孚尔根染色法
大学课程遗传学实验实验四 孚尔根(Feulgen)核染色课件
1N HCl 60℃
酸解使DNA醛基暴露
醛基与Schiff试剂发生显色反应
孚尔根核染色法是Feulgen和Rossonbek于1924 年提出的鉴定细胞中DNA的组织化学方法。其 优点是制片清洁、染色体清晰、组织软化好， 易于压片。但对小型染色体（如玉米、水稻） 效果较差。在切片、涂片上研究核和染色体时， 能减少细胞质着色对观察的影响。在细胞学研 究中普遍采用
材料：大蒜根尖、洋葱根尖
1mol/L 盐酸(常温和60℃) Schiff试剂 45%醋酸或亮绿
实验步骤
预处理的目的及方法
目的：改变细胞质粘度，破坏和抑制纺锤体 的形成，使染色体适度缩短和分散。
方法： 0.04-0.2%秋水仙素溶液2-4小时。 对二氯苯饱和溶液3-5小时。 0.002M (或0.03%)8-羟基喹啉1.5-2小时以
黑暗条件下染色。 要保证细胞呈单层，使染色体在一个平面上，
根尖的切片尽量要薄，压片必须用力适度，压 片的实验台面要平坦。
实验作业
绘制你所观察到的图象，并说明是有丝 分裂的哪一个时期，并注明放大倍数。
前期、中期、后期、末期
思考题
为什么要严格掌握DNA的水解条件？ 为什么实验材料从60℃盐酸中倒出后，
实验原理
有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，在植物根尖或茎尖的 分生组织中可清晰观察。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很 大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规 律地进行。各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的， 并随科属种的不同而具有一定的特征。大蒜体细胞中有8对共 16条染色体，在有丝分裂过程中，每个染色体能复制一份， 然后分配到两个子细胞中，所以两个子细胞与母细胞所含的染 色体在数目、形态和性质上都是相同的。在细胞遗传学研究中， 人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就 是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。
九孚尔根Feulgen核反应染色法
实验设计
5分钟 50度 60度 70度
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
10分钟
15分钟
以+,++,+++……表示染色效果强弱,+号最多表示染色最佳.
水解时DNA中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打 断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基 与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有 这种专一反应，因此可鉴定DNA的存在。
三 、实验方法和步骤
（一）材料准备 取一洋葱鳞茎，置于盛满水的小烧杯
上使其长出新根。待根尖长2cm 时，于上 午8时剪下根尖进行预处理、固定、保存 （请参考实验一）。
（二）水解
取准备好的洋葱根尖，装到青霉素瓶中，水洗三 次，换1M HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1M HCl，覆盖样品即可，放入恒温水浴锅中在60℃下 水解10分钟，然后吸去热1M HCl，换入冷1M HCl洗 一次，再水洗三次。
水解是本实验成败的关键。重要的是温度和时间。 如果温度过高或时间过长，造成水解过度，核糖与 醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，不能 呈现颜色反应。
（三）染色
加入适量的Schiff试剂，避光染色30分 钟，然后用漂洗液漂洗2～3次，水洗后压片。 （四）压片、镜检
取一根尖置于载玻片，切下0.3cm生长 区部位，加一滴亮绿液对染一分钟，吸去亮 绿液，加一滴清水或醋酸水溶液压片，镜检， 观察有丝分裂各个时期的染色体。
以小组为单位，探究温度高低与酸水解 时间长短对孚尔根核反应的影响。
实验九 孚尔根（Feulgen）核反应染色法
一、实验目的 1、学习孚尔根核反应染色法，鉴
