基因敲除新技术
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理同源重组基因敲除，也称为转基因技术，是将两个基因上的片段截取到等位基因之外的 DNA 中，再重新组合到同一个基因上的一种技术。
这个过程也被称为基因敲除技术。
这种技术用于将特殊基因编码的蛋白质从生物体中组装起来，从而达到敲除某种特定的基因，或者研究新的突变和表型。
基因敲除技术可以将DNA片段连接在一起，并且可以融合多种中性拷贝来表达新的基因，这对于基因组结构研究非常重要。
基因敲除技术主要可以分为三类：突变型、常用片段融合型及同源重组型敲除技术。
常用片段融合型敲除技术是在目标基因中添加一个特异的连接头，从而使其具有隐藏的模式，抑制其功能。
而同源重组型敲除技术则是将两个基因的片段植入另一个片段的DNA中，使两个片段插入到一起，形成新的突变。
这些突变可以减弱目标基因的功能，从而屏蔽与此有关的特性或表型。
目前，学者们可以使用同源重组型敲除技术来研究特殊基因编码的蛋白质在生物体中的作用以及在病理、发育等过程中的调控机制。
而且，它还可以用来研究新的突变及其相关的表型，从而开展更多的生物学研究。
传统的同源重组方法，如DNA克隆、引物扩增PCR等，可以很好的实现相关的突变的敲除。
然而，随着生物素质技术的进步，细胞核酸和抗原之间的关系更加清晰。
利用CRISPR/Cas9及其衍生技术，可以有效地对基因组或蛋白质结构模糊位点进行控制，从而实现敲除特定染色体上的特殊基因或者研究新的突变及其相关表型。
同源重组基因敲除技术由其可靠性和卓越的灵敏度被广泛应用于许多生物学研究中。
这种技术可以增强基因上的特性，可以用来改变类型的基因的表观遗传性，可以从模式生物中删除特定的基因，从而探索这些缺失基因在生物体中扮演的角色。
它还可以使用在基因工程领域，有助于改变生物体的结构和功能，从而开发高效的药物等。
基因敲除技术的方法
基因敲除技术的方法
基因敲除技术是一种利用CRISPR-Cas9系统对细胞基因进行定向编辑和删除的新技术。
该技术可以帮助研究人员研究基因功能和疾病发生机制，以及开发新的治疗方法。
基因敲除技术的方法主要包括以下几个步骤：
1. 设计sgRNA：首先需要选择待敲除的基因，然后设计合适的sgRNA序列。
sgRNA是一种小RNA分子，能够将Cas9蛋白精确地指向目标基因，并切割该基因的DNA序列。
2. 转染sgRNA和Cas9：将sgRNA和Cas9蛋白导入目标细胞中。
通常采用的方法有脂质体转染、电穿孔转染等。
3. 筛选细胞：利用细胞内的修复机制，CRISPR-Cas9系统会在目标基因处切割DNA序列，并引起细胞的修复。
通过筛选，可以获得已经敲除目标基因的细胞。
4. 鉴定敲除效果：可以采用PCR、Western blot、qPCR等技术检测目标基因是否已被完全删除。
通过基因敲除技术，研究者能够研究目标基因对某种生物功能的影响，以及对疾病发生的贡献。
这一技术被广泛应用于生命科学研究领域，并在基因治疗等领域也具有广阔的应用前景。
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植物功能基因组研究中的基因敲除技术
植物功能基因组研究中的基因敲除技术植物基因敲除技术是近年来植物功能基因组研究中的一项重要技术。
通过该技术可以精准地删去植物基因组中的某个基因，从而研究该基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。
下面我们将详细介绍植物基因敲除技术的原理和应用。
一、植物基因敲除技术的原理植物基因敲除技术是通过基因编辑技术实现的。
目前主要有CRISPR/Cas9和TALEN两种技术用于植物基因编辑。
这两种技术都是利用人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA 序列，从而实现基因敲除。
先来介绍一下CRISPR/Cas9技术。
CRISPR是一种天然存在于细菌中的免疫系统。
通过CRISPR系统，细菌可以识别并摧毁侵入其体内的病毒DNA。
科学家们发现，CRISPR系统中有一种酶叫做Cas9，可以切割DNA序列。
利用人工合成的RNA序列，可以将Cas9定位到需要切割的基因上，并切割掉该基因。
这样就实现了精准的基因敲除。
TALEN技术原理类似于CRISPR/Cas9，也是通过人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA序列。
TALEN技术主要是利用一种叫做TALEN（转录激活样核酸酶）的酶来实现基因敲除。
二、植物基因敲除技术的应用植物基因敲除技术已经成为植物功能基因组研究中的一项重要技术。
它可以用于研究植物生长、发育和代谢等方面的功能。
以下是该技术的一些具体应用：1.研究基因功能植物基因敲除技术可以用于研究基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。
通过敲除某个基因，可以观察其对植物生长、发育和代谢等方面的影响。
这种方法可以帮助科学家们更好地了解植物基因的功能。
2.筛选基因植物基因敲除技术可以用于筛选植物基因。
在研究植物新陈代谢方面，需要筛选大量的植物基因，以了解这些基因在植物代谢中的作用。
植物基因敲除技术可以快速地筛选出与目标代谢过程相关的基因，从而加速研究进程。
3.改良植物品种植物基因敲除技术可以用于改良植物品种。
基因敲除技术的原理和应用
