青霉素酰化酶的分离纯化共97页
酶的分离纯化资料PPT课件
胞外酶：过滤、离心等方法出去菌体
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◆细胞抽提液的制备
酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞 破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过 程。
通过降低溶液的介电常数，增强偶极离子间的静电吸引，从 而使分子聚集沉淀。此外，有机溶剂本身如酒精、甲醇、丙酮等， 对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使 蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性
选择原则：
①必须与水混溶 ②不与pr反应 ③较好的沉淀效应 ④溶剂蒸汽无毒，
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盐析法
向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响:盐溶现 象和盐析现象
盐析方程:
lg0= β
Ks:盐析效率，是蛋 白质和盐种类的 特征常数。在一 定pH和温度条 件下，利用不同 蛋白质的Ks不同
β分段盐析：S0随pH和温度的变化而变化,在一定的I值下通过改变
§1.6酶的分离纯化
2013春
提纲
蛋白质纯化的一般考虑 蛋白质的粗分离 蛋白质的大规模分离纯化
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一、蛋白质纯化的一般考虑
※从量上考虑
为测序或克隆的目的，只需几微克； 为工业或医药的用途，则可达几千克
※从纯化的标准
为临床治疗所需，纯度应达到98%或99%以上； 用于其它一般用途，要求低
高度纯化
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成品加工
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二、蛋白质的粗分离
材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白
青霉素的提取与纯化[发明专利]
![青霉素的提取与纯化[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/79d2e94a1611cc7931b765ce05087632311274a9.png)
[19]中华人民共和国专利局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1110686A[43]公开日1995年10月25日[21]申请号94116070.X [22]申请日94.9.22[71]申请人天津大学地址300072天津市南开区卫津路92号[72]发明人李十中 [74]专利代理机构天津大学专利代理事务所代理人曲远方 张强[51]Int.CI 6C07D 499/18权利要求书 1 页 说明书 3 页[54]发明名称青霉素的提取与纯化[57]摘要本发明属于有机化合物的分离。
在青霉素发酵液的溶剂萃取工艺中不引入任何表面活性剂，采用切割分子量20000及以下的超滤膜对该发酵液或其过滤后的滤液进行超滤处理，纯化滤液，透过液的青霉素萃取过程可在生产中使用任意萃取设备一次完成青毒素的提纯和浓缩过程，萃取液用无盐水洗涤，进一步纯化萃取液。
94116070.X权 利 要 求 书第1/1页 1、一种有机化合物的分离工艺，本发明的特征在于使用切割分子量(MWCO)20000及以下的超滤膜对青霉素发酵液预处理过滤后的滤液，或直接对发酵液进行超级过滤，纯化滤液，透过液的青霉素萃取过程可在生产中使用的任意萃取设备中一次完成青霉素的提纯和浓缩过程，萃取液用无盐水洗涤，进一步纯化萃取液。
2、根据权利要求1所述的有机化合物分离工艺，其特征在于超级过滤是在5～30℃，0.1～0.5MPa的条件下进行的。
94116070.X说 明 书第1/3页青霉素的提取与纯化本发明属于有机化合物的分离。
青霉素的提纯在已有技术中有报导，从发酵液中提取青霉素，有活性碳吸附法、沉淀法、离子交换法、溶媒萃取法等方法。
目前普遍采用溶媒萃取法，是将有机溶媒与青霉素发酵液预处理过滤的滤液混合，通过调节PH值使青霉素由水相转入溶媒，达到提纯和浓缩的目的。
该方法有以下几种：将青霉素由滤液通过Podbielniak萃取机一步萃取到溶媒中的一步萃取法（prensive Biotchnology.ed.M.Mooy oung.vol.3.P28-29 Pergamon press New York，1985）;将青霉素由滤液提入溶媒，转入缓冲液，再由缓冲液提入溶媒相的三步提取法（俞文和等，《抗生素工艺学》，辽宁科学技术出版社，P227（1988年）;将青霉素提入溶媒后直接进行共沸结晶的一次萃取共沸结晶法（俞文和等，《抗生素工艺学》，辽宁科学技术出版社，P196-197（1988年））;对青霉素发酵液直接使用倾析器进行萃取的直接萃取法（俞文和等，《抗生素工艺学》，辽宁科学技术出版社，P227（1988年））。
巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶在枯草杆菌中的表达及其分离纯化