定染色体、DNA的存在。 2、探究水解时间及温度对孚尔根
植物染色体的孚尔根染色法
四、实验步骤
1. 希夫试剂的配制
• 将0.5g碱性品红徐徐加入煮沸的 碱性品红徐徐加入煮沸的100ml蒸馏水中 用玻璃棒搅拌 蒸馏水中, 碱性品红徐徐加入煮沸的 蒸馏水中 用玻璃棒搅拌, 使之充分溶解, 待溶液冷却至58°C左右 过滤于棕色瓶中。 使之充分溶解 待溶液冷却至 ° 左右, 过滤于棕色瓶中。 左右 • 当滤液冷却至 °C时, 再加入 当滤液冷却至26° 时 再加入10ml的1M盐酸和 盐酸和0.5g亚硫酸氢钠 的 盐酸和 亚硫酸氢钠 或偏重亚硫酸钠(钾 摇动, 溶解后密封于棕色瓶中, 或偏重亚硫酸钠 钾), 摇动 溶解后密封于棕色瓶中 置于黑暗 低温处。次日检查溶液颜色, 须呈无色透明或淡茶色才可使用。 低温处。次日检查溶液颜色 须呈无色透明或淡茶色才可使用。 • 若稍呈红色可加入 若稍呈红色可加入0.5g活性炭连续摇动 在4°C下静置过夜 然 活性炭连续摇动, 下静置过夜, 活性炭连续摇动 ° 下静置过夜 后过滤脱色。 后过滤脱色。
2. 染色过程
① 取固定好的根尖, 用水洗2-3分钟, 放入室温条件下的1N HCl处理根尖 材料2-3分钟。 ② 将根尖换入60℃预热的HCl, 置于恒温水浴中, 在60±0.5℃的条件下水 解8-10分钟。 ③ 吸出热HCl, 换入室温1N HCl再处理1-2分钟, 然后水洗2-3次。 ④ 吸净水分, 加入Schiff试剂, 盖上盖子, 在黑暗条件下染色30分钟, 也可 过夜。 ⑤ 用水漂洗, 去掉细胞中残存的一些有色的品红分子。 ⑥ 取根尖置载玻片上, 用镊子夹碎后, 加一滴45%醋酸, 然后盖上盖片。 ⑦ 压片、观察。
玉米染色体核型图(2n=20), Feulgen 染色
玉米染色体核型图(2n=20+2B)
玉米染色体核型图(2n=20+4B) /mnl/79/18rosado.htm
DNA的原位显示—Feulgen染色法
Carnoy固定液：3份95%酒精加入1份冰醋酸。固定显 示DNA、RNA的效果好
，否则会使染色剂浓度降低。
• 漂洗时，所用的亚硫酸水，最好在每次实验前
临时配制，以便保持较浓的SO2。
• 加盖玻片时，切勿用力过大。
『其他固定液』
Flemming固定液：1%铬酸水溶液 25ml，1%冰醋酸 （用前加入）10ml，蒸馏水 60ml
Champy固定液：3%重铬酸钾 70ml，1%铬酸 70ml，2% 锇酸 40ml
『实验原理』 DNAຫໍສະໝຸດ 弱酸（1M的HCL）水解，其上的嘌呤碱和脱氧
核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛 基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸 溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA 的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应 产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具
『思考题』
欲得到一张好的Feulgen反应制片，制片过程 中应注意些什么？
• 水解是本实验成败关键之一。水解时间和温度
一定要合适，如果温度过高或时间过长，造成 水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流 失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基， 都不能呈现颜色反应。
• 用Schiff试剂染色前，蒸馏水的残留不宜过多
4、Schiff液黑暗条件下染色30-50min（避光: 因为生成不稳定的物质，见光很容易分 解）。
5、用新配制的亚硫酸氢钠溶液洗3次，每次 约5min。（洗去无色品红，在自然条件下 易还原为碱性品红）
6、用清水洗2次，每次2min。 7、取一根尖置于载玻片上，切下生长区部位
实验二孚尔根染色法
实验二孚尔根染色法一、实验原理染色体是遗传物质的载体，它的主要化学成分是脱氧核糖核酸(DNA)，DNA系核苷酸的多聚体，核苷酸又由碱基脱氧核糖和磷酸所组成，当细胞经60℃、1mol·1-1HCl处理后，不仅使分生组织的细胞彼此分离，而且可以破坏核内DNA链上的嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键，嘌呤脱下，脱氧核糖上的醛基暴露，形成含醛基的无嘌呤结构物，醛基与希夫试剂反应显紫红色。
