第三章酶的分离纯化演示教学
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3酶的分离纯化-2.ppt
颗粒状，装进凝胶层析柱使用。 设备简单，操作方便（不需经过再生处理可反复使用）。不 需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，适于 不同分子量的各种物质。
１、凝胶层析的基本原理
凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加 入欲分离的混合物，大量蒸镏水或其它稀 溶液洗柱;
分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿 凝胶颗 粒间的空隙最先流出柱外。分子量 最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞， 流速缓慢，最后流出柱外。
第六节 层析分离
层析分离
是利用混合物中各组分的物理化学性质（分 子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲 和力和分配系数等）的不同，使各组分在两 相中的分布程度不同而达到分离。 层析分离中一个相是固定的,称为固定相; 另一个相是流动的,称为流动相; 各组分移动速度步同,使不同组分分纯化; 层析分离设备简单,操作容易;
胶膜放入底座
胶膜固定在底座上
加胶
安裝防护罩
整套安裝完毕准备电泳
放入电泳槽中
制胶完成取出
放电梳
Back
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决 于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交 联度（C）的计算公式分别为：
T= Acr（g）+Bis（g）XC1=00%
六 层析聚焦
将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析特 性结合在一起,实现组分分离。
柱内装上多缓冲离子交换剂，多缓冲液流经层析 柱时形成稳定pH梯度；酶液和组分移到与其等电 点相当的pH位置上。
１、交换剂和缓冲液体系 ２、pH梯度的形成 ３、层析聚集的操作过程
back
第七节 电泳分离
定义:electrophoresis带电粒子在电场中向着与其 本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。
１、凝胶层析的基本原理
凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加 入欲分离的混合物，大量蒸镏水或其它稀 溶液洗柱;
分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿 凝胶颗 粒间的空隙最先流出柱外。分子量 最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞， 流速缓慢，最后流出柱外。
第六节 层析分离
层析分离
是利用混合物中各组分的物理化学性质（分 子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲 和力和分配系数等）的不同，使各组分在两 相中的分布程度不同而达到分离。 层析分离中一个相是固定的,称为固定相; 另一个相是流动的,称为流动相; 各组分移动速度步同,使不同组分分纯化; 层析分离设备简单,操作容易;
胶膜放入底座
胶膜固定在底座上
加胶
安裝防护罩
整套安裝完毕准备电泳
放入电泳槽中
制胶完成取出
放电梳
Back
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决 于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交 联度（C）的计算公式分别为：
T= Acr（g）+Bis（g）XC1=00%
六 层析聚焦
将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析特 性结合在一起,实现组分分离。
柱内装上多缓冲离子交换剂，多缓冲液流经层析 柱时形成稳定pH梯度；酶液和组分移到与其等电 点相当的pH位置上。
１、交换剂和缓冲液体系 ２、pH梯度的形成 ３、层析聚集的操作过程
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第七节 电泳分离
定义:electrophoresis带电粒子在电场中向着与其 本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。
酶的提取与分离纯化幻灯片
密度的沉降样品
最大的沉降样品
在最前的沉降物质达 使各组分沉降到其平衡
到管底前停止，短时 的密度区，长时间，高
间，低速度
速度
密度相近，但沉降系 沉降系数相近，但密度
数不同
不同
总结：
•等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的 静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使 之包括待分离物的密度范围。 •差速离心是一种动力学方法，关键在于选择 适合于各分离物的离心力。 •密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关 键在于制备优质的密度梯度溶液。
