基因敲除新技术

背景
水稻病原菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)导致细菌性白叶枯病。 细菌天然 TALE AvrXa7 or PthXo3 与水稻Os11N3基因 启动子结合，调控（hijack） 此基因上调表达，促进细胞内糖份向细胞外转运，便于病原菌利用。
策略
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除
• 片段插入
目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
靶向基因技术
经典方法 ： 自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
突变体筛选
• 有限稀释法获得单细胞克隆
• PCR-酶切法鉴定
• PCR测序确认
怎样做TALEN
基本工具质粒
1单元模块质粒：A，G，C, T共4种 2单元模块质粒：4X4=16种 TALEN表达载体：基于PCS2质粒2种
14 – 18bp靶点序列
怎样做TALEN
康 为 T A L E N 定 制 质 粒 产 品 1单元模块质粒 A, G, C, T 4种选择
TALEN技术成功率影响因素
重组TALEN模块与靶位点的 ‘亲合力’
靶点序列设计原则来自20个天然TLAE的统计规律
细胞系固有特性
K562容易，293中等，MC-10困难
细胞转染效率
不同细胞系转染效率不同，293高， HeLa低
所期待的目标
Heterozygous？Homozygous？Exact point mutation？
X2
TAL 靶点识别模块
FokI
FOKI 内切酶打断靶点区
步骤三. 将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除
TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位 点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成 二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。
Mut
• 当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用 CEL-I核酸酶检测。
• 经验规律：>= 2%可用，>=10%很好
TALEN切割效率检测
荧光素酶检测法 启动子 – ABCDEF – stop-Target site - DEFHIJK 共转染 荧光素酶检测质粒 + TALEN质粒 1 + TALEN质粒 2 启动子 – ABCDEFHIJK 发光倍数与切割效率之间的定量关系尚缺乏充分研究。 有文献表明，发光倍数达1.5至2倍即可有效获得突变体。
具专利保护的克隆构建系统
具专利保护的克隆构建系统
步骤一：靶点识别单元串联
具专利保护的克隆构建系统
步骤二：TALEN表达质粒构建
真核表达TALEN质粒对
将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含 有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2 聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔 17碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。
《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》 •
一篇综述 《Move over ZFN》
TALEN靶向（基因敲除）技术 基本流程
1. 选择、确定靶点
2. TALE识别模块串联构建
X2
3. TALEN真核表达质粒构建
X2
突变体形成
内切酶的切割诱发DNA损伤修复机制 （nonhomologous end-joining，NHEJ）。 由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。 在修复中发生移码突变错误的个体即形成目 标基因敲除突变体。
TALEN切割效率检测
PCR – 酶切法
• 利用靶点设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的 特异性内切酶位点，进行PCR产物酶切鉴定。
T A L E N 技 术 服 务
提供两个测序证明的14-18碱基TALEN识别域真核表 达克隆(pCS2)。且以293T细胞系转染，PCR酶切 鉴定，灰度扫描定量证实突变效率高于10%
TALEN靶向 敲除细胞 系构建 TALEN靶向 敲除斑马 鱼构建
提供经克隆测序证明的目标基因移码突变细胞系(杂 合子） 提供目标基因基因移码突变F1斑马鱼（杂合子）
TALEN应用扩展的技术关键： 切实可靠的表达系统。 高效的转基因及克隆筛选技术。
TALEN的植物应用
Ting Li et. al. High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease resistant rice， volume 30 number 5 may 2012 Nature Biotechnology
ZFN 技术原理
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别 3-4个碱基； • 人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采 用如上的通用序列，通过改变其中7个 X来实现识别不同的三联体碱基， TGEK是多个螺旋间的连接序列； • 构建成对人工锌指结构域和FokI融合 蛋白（ZFN）可以在指定区域切断 DNA双链。
饱含希望与失望的技术： ZFN，被Sigma公司垄断 新的里程碑： TALEN
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向 基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、 斑马鱼与大鼠等各类研究对象。 技术原理： 表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核 酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。
Selection marker insertion？
TALE技术应用范围