细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此所以根据紫红色出现的部位就可鉴定脱氧核糖核酸(DNA)的存在，并广泛应用于核及染色体的研究中。
二、实验目的学习和掌握孚尔根反应染色法，鉴定植物细胞核内染色体上DNA的存在。
三、实验材料、用具及药品1．材料：洋葱或大蒜的根尖2．用具显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、吸管、烧杯、量筒、3．药品希夫氏试剂(无色碱性品红液)、漂洗液、1mol·1-1 HCl、45％醋酸等。
四、实验步骤1. 取材与固定：待大蒜根尖长1cm 时，于上午8时剪下根尖，经过预处理后投入卡诺固定液中固定2-24h。
固定后，保存在70%的酒精中，放入冰箱中冷藏供用。
2.水解试管1：取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，换1N HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1N HCl 浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟（视材料而定，水解时间可以从10分钟延长至30分钟）。
然后吸去热1N HCl，换入冷1N HCl洗一次，再用清水将根尖洗三次。
试管2（对照）取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，入预热60℃的蒸馏水浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟。
以下各步骤两试管相同。
（水解是本实验成败的关键之一。
重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。
如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。
实验02 孚尔根核反应染色法
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有丝分裂各时期
中期 ——极面
后期
末期
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子细胞
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有丝分裂各时期
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20
六、注意事项
1. 水解时间和温度是实验的关键因素；
2. Schiff试剂中SO2的含量影响孚尔根反应的 颜色表现；
3. 压片技术是视野观察清晰与否的关键；
4. 材料的不同（DNA含量的不同），是影响 显色反应强度的根本因素；
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五、实验步骤
材料
培养的植物根尖长到2cm左右时，切下；或取幼小 花药或叶表皮或愈伤组织，或动物组织，或果蝇唾 腺等材料。
固定
将取出的材料放入新配制的Carrnoy固定液（无水 乙醇:冰醋酸=3:1）处理2~24hr→95%乙醇洗2次， 每次10min→80%乙醇洗1次，10min→70%乙醇， 冰箱保存。
染色30min~4h； 漂洗液漂洗2~3次，每次2~5min，待用。
五、实验步骤
以下各人独立完成： 将根尖置载玻片上，切取适当部位； 加45%醋酸洋红1滴； 压片； 镜检； 作图（实验报告）。
有丝分裂各时期
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有丝分裂各时期
间期
前期
中期 ——侧面
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实验二 孚尔根核反应染色法
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1
一、实验目的
1. 学习和了解孚尔根（Feulgen）反应的原理； 2. 掌握对植物组织及细胞中鉴别DNA分布的 孚尔根反应染色方法； 3. 掌握压片方法； 4. 了解制作玻片标本的方法； 5. 观察细胞中DNA的分布。