1）超声波破碎法。 2）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等） 平衡后迅速转入低渗溶液或水中。 3）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用 丙酮、丁醇、氯仿等。 2）表面活性剂处理：常用非离子型表面 活性剂，如Triton X-100，Tween等。
注意事项
低速离心机 6000
常温，注意样品热变性和 离心管平衡
高速离心机 6000〜 25000 冷冻（防止温度升高）， 离心管的精确平衡
超速离心机 >25000
冷冻＋真空系统（减少空 气阻力和摩擦），
离心管的精确平衡
实验室离心机
温度类型：常温及 冷冻
超速离心机均为冷 冻型。
使用冷冻离心机时 提前降温，预冷离 心头。
β分级盐析法 ：在一定离子强度下，通过改变
溶液的pH及温度的沉淀方法。
酶的提取与分离纯化幻灯 片
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第一节 酶的分离
酶的提取与分离纯化(1)ppt课件
Size-exclusion chromatography
★
② 凝胶的种类和性质
▼交联葡聚糖凝胶（dextran gel)
商品名:Sephadex 型号 Sephadex G－10至G-200 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大， 交联度越小，孔径越大，分离范围越广。
葡聚糖凝胶层析介质的有关参数
微滤 超滤
反渗透
<20A
0.7-13MPa
★
微滤(Microfiltration，MF) 一种静态过滤， 随过滤时间延长，膜 面上截流沉积不溶物， 引起水流阻力增大， 透水速率下降，直至 微孔全被堵塞；
●
原料液
渗透液 无流动操作
●
超滤
(ultrafiltration，UF )
★
一种动态过程，由泵提供推动力，在膜 表面产生两个分力：一个是垂直于膜面的法 向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜 面平行的切向力，把膜面截流物冲掉。
③ 层析柱的制备与层析操作
●
★
柱层析的设备:
层析柱、蠕动泵（恒流泵）、紫外检测仪、 部分收集器、梯度洗脱器。
层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器
低温层析柜
记录仪
2
吸附层析（adsorption chromatography）
★
①原理:利用固定相的固体吸附剂表面
对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶 解作用（解吸作用）的差异进行分离。
★
③色谱仪组成
1）进样系统 2）输液系统 3）分离系统 4）检测系统 5）数据处理系统
作业:1膜分离的原理﹑有哪些类型 2层析法的原理﹑有哪些类型
后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑营：课件设计，文档制作，网络软件设计、 图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满 意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、 计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面， 打造全网一站式需求
酶的分离与纯化PPT课件
2）非机械法：酶法、化学法、物理法 • 化学渗透法（chemical permeation）：改变细胞壁或细胞膜的通
透性；TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；EDTA：对G-菌 外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐 酸胍与水中氢键作用。优点：选择性，易于固液分离。缺点：通用性 差，效率低，毒性
(NH4)2SO4饱和度表
• 温度是影响蛋白质溶解度的重要因素。在无盐或稀盐溶液 中，温度低，蛋白质溶解度也低；在高盐溶液中，蛋白质 的溶解度随温度的升高反而减小。许多蛋白质在高离子强 度溶液中，25℃时的溶解度比0℃时明显减小。这主要是 因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热，温度升 高有利于蛋白质失水沉淀。一般盐析时不要降低温度，除 非这种酶对温度比较敏感。
蛋白质的盐析
盐析应用最广泛的是硫酸铵
• 优点 1）溶解度大 25℃时硫酸铵的溶解度可达4.1mol/L(541g/L)以上。大 约每升水可溶解767g之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶 都可以被盐析沉淀出来。 2）温度系数小 硫酸铵的溶解度受温度影响不大。例如 0℃时，硫酸 铵的溶解度仍可达到3.9mol/L(515g/L)。大约每升水可溶解676g。对 于需要在低温条件下进行酶的纯化来说，应用硫酸铵是有利的。 3）硫酸铵不易引起蛋白质变性，对于很多种酶还有保护作用，且价格 低廉，容易获得。 • 缺点 铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。
（五）沉淀分离
1、盐析法 盐溶(salting in) 在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。 盐析(salting out) 盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓 度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析出。 （1）盐析法的机制 （2）盐析用中性盐的选择 常用的中性盐：MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4和NaH2PO4 （3）(NH4)2SO4饱和度表示法 （4）影响盐析的因素 1）蛋白质浓度 2）pH和温度的影响