第15卷第1期1999年2月中国生物化学与分子生物学报Ch inese Jou rnal of B i ochem istry and M o lecu lar B i o logyV o l.15,N o.1Feb.19993 联系人 T el:(021)643744302289,Fax:(021)64338357E2m ail:zhongyi@黄艳红:女,32岁,博士收稿日期:1997212212,修回日期:1998204201・研究简报・巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶在枯草杆菌中的表达及其分离纯化黄艳红 袁中一3 王应睐(中国科学院上海生物化学研究所,上海200031)Expression and Pur if ica tion of the PGA gene ofB acillus m ega ter ium i n B acillus subtilisHU AN G Yanhong,YU AN Zhongyi,W AN G Y inglai(S hang hai Institu te of B ioche m istry,Ch inese A cad e my of S ciences,S hang hai 200031) Abstract Pen icillin G acylase(PGA)gene of B acillus m eg a terium w as in serted in to the p las m id of pM A5E.coli2B.subtilis shu ttle vecto r,then the recom b inan t p las m id pM A GA w as tran sfo rm ed in to B.subtilis BCL1050.T h is is a secrete system,in w h ich PGA can be exp ressed and secreted in2 to cu ltu re m edium directly,p roviding a conven ien t m ean s of ob tain ing relatively p u re enzym e in large quan tity.A fter cu ltu ring fo r24hou rs in rich m edium,the enzym e activity reached abou t1.4 U m l.PGA exp ressed in B.subtilis BCL1050w as p u rified app rox i m ately6002fo ld by p henylala2 n ine hydrop hob ic ch rom atograp hy,amm on ia su lfate p reci p itati on,size exclu si on ch rom atograp hy and D EA E2Sep hadex A250ch rom atograp hy.T he p u rified enzym e,w ith an app rox i m ate m o lecu lar w eigh t of82kD,app eared to be hom ogeneou s judged by SD S2PA GE analysis.T he m ass ofΑandΒsubun its determ ined by SD S2PA GE w as54.95kD and21.88kD resp ectively.Key words B acillus m eg a terium,Pen icillin acylase,Exp ressi on,B acillus subtilis,Pu rificati on 青霉素酰化酶(PGA)在医药工业起着重要的作用,它能够水解青霉素G产生62氨基青霉烷酸(62A PA)和苯乙酸,62A PA是半合成青霉素的关键中间体.该酶广泛存在于各种微生物中如真菌和细菌中.国际上对E.coli、A rth robacter v iscosus、K luy vera citrop h ila来源的PGA研究较多,对巨大芽孢杆菌(B acillus m eg a terium)来源的青霉素酰化酶研究较少,并且对它的表达研究大部分是在大肠杆菌表达系统中进行的.枯草杆菌(B acillus subtilis)作为表达系统有以下优点:(1)它能够把有功能的蛋白直接分泌到胞外;(2)非致病性;(3)没有明显的偏爱密码子.它的非致病性决定了它在食品卫生方面有广阔的应用前景.我们尝试用枯草杆菌表达系统对巨大芽孢杆菌来源的PGA进行表达研究.巨大芽孢杆菌的PGA基因克隆到大肠杆菌2枯草杆菌穿梭质粒pM A5中,再转化到枯草杆菌BCL1050中,在H p a 启动子作用下进行表达.表达产物通过苯丙氨酸2Sep haro se24B柱、Sep hacryl 2100和2250柱纯化得到了纯度达90%以上的青霉素酰化酶.1 材料与方法111 枯草杆菌质粒的抽提、感受态细胞的制备和质粒的转化 参照文献[1].112 外源基因的表达把重组表达质粒pM A GA转化到枯草杆菌BCL1050,接种单菌落于3m l LB(含Km50Λg m l),37℃培养过夜,取上述过夜菌以0105%的接种量于新鲜的LB(Km)培养液中,37℃振荡培养24 h,即可得含酶的发酵液.113 酶活力测定酶活力测定采用N IPAB方法[2]和PDAB方法[3].