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Schiff试剂中的无色亚硫酸品红分子与活性醛 基反应而呈现为紫红色化合物。该产物能特异 地吸收峰值为550~570nm的光波。并在一定的 浓度范围内，在550~570nm光波的吸收值与 DNA含量成正比，即符合化学计量学关系。
《孚尔根核染色》课件
染色过程
孚尔根核染色包括几个关键步骤：细 胞固定、细胞通透性处理、DNA氧化 、染色和观察。
染色过程需要在弱酸条件下进行，以 促进DNA的氧化和后续的染色反应。
在染色过程中，需要使用特定的染料 ，如Giemsa染料或巴尔巴土染料，这 些染料能够与DNA-蛋白质加合物结 合，产生明显的染色效果。
染色效果
政策支持
政府可以出台相关政策， 支持孚尔根核染色技术的 研发和应用，促进其发展 壮大。
感谢您的观看
THANKS
该技术可用于DNA多态性分析 ，有助于研究基因变异与疾病 的关系。
技术局限性
1 样本量要求
孚尔根核染色技术需要一定量的样本才能进行检测，对 于微量样本可能存在限制。
2 交叉污染风险
孚尔根核染色技术需要一定量的样本才能进行检测，对 于微量样本可能存在限制。
3 假阳性结果
孚尔根核染色技术需要一定量的样本才能进行检测，对 于微量样本可能存在限制。
减少人工操作误差。
降低成本
通过优化试剂和设备， 降低检测成本，使更多 实验室和医疗机构能够
应用该技术。
05
孚尔根核染色技术的未来发展
技术发展趋势
自动化与智能化
随着机器人技术和人工智能的发展，孚尔根 核染色技术将逐渐实现自动化和智能化，提 高染色效率和准确性。
环保与可持续发展
随着环保意识的提高，未来的孚尔根核染色 技术将更加注重环保和可持续发展，减少对 环境的污染和资源消耗。
《孚尔根核染色》PPT课件
目录
• 引言 • 孚尔根核染色技术原理 • 孚尔根核染色技术的应用 • 孚尔根核染色技术的优缺点 • 孚尔根核染色技术的未来发展
01
引言
核染色技术简介
孚尔根(FEULGEN) 染色
Schiff 试剂的配置
称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶）， 时时振荡，继续煮 5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然 后冷却至50℃时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1N HCl，冷却至 25℃时，加入0.5g Na2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡 后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24小时（有时需2～3天）， 使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟， 最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应 为无色也无沉淀，贮于4℃冰箱中备用。如有白色沉淀，就不 能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之 再转变为无色时，仍可再用
反应原理
样品经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤 碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛 基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应， 形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色 团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经 稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用， 可与无色品红结合形成紫红色化合物，从 而显示出DNA的分布。
操作方法及步骤
以Feulgen染色法观察洋葱根尖有丝分裂为例
