实验三 孚尔根染色法

实验三 孚尔根染色法
一、实验原理
染色体是遗传物质的载体，它的主要化学成分是脱氧核糖核酸(DNA)，DNA系核苷酸的多聚体，核苷酸又由碱基脱氧核糖和磷酸所组成，当细胞经60℃、1mol?1-1HCl处理后，不仅使分生组织的细胞彼此分离，而且可以破坏核内DNA链上的嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键，嘌呤脱下，脱氧核糖上的醛基暴露，形成含醛基的无嘌呤结构物，醛基与希夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此所以根据紫红色出现的部位就可鉴定脱氧核糖核酸(DNA)的存在，并广泛应用于核及染色体的研究中。
二、实验目的
学习和掌握孚尔根反应染色法，鉴定植物细胞核内染色体上DNA的存在。
三、实验材料、用具及药品
1．材料：洋葱或大蒜的根尖
2．用具 显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、吸管、烧杯、量筒、
3．药品 希夫氏试剂(无色碱性品红液)、漂洗液、1mol?1-1 HCl、45％醋酸等。
四、实验步骤
1. 取材与固定：待大蒜根尖长1cm 时，于上午8时剪下根尖，经过预处理后投入卡诺固定液中固定2-24h。固定后，保存在70%的酒精中，放入冰箱中冷藏供用。
2.水解 试管1：取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，换1N HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1N HCl 浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟（视材料而定，水解时间可以从10分钟延长至30分钟）。然后吸去热1N HCl，换入冷1N HCl洗一次，再用清水将根尖洗三次。试管2（对照）取大蒜根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，入预热60℃的蒸馏水浸没根尖，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解10分钟。以下各步骤两试管相同。（水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。）
3. 染色 两试管中均滴加希夫试剂，浸没根尖，立即置于暗处处理0.5—1h，然后用漂洗液换洗3次，每次2min；再用蒸馏水换洗2次，每次2min。
4. 压片镜检。分别取上述两试管中的根尖，置于载玻片上，滴加1滴45%醋酸，然后压片镜检。
〖注意事项〗 注意水解时间和温度。
五、作业
1.经孚尔根染色的压片，用指甲油将盖玻片的四周封固成临时片，储于冰箱中。
2.比较根尖经盐酸水解处理与否所获得的结果，并作出解释。
附试剂配制
1．Schiff试剂 称1g碱性品红于200ml煮沸的蒸馏水中，5分钟后断电使其冷却至55～50℃，过滤到一个棕

色的试剂瓶中，加入1N HCl 20ml，继续冷却至25℃，加入3g偏重亚硫酸钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗低温处或冰箱内（4℃左右），18～24小时后检查，试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用。如有不同程度的红色未褪，可加入1g活性炭，强烈震荡一分钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在5℃以下冰箱内可以保存半年。
2．漂洗液 在200ml蒸馏水中，加入10ml 1N HCl 和10ml 10%亚硫酸钠溶液。此液在临用前配制。
3．1N HCl 准确量取86.2ml浓盐酸（比重1.18）加入到913.8ml蒸馏水中。