酶活力单位定义为每分钟产生1Λm o l62A PA 所需酶量.114 青霉素酰化酶的分离纯化苯丙氨酸2Sep haro se4B柱层析(按文献[4]和[5]方法制备苯丙氨酸2Sep haro se4B),Sep hacryl S2 100分子筛柱层析,D EA E2Sep hadex A250柱层析参照有关文献进行.2 结果与讨论211 表达载体的构建和转化通过PCR技术,从巨大芽孢杆菌CA2098菌种中获得青霉素酰化酶基因,克隆到pB luescri p t+SK 中,得到重组质粒p SKGA(513kb).p SKGA用E co R 、B am H 切下p ga,连接到N d e 、B am H 酶切的pM A5中,产生重组质粒pM A GA(919kb). pM A5是一个大肠杆菌2枯草杆菌穿梭质粒,核苷酸长度为715kb.用B am H 、E co R 把重组质粒pM A GA切开,经连接转化,筛选到只带有卡那霉素抗性的质粒pM A GA2(6115kb)(F ig.1),将pM A2 GA,pM A GA2分别转化到枯草杆菌受体菌BCL1050中,得到BCL1050(pM A GA)与BCL1050 (pM A GA2).BCL1050是一个在染色体上去除大部分蛋白酶基因的工程菌[6],外源基因能在BCL1050中得到很好的表达,并且稳定性好,BCL1050 (pM A GA)培养24h的发酵液4℃放置1周酶活力不下降.枯草杆菌质粒的转化与大肠杆菌质粒转化不同,枯草杆菌感受态转化质粒发生在生长的特殊阶段,转化效率最高的感受态是对数期后生长3h 的菌,与起始培养菌的生长率无大关系[7].212 青霉素酰化酶的表达以0105%接种量将过夜菌BCL1050 (pM A GA)接种于80m l LB培养基(含50Λg m l Km).测菌体生长曲线和产酶活力曲线.发现在24 h产酶量已趋于稳定,活力单位为018U m l.把含有pM A GA2的BCL1050过夜菌接种于新鲜的LB 中培养,与BCL1050(pM A GA)比较,发现BCL1050 (pM A GA)的菌生长较慢,但活力高.BCL1050 (pM A GA2)的菌体虽然生长快,但活力低.同时,采用不同的培养基如丰富培养基来进行发酵,发现酶活力比在LB培养基中活力高.培养24 h后LB培养基中的酶活力为018U m l,丰富培养基中的酶活力则已达114U m l.继续延长培养在LB培养基中的酶活力基本稳定而丰富培养基中的酶活力还在增加.84h后酶活力达到4U m l.提高F ig.1 Constructi on of B.subtilis exp ressi on vecto r接种量到2%和5%,发现相同时间酶活力并未因接种量增大而提高.还测定了在丰富培养基中接种量为0105%发酵液中菌体内的酶活力,1m l发酵液中菌体内的酶活力单位24h为011U m l,48h为0115U m l,68h为0114U m l,84h为011U m l,菌体内的酶活力稍有变化.发酵液中酶活力一直增长的原因可能有二:一是随着培养时间的延长,新生菌不断产生酶,有累积效应;二是大量老的菌体死亡,分解释放出菌体内残留的酶,所以酶活力一直在增加.在巨大芽孢杆菌中,PGA的产生受葡萄糖的抑制,把丰富培养基中的葡萄糖去掉,发现BCL1050(pM A GA)发酵液酶活力不仅不增高,反而下降.重组质粒pM A GA只含有PGA的结构基因,不含有它的调控基因,所以重组表达菌种BCL1050(pM A GA)中葡萄糖并未抑制PGA的产生,反而是菌体生长所需的营养成分.213 青霉素酰化酶的分离纯化在含有22%硫酸铵的磷酸缓冲液中,青霉素酰化酶与苯丙氨酸224通过疏水相互作用071中国生物化学与分子生物学报15卷而吸附,其它疏水性弱的杂蛋白则不被吸附.当硫酸铵浓度降低时,使它们之间的疏水作用减弱而解吸,PGA 被洗脱下来[5].这一纯化步骤可除去培养基中的大部分杂质,而吸附大部分酶分子.产率为81%,达到浓缩酶的作用.收集的活力峰直接加入硫酸铵使其浓度达75%饱和度,经过沉淀离心可以得到80%的酶.再通过分子筛,除去小分子和大分子的杂蛋白.最后经过D EA E 2Sep hadexA 250柱层析,在pH 715时,酶分子带负电荷,能与C l -进行交换.经过这几步的纯化,SD S 2PA GE 显示出只有两个亚基的条带(F ig .2),酶的纯化倍数提高了600倍(T ab le 1).F ig .2 SD S 2PA GE pattern of purified penicillin acylase 1:P ro tein m arkers2:Purified PGA samp le (10Λg )Table 1 Pu rificati on of pen icillin acylase from the recom b 2inan t B acillus subtilis pM A GA (BCL 1050)To tal vo lum e m l To tal p ro tein m g To talactivity U Specific activity U ・m g -1Yeild (%)Ferm entati on bro th 10001602736817501023100Phe 2Sepharo se ch rom atography 9183173001733159381155Ammonium sulfate p reci p itati on 819431129615461888014Sephacryl S 2100163251223210991213116D EA E 2Sephadex A 250343155118141814214 青霉素酰化酶分子量的确定12%SD S 2PA GE 电泳测定蛋白质的分子量.