体 的形成，使染色体适度缩短和分散。
方法： 0.04-0.2%秋水仙素溶液2-4小时。 对二氯苯饱和溶液3-5小时。 0.002M (或0.03%)8-羟基喹啉1.5-2小时以
黑暗条件下染色。 要保证细胞呈单层，使染色体在一个平面上，
根尖的切片尽量要薄，压片必须用力适度，压 片的实验台面要平坦。
实验作业
绘制你所观察到的图象，并说明是有丝 分裂的哪一个时期，并注明放大倍数。
前期、中期、后期、末期
思考题
为什么要严格掌握DNA的水解条件？ 为什么实验材料从60℃盐酸中倒出后，
实验原理
有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，在植物根尖或茎尖的 分生组织中可清晰观察。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很 大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规 律地进行。各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的， 并随科属种的不同而具有一定的特征。大蒜体细胞中有8对共 16条染色体，在有丝分裂过程中，每个染色体能复制一份， 然后分配到两个子细胞中，所以两个子细胞与母细胞所含的染 色体在数目、形态和性质上都是相同的。在细胞遗传学研究中， 人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就 是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。
Carnoy’s固定液： 冰醋酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6 改良Carnoy’s固定液： 冰醋酸:无水乙醇=1:3
分组：6人一组
1、取材: 每人2-3个根尖置于eppendorf管—— dH2O洗2-3次——1N HCl，室温2分钟。
2、水解 :倒掉HCL，换入60O预热的HCl——60O 水浴10’。去掉热HCl，再换冷HCl，1分 钟，——蒸馏水洗2次
Schiff试剂 的组成及配制
Schiff试剂 ：即无色亚硫酸品红。 配制方法：溶解1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸
水中，轻轻摇动，继续煮5min使其完全溶解， 冷却至55-50℃时过滤到棕色带塞子的玻璃瓶中， 加入1N HCl 20 ml，继续冷却至25 ℃左右，再 加入1g偏重亚硫酸钠，摇动使之溶解，置黑暗低 温处或冰箱内18-24小时后检查，试剂如透明无 色或淡黄色即可使用。
3、染色: 吸净水分，加入Schiff试剂,盖上盖子， 暗处染色30’——漂洗液漂洗2次，2分钟/次
4、取根尖置于载玻片上，用镊子夹碎后，再加 一滴45%的醋酸，软化5min，压片镜检。
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根尖形态与结构
成熟区 伸长区
分生区 根冠
注意事项
Schiff试剂小心取放，及时清洗吸取Schiff试剂 的吸管。
实验 四
植物有丝分裂的孚尔根 (Feulgen)核染色观察
实验目的
掌握孚尔根核染色的方法。 了解孚尔根染色的原理。 有丝分裂
实验原理
孚尔根染色法是鉴别细胞中DNA的组织 化学方法.
DNA—１ＮHCl,60OC水解,部分地破坏核 糖与嘌呤之间的糖苷键—嘌呤碱脱掉—核 糖的C1上的醛基呈游离态—与Schiff试剂 的无色亚硫酸品红分子反应——呈现为紫 红色的化合物。
材料从60℃的盐酸倒出后温度还相当高，如 果直接转入Schiff试剂中，则会使Schiff试剂发 生分解影响效果。所以我们首先要把材料转入 室温的盐酸溶液中，做一个缓冲以避免Schiff 试 剂分解。
为什么RNA在此过程中不会着色？
由于在酸解条件下，RNA较DNA分子更 加稳定，它的醛基难以游离，所以在用 Schiff试剂染色时RNA分子不会着色。
前期（prophase)
染色体逐渐变得清晰可辨，缩短变粗，收缩成 螺旋状，核仁逐渐消失，核膜开始破裂，核质 和细胞质融为一体。
前中期（premetaphase)
纺锤体逐渐明显，在核区形成 ，着丝粒附着在纺锤 丝上。
中期（metaphase)
后期（anaphase)
着丝粒纵裂为二，姐妹染色单体彼此分离，各自移向 一极，染色体的两臂由着丝粒拖曳移动。
使组织内各种物质成分产生不同的折射率，便 于鉴定、观察。
使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于 染色。
防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结 构。
固定液
简单固定液：如乙醇、甲醛、冰醋酸、 升汞等。
混合固定液：如Carnoy’s固定液、AF液 （乙醇:甲醛=9:1)
Carnoy’s固定液
漂洗液——200ml水+10ml 1 M HCl+1g偏 亚硫酸钾（钠）
背背景景知知识识
有丝分裂（mitosis）是细胞分裂的方式，每个 子细胞精确地具有和亲代细胞在数目上及形态上完 全相同的染色体，以保证子细胞含有与母细胞相等 的遗传信息。有丝分裂时，染色体呈现连续的、动 态的变化，一般分为间期、前期、中期、后期和末 期5个时期。从间期到前期和中期，每条染色体为 两条染色单体。从后期到末期，直到下一个细胞周 期的G1期，其染色体实质上只是一条染色单体。在 光学显微镜下，可根据染色体的收缩程度、集结等 特征来确定一个细胞所处的分裂时期。
细胞类型
体细胞
生殖细胞
DNA复制 细胞分裂次数
染色体数目
一次
一次
一次
二次
不变（2n 2n） 减半（2n n）
DNA含量由4c 2c DNA含量由4c c
联会、互换
无
有
实验原理
有丝分裂是一个复杂的连续过程，细胞 内发生了一系列的变化，最主要的是细胞核 内的染色质形成了染色体。经过复制，每条 染色体复制成为两条。有规则地平均分配到 两个子细胞中去
还要放入室温的盐酸中呢？ 为什么RNA在此过程中不会着色？
为什么要严格掌握DNA的水解条件？
温度过低，时间过短：则DNA的水解不 够彻底，醛基暴露不充分，染色会过浅。
温度过高，时间过长：则DNA过度水解， 游离的核苷酸会漂移到细胞质中，造成 染色浅或不均一 。
为什么要在实验材料从60℃盐酸中倒 出后，再放入室温的盐酸中呢？
上，室温。 低温：1-4℃处理24小时。
固定：将新鲜的活组织从生物体取下后， 立即投入固定剂中，借助化学药品的作 用，使细胞保持原有形态结构的一种手 段。
固定的目的
迅速防止细胞的死后变化，防止自溶、腐败， 尽量保持生长状态结构。
使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变 为不溶性物质，以保持生前状态。
末期（telophase)
子细胞的染色体凝 缩为一个新核，在核的 四周核膜重新形成，染 色体又变为均匀的染色 质，核仁又重新出现。 纺锤体被降解，细胞质 被新的细胞膜分隔成两 部分，结果产生2个子 细胞，其染色体和原来 细胞中完全一样。
减
数
分期Ⅰ
分
中期Ⅱ
中期
裂
的
后期Ⅱ
后期
比
较
有丝分裂 减数分裂