Chapter 3 酶的提取与分离纯化
Chapter 3 酶的分离与纯化我们要研究或使用一种酶，首先要采用相关方法先得到它，因此酶的分离与纯化是酶的生产、应用及酶学性质研究的基础。
Section 1 酶制剂的制备过程一个完整的酶制剂制备方案应该包括：酶活力测定体系的建立、材料的选择、材料的预处理、酶的酶学性质初步研究、酶的分离与纯化、酶制剂的保存。
一、材料的选择注意把握植物的季节性、微生物的生长期（对数生长期）和动物的生理状态等。
二、材料的预处理（一）细胞破碎上节课我们提到根据酶的分布，可将酶分为胞内酶和胞外酶。
若是胞外酶，就不存在细胞破碎的问题，但是胞外酶的种类很少，绝大多数酶都属于胞内酶。
要想获得胞内酶，就得先进行细胞破碎，使酶从细胞内释放出来，这样才能进一步进行酶的提取和分离纯化。
细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶溶法。
在实际使用时，我们要根据细胞的特性和酶的特性选择适宜的方法，有时也可以联合采用2种或2种以上的方法，以达到细胞破碎的效果，而又不影响酶的活性。
1、机械破碎法按照所用破碎机械的不同，又可以分为捣碎法、研磨法和匀浆法。
（1）捣碎法：常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞的破碎，也可以用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。
（2）研磨法：常用于微生物和植物组织细胞的破碎。
（3）匀浆法：常用于破碎易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞。
大块的组织或者细胞团需要先用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散后才能进行匀浆。
2、物理破碎法根据物理力的不同，可分为冻融法、渗透压法和超声波破碎法。
（1）冻融法：适用于易于破碎的细胞，如革兰氏阴性菌。
如将-20℃冷冻的细胞突然放进沸水浴中，或沸水浴中的热细胞突然放进-70℃冷冻，这样都可以使细胞破坏。
但是，在酶的提取时，要注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。
（2）渗透压法：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞或革兰氏阴性菌。
使用时，先将细胞分离出来，悬浮在高渗透压的溶液中，平衡一段时间后，将细胞迅速转入低渗透压的蒸馏水或缓冲溶液中，由于渗透压的作用而使细胞破碎。
《酶的分离纯化》PPT课件
2
0
精品医学
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择 适当的溶剂。
一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中（水、稀 酸、稀碱、稀盐溶液等） ，非极性物质易溶于非 极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中， 碱性物质易溶于酸性溶剂中
2
1
精品医学
提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短 扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的 扩散速度，从而增大提取效果。
捣碎法 研磨法 匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法
有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween
自溶法 外加酶制剂法
精品医学
机械法（注意预冷）：
捣碎法： 10000rpm
研磨法： 匀浆法：研杆和管壁
间只有几百微米
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
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精品医学
物理法：
反复冻融法：时间长，需加蛋 白酶抑制剂（PMSF、EDTA 等）
超声波处理法：处理时间尽量 短，避免局部过热使得酶失活
渗透压法： 冷热交替法：
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JY92-II D超声波 细胞粉碎机
高压细胞破碎机
精品医学
动物
细菌
植物
∣研磨 ∣超声波
∣纤维素酶
∣匀浆 ∣溶菌酶
∣
↓捣碎机 ↓化学溶剂 (甲苯) ↓
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精品医学
细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
物理破碎 化学破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
酶学第三章酶活性的测定及分离纯化
酶学第三章酶活性的测定及分离纯化第三章酶活性的测定及分离纯化在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的⽣产和应⽤时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进⾏经常的、⼤量的测定⼯作，这是必不可少的指标。