测量和计算标准蛋白质和PGA 两亚基的相对迁移率m R (样品迁移距离染料迁移距离),以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率m R 作图,得到标准曲线,根据Α、Β亚基的相对迁移率,从标准曲线上查出它们的分子量分别为54195kD 和21188kD ,这与从PGA 基因推导出的分子量59107kD 和22188kD 基本相符.致谢:对美国D arto is 博士所提供的枯草杆菌受体菌BCL 1050和穿梭质粒pM A 5深表谢忱.References1 贾盘兴,蔡金科编著.微生物遗传学实验技术.北京:科学出版社(J ia Panxin ,Cai J inke .L aboratory M anual of M icrobiology Ge 2netics.Beijing :Science P ress ),1992:130～1372 上海第三制药厂,一种快速简便的测量青霉素酰化酶的方法.医药工业(Shanghai T h ird Pharm acial Facto ry .M ethod to deter 2m ine penicillin acylase fast and conviniently .M ed Ind ),1978,7:22～243 Balasingham K ,W arburton D ,D unnill P ,L illy M D .T he iso la 2ti on and k inetics of penicillin am idase from E scherich ia coli .B ioch i m B iop hy s A cta ,1972,276:250～2564 徐俊,祁俊,袁中一.共价法固定化胰蛋白酶的研究.生物工程学报(Xu Jun ,Q i Jun ,Yuan Zhongyi .I mmobilizati on of T ryp sin onSepharo se derivatives using vari ous covalent bonding m ethods .Ch in J B iotechnol ),1993,9(1):69～735 费俭,顾秋.疏水层析法纯化青霉素酰化酶.生物化学与生物物理学报(Fei J ian ,Gu Q iu .Study on hydrophobic ch rom atogra 2phy of B .M eg aterium penicillin acylase .A cta B ioch i m B iop hy sS in ),1989,21(9):315～3216 D arto is V ,Coppee J Y,Co lson C,Baulard A.Genetic analysisand overexp ressi on of li po lytic activity in B acillus subtilis .A pp lE nv ironm M icrobiol ,1994:1670～16737 Bo tt K F ,W ilson G A .D evelopm ent of competence in the B acil 2lus subtilis transfo rm ati on system .J B acteriol ,1967,94(3)562～570171第1期黄艳红等:巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶在枯草杆菌中的表达及其分离纯化 。
酶的提取和分离纯化.pptx
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11.2.1 机械破碎法 • 指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：
• 1.机械捣碎法
• 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。 10000r/min
• 此法在实验室和生产规模均可采用。
• 2.研磨法
• 突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压 容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几 分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降， 使细胞破碎。
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压力差破碎法
• （3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。 • 应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖
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球蛋白溶解度-溶液离子强度关系
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盐析
• 中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因： • 1).中和蛋白质分子表面电荷 • 2).与蛋白质颗粒竞争水分子 • 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不
同，因而可以分级沉淀。 • 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋
• 性质
方法
• 分子大小
离心，超离心法、凝胶过滤，
膜分离技术（超滤，反渗透，
微孔过滤，透析，电渗析等）
• 溶解度
法，
盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀
选择性沉淀法，结晶
• 电荷或基团
离子交换色谱，电泳，等电聚焦，
吸附 色谱，疏水色谱，聚焦色 谱
• 稳定性
选择性变性法（热，酸碱，
表面活性剂）
• 特殊（专一性结合）第30亲页/共和13色9页谱，亲和洗脱，亲和电
青霉素酰化酶提取技术研究
青霉素酰化酶提取技术研究摘要：青霉素酰化酶的催化效率高，具有很强的底物专一性，但是作为胞内酶，需要破壁后释放后才能发挥作用。
本研究采用超声破壁技术处理青霉素酰化酶粗酶液，通过单因素实验考察酶液比、超声时间、超声功率对细胞破壁率的影响情况。
实验结果显示酶液比对破壁效果影响最大，超声时间次之，超声功率的影响最小；超声最佳的处理参数为：酶液比为1:200，超声时间为10 min，超声功率为500W，得到超声处理的最大破壁率为78.2%。
本研究为青霉素酰化酶的提取提供了新的技术参数和理论指导，具有工业化价值。
关键词：青霉素酰化酶；提取；破壁；超声波1950年，日本的科学家第一次在产黄青霉Q176中发现了青霉素酰化酶（PA）[1]。
随后研究者发现自然界中的放线菌、细菌、真菌都能合成青霉素酰化酶[2]。
青霉素酰化酶具有重要的应用价值，是一种工具酶，广泛地应用于催化D-氨基酸类似物和β-内酰胺母核酶法合成新型的半合成β-内酰胺类抗生素，而且能逆向催化青霉素水解，生产β-内酰胺类抗生素中间体7-氨基-3-脱乙酸酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)和6一氨基头孢烷酸(6-ACA)，同时在手性药物的拆分和多肽合成等方面也有不错的表现[3]。
发酵液中不仅含有游离酶，还有大量的色素、无机盐、杂蛋白等杂质，这就需要对发酵液进行分离纯化，再使细胞内酶释放，从而得到比活好、纯度高的青霉素酞化酶[5]。
青霉素酰化酶的催化效率高，具有很强的底物专一性[4]。
但是，由于青霉素酰化酶属于胞内表达酶，需要将酶从细胞内释放后细胞外发挥作用，这就需要破碎细胞或者改变细胞壁的通透性[6]。
细胞破壁技术包括机械破壁法和非机械破壁法。
其中机械破壁法的主要方式是高压均质器法和超声波破壁法[7]。
而非机械破壁法的典型方式则是冻融破壁法和溶酶菌法。
高压均质法容易操作，但是能源消耗过高，不利于工业化生产[8]。
冻融破壁法条件温和，但是耗时长。
溶酶菌法则是成本过高无法实现大生产[9]。
青霉素几种分离纯化方法比较
青霉素几种分离纯化方法比较生物工程下游技术期末作业青霉素的分离提纯方法的发展与比较摘要：本文主要介绍了青霉素的分离提纯方法的发展以及比较，包括传统的方法，如吸附法，沉淀法，溶剂萃取法等，也包括现代发展的高新技术，如反胶团萃取法，乳状液膜法，中空纤维更新液膜法以及其它的高效提取方法。
Abstract：This paper describes the development of penicillin G and the comparison of methods of separation and purification , including traditional methods, such as adsorption, precipitation, solvent extraction, but also includes modern high-tech development, such as reverse micelles extraction, emulsion liquid membrane hollow fiber renewal liquid membrane extraction and other efficient methods.正文：1、青霉素简介1、1基本性质：青霉素（Benzylpenicillin / Penicillin）又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。
青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。
青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。
分子式为：1、2发展历程：早在唐朝时，长安城的裁缝会把长有绿毛的糨糊涂在被剪刀划破的手指上来帮助伤口愈合，就是因为绿毛产生的物质（青霉素素菌）有杀菌的作用，也就是人们最早使用青霉素。