免疫血清制备及效价测定-1

合集下载

免疫血清的制备及效价测定在临床免疫学检验实验教学中的应用

检验科，黑龙江佳木斯１５４００３；３．佳木斯大学检验医学院２００７级，黑龙江佳木斯１５４００２；４．佳木斯大学检验医学院２００８级，黑龙江佳木斯１５４００２）
文献标识码：Ｂ
文章编号：１６７３—４１３０（２０１３）１０—１３３６—０２
的健康成年雄性家兔，６只／组。制备］．５绵羊红细胞（ＳＲＢＣ）悬液４ ℃冰箱保存备用。免疫途径为抽取１．５ＳＲＢＣ悬液，腹腔多点注射，时间为２ｄ短期间隔免疫，每只每次２ｍＬ，ＳＲＢＣ共免疫９次】。１．３方法１．３．１收集免疫血清于末次免疫后两周采集兔静脉血，置于无菌容器，并做好标记，４Ｃ冰箱中２４ｈ。待血清析出后，收集血清分装成小瓶，做好标记，一８Ｏ℃冰箱保存。１．３．２血球凝集法筛选抗血清将分离的新鲜血清灭活补
高效价、高特异度的免疫血清是免疫学实验室必不可少的生物制剂，是高等医学院校学生免疫学实验的重要内容ｌ１】。而目前，在各大医学院校的医学实验课中学生更多应用的是市售的商品诊断试剂，虽然方便简单，但是学生对免疫血清的制备、效价的鉴定及制备的注意事项以及实验结果偏移与斌剂的关系了解甚少，同时极大地增加了实验费用。故引导学生自己动手制备免疫血清，对检验专业的学生来说很有必要。免疫血清的制备是一项综合性实验，在实验中，学生不但能将基础课程和专业课程的理论衔接起来，同时极大地培养学生实践动手能力、科研创新能力和团队协作精神。１实验方案设计１．１确定实验人员２００８级检验专业学生为实验的执行者，按成绩（好中差）每６人分为一组，全班分为５组。１．２教师指导学生确定实验方案实验动物为体质量２～３

1-1 免疫血清制备及效价测定-1

实验1-1 免疫血清制备及效价测定
实验目的和要求
1、学习抗血清的制备方法； 2、掌握抗血清的收集和保存方法； 3、掌握免疫血清效价的测定方法。
实验原理
制备免疫血清的基本方法是将抗原注入动物体内，由动物体内特异的B淋巴细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原决定簇受体的B淋巴细胞系产生针对该决定簇的抗体，因此用抗原免疫动物获得的免疫血清一般为多克隆抗体（polyclonal antibody）。
本次实验将采用溶血实验测定所获免疫血清的效价。
• 抗原的两种特性：免疫原性与抗原性
• 免疫原性的本质——异物性
• 与机体亲缘关系越远，组织结构的差异越大，异物性越强。
实验材料
1. 40% SRBC 2. 18-22g的BALB/C系小白鼠 3. 无菌1ml 注射器 4. 抗凝剂（枸橼酸钠或肝素） 5. 新鲜豚鼠血清（作为补体用） 6. 小试管等
实验内容
1、免疫动物
初次免疫小鼠为腹腔注射40%绵羊红细胞（SRBC）0.2ml，以后分别于第4天、第7天和第10 天时间，以相同免疫剂量、相同免疫途径加强免疫。
小鼠腹腔注射
1. 小鼠腹腔注射可以用1ml的注射器，配合4号针头。 2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的
尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器官。 3. 尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，不要越轨。20 20年12 月12日星期六 10时9 分59秒1 0:09:59 12 December 2020

效价的测定

二、免疫血清（浆）的效价测定—溶血法实验原理该方法的基本原理是根据补体的经典激活途径，即当抗原抗体复合物存在时，补体系统被激活，最后形成的攻复合体可使细胞性抗原溶解。