•1．将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1N HCl中， 加热到60℃水解8～10 min。 • 2．蒸馏水水洗。 •3．Schiff试剂遮光染色30min。 •4．用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次 1min。 • 5．水洗5min。 •6．将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖 玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。 • 7．显微镜检查。 结果：细胞中凡有DNA的部 位应呈现紫红色的阳性反应。
孚尔根染色法的反应原理主要与Schiff试剂的化学性质有关，此试剂的基本 成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是 三氨基三苯甲烷氯化物。
期末实验 孚尔根染色法和植物染色体标本的制备
期末实验孚尔根染色法和植物染色体标本的制备207.12.1 6.结果与分析6.1结果（1）孚尔根染色结果图1.洋葱根尖分生区孚尔根DNA染色结果（10×10倍）图2.洋葱根尖分生区孚尔根DNA染色结果（10×40倍）①结果描述：在光学显微镜下，洋葱根尖细胞被均匀地压成了单层细胞，细胞分布较为均匀，变形细胞较少。
DNA成功被染上紫色，染色较深，视野背景为白色无红色颗粒较为清晰，视野中无气泡。
处于分裂时期的细胞约占10％，分裂期的细胞染色体染色较深，而分裂间期的染色较浅，中间有1-3个白斑为核仁。
②结果评价：较成功③结果分析：在物镜10倍观察下可以清晰反映出压片的结果与染色的情况。
在压片前要注意用亚硫酸水把染液冲洗干净，防止背景一片红，不利于观察，压片时先把根尖捣碎，防止细胞堆积；在压片时要固定好盖玻片防止盖玻片与载玻片之间发生摩擦，防止细胞变形，同时也要注意力度的把握和敲击的方向，垂直敲打，且从中间到边缘。
染色的时间要足够长，这是我实验时制作的第二张装片，染色时间为18min,第一张为10min，染色较浅，不利于观察。
视野中，由于分裂期的染色质高度螺旋为染色体，DNA浓度较高，所以分裂期的染色体染色较深，而分裂间期的细胞，DNA分裂较为均匀，所以染色较为均匀且相对浅，中间的白斑为核仁，因为核仁中主要为rRNA，所以不被染成紫色。
A B C DE F G HI J K LM N O P图2.洋葱根尖分生区孚尔根DNA染色有丝分裂过程（10×40倍）①结果描述：A间期:DNA均匀分部于细胞核中，核仁明显，为透明发亮圆形，可见1—3个。
B-E前期：细胞核膨大，染色质缩短变粗，晚前期（D、E）核仁、核膜消失。
F-G中期：染色体缩短变粗，形成姐妹染色单体，整齐排列与赤道板上。
H-L后期：着丝粒分裂，姐妹染色单体分离，分别移向细胞两极。
M-P末期：染色体解旋为染色质，核仁核膜重新出现，细胞中间形成细胞板。
实验10 DNA孚尔根染色
实验10孚尔根（Feulgen）反应
一、实验目的
掌握孚尔根（Feulgen）反应的原理和方法，观察了解DNA在细胞内的分布。
二、实验用具
洋葱内表皮，显微镜、染色缸、剪刀、镊子、培养皿等；1M HCl、希夫试剂、亚硫酸水溶液等。
三、原理
孚尔根反应是Feulgen和Rosserbeck于1924年发现的,是鉴定细胞内DNA特殊有效的方法。
其原理一般认为：稀酸（1M HCl,60℃)水解DNA，打开DNA分子上嘌呤碱和脱氧核糖连接的键，从而使脱氧核糖中的醛基释放出来，然后再与希夫试剂（Schiff试剂，无色品红）反应，由于醛基的氧化作用，使之与无色品红结合成紫红色的化合物。
细胞内凡有DNA的地方都呈阳性反应。
四、操作过程
1、将洋葱鳞茎内表皮放在1mol/l的HCl中，加热到60℃水解8-10分钟。
2、蒸馏水水洗3次。
3、入希夫试剂染色30分钟。
4、亚硫酸水溶液洗3次，每次1分钟。
5、水洗5分钟。
6、将鳞茎内表皮放在载玻片上，盖好盖玻片，用吸水纸吸去玻片上多余的溶液，置显微镜下检查，细胞内凡有DNA的地方都呈阳性反应（玫瑰红色）。
五、实验结果
绘图示Feulgen反应的结果即细胞内DNA的分布。
feulgen染色法
feulgen染色法Feulgen染色法是一种细胞核染色的技术，是由德国生物学家弗朗西斯·费尔根（Robert Feulgen）在1914年发明的。
该技术的主要原理是利用増感反应特异性亲合性使DNA成为已知物质之一的二硫化物发生比较强的发色反应，因而得名 Feulgen 染色法。