基因敲除技术是一种基因编辑技术，通过这种技术，研究人员可以删除或改变特定的DNA 序列，以研究基因的功能和作用机制。
基因敲除技术的原理：
1. 基因敲除可以通过同源重组的方法实现。
具体来说，研究人员将一个含有同源序列的筛选标记基因插入到待编辑的基因的3'端，然后加入四环素抗性基因的启动子和终止序列，通过筛选标记基因的表达，选择含有同源序列的细胞，再通过同源序列的识别和同源重组将待编辑的基因删除。
2. 另一种基因敲除方法是随机突变。
研究人员将含有同源序列的筛选标记基因插入到待编辑的基因的3'端，然后加入四环素抗性基因的启动子和终止序列，通过筛选标记基因的表达，选择含有同源序列的细胞，再通过随机突变的方法产生突变体。
基因敲除技术的应用：
1. 研究基因的功能和作用机制。
通过基因敲除技术，研究人员可以删除或改变特定的DNA 序列，以研究该基因的作用和影响。
2. 疾病治疗。
基因敲除技术也可以用于治疗某些疾病，如遗传性疾病、癌症等。
3. 药物开发。
研究人员可以通过基因敲除技术来研究药物的作用机制和效果，以开发新的药物。
基因敲除技术路线
基因敲除技术路线基因敲除技术是一种常用的基因组编辑方法，通过破坏特定基因的功能，以研究该基因在生物体发育、生理和病理过程中的作用。
本文将介绍基因敲除技术的基本原理、常用的敲除方法和技术路线。
一、基因敲除技术的原理基因敲除是指通过人为手段使特定基因在生物体中失去功能。
在细胞层面上，基因敲除可以通过两种方式实现：直接破坏基因编码区域或间接影响基因表达。
直接破坏基因编码区域的方法包括插入缺失、替换和故障等，而间接影响基因表达的方法则通过RNA干扰或基因废弃等方式实现。
二、常用的基因敲除方法1. 全基因敲除方法：全基因敲除是将整个基因组中的某个特定基因进行敲除，即完全破坏该基因的编码区域。
常用的全基因敲除方法包括基因敲除小鼠模型、转基因植物敲除和CRISPR-Cas9等。
2. 特定基因敲除方法：特定基因敲除是指对某个特定基因进行有针对性的敲除，保留其他基因的功能不受影响。
常用的特定基因敲除方法包括siRNA靶向敲除、基因编辑酶的使用和肌肉纤维母细胞的敲除等。
三、基因敲除技术路线基因敲除技术的路线可以分为以下几个步骤：1. 确定目标基因：首先需要确定要敲除的目标基因。
通过文献研究和生物信息学分析，可以确定该基因在生物体发育、生理和病理过程中的作用，以及敲除后可能引起的变化。
2. 设计敲除载体：根据目标基因的序列信息，设计敲除载体。
敲除载体通常包括靶向序列、选择性标记基因和背景基因等。
靶向序列用于特异性识别目标基因，选择性标记基因用于筛选敲除细胞，背景基因用于确认敲除效果。
3. 转染敲除载体：将设计好的敲除载体导入到目标细胞中。
常用的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒载体介导法等。
转染后，目标细胞中将存在敲除载体和非敲除细胞。
4. 筛选敲除细胞：通过添加相应的筛选剂或选择标记基因，筛选出成功敲除目标基因的细胞。
敲除细胞可以通过PCR、Western blot 或克隆等方法进行鉴定。
5. 验证敲除效果：通过对敲除细胞进行功能性实验，验证敲除效果。
基因敲除技术
基因敲除技术1．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1． 利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
基因敲除技术的原理方法和应用
基因敲除技术的原理方法和应用
体外基因敲除是指将靶基因进行人工干扰，通过CRISPR/Cas9系统或RNA干扰技术等手段，敲除特定基因，并在细胞培养系统中观察敲除基因
后细胞的变化。
体外基因敲除的主要方法有：
体内基因敲除是指在整个生物体内敲除特定基因，通常通过转基因技
术将敲除基因的胚胎或细胞转入受体生物体中，使其在整个生命周期内缺
少该基因的作用。
体内基因敲除的主要方法有：
1.胚胎干细胞诱导：通过干细胞技术将敲除特定基因的胚胎干细胞注
射到受体胚胎的早期胚胎或女性动物的卵子中，使得整个个体在发育过程
中缺少该基因。
2.基因敲入技术：通过转基因技术将敲除基因的DNA序列插入目标细
胞的基因组中，使其成为目标细胞的一部分，并在后代中传递下去。
1.功能研究：通过敲除特定基因，可以观察该基因在发育、代谢、免
疫等生理过程中的作用，从而揭示基因功能。
2.疾病模型建立：通过敲除与特定疾病相关的基因，可以建立动物模
型以研究该疾病的机制，如敲除小鼠中的肿瘤抑制基因p53可产生肿瘤模型。
3.药物研发：通过敲除特定基因，可以研究该基因与药物反应的关系，为药物研发提供新的靶点和策略。
4.转基因生物培育：通过敲除或沉默对农业和畜牧业产生负面影响的
基因，可以改良农作物和畜禽品种，提高产量和抗病能力。
总的来说，基因敲除技术是一种重要的生物学研究工具，它为我们深入理解基因功能和疾病机制提供了新的途径，也为药物研发和农业生产提供了新的思路和方法。
随着技术的不断发展，基因敲除技术将在更多领域展现其巨大的潜力和价值。
基因敲除
4.制作感受态细胞 参照链霉菌中想要敲除的基因A相应的核 苷酸序列，设计引物1、2，其中引物1中有 EcoR I 的酶切位点，引物2中有BamH I 酶 切位点，以链霉菌的基因组DNA 为模板， 引物1 和引物2 进行PCR 扩增。将PCR 获 得的A基因片段经纯化及EcoR I 和BamH I 双酶切，与经同样双酶切的大肠杆菌－ 链 霉菌穿梭质粒载体pGH112 连接，得到重组 质粒pGH112-A 。将验证正确的重组质粒 pGH112 – A 电转至Ecoli BW25113 /pIJ790 感受态中，获得E． coliBW25113 /pIJ790 /pGH112-A 转化子，将其制作成 感受态细胞。