当实验中抗原和补体的量固定不变，且对于抗体相对过量时，则随着抗体量的不同，被溶解的细胞性抗原的量也不同，两者成正比关系，因此根据溶解的抗原的多少就可以判断出抗体的量。

实验材料1. 待测免疫血清（浆）2. 20%SRBC3. 补体4. 生理盐水5. 试管实验方法1. 将前面获得的小鼠抗 SRBC 免疫血浆首先稀释 10 倍，成为 1:10 免疫血浆。

2. 取3个试管,分别编号为A、B、C,用于对1:10免疫血浆的3倍、4倍和5倍稀释，即A号管内为1:30的免疫血浆;B号管为1:40 的免疫血浆；C号管为1:50的免疫血浆。

3. 取 15 支试管，分为A、B、C三列，每列5只，先给每管中加入生理盐水0.5ml,再从A、B、C号管中分别吸取0.5ml血浆加入相应各列的第一个管中,然后各列再进行倍比稀释,血清稀释度如下表：管号 1 2 3 4 5A 列1:60 1:120 1:240 1:480 1:960B 列1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280C 列1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600注意每列的最后一管应该弃去0.5ml液体。

4. 向每个试管中分别加入SRBC0.25ml和补体0.25ml 。

5. 混均各管中的液体,置37°C水浴30~40分钟。

结果判定以发生完全溶血的最高血清稀释度管为效价判定管，其血清稀释度即为免疫血清的效价。

注意事项1. 动物免疫时注意确保SRBC被注射到了腹腔中,要避免注入其他脏器（如肠、膀胱）内。

2. 稀释血清时尽量做到精确，注意用于不同列的吸管不要混用。

思考题1. 影响免疫血清质量的因素有那些？2. 各种检测抗体效价的方法相比有什么优缺点？返回。

4-2 免疫血清制备及效价测定-4

免疫血清制备及效价测定（2）
补体溶血反应法
实验目的：
了解补体在溶血反应中的作用熟悉抗血清效价测定方法掌握补体介导的细胞溶解机理
实验原理：
作为抗原的绵羊红细胞（sheep red blood cell， SRBC）与其对应抗体（溶血素）结合后，通过补体活化的经典途径激活补体，经过一系列放大的级联反应，最后形成膜攻击复合体（MAC），产生膜攻击作用，导致SRBC溶解，发生溶血反应。
1 1:60
弃去 0.25 ml
4 1:120
7
10
弃去 0.25 ml
0.25ml
弃去 0.5 ml
1:240 1:480 0.25ml 0.25ml
弃去
0.75 ml
2 1:80
5 1:160
8
11
0.25 ml
0.25ml
1:320 1:640 0.25ml 0.25ml
弃去
0.25ml

1.0 ml
补体激活途径
经典补体激活途径
经典补体激活途径
实验材料：
1. 1％ SRBC悬液 2. 阳性对照溶血素（抗绵羊红细胞抗体，适当稀释） 3. 豚鼠新鲜血清（当做补体用，临用前稀释成适当浓度） 4. 生理盐水 5. 试管架、试管、吸管、37℃水浴箱 6. 自制的小鼠抗SRBC抗血清
摘取小鼠眼球放血：
将小鼠抓出来，放在鼠笼盖上，用右手抓住尾巴，让它向前爬，用左手抓住耳朵及脑后毛皮，捏紧，使眼珠鼓出来，用小指和无名指压住鼠尾巴，小镊子夹住并迅速摘出眼球，将小鼠血收集入一洁净的平皿中。尔后，通过拉脱颈椎的方法将小鼠处死。
操作步骤：
1）取洁净小试管12支，排列和做标记如下图所示；

生化免疫技术----免疫血清的制备及效价测定

免疫血清的制备及效价测定制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。

由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。

制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。

因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。

测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。

第一部分、免疫血清的制备我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG抗体的制备。

Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。

可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。

在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。

【实验材料】1．动物IgG（兔源的，购买）2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物： BALB/c小鼠5．无菌 1ml 注射器6. 生理盐水，酒精棉等【实验步骤】1. 免疫程序：40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。