细菌：尚无报道，已另有多种高效靶向技术。 真菌：有报道，TALE原理可行。 植物：TALE原理发现于植物，需特定转基因技术。 动物细胞：TALE原理可行，各细胞系效率不一。 斑马鱼：有TALEN基因敲除报道，尚无点突变与敲入报道。 小鼠、大鼠……原理肯定可行，但尚无报道（技术太新，转基 因动物构建实验周期较长）。
TALEN 发展过程
1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.）
avrBs3 基因被克隆。
2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 由34个aa组成一个单元模块，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对
TAL 靶点识别模块
FokI
X2
TALEN介导的同源重组
HR
基因敲入
片段删除 Left arm Right arm
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
Donor plasmid
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
以TALEN对细菌TALE靶点区做突变，使细菌TALE无法与水稻Os11N3基因 启动子 结合。
结果
突变水稻获得抵御细菌感染的能力
TALEN与主要类同技术比较
siRNA
优于TALEN
可瞬时转染快速观察效果 Knockdown效果确实，可用于必须基因
逊于TALEN
瞬时转染效果短暂 不是彻底knockout 慢病毒稳转发生染色体随机整合
4. TALEN真核表达质粒转入 （卵）细胞，表达TALEN 重组蛋白
X2
Mut
5. 检测突变效率，筛选 （移码）突变体
选择确定TALE靶点
靶点的DNA序列特征： 相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点
参考文献：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82. 在线靶点选择设计软件：https://boglab.plp.iastate.edu/node/add/talef-off/
ZFN
优于TALEN
经验积累多，技术较成熟
逊于TALEN

技术复杂，难度高，被Sigma公司垄断 靶点序列要求高，难找 Off-targeting现象严重 经常有显著细胞毒性
基因组精密工程
•
今年来自梅奥医学中心的研究人员第一次利用人工酶切割一段基因序 列中的部分DNA，并用合成DNA取代它们，对斑马鱼基因组部分序列 进行了定制修改。这种技术称为转录激活因子样效应物核酸酶 （transcription activator-like effector nucleases ，TALENs）方法， 相比ZFNs和 morpholinos，TALENs具有几个优势：它们更便宜、更 有效，尤其是以一种开发活性形式应用时。ZFNs只能靶向特异序列， 而TALENs有潜力对任何的DNA序列起作用。Morpholinos的效应是短 暂的，而TALENs可造成永久性的改变。随后科学家们在蟾蜍等其它 动物中展开了这方面的研究，证明这种技术与已证实的基因靶向技术 一样有效。国内清华大学的施一公和颜宁等人也于今年在Science杂 志上报道了TALE特异识别DNA的分子机理，这提供了TALE蛋白的改 造基础，极大地拓宽了TALE蛋白在生物技术应用上的前景。
ZFN 技术
研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因 敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达 到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。
锌指核酸酶介导的定向染色体删除
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
应识别一个目标碱基
人工构建TALE模块识别指定核酸序列
…… 14 – 18个重复
102碱基模块单元 真核表达
…… 14 – 18个重复 34氨基酸单元 特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合
TALEN 发展过程
TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对 TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点 切割诱发DNA损伤修复机制 （nonhomologous end-joining， NHEJ）。由于在此修过程中总是 有一定的错误率存在。在修复中发 生移码突变错误的个体即பைடு நூலகம்成目标 基因敲除突变体
2单元模块质粒
pCS2 TALEN真 核表达载体 1+2单元模块质 粒套装 多单元模块质粒 pCS2 TALEN真 核表达质粒
共16种选择
TALEN空载体2种/套 4+16+2共22种质粒/套
20以下任意单元数目 将指定TALEN模块插入pCS2 TALEN真核表达载体
怎样做TALEN
康 为
TALEN质粒 构建
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 • 一篇大鼠
《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs 》
TALE识别模块串联构建
• TAL的核酸识别单元
为34aa模块中的双连 氨基酸（RVD） • RVD与A、G、C、T 有恒定的对应关系， 即NI识别A，NG识别T， HD识别C，NN识别G， 非常简单明确 • 欲使TALEN特异识 别某一核酸序列（靶 点），只须按照靶点 序列将相应TAL单元 （14 -18个）串联克 隆即可。