Thanks
Flowchart of gene disruption by PCR-targeting
1.质粒 质粒pIJ773中安普抗性基因的序列 ( 该序列中还包含转移复制起始点oriT 以及FLP 重组酶的识别位点FRT 序列， oriT 便于后面重组质粒的接合转移) 。
2.引物设计 设计一对长59nt及58nt 的引物( 引 物3 和引物4) ，其中引物3 包含20nt 的安普抗性基因上游的FRT 序列以及A基 因（想要敲除的基因）上游的一段39nt 的互补序列，引物4 包含19nt 的安普抗 性基因下游的FRT 序列以及A基因下游的 一段39nt 的互补序列。 3.PCR产生阻断片段 按此引物PCR 所得产物中应包含一个 安普抗性基因，并且在它的两端含有各 带有39bp 的A基因上下游的同源序列， 将此PCR 产物称为安普抗性框。以含有 安普抗性基因的质粒pIJ773 作为模板， 引物3 和引物4 进行PCR 扩增，产生阻 断片段。
Gene disruption by PCR-targeting
基因治疗中的基因敲除技术及其应用
基因治疗中的基因敲除技术及其应用基因治疗是一种利用基因工程技术来治疗疾病的新型医疗方法。
基因敲除技术是基因治疗的关键技术之一，它通过引入干扰性RNA或基因编辑工具，针对患者身体内的异常基因进行靶向打击，以实现基因疾病的治疗。
本文将介绍基因敲除技术的基本原理、方法及其在基因治疗中的应用。
基因敲除技术是指通过致使特定基因失活或删除之前定义的区域，来研究近亲气生物中基因的功能，尤其在人类基因组中的应用十分广泛。
基因敲除技术通常包括两种方法：RNA干扰技术和基因编辑技术。
RNA干扰技术是一种用来靶向沉默特定基因表达的方法。
它通过引入干扰性RNA（siRNA或shRNA）来干扰目标基因的转录或翻译，从而使目标基因的表达水平下降。
siRNA是由人工合成的双链RNA构成，可以选择性地降解与其互补的mRNA，使其无法被翻译成蛋白质。
shRNA是一种基因表达载体，可以产生siRNA，并持续地抑制目标基因的表达。
基因编辑技术是一种直接修改基因组的方法，可以实现精确编辑和改变DNA 序列。
基因编辑技术主要包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录调节因子样活化基因编辑酶（TALENs）和CRISPR-Cas9系统。
这些工具通过引导靶标DNA序列，切割和修复DNA，来实现基因敲除。
基因敲除技术在基因治疗中具有广阔的应用前景。
首先，基因敲除技术可以用于治疗单基因型遗传疾病。
通过针对致病基因进行敲除，可以恢复受影响的细胞正常功能，从而治疗疾病。
例如，囊性纤维化患者常常携带突变的囊性纤维化转膜调节器（CFTR）基因，通过使用基因敲除技术，可以删除异常CFTR基因，恢复肺部细胞的正常功能。
其次，基因敲除技术还可以用于癌症治疗。
癌症是由于细胞基因突变引起的，因此通过敲除异常基因可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。
例如，肿瘤抑制基因TP53的突变在很多类型的癌症中都很常见。
使用基因敲除技术来恢复正常TP53基因的功能，可以促进癌细胞凋亡和抑制其生长。
植物基因敲除技术步骤
植物基因敲除技术步骤植物基因敲除技术是现代植物遗传学领域的一项重要研究工具，它通过利用CRISPR/Cas9等工具精确地切断植物基因，从而实现对植物基因组的精准编辑和改造。
下面我们将详细介绍植物基因敲除技术的步骤，希望对您有所帮助。
植物基因敲除技术步骤一、制备CRISPR/Cas9载体1.选择合适的CRISPR/Cas9载体：首先需要确定用于植物基因敲除的CRISPR/Cas9载体，一般选择含有Cas9核酸酶、sgRNA以及适当的植物选择标记的载体。
2.将目标基因sgRNA序列插入载体：利用分子克隆技术，将设计好的sgRNA序列插入CRISPR/Cas9载体中，确保sgRNA能够专一且高效地识别目标基因序列。
二、转化植物细胞1.选择合适的植物材料：根据研究需要选择适宜的植物组织或细胞系，比如拟南芥、水稻、玉米等。
2.利用农杆菌介导转化技术：将制备好的CRISPR/Cas9载体利用农杆菌介导转化技术导入植物细胞中，促使其整合到植物基因组中。
三、筛选敲除突变体1.培养转化的植物细胞：将转化的植物细胞进行培养，培养条件包括合适的培养基、光照和温度等。
2.筛选突变体：利用PCR、Southern blot等技术筛选出含有目标基因敲除的突变植株，确认其为敲除突变体。
四、鉴定敲除突变体1.验证基因组序列：对候选的敲除突变体进行测序鉴定，确认目标基因已被成功敲除。
2.确认敲除效果：通过表型观察、生物化学分析等方法，评估目标基因敲除对植物的影响，确认敲除效果。
通过以上步骤，可以实现对植物基因的精准敲除，为研究植物基因功能、开发新品种以及改良农作物品质提供了重要的技术手段。
植物基因敲除技术的不断完善和广泛应用，将为农业生产和生物科学研究带来更多的机会和挑战。
基因敲除技术与转基因技术的比较研究
基因敲除技术与转基因技术的比较研究生物技术的发展和应用为人类带来了巨大的利益。