酶活性是指酶催化⼀定化学反应的能⼒，检查酶的含量及存在，通常是⽤该酶在⼀定条件下催化某⼀特定反应的速度，即酶的活性来表⽰。
3.1 酶活性单位酶活性指的是酶制剂催化能⼒的⼤⼩，它既与酶蛋⽩的浓度有关，⼜与酶分⼦的催化能⼒⼤⼩有关。
酶活性⽤单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表⽰，即u/ml或u/mg。
3.1.1 实⽤单位不同的酶采⽤不同的标准。
如DNA聚合酶Ⅰ以在特定反应条件下，30分钟内催化10nmol dNTP合成为TCA（三氯⼄酸）不溶物所需的酶量；⼜如T4 DNA连接酶的单位定义为：在20µl反应体积中，16℃，30分钟内，将50%的HindⅢ酶切的λDNA⽚段重新连接起来所需的酶量。
ACC合成酶的单位是：30℃，1⼩时转化SAM⽣成1nmol ACC所需的酶量。
3.1.2 国际酶活性单位1961年，国际酶学会议为酶活性单位规定了⼀个统⼀的标准，即在特定的条件下，1分钟转化1µmol底物，或转化1µN底物有关基团所需的酶量为1个单位(u)。
这是酶活性的国际单位。
3.1.3 Katal1972年，国际酶学委员会提出了⼀个新的酶活单位，叫katal(kat)，katal是⼀个很⼤的酶活单位，1 katal是指1秒钟转化1mol 底物，或转化1N底物有关基团所需的酶量。
1 katal＝6×10u。
3.1.4 转换数在标准条件下，每摩尔单体酶或每摩尔催化中⼼在1分钟内转换底物成产物的µmol数，可表⽰为：1/Kp称为⼀个催化循环，单位为分钟。
3.1.5 ⽐活性酶的纯度往往⽤⽐活性来表⽰，⽐活性是⽤同⼀酶制剂的酶活性除以蛋⽩质的质量，即单位质量蛋⽩质所具有的酶活性，常⽤的单位为u/mg protein。
酶的提取和分离纯化.pptx
破碎细胞的方法有: 机械法，物理法，化学法和酶法
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11.2.1 机械破碎法 • 指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：
• 1.机械捣碎法
• 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。 10000r/min
• 此法在实验室和生产规模均可采用。
• 2.研磨法
• 突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压 容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几 分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降， 使细胞破碎。
第16页/共139页
压力差破碎法
• （3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。 • 应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖
第33页/共139页
球蛋白溶解度-溶液离子强度关系
第34页/共139页
盐析
• 中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因： • 1).中和蛋白质分子表面电荷 • 2).与蛋白质颗粒竞争水分子 • 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不
同，因而可以分级沉淀。 • 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋
• 性质
方法
• 分子大小
离心，超离心法、凝胶过滤，
膜分离技术（超滤，反渗透，
微孔过滤，透析，电渗析等）
• 溶解度
法，
盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀
选择性沉淀法，结晶
• 电荷或基团
离子交换色谱，电泳，等电聚焦，
吸附 色谱，疏水色谱，聚焦色 谱
• 稳定性
选择性变性法（热，酸碱，
表面活性剂）
• 特殊（专一性结合）第30亲页/共和13色9页谱，亲和洗脱，亲和电
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11.2.1 机械破碎法 • 指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：
• 1.机械捣碎法
• 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。 10000r/min
• 此法在实验室和生产规模均可采用。
• 2.研磨法
• 突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压 容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几 分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降， 使细胞破碎。
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压力差破碎法
• （3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。 • 应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖
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球蛋白溶解度-溶液离子强度关系
