第三章酶的分离纯化演示教学

离子交换纤维素: 是纤维素作为母体，引入相应的交换 基团，蛋白质不容易变性，交换容量大 （0.2-1.0mg/克干胶）
离子交换树脂:
聚苯乙烯Байду номын сангаас脂引入相应的解离基团， 分阴，阳离子交换树脂。 有强酸， 强碱，弱酸，弱碱。
离子交换凝胶: 葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶为母体，导入 相应的交换基团，交换容量更大2.54.5mg/克干胶）
化学稳定性和机械强度更好，应用更大
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作用：浓缩，脱盐等，分级分离
1.3 透析和超过滤
• 透析膜：带有微孔的筛子 • 小于等于20000的大分子通过，更大的分子不
通过。 • 除去酶液的盐、有机溶剂或低分子量的抑制剂 • 超过滤：在0.29 MPa氮气压力下使酶液透过
透析膜。 • 浓缩酶液
• 其他名称：分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻 层析
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• Sephadex(交联葡聚糖）、Bio-Gel(交联聚 丙烯酰胺）
• 酶后期处理（小量试样）
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葡聚糖凝胶操作流程： 1）选择 根据分子量大小范围选择凝胶。
凝胶 如:G50排阻1,500-30,000 （Sephadex） 还有粗，中，细分，细的分辩率高,流速慢；粗的
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聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺聚合而成。
Bio-Gel P-2 数字后面乘1000表示最高排阻分子量 分离生物大分子的范围与葡聚糖凝胶
基本相同
琼脂糖凝胶 水
Sepharose
。
是琼脂去除琼脂胶后得到 D-半乳糖和6-脱
半乳糖相间排列而成。 如：4B即琼脂糖含量占4% 。
另外的商品Bio-Gel A是琼脂糖与丙烯酰 胺交联而成。Bio-Gel CL，比上述二种
分辩率低,流速快。 2）溶涨 水浸或沸水煮，快而可以杀菌，防止微生物污染。 3）装柱 不能有气泡，用缓冲液平衡 4）上样 按柱床体积计算约1/ 40左右。
然后用缓冲液洗脱。注意流速。 5）再生 稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微
生物生长，加0.02% NaN3
使用时要注意可能抑制你要分离的酶。
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• 解吸方法：改变pH（改变结合基团的电 荷），提高溶液的离子强度（与酶竞争 结合位置）
• 使用规模可大可小 • 纯化倍数为10左右
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2.2 电泳
• 原理：在外加电场的影响下，带电分子 具有不同的运动速度。
第三章 酶的分离纯化
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本章重点
• 各种分离方法的操作原理 • 分离方法的应用原则 • 酶分离纯化中应注意的问题
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酶制剂的来源
酶
天然酶
人工改造酶
动物
植物 微生物
化学的
生物的
粗酶
固定化酶 化学修饰酶 抗体酶
基因工程酶
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精制酶 冻干酶粉 溶液态酶
3.1 酶纯化的必要性 3.2 起始材料的选择 3.3 酶的萃取 3.4 分离方法 3.5 酶纯化步骤的设计 3.6 纯化步骤的定量评价 3.7 在纯化过程中酶活力的损失
80,000~250,000 g 之间。主要分离小分子量酶。 沉降速度, 离心法（区带离心法），等密度梯度离心
法（沉降平衡法）。
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1.2 凝胶过滤
• 原理：不同大小的分子进入颗粒状凝胶内微孔 的能力不同，能进入微孔的小分子被阻滞，不 能进入微孔的大分子未被阻滞。
• 换句话说，分离是因为不同分子在进入或不进 入凝胶所经过的路程不同而达到分离的目的。
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（3）以溶解度变化为依据：改变pH、改变离子强
度、降低介电常数
（4）以特异性结合位置为依据：亲和色谱、亲和洗
提
（5）其它方法：热变性、在磷酸钙凝胶柱上分级吸附
、羟基磷灰石色谱、疏水色谱、用水溶性的非离子聚 合物（聚乙二醇）沉淀、冷冻干燥浓缩
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分离方法分解
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(1)以大小或质量为依据
离心 凝胶过滤 透析和超过滤
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1.1 离心
• 原理：以质量不同为分离依据 • 离心力5000-50000g
• 处理量可达几升 • 分离对象:细胞碎片、沉淀下来的酶
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高速离心 速度一般在20,000以下。 超离心 相对离心力场速度在75,000 g以上，在
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3.2 起始材料的选择
• 不顾及酶的来源时，可选择酶含量高的材料。 • 微生物培养物 • 注意材料的年龄 • 注意在生物体内的富集区域
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3.3 酶的萃取
（处理液应及时处理，否则在均浆上加一薄层甲苯可以防止微生物感染。 ）
（1）膜和细胞壁的破碎：研磨、超声波、高压（注意胞外酶的测定） （2）酶的萃取：萃取液3倍于起始材料
缓冲液(pH 7.5)的作用，中和从空泡中放出的大量酸；高离子强度 (0.1-0.5)有助于将酶从结合的膜上解析下来；丙酮粉有助于将酶与脂肪 或磷脂膜分离。 注意事项：蛋白酶的抑制方法（低温快速、抑制剂）
制备丙酮粉用以解除酶与脂肪或磷脂膜的结合。 除去核酸：调整pH沉淀（鱼精蛋白硫酸盐或链霉素）、水解
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(2)以电荷为依据
• 离子交换色谱 • 电泳 • 等电聚焦
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2.1 离子交换色谱
• 取决于带相反电荷基团的静电吸引。
• DEAE-纤维素（二乙基氮基乙基-纤维素 ） 结合带负电荷基团，阴离子交换剂
• CM-纤维素（羧甲基-纤维素） 结合带正电荷基团，阳离子交换剂
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1）离子交换剂选择：考虑酶稳定性需要
酶蛋白在くpI的pH条件下稳定 用阳离子交换剂。 酶蛋白在〉pI的pH条件下稳定 用阴离子交换剂 在﹤pI pH,﹥pI pH条件下稳定 二种交换剂都可用
2）如何选择强型和弱型交换剂
酶蛋白pI在 < 6或 > 9 时 考虑用强型离子交换剂
酶蛋白在强型或弱型离子 考虑到酶的不稳定性， 交换剂通用，选弱型。
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3.4 酶的分离方法
（1）以大小或质量为依据：离心（300000g)、凝胶
过滤（Sephadex交联葡聚糖、Bio-Gel交联聚丙烯酰 胺）、透析、超过滤
（2）以电荷为依据：离子交换色谱（低离子强度、
适当pH）Sephadex、DEAE-纤维素、CM-纤维素；电泳（ 电荷、分子大小、分子形状）纸、纤维素粉末、淀粉、聚丙 烯酰胺；等电聚焦（pH梯度中的平衡位置）