然而，与此同时，也不可避免地带来了一些争议。
在生物技术领域，基因敲除技术和转基因技术是两个热门话题，它们的利用在不同领域具有巨大的应用前景。
本文旨在比较基因敲除技术与转基因技术，帮助读者更好地了解它们的区别和优劣之处。
一、基因敲除技术基因敲除技术是一种通过DNA重组实现基因灭活或剔除的方法。
它通常通过利用重组酶切，将合成的DNA序列植入到细胞中，可以导致目标基因在细胞内被敲除或被靶向沉默。
基因敲除技术的优势在于可以准确地控制目标基因，从而促进基因治疗的发展。
此外，它还可以为疾病基因的研究提供新的平台。
基因敲除技术在基础研究、药物研发、细胞修饰和癌症研究等领域有着广泛的应用。
例如，通过敲除恶性肿瘤细胞中的抑癌基因，可以阻止恶性肿瘤的发展；在研发新的药物时，可以通过基因敲除来验证药物的靶点，从而确定药物的作用机理；以及通过基因敲除来研究不同基因在特定生物过程中的作用，例如神经发育和心肌细胞的分化。
二、转基因技术与基因敲除技术不同，转基因技术针对的是在植物和动物等有机体中插入外来基因的技术。
转基因技术常用的几种方法包括随机插入、受控插入、基因扩增和胚胎基因修饰。
转基因技术可以实现“设计”生物体，也就是人为地改变其生物特性。
转基因技术在食品生产、医疗和工业生产等领域有着广泛的应用。
例如，经过转基因技术改造后的植物可以抵抗病虫害，提高产量和质量，从而为食品生产提供了可能；在医疗领域，转基因技术可以用于生产抗体和蛋白质药物，或者用于治疗癌症、糖尿病和多发性硬化等疾病。
此外，转基因技术还可以用于工业制造，例如用转基因植物生产生物燃料、革命纤维和生物塑料等。
三、基因敲除技术与转基因技术的比较基因敲除技术和转基因技术虽然都是生物技术领域的重要发展方向，但二者还是有所不同的。
基因敲除技术致力于通过切断DNA序列来消除不必要的基因，而转基因技术则是通过插入新的基因来增强或改变生物体的功能。
基因敲除
二、基因敲除的方法
利用随机插入突变进行基因敲除。 特点：依赖于细胞内自然发生的同源染色体 的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组 利用同源 大规模的随机插入突变理论上可实现在基因 的效率特别低( 低于 10－ 6) 。增加了实际操 重组 作的工作量，限制了该项技术的应用 组范围内敲除任一基因目。 传统基因 敲除方法 该基因敲除( gene knock －out) 技术，是在转染 细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因 之间的 DNA 同源重组，能够使外源基因定点 地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改 应用随机 特点：可以分为 T-DNA 插入突变和转座子插 变细胞遗传特性的目的。 插入突变 入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲 除手段
二、基因敲除的方法
CRISPER/Cas系统的由来：
CRISPR（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats） 广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统， 该系统可以介导外源 DNA 的降解，从而抵御病毒等外来入侵者。 1987年日本学者首次在大肠杆菌中发现该间隔重复序列。 2002年，Jansen 等将其正式命名为 CRISPR，基因编码的蛋白质统称为 CRISPR 附属蛋白（CRISPR-association proteins，Cas）。
CRISPR/Cas系统的分类：
TypeⅠ TypeⅡ TypeⅢ三种不同类型 TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质 量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌 体DNA或是外源质粒。
CRISPR/Cas的基因座结构
5'端为tracrRNA基因
基因敲除和敲入技术的发展和应用
基因敲除和敲入技术的发展和应用随着科技的不断进步，人类对于基因的探究也日渐深入。
基因敲除和敲入技术作为其中的重要探究手段，则受到越来越多的关注和应用。
本文将从技术原理、研究进展、应用前景等方面阐述基因敲除和敲入技术。
一、技术原理基因敲除和敲入技术是利用DNA重组技术将人造的基因片段有选择地插入到细胞或某个生物体的特定位置，从而改变这个生物体的某种性状或者产生新的性状。
所谓基因敲除，就是将某个基因的序列刻意人为删除；而基因敲入，则是将人造基因片段有选择地插入到细胞或生物体中。
这两种技术都属于基因工程领域内的基础技术，也为其他生命科学领域提供了良好的研究工具。
二、研究进展基因敲除和敲入技术的研究始于20世纪80年代，最早是借助于整合子（Transposon）等修饰体来达到基因敲入的目的。
然而其限制因素太多，因此研究人员开始寻找其他方法。
1996年，Nobuyoshi Shimizu和John Witthuhn在细菌中利用锂盐法将基因敲除策略应用到实践中，为基因敲除技术的研发打下了基础。
此后的20多年里，随着不断的技术进步和生物技术产业的蓬勃发展，基因敲除和敲入技术也得到了飞速发展。
最近几年，基因敲除和敲入技术的进步尤其引人注目。
CRISPR-Cas9技术以其高效易用和精确性受到广泛关注，成为现在最主流的基因敲除和敲入技术之一。