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盐析
• 中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因： • 1).中和蛋白质分子表面电荷 • 2).与蛋白质颗粒竞争水分子 • 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不
同，因而可以分级沉淀。 • 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋
• 性质
方法
• 分子大小
离心，超离心法、凝胶过滤，
膜分离技术（超滤，反渗透，
微孔过滤，透析，电渗析等）
• 溶解度
法，
盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀
选择性沉淀法，结晶
• 电荷或基团
离子交换色谱，电泳，等电聚焦，
吸附 色谱，疏水色谱，聚焦色 谱
• 稳定性
选择性变性法（热，酸碱，
表面活性剂）
• 特殊（专一性结合）第30亲页/共和13色9页谱，亲和洗脱，亲和电
课件十二酶的提纯和分离纯化的方法(三)(精)
工作任务（二）酶的分离纯化方法
电泳
等 点 聚 焦 电 泳
原理
两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳
极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此
pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动， 被浓缩成狭窄的区带。
工作任务（二）酶的分离纯化方法
电泳
等 点 聚 焦 电 泳
•两性电解质载体(carrier ampholytes) (1)易溶于水，有足够的缓冲能力——以便保 持稳定的pH梯度。
泳速度不同的各组成分离成若干区带
支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。
工作任务（二）酶的分离纯化方法
电泳
• 按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：
①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的 定性定量分析。
②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清 蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存 照相，比纸电泳分辨率高。 以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大， 没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少 进行分离。
SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，
形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。
工作任务（二）酶的分离纯化方法
电泳
SDS 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和 形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有 关。两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对数呈 线性关系，
迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技
术。
带负电粒子
正极
带正电粒子
负极
工作任务（二）酶的分离纯化方法
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离子交换纤维素: 是纤维素作为母体，引入相应的交换 基团，蛋白质不容易变性，交换容量大 （0.2-1.0mg/克干胶）
离子交换树脂:
聚苯乙烯Байду номын сангаас脂引入相应的解离基团， 分阴，阳离子交换树脂。 有强酸， 强碱，弱酸，弱碱。
离子交换凝胶: 葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶为母体，导入 相应的交换基团，交换容量更大2.54.5mg/克干胶）
化学稳定性和机械强度更好，应用更大
2020/7/3
作用：浓缩，脱盐等，分级分离
1.3 透析和超过滤
• 透析膜：带有微孔的筛子 • 小于等于20000的大分子通过，更大的分子不
通过。 • 除去酶液的盐、有机溶剂或低分子量的抑制剂 • 超过滤：在0.29 MPa氮气压力下使酶液透过
透析膜。 • 浓缩酶液
• 其他名称：分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻 层析
2020/7/3
• Sephadex(交联葡聚糖）、Bio-Gel(交联聚 丙烯酰胺）
• 酶后期处理（小量试样）
2020/7/3
葡聚糖凝胶操作流程： 1）选择 根据分子量大小范围选择凝胶。
凝胶 如:G50排阻1,500-30,000 （Sephadex） 还有粗，中，细分，细的分辩率高,流速慢；粗的
2020/7/3
聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺聚合而成。
Bio-Gel P-2 数字后面乘1000表示最高排阻分子量 分离生物大分子的范围与葡聚糖凝胶