一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。

2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。

第二部分、免疫血清质量评价一、效价测定抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法—）、琼脂扩散法1.操作步骤（具体见附注）⑴ 做琼脂板，打梅花孔。

血清抗体效价的测定

实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。

结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。

①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。

加酶标抗体进行孵育。

固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。

彻底洗涤未结合的酶标抗体。

此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

加底物反应。

直接法主要用于测定抗原。

②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。

洗涤除去未结合的抗原及杂质。

加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。

经洗涤后，加酶标二抗。

固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。

洗涤后，加底物显色。

③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。

将特异。

综合性实验三、抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定

西安医学院教案（专业课程）课程名称临床免疫学与检验班级检本1008 专业，层次检验，本科教师武永红专业技术职务讲师授课方式（大，小班，实习）实验学时9学时授课题目（章，节）抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定基本教材或主要参考书王兰兰，许化溪主编.临床免疫学检验.第5版：人民卫生出版社，2012 刘辉．临床免疫学与检验实验指导第3版：人民卫生出版社，2009 曹励民．免疫学检验实验指导．自编教材，2011教学目的：1.掌握：细菌接种培养的操作能力，加强细菌性抗原免疫动物的实验操作能力，肥达氏反应的模拟操作及间接血凝实验测定细菌性抗体的效价，2.熟悉：临床用于诊断细菌或病毒感染的凝集反应测定效价试验的原理。

教学内容：1.细菌培养与免疫原的制备2.“O”和抗“H”血清的制备3.试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价4.间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价教学方法：启发式教学；讲授重点内容。

教具：板书示教教学重点、难点：1. 间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价教研室审阅意见（教研室主任签名）年月日教学内容教学手段时间分配抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定（一）细菌培养与免疫原的制备（二）“O”和抗“H”血清的制备（三）试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价（四）间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价（一）细菌培养与免疫原的制备伤寒沙门菌标准菌株干粉→生理盐水溶解→接种肉汤培养基→接种普通平板→生理盐水菌液（100℃水浴制备O抗原，甲醛处理制备H抗原）（二）“O”和抗“H”血清的制备Ag伤寒沙门菌O和H抗原→分别免疫两组家兔→抗O血清和抗H血清O/H抗原的免疫程序：日序（天）免疫剂量（ml）免疫途径1 1 皮内五点注射8 1.5 耳静脉注射15 1.5 耳静脉注射22 1.5 耳静脉注射放血方法：颈动脉采血试血方法：试管凝集试验（三）试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价试管凝集试验的原理：在试管内，用已知颗粒性抗原作为诊断试剂，与一系列倍比稀释的待检血清混合反应，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集现象。

免疫血清的制备实验报告

实验报告实验名称多克隆抗体的制备一（抗血清制备）实验日期院系专业班级姓名学号一、实验目的了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术。

二、实验器材试剂：酒精棉球、NDV灭活油乳剂疫苗、麻醉剂器材：兔笼、注射器、剃毛剪、手术刀、止血钳、手术剪（组织剪、眼科剪）、动脉夹、眼科剪、动脉导管、纱布、棉线、细线、培养箱、冰箱、结扎细线、离心机、温箱三、实验原理1.机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产体液免疫和细胞免疫的过程。

一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构——抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。

2.将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。

抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。

抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。

待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。

3.由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体。

4.多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。

对于免疫原性较弱的可溶性抗原（如蛋白质类抗原）要加入佐剂，以增强免疫性。

3. 放37度温箱温浴，是为了让血液内纤维蛋白原收缩，降低血清和红细胞的粘连，从而使使血清更容易与红细胞分离，不易产生溶血现象。

4. 在4℃冰箱内放置使血清析出，低温有利于稳定抗体等蛋白质的结构，防止其变性而丧失功能。

免疫学实验论文——抗血清的制备及效价测定

免疫学实验抗血清的制备及其效价测定班级：生物技术1401小组：11姓名：2016年11月抗血清的制备及免疫小鼠效价检测摘要：本试验以牛血清白蛋白为抗原，对小鼠和家兔进行免疫，以制备高效价抗血清。