除此之外，ZFN（zinc finger nuclease）和TALEN（TAL effector nuclease）等技术也在持续发展中，不断完善。
随着技术的不断创新和完善，基因敲除和敲入技术的应用范围也越来越广泛。
三、应用前景基因敲除和敲入技术得到广泛应用的趋势也日益明显，涵盖了从基础科学到临床医学的多个应用领域。
在基础科学领域，基因敲除和敲入技术可以被广泛应用于基础遗传学、生理学、细胞生物学、分子生物学等各个领域的研究。
以生物缺陷基因的研究为例，利用这两种技术可以实现对缺陷基因的破坏或修复，有助于进一步认识缺陷基因对生命活动的影响机制等。
基因敲除小鼠概念及原理
基因敲除小鼠概念及原理
基因敲除小鼠是一种通过基因敲除技术创造出来的实验动物模型。
基因敲除技术是一种新的分子生物学技术，建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上。
基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。
基因敲除小鼠的原理是利用基因同源重组进行基因敲除。
具体来说，通过同源重组将外源基因定点整合入小鼠的基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。
这种技术克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
基因敲除小鼠具有广泛的应用前景和商业价值，特别是在发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科的研究和治疗中。
这种技术的出现为这些学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有重要的意义。
基因敲除的技术和应用
基因敲除的技术和应用随着现代生命科学技术的发展，人们逐渐感受到基因敲除技术的强大和对于生命科学研究的深刻影响。
基因敲除是一种迅速且精准的基因表达抑制技术，其引起的基因失活可以为许多生物学问题提供重要答案。
本文将介绍基因敲除技术的原理及其应用。
基因敲除技术的原理基因敲除（Gene Knockout）是通过基因转染、体外转录、酶联反应以及基因编辑等手段，将物种基因组DNA序列的一部分或全部突变或删去，以制造失活变异体，实现基因靶点的消除，从而破坏目标基因的功能。
这种技术需要在实验室内精准选择目标基因（受体、信号通路等）并引入外源DNA分子，以制造一定的突变或完全失活的生理状态。
国际上常用的基因敲除系统有Cre-LoxP系统、Flippase （Flp）/FRT系统、Tet-On/Tet-Off系统、RNAi系统等。
Cre-LoxP系统是基于一个菌群住在肠道内的细菌切割酶的作用。
LoxP位点为34个碱基的DNA序列，Cre为双链酶，可以识别该位点，同时发挥切割酶和粘接酶的作用，形成“切掉”或“加入”等效果，从而达到改变目标基因DNA序列的目的，进而实现基因敲除的作用。
而Flippase（Flp）/FRT系统则是以酵母菌的响应元件FRT为基础。
在这个系统中，与Cre-LoxP系统类似的重新组合酶Flp可以切割、粘接两个FRT位点，使相邻的基因模块（例如启动子和融合基因）被分离，实现目标基因失活。
Tet-On/Tet-Off系统则是利用反转录病毒的基因表达特性，通过快速手段改变靶向基因表达。
该系统中，编码反向反而使靶向基因表达迅速发生变化，在短时间内实现基因敲除，并进一步研究变化造成的生物学效应。
RNAi系统则是通过RNA 干扰技术实现目标基因敲除。
其中，siRNA技术主要包括设计合适的RNA序列，然后将其导入到靶向基因的mRNA中，促成靶向基因的特定片段丧失其生物学功能，达到敲除目标基因的目的。
基因敲除技术的应用基因敲除技术主要应用于以下两个方面：1.生命科学研究基因敲除技术在生物医学、基础研究和农业等领域的应用非常广泛。
基因敲除技术在生命科学中的应用
基因敲除技术在生命科学中的应用随着生命科学的不断发展，我们对基因的研究和认识也越来越深入。
基因敲除技术就是其中的一种重要手段。
本文将介绍基因敲除技术的定义、原理、应用领域和趋势。
一、基因敲除技术的定义基因敲除技术就是利用生物学家获得或合成的一种名为“核酸酶”的特定分子工具，在细胞水平上去除一个或多个特定的基因。
一般情况下，基因敲除技术主要通过两种方式进行，一种是靶向克隆，另外一种则是表面转染。
二、基因敲除技术的原理基因敲除技术主要基于DNA重组技术，利用重组获得的核酸酶在细胞水平上切断需要敲除的目标基因的DNA序列，从而去除该特定基因的生物学功能。
换句话说，通过切断目标基因的DNA序列，从而改变了细胞内的基因表达并导致细胞生物学功能的改变。
三、基因敲除技术的应用领域1. 疾病研究基因敲除技术在疾病研究中发挥着十分重要的作用。
通过敲除某些特定的基因，可以观察细胞内基因表达的变化，从而识别出某些疾病个体的病理过程和分子机制，并且有助于开发新的治疗方法。
例如，利用基因敲除技术可以研究基因对于闭经、代谢综合征、血管紧张素性肺动脉高压等疾病的发病机制。
2. 肿瘤研究在肿瘤治疗方面，基因敲除技术有助于识别出相关肿瘤发生和发展的影响因素，以及选择最佳治疗方法。
例如，通过针对性敲除或修改某些关键基因，可以有效研究肿瘤的发展过程和病理机制，为开发新的治疗策略奠定重要基础。