Feulgen染色法以弗洛分离作为基础原理，对细胞内的核酸进行染色，并通过显微镜观察、分析和研究细胞发生分裂的相关特征。
该方法能够比较准确的区分细胞核与其他成分，尤其是有机质成分。
因此，Feulgen染色法在细胞学、细胞遗传学、组织学等领域中都有广泛的应用。
下面是 Feulgen 染色法的步骤：1. 细胞固定将要检测的细胞固定于载玻片上， Feulgen 染色法通常使用3.7%的甲醛作为固定液，使DNA在细胞和载玻片上不再发生运动和变化。
2. 酸解样品的酸解可以利用鹰嘴豆素和酸来进行。
这一步旨在剥离细胞的蛋白质并让核酸暴露在表面上，使其改变成醛基结构，以便接下来的染色成分与核酸相互作用。
3. 饱和无水硝酸样品用饱和无水硝酸处理，以去除酸中不必要的离子，同时也可以使其完成DNA的醛基反应。
4. Feulgen 组合液染色细胞样品将在染色溶液中放置2至10分钟，然后被放置于高氯酸中洗涤。
洗后，样品将被去水、除脂和用玻片覆盖。
5. 显微镜下观察使用荧光显微镜观察样品，利用目镜下特殊荧光物质的作用，可以使核酸发亮，显露出来并被直接观察到。
总的来说，Feulgen 染色法是一种快速、准确的核酸染色方法，可用于在细胞组织学、细胞遗传学和生物亚细胞学等领域中快速、准确地检测DNA的含量，为对生命现象的研究提供了有效的工具。
富尔根染色原理
富尔根染色原理
富尔根氏核染色法是根据席夫氏(Schiff)试剂进行的反应而建立的。
席夫氏试剂含有碱性复红和亚硫酸，碱性复红与亚硫酸结合后，失去醌式结构而变为无色，当DNA经酸作用后生成的醛化合物与席夫氏试剂结合后，使醌式结构恢复，合成一种带紫红色的碱性复红衍生物。
1富尔根染色的基本原理：
富尔根氏核染色法对DNA具有特异性。
细菌细胞用此法染色后，可在普通光学显微镜下观察到核。
2 富尔根氏染色法主要分两步:
(a)将细菌用1mol/LHCl温和水解，使DNA中的嘌呤碱与戊糖分开，放出戊糖的醛基;
(b)放出的戊糖醛基与席夫氏试剂作用后呈紫红色。
3 富尔根氏染色法操作步骤：
1.取培养8-10小时的酿酒酵母涂片，室温下风干。
2.将涂片置于有2%锇酸的蒸汽瓶口上，用锇酸蒸气固定5分钟，然后放入加热至60℃的Schandiun固定液中10分钟。
3.用水冲洗固定后的标本，然后放在60℃1mol/LHCl中水解8分钟，水洗。
4.用席夫氏试剂作用30-40分钟。
5.由席夫氏试剂中取出放在亚硫酸水溶液中洗5分钟。
6.由亚硫酸水溶液中取出水洗，干燥后，用油镜观察。
1孚尔根核染色共25页
掌握孚尔根核染色的方法。 了解孚尔根染色的原理。
Schiff试剂 的组成及配制
Schiff试剂 ：即脱色亚硫酸品红。 配制方法：溶解1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸水中，
轻轻摇动，继续煮5min使其完全溶解，冷却至55-50℃ 时过滤到棕色带塞子的玻璃瓶中，加入1M HCl 20 ml， 继续冷却至25 ℃左右，再加入1g硫代硫酸钠，摇动使 之溶解，置黑暗低温处或冰箱内18-24小时后检查，试 剂如透明无色或淡黄色即可使用。
方法： 0.04-0.2%秋水仙素溶液2-4小时。 对二氯苯饱和溶液3-5小时。 0.002M (或0.03%)8-羟基喹啉1.5-2小时以上，
室温。 低温：1-4℃处理24小时。
HE XI UNIVERSITY
根尖形态与结构
成熟区 伸长区
分生区 根冠
注意事项
Schiff试剂小心取放，及时清洗吸取 Schiff试剂的吸管。
黑暗条件下染色。
实验作业
绘制你所观察到的图象，并说明是有丝 分裂的哪一个时期，并注明放大倍数。
前期、中期、后期、末期
光学显微镜基本结构： 1. 照明灯(Lamp) 2. 聚光器(Condenser)
3. 载物台和切片夹
(Mechanical stage and
specimen retainer) 4. 推进器(Mechanical stage adjustment knob) 5. 物镜(Objectives) 6. 粗细螺旋(Course and fine focus knob) 7. 8.目镜(Oculars)
固定的目的
迅速防止细胞的死后变化，防止自溶、腐败， 尽量保持生长状态结构。
使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转 变为不溶性物质，以保持生前状态。
孚尔根染色法
孚尔根染色法DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。