采用多次中程免疫使产生免疫应答小鼠的血清中抗体达到实验所需的要求，然后采集小鼠血液，从中分离出血清，从而获得抗血清。

利用间接ELISA 方法测得抗血清效价。

关键词：抗血清；间接法ELISA ；抗体效价前言：用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。

抗体主要存在于血清中，经三次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。

酶联免疫吸附实验（ELISA ）是一种新型的免疫测定技术，利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加相应的二抗，生成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。

材料与方法：实验主线：实验材料：包被缓冲液（0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液）、10ug/ml 抗原（牛血清白蛋白）、0.01M PBS 溶液、5%（w/v ）脱脂奶粉、PBST 洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01M 的PBS ）、2M H2SO4、待测抗体、HRP 标记的羊抗小鼠IgG （二抗）、底物溶液TMB 、健康小鼠酶标板、酶标仪、保鲜膜、排枪、离心管、玻璃棒、烧杯、离心机、恒温箱动物免疫抗血清的采集与分离中程免疫3次间隔一周间接法ELISA 测定抗血清的效多克隆抗体实验内容与方法：一．动物的免疫：1.1实验动物的选择选择实验动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。

选择与抗原亲缘关系远的动物，尤其在制备抗免疫球蛋白（Ig）抗体时；根据抗体的需要量选择动物，制备一抗常用动物为小鼠和家兔，制备二抗常用动物为羊和马；常用青壮年期的雄性动物。

免疫学实验抗血清制备及抗体效价检测华中农业大学免疫学基础及免疫学技术

v 10月14日 2.0ml 耳静脉
v 10月25日 2.5mL 耳静脉
一、采血
（一）心脏抽血
v 家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的 12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再重复上述操作继续抽血，直至抽完。
v 将双扩实验结果用铅笔绘图并分析判断：（1）待测Ag中至少有几种组分？（2）待测Ag各组分相对应的Ab的效价？
如：待测抗原组分一相对应的抗体的效价为1：X。
v 注意沉淀线的数量、部位、走向、粗细、清晰度等。
★结果分析
v 1、本实验采用的是什么Ag、Ab？
v 2、 Ag、Ab为什么要设置一系列的浓度 (方阵排列) ？ “效价”是指Ag的、还是Ab的？与Ag、Ab的浓度有何关系？
本次实验目的
1、分析待测抗原的组分数量； 2、测定各组分相应抗血清的效价。
以出现沉淀线抗体的最高稀释倍数为该抗体效价。
1、融化凝胶、倒胶制备凝胶板（每人1板）。 2、Ag、Ab稀释（见图、4人1套）。 3、打孔、点样（加Ag、Ab，每孔8ul）。 4、37℃保温保湿扩散1d，结果观察。
记号：学号
四、免疫途径
五、免疫时间间隔
v 羊、马、鸡、猴、豚鼠、兔都是常用的免疫动物，在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。
v 免疫用动物应选适龄、健壮．最好为雄性。
v 最常用的实验动物是家兔，一般选择选择年龄在 6个月以上当年繁殖的♂性，体重2 ～3公斤，健康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。

免疫学实验报告

免疫学实验报告 Modified by JACK on the afternoon of December 26, 2020免疫实验—抗血清制备及抗体效价检测摘要：用具有抗原性的物质牛血清白蛋白（BSA)注入到健康动物例如鼠、兔的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。

抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。

抗血清，是指含有免疫蛋白的血清。

抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。

此次实验主要是进行小鼠的牛血清白蛋白（BSA)抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验（ELISA）对其进行抗体效价检测。