3. 物种遗传学研究基因敲除技术可以用于研究不同物种之间的基因功能的差异性，有助于对比不同物种之间的遗传差异，发现基因与物种特征的相关性。
例如，借助基因敲除技术，可以研究蜜蜂的基因类型，了解其生物学特征和行为特征，同时也有助于发现与生产相关的基因等。
四、基因敲除技术的趋势1. 敲除多个基因针对重要的复杂疾病和复杂性状，基因敲除研究者可以同时敲除多个基因，以探究多基因作用的相关性和潜在医学应用。
2. 敲除肿瘤特定基因越来多的基因敲除研究者将关注重心转向敲除与肿瘤发展直接相关的基因，以此探究肿瘤发展的机理，及其对治疗的可能贡献。
基因敲除技术的优势与劣势分析与对比
基因敲除技术的优势与劣势分析与对比基因敲除技术是一种重要的基因编辑技术，能够精确改变特定基因的表达，从而帮助研究者更好地理解生物学过程以及治疗人类疾病。
本文将从优势和劣势两个方面对基因敲除技术进行分析与对比。
首先，我们来看一下基因敲除技术的优势。
首先，基因敲除技术具有高度的精准性。
通过特定的设计和操作，基因敲除技术可以直接删除目标基因的DNA序列，实现基因的永久性失活。
相比之下，其他基因编辑技术如基因敲入技术和基因修饰技术则需要在目标基因中插入新的DNA序列或对已有的DNA序列进行修改，这可能导致非特异性效应或潜在的安全风险。
其次，基因敲除技术对于基因功能研究和疾病机制研究非常有帮助。
通过敲除某个基因，研究者可以观察其在生物体发育、疾病进程以及生理活动中的角色和作用。
这有助于深入了解基因与生物体之间的关系，揭示疾病的发生机制，并为药物研发提供新的靶点。
另外，基因敲除技术在基因治疗中具有潜力。
通过针对致病基因的敲除，基因敲除技术能够治疗遗传性疾病，并有望成为一种有效的治疗手段。
例如，最近的研究发现，通过敲除特定基因可以治疗某些类型的癌症和遗传性疾病，为疾病患者带来新的希望。
然而，基因敲除技术也存在一些劣势需要考虑。
首先，基因敲除技术通常需要使用大量的时间和资源。
由于其精确性要求，研究者需要设计和合成特定的DNA构建，然后进行特定细胞中的基因敲除。
这需要耗费大量的实验操作和时间。
此外，基因敲除技术对于不同基因和细胞类型可能存在差异性，导致实验的复杂性和难度增加。
其次，基因敲除技术对于全身性基因敲除的研究面临伦理和安全性问题。
全身性基因敲除可能导致显著的生理和行为改变，甚至死亡。
因此，在动物模型和临床试验中需要严格控制，避免潜在的风险和伦理问题。
此外，基因敲除技术可能会产生非特异性的影响。
当研究者敲除一个基因时，可能会影响其他基因的表达和功能，造成非特异性效应。
这无形中增加了数据的解读和分析的复杂性。
遗传学中的基因敲除技术
遗传学中的基因敲除技术随着遗传学研究的不断深入，基因敲除技术的出现为研究基因和基因功能提供了更好的手段。
基因敲除技术是指通过遗传工程手段，使特定细胞或个体中的某一基因或基因组不表达或失去功能的技术。
它可以帮助我们更深入地了解基因的功能，揭秘疾病的发生机制以及探究生物的生命活动中所涉及到的遗传机制等方面。
基因敲除技术的分类目前基因敲除技术主要有两种：一种是RNA干扰技术，另一种则是CRISPR/Cas9技术。
RNA干扰技术：如今已成为非常成熟的分子遗传学方法之一。
该技术通过小分子RNA或 hairpin RNA影响特定基因的表达，从而对细胞、组织、个体进行基因敲除。
它的原理是通过特殊的酶来切割RNA并将其降解，从而抑制RNA转录，进而实现基因敲除。
这种方法的优点是适用性广泛，不需要对宿主细胞进行基因改造。
CRISPR/Cas9技术：CRISPR/Cas9技术是指利用CRISPR介导的Cas9核酸酶来靶向切割和编辑基因组DNA的新型基因编辑技术。
该技术以高效、便捷、准确、可控为特点。
CRISPR/Cas9技术还可以将新DNA序列导入基因组，从而实现基因敲入。
CRISPR/Cas9技术引起了生命科学界的轰动，成为近年来研究基因组编辑技术的当红炸子鸡。
基因敲除技术在研究中的应用基因敲除技术的出现极大地促进了生命科学的发展。
它已经被广泛应用于研究基因组和基因功能，具体应用如下：1.揭示基因的功能：通过敲除某一基因，可以观察该基因对生命活动的贡献，从而深入了解其功能。
2.探究疾病的发生机制：某些疾病与特定基因的异常有直接关系，而基因敲除技术可以控制某些基因是否表达，从而更好地探究疾病的发生机制。
3.开发新药：基因敲除技术可以通过创建动物模型，在其中敲除某些基因，观察其对药物治疗效果的影响，从而开发新药。
4.精准基因治疗：基因敲除技术可以将健康基因导入染色体中进行修复，从而达到治疗疾病的效果。
5.研究基因联锁和遗传图谱：利用基因敲除技术，可以拆分遗传联锁，以便更好地理解和研究基因群之间的相互作用。
基因敲除的新技术_RNAi
缺点 (表 1) 。哪种是最好的方法 ,取决于实验目的 。 除了方法 3 以外 ,其他方法在制备 siRNA 前都
需要单独设计 siRNA 序列 。关于怎样设计 siRNA 以 及 siRNA 设计对 siRNA 功能的影响 ,尽管不断掌握 了越来越多有关设计原则的信息 ,但仍然不精确 。通 常来说 ,每个目标序列设计 3～4 对 siRNA s ,在后面 的实验中选择最有效的 1 个即可 。网上可提供免费 的 siRNA 设计工具 。
中图分类号 : R457. 4
文献标识码 :A
文章编号 :167324130 (2007) 1121016204