1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。
孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。
实验原理：细胞中的DNA受1NHC1，60℃水解作用以后，核酸中的嘌呤碱很快完全被除掉，使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态。
水解后，组织要经水洗再移至希夫（Schiff）试剂中，希夫试剂即同露出来的醛基发生反应，呈现紫红色。
这个反应是Feulgen在1942年提出来的，是DNA的一个特异性检查法。
水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程，第一，漂呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来，第二，组蛋白和核酸愈来愈多地被除掉。
在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用希夫试剂染色，染色体的染色作用最强。
随着水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的希夫反应增强，而染色体中的希夫应减弱。
最后，第二个过程超过第一过程时，染色体也随之停止反应。
希夫试剂是碱性品红———亚硫酸溶液，呈无色。
与DNA醛基反应后，使碱性品红恢复原来的红色。
二、实验目的：观察蚕豆根尖细胞或其它根尖细胞内染色体中的DNA，以及染色体在有丝分裂中的行为，掌握Feulgen染色方法。
三、实验材料：上次实验制成了石蜡切片。
四、实验准备：1．用具立式染色缸一套，镊子，盖玻片，小漏斗，铁架，毛边纸，玻璃棒，显微镜，恒温水浴锅，温度计，烧杯，棕色瓶，黑纸。
2．玻璃器皿的清洗主要是染色缸的清洗，一般用肥皂粉洗，用水冲净即可，如不能洗净时，要用洗液浸泡后，再冲洗，自来水洗后，再用少量蒸馏水过洗一次。
盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必须干燥，缸盖内缘必须涂以几士林，以防止蒸发和收水分，影响浓度。
染色缸上要贴上标签。
实验三孚尔根反应
实验三孚尔根反应实验三孚尔根(Feulgen)反应⼀、实验⽬的：（1）熟悉并掌握孚尔根反应得原理及实验操作⽅法。
（2）对细胞的免疫组织化学研究⽅法有⼀初步的认识。
⼆、实验原理：标本经稀盐酸⽔解后，DNA分⼦中的嘌呤碱基被解离，从⽽在核糖的⼀端出现了醛基。
Schiff试剂中的⽆⾊品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分⼦，因醌基为发⾊团，故可呈现出紫红⾊。
也就是说，DNA经稀酸⽔解后产⽣的醛基，具有还原作⽤，可与⽆⾊品红结合成紫红⾊化合物，从⽽显⽰出DNA的分布。
三、实验⽤品：1、材料：镊⼦、盖玻⽚、⽤carnoy固定液固定的肝脏切⽚。
2、试剂：（1）schiff试剂1瓶。
（2）亚硫酸⽔（洗涤剂）3瓶。
（3）1mol/L HCl(⽔解)1瓶。
（4）1％亮绿1瓶。
（5）30％，50％，70％，85％，95％，100％的酒精各1瓶，100%的酒精2瓶。
（6）⼆甲苯3瓶。
3、器材：显微镜、⽴式染⾊缸。
四、实验⽅法：1、脱⽔：依次经过95%酒精两次，每次20-30分钟；100%酒精两次，分别为30分钟、40分钟。
2、制⽚：⼆甲苯透明，⽯蜡包埋，切⽚6-7µm，动物胶（明胶）贴⽚，烘⼲。
在贴⽚时应滴加1-2滴10%甲醛予以固定，否则很容易脱⽚。
（以上两部实验前已经准备完成）3、脱蜡：将制⽚经⼆甲苯Ⅰ（20分钟）和⼆甲苯Ⅱ（10分钟）将⽯蜡脱净。
4、复⽔：将制⽚分别放⼊100％Ⅰ，95％，85％，70％，50％，30％的酒精各5分钟，再放⼊蒸馏⽔中10分钟，然后⽤1mol/L HCl冲洗⼀下。
5、⽔解：将制⽚放⼊已温浴⾄60℃的1mol/L HCl溶液⽔解8分钟（对照不⽔解），然后⽤蒸馏⽔洗3次。
6、染⾊：⽤schiff试剂染⾊1个⼩时。
7、洗涤：⽤亚硫酸溶液⽔洗3次，每次3分钟。
8、⽔洗：⽤蒸馏⽔洗3-5次。
9、复染：⽤1％亮绿复染数秒（3个制⽚所⽤时间依次为20s、30s、50s），然后⽤蒸馏⽔洗2次，每次5分钟。
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孚尔根染色法
DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。
1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。
孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。
实验原理：细胞中的DNA受1NHC1，60℃水解作用以后，核酸中的嘌呤碱很快完全被除掉，使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态。
水解后，组织要经水洗再移至希夫（Schiff）试剂中，希夫试剂即同露出来的醛基发生反应，呈现紫红色。
这个反应是Feulgen在1942年提出来的，是DNA的一个特异性检查法。
水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程，第一，漂呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来，第二，组蛋白和核酸愈来愈多地被除掉。
在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用希夫试剂染色，染色体的染色作用最强。
随着水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的希夫反应增强，而染色体中的希夫应减弱。
最后，第二个过程超过第一过程时，染色体也随之停止反应。
希夫试剂是碱性品红———亚硫酸溶液，呈无色。
与DNA醛基反应后，使碱性品红恢复原来的红色。
二、实验目的：观察蚕豆根尖细胞或其它根尖细胞内染色体中的DNA，以及染色体在有丝分裂中的行为，掌握Feulgen染色方法。
三、实验材料：上次实验制成了石蜡切片。
四、实验准备：
1．用具立式染色缸一套，镊子，盖玻片，小漏斗，铁架，毛边纸，玻璃棒，显微镜，恒温水浴锅，温度计，烧杯，棕色瓶，黑纸。
2．玻璃器皿的清洗主要是染色缸的清洗，一般用肥皂粉洗，用水冲净即可，如不能洗净时，要用洗液浸泡后，再冲洗，自来水洗后，再用少量蒸馏水过洗一次。
盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必须干燥，缸盖内缘必须涂以几士林，以防止蒸发和收水分，影响浓度。
染色缸上要贴上标签。
3．实验所需药口及配制
浓盐酸（36—38%），碱性品红，偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）;
亚硫酸钠（Na2SO3）,固绿（fast green），加拿大中性树胶乙醇（30—100%），二甲苯。
药品配制：
1各种浓度的乙醇配制.
21NHCI配制：取浓HCI 82.5毫升加蒸馏水至1000毫升，摇匀。
3Sciff 试剂的配制
0．5克碱性品红，加到已经煮沸的100毫升蒸馏水中，再煮沸3—4分钟，待溶液冷却到50℃时过滤，再等溶液冷到25℃以下时，加入10毫升的1NHCI和1。
5克偏重亚硫酸钠，装在棕色瓶中，塞紧瓶子，用黑纸包好，放在暗处，第二天观察，溶液还是淡红色就不能用，只得重配。
偏重亚硫酸钠与1NHCI反应，放出SO2，SO2与碱性品红反应，生成碱性品红--亚硫酸溶液，呈无色。
4漂染液的配制
先配10%的亚硫酸钠溶液。
把10%亚硫酸钠溶液10毫升加200毫升蒸馏水，再加10毫升1NHCI，即成漂当液。
5固绿染色液
0.5克固绿溶于100毫升95%乙醇溶液。
五、实验步骤：
2．水解先在恒温水浴箱中准备好恒温60℃的1NHCI。
注意一定要控制好温度不能过高，高了醛基要破坏，低了水解不充分，醛基不能释放出来。
水解的时间长短要根据材料，以及固定液的种类而定。
根据试验结果，取一个适当时间。
因加拿大树胶溶于二甲苯，所以片子一定要经二甲苯透明后才进行封片，操作方法如下：
1.用镊子从二甲苯中取出载玻片，以毛边纸吸干余液。
2.左手开启树胶瓶，右手用瓶中玻璃棒蘸取树胶滴于载玻片上，并随即盖好瓶盖。
树胶的用量视盖玻片大小而定。
要使树胶在盖玻片下满布，不发生过多或不足。
3镊取洁净盖玻片，以一边浇于载玻片上，然后徐徐放下，使树胶布满盖玻片与载玻片之间。
产生气泡的原因是覆盖太快树胶用量不足，或树胶过稠。
气泡侵入后，妨碍镜检，且使标本褪色。
如有气泡产生，则可以在靠近气泡的一边再滴树胶一滴，然后轻压盖玻片，使气泡逸出。
片子封片后，放在切片木框上，让其自然干燥，即可保存。