关键字：牛血清白蛋白（BSA) 抗血清抗体效价免疫实验过程：本次实验一共分为三个分实验：实验一：免疫实验二：抽血、放血，分离抗血清实验三：ELISA测定抗体效价实验一：免疫一、抗血清制备的原理用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。

抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。

二、目的制备高效价的抗血清三、实验仪器、材料和试剂实验仪器：1mL 注射器，酒精棉球，剪刀材料：家兔，小鼠试剂：3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸，牛血清白蛋白（BSA)三、方法和步骤1、动物编号左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。

红色表示十位数,用黄色表示个位数。

免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。

2、动物抓取及注射按如下图所示抓取目标动物家兔为300～600 μg/次（400），每次不超过2mL；小鼠为10～100 μg /次（10-20，20~40 μg / ml），每次不超过。

实验一抗血清制备

佐剂是一种能够增强机体免疫应答的物质，常与免疫原混合使用，以提高抗体的产量和特异性。常见的佐剂包括弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等。
磷酸盐缓冲液用于调节溶液的酸碱度，维持实验环境的稳定。
04
实验步骤
免疫原制备与注射
免疫原制备
根据实验需求，选择适当的抗原，进行适当的处理和纯化，确保抗原的纯度和浓度符合实验要求。
详细描述
本实验采用了ELISA方法，将抗血清与抗原进行反应，通过酶标仪检测反应后的吸光度值，计算出抗血清的效价。实验结果表明，制备的抗血清具有较高的效价，能够与抗原特异性结合。
抗血清的纯度分析
总结词
通过电泳、色谱等技术分析抗血清中杂蛋白的含量，评估抗血清的纯度。
VS
详细描述
本实验采用了SDS-PAGE电泳和离子交换色谱技术，对抗血清进行纯度分析。实验结果表明，制备的抗血清中杂蛋白含量较低，纯度较高，符合实验要求。
免疫注射
将制备好的免疫原注射到实验动物体内，通常采用皮下注射或肌肉注射的方式，注射后观察动物反应，确保免疫原安全有效。
免疫血清的分离与收集
血清分离
在免疫注射一定时间后，无菌采集动物血液，分离出血清，去除红细胞和杂质。
血清收集
根据实验需求，收集不同时间点的血清样本，记录采集时间和量，确保血清的质量和可追溯性。
免疫原是指能够刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答的物质，通常为微生物或其代谢产物、人工合成的多肽等。
在抗血清制备实验中，免疫原需要经过适当的处理和修饰，以提高其免疫原性。常见的处理方法包括加热、化学偶联、放射性标记等。
实验试剂：生理盐水、佐剂、磷酸盐缓冲液等
生理盐水是常用的稀释液，用于将免疫原和佐剂稀释到适当的浓度。

血清效价检测

第1页共1页
血清效价检测
一、技术说明
抗体效价测定是指测定抗体的物理状态及其在体内的滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。

本实验是采用间接ELISA检测血清效价。

二、技术原理
利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体。

三、技术流程：
（一）实验准备
（1）实验材料：免疫抗原
（2）试剂和耗材：1x PBS（pH7.2)：8gNaCl,0.2g KCl,3.62gNa2HPO4.12H2O, 0.24g KH2PO4定容至1L；BSA、PBST、HRP标记羊抗鼠二抗、TMB、1M HCl、酶标板。