基因敲除是一种反向的遗传学研究方法 ,是八十 年代后发展起来的一种新型的分子生物学技术 ,是通 过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术 。 通常意义上的基因敲除主要是应用 DNA 同源重组原 理 ,但此技术较复杂且成功率不高 。随着基因敲除技 术的发展 ,除了同源重组外 ,新的原理和技术也逐渐 被应用 ,比较成功的有基因的插入突变和 RNA 干扰 ( RNA interference , RNAi) ,它们同样可以达到基因 敲除的目的 。其中 RNAi 由于方法简便 ,周期较短 , 因此近几年来越来越多的基因敲除采用了 RNAi 方 法[1～3 ] 。RNAi 是指双链 RNA 诱导同源 mRNA 降解 导致基因表达抑制的现象 ,又称基因沉默. 是一种转 录后 基 因 沉 默 (po st t ranscriptio nal gene silencing , P T GS) 现象 ,是生物体在进化过程中抵御病毒感染及 防御重复序列和突变引起基因组不稳定的保护机制 。
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锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别 3-4个碱基； • 人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采 用如上的通用序列，通过改变其中7个 X来实现识别不同的三联体碱基， TGEK是多个螺旋间的连接序列； • 构建成对人工锌指结构域和FokI融合 蛋白（ZFN）可以在指定区域切断 DNA双链。
2单元模块质粒
pCS2 TALEN真 核表达载体 1+2单元模块质 粒套装 多单元模块质粒 pCS2 TALEN真 核表达质粒
共16种选择
TALEN空载体2种/套 4+16+2共22种质粒/套
20以下任意单元数目 将指定TALEN模块插入pCS2 TALEN真核表达载体
怎样做TALEN
康 为
TALEN质粒 构建
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 • 一篇大鼠
《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs 》
TALEN应用扩展的技术关键： 切实可靠的表达系统。 高效的转基因及克隆筛选技术。
TALEN的植物应用
Ting Li et. al. High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease resistant rice， volume 30 number 5 may 2012 Nature Biotechnology
应识别一个目标碱基
人工构建TALE模块识别指定核酸序列
…… 14 – 18个重复
102碱基模块单元 真核表达
…… 14 – 18个重复 34氨基酸单元 特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合
TALEN 发展过程
TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对 TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点 切割诱发DNA损伤修复机制 （nonhomologous end-joining， NHEJ）。由于在此修过程中总是 有一定的错误率存在。在修复中发 生移码突变错误的个体即形成目标 基因敲除突变体
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除
• 片段插入
目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
靶向基因技术
经典方法 ： 自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
T A L E N 技 术 服 务
提供两个测序证明的14-18碱基TALEN识别域真核表 达克隆(pCS2)。且以293T细胞系转染，PCR酶切 鉴定，灰度扫描定量证实突变效率高于10%
TALEN靶向 敲除细胞 系构建 TALEN靶向 敲除斑马 鱼构建
提供经克隆测序证明的目标基因移码突变细胞系(杂 合子） 提供目标基因基因移码突变F1斑马鱼（杂合子）
TALEN 发展过程
1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.）
avrBs3 基因被克隆。
2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 由34个aa组成一个单元模块，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对
突变体筛选
• 有限稀释法获得单细胞克隆
• PCR-酶切法鉴定
• PCR测序确认
怎样做TALEN
基本工具质粒
1单元模块质粒：A，G，C, T共4种 2单元模块质粒：4X4=16种 TALEN表达载体：基于PCS2质粒2种
14 – 18bp靶点序列
怎样做TALEN
康 为 T A L E N 定 制 质 粒 产 品 1单元模块质粒 A, G, C, T 4种选择
ZFN 技术
研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因 敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达 到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。