基本相同
琼脂糖凝胶 水
Sepharose
。
是琼脂去除琼脂胶后得到 D-半乳糖和6-脱
半乳糖相间排列而成。 如：4B即琼脂糖含量占4% 。
另外的商品Bio-Gel A是琼脂糖与丙烯酰 胺交联而成。Bio-Gel CL，比上述二种
分辩率低,流速快。 2）溶涨 水浸或沸水煮，快而可以杀菌，防止微生物污染。 3）装柱 不能有气泡，用缓冲液平衡 4）上样 按柱床体积计算约1/ 40左右。
然后用缓冲液洗脱。注意流速。 5）再生 稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微
生物生长，加0.02% NaN3
使用时要注意可能抑制你要分离的酶。
2020/7/3
• 解吸方法：改变pH（改变结合基团的电 荷），提高溶液的离子强度（与酶竞争 结合位置）
• 使用规模可大可小 • 纯化倍数为10左右
2020/7/3
2.2 电泳
• 原理：在外加电场的影响下，带电分子 具有不同的运动速度。
第三章 酶的分离纯化
2020/7/3
本章重点
• 各种分离方法的操作原理 • 分离方法的应用原则 • 酶分离纯化中应注意的问题
2020/7/3
酶制剂的来源
酶
天然酶
人工改造酶
动物
植物 微生物
化学的
生物的
粗酶
固定化酶 化学修饰酶 抗体酶
基因工程酶
2020/7/3
精制酶 冻干酶粉 溶液态酶
3.1 酶纯化的必要性 3.2 起始材料的选择 3.3 酶的萃取 3.4 分离方法 3.5 酶纯化步骤的设计 3.6 纯化步骤的定量评价 3.7 在纯化过程中酶活力的损失
80,000~250,000 g 之间。主要分离小分子量酶。 沉降速度, 离心法（区带离心法），等密度梯度离心
法（沉降平衡法）。
2020/7/3
1.2 凝胶过滤
• 原理：不同大小的分子进入颗粒状凝胶内微孔 的能力不同，能进入微孔的小分子被阻滞，不 能进入微孔的大分子未被阻滞。
• 换句话说，分离是因为不同分子在进入或不进 入凝胶所经过的路程不同而达到分离的目的。
2020/7/3
（3）以溶解度变化为依据：改变pH、改变离子强
度、降低介电常数
（4）以特异性结合位置为依据：亲和色谱、亲和洗
提
（5）其它方法：热变性、在磷酸钙凝胶柱上分级吸附
、羟基磷灰石色谱、疏水色谱、用水溶性的非离子聚 合物（聚乙二醇）沉淀、冷冻干燥浓缩
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分离方法分解
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(1)以大小或质量为依据
离心 凝胶过滤 透析和超过滤
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1.1 离心
• 原理：以质量不同为分离依据 • 离心力5000-50000g
• 处理量可达几升 • 分离对象:细胞碎片、沉淀下来的酶
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高速离心 速度一般在20,000以下。 超离心 相对离心力场速度在75,000 g以上，在
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3.2 起始材料的选择
• 不顾及酶的来源时，可选择酶含量高的材料。 • 微生物培养物 • 注意材料的年龄 • 注意在生物体内的富集区域
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3.3 酶的萃取
（处理液应及时处理，否则在均浆上加一薄层甲苯可以防止微生物感染。 ）
（1）膜和细胞壁的破碎：研磨、超声波、高压（注意胞外酶的测定） （2）酶的萃取：萃取液3倍于起始材料
缓冲液(pH 7.5)的作用，中和从空泡中放出的大量酸；高离子强度 (0.1-0.5)有助于将酶从结合的膜上解析下来；丙酮粉有助于将酶与脂肪 或磷脂膜分离。 注意事项：蛋白酶的抑制方法（低温快速、抑制剂）
制备丙酮粉用以解除酶与脂肪或磷脂膜的结合。 除去核酸：调整pH沉淀（鱼精蛋白硫酸盐或链霉素）、水解
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(2)以电荷为依据
• 离子交换色谱 • 电泳 • 等电聚焦
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2.1 离子交换色谱
• 取决于带相反电荷基团的静电吸引。
• DEAE-纤维素（二乙基氮基乙基-纤维素 ） 结合带负电荷基团，阴离子交换剂
• CM-纤维素（羧甲基-纤维素） 结合带正电荷基团，阳离子交换剂
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1）离子交换剂选择：考虑酶稳定性需要
酶蛋白在くpI的pH条件下稳定 用阳离子交换剂。 酶蛋白在〉pI的pH条件下稳定 用阴离子交换剂 在﹤pI pH,﹥pI pH条件下稳定 二种交换剂都可用
2）如何选择强型和弱型交换剂
酶蛋白pI在 < 6或 > 9 时 考虑用强型离子交换剂
酶蛋白在强型或弱型离子 考虑到酶的不稳定性， 交换剂通用，选弱型。
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3.4 酶的分离方法
（1）以大小或质量为依据：离心（300000g)、凝胶
过滤（Sephadex交联葡聚糖、Bio-Gel交联聚丙烯酰 胺）、透析、超过滤
（2）以电荷为依据：离子交换色谱（低离子强度、
适当pH）Sephadex、DEAE-纤维素、CM-纤维素；电泳（ 电荷、分子大小、分子形状）纸、纤维素粉末、淀粉、聚丙 烯酰胺；等电聚焦（pH梯度中的平衡位置）