锌指核酸酶介导的定向染色体删除
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
TALEN技术成功率影响因素
重组TALEN模块与靶位点的 ‘亲合力’
靶点序列设计原则来自20个天然TLAE的统计规律
细胞系固有特性
K562容易，293中等，MC-10困难
细胞转染效率
不同细胞系转染效率不同，293高， HeLa低
所期待的目标
Heterozygous？Homozygous？Exact point mutation？
X2
TAL 靶点识别模块
FokI
FOKI 内切酶打断靶点区
步骤三. 将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除
TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位 点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成 二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。
《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》 •
一篇综述 《Move over ZFN》
TALEN靶向（基因敲除）技术 基本流程
1. 选择、确定靶点
2. TALE识别模块串联构建
X2
3. TALEN真核表达质粒构建
X2
Mut
• 当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用 CEL-I核酸酶检测。
• 经验规律：>= 2%可用，>=10%很好
TALEN切割效率检测
荧光素酶检测法 启动子 – ABCDEF – stop-Target site - DEFHIJK 共转染 荧光素酶检测质粒 + TALEN质粒 1 + TALEN质粒 2 启动子 – ABCDEFHIJK 发光倍数与切割效率之间的定量关系尚缺乏充分研究。 有文献表明，发光倍数达1.5至2倍即可有效获得突变体。
饱含希望与失望的技术： ZFN，被Sigma公司垄断 新的里程碑： TALEN
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向 基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、 斑马鱼与大鼠等各类研究对象。 技术原理： 表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核 酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。
具专利保护的克隆构建系统
具专利保护的克隆构建系统
步骤一：靶点识别单元串联
具专利保护的克隆构建系统
步骤二：TALEN表达质粒构建
真核表达TALEN质粒对
将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含 有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2 聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔 17碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。
TALE识别模块串联构建
• TAL的核酸识别单元
为34aa模块中的双连 氨基酸（RVD） • RVD与A、G、C、T 有恒定的对应关系， 即NI识别A，NG识别T， HD识别C，NN识别G， 非常简单明确 • 欲使TALEN特异识 别某一核酸序列（靶 点），只须按照靶点 序列将相应TAL单元 （14 -18个）串联克 隆即可。
TAL 靶点识别模块
FokI
X2
TALEN介导的同源重组
HR
基因敲入
片段删除 Left arm Right arm
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
Donor plasmid
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
4. TALEN真核表达质粒转入 （卵）细胞，表达TALEN 重组蛋白
X2
Mut
5. 检测突变效率，筛选 （移码）突变体
选择确定TALE靶点
靶点的DNA序列特征： 相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点
参考文献：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82. 在线靶点选择设计软件：https:///node/add/talef-off/
背景
水稻病原菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)导致细菌性白叶枯病。 细菌天然 TALE AvrXa7 or PthXo3 与水稻Os11N3基因 启动子结合，调控（hijack） 此基因上调表达，促进细胞内糖份向细胞外转运，便于病原菌利用。