（3）仪器和设备：恒温培养箱、酶标仪
（二）实验步骤
（1）抗原包被：抗原(PBS稀释，终浓度2μg/mL，100μL/孔)，4℃包被过夜。

（2）封闭：2%BSA(150Μl/孔)，37℃封闭2h。

（3）一抗孵育：血清首孔稀释1000倍后逐级稀释3倍梯度（PBS稀释，100μL/孔），37℃孵育1h，PBST洗5次，每次150μL。

（4）二抗孵育：加入对应二抗（Goat-anti-mouse-IgG-HRP，1%BSA稀释，100μL/孔）37℃孵育1h，PBST洗5次，每次150μL。

（5）显色：加入TMB100μL,室温避光显色10min。

（6）终止读数：加入100μl/孔1M HCl，终止反应，OD450读数。

兔抗鸡免疫血清的制备及效价测定

１．实验方法２
１２１免疫程序．．初免：２ｍＬ注射器吸取经ＦＡ乳化的鸡血清１ｍＬ同时在兔的颈背部和大腿（用Ｃ，或臂部）４选～６点皮下注射，点注０２ｍＬ．每．
二免：间隔１～１，于上述部位选不同点以及两侧用窝部肿大的淋巴结内注射用ＦＡ乳化０４ｄ后再Ｉ的鸡血清，每点注０１ｍＬ其余注入淋巴结附近皮下，注射１ｎ．．，共三免和四免：分别间隔７ｄ，后耳静脉注射无佐剂的鸡血清抗原１ｍＬ．
［者简介］王冬梅（９９）女，作１６一，甘肃兰州人，硕士，副教授，主要从事微生物与免疫学的教学和科研工作
－－－— —
４９・— －－ —
免疫免抗血清的效价．体效价达１１抗：６以上的实验兔通过心脏采血法放血，离血清．分
兔．末次加强免疫后７兔血清，用双向免疫扩散法测定其效价；用沉降与离心方法分离血清．果：－９ｄ取应采结免疫家兔在全程免疫后都产生了高效价抗体，效价达到１３．：２结论：用抗原鸡血清免疫家兔，可成功制备高效价的免疫血清，为
清２Ｌ加样后置湿盒中，３Ｏｕ，置７℃培养箱中扩散４－７．８２ｈ出现沉淀线的最高血清稀释倍数即为兔免
疫血清的效价．
１２４血清的分离．．血清的分离要在无菌条件下进行．采集血液先置３将７℃培养箱１ｈ再置４℃ 冰箱内过夜使血清，充分析出．日用无菌毛细滴管吸取血清，０／ｉ心１ｎ取上清，器除菌，防腐剂次３００ｒｒｎ离ａ５ｍｉ，滤加

项目一免疫血清的制备与提纯

项目一免疫血清的制备与提纯一、免疫血清的制备(Preparation of antiserum)【实验原理】将适当的免疫原物质注入动物体内，经一段时间动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为抗血清(或免疫血清)。

它在血清学检测中有广泛应用。

理想的抗血清的产生主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的应签性。

同时免疫接种时的免疫途径、抗原剂量、有无佐剂、注射次数及间隔时间等因素均可影响抗血清的质量。

制备的抗血清可直接用于某些实验，也可从中提取特异性抗体或某一组分。

下面介绍几种常用的免疫血清制备方法，免疫动物均选用家兔，这是因为：(1)其产生的血清量足够实验应用并容易驯养；(2)为采血、注射用耳血管很容易找到；(3)用兔子作免疫接种的资料较多，可方便利用；(4)能产生高效价抗体，并且可用常用的沉淀反应、凝集反应或溶血、溶菌反应等试验方法进行鉴定。

【试剂和器材】1．免疫动物2～3kg健康雄性家兔。

2．免疫原绵羊红细胞(SRBC)、OX19变形杆菌、人IgG(SPA菌体吸附)、正常人混合血清、牛血清白蛋白(BSA)、聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质抗原。

3．佐剂完全和不完全福氏(Freund)佐剂。

4．其它试剂生理盐水、70%酒精等。

5．器材注射器及针头、棉球、三角烧瓶、玻璃珠、试管、吸管、柯氏瓶(扁瓶)、Luer-lock(双联)注射器、止血钳、手术剪、手术刀等，以上器材均应高压灭菌或消毒后使用；离心机、液体旋转混合器、温箱、水浴箱、冰箱等。

【步骤和方法】(一)溶血素的制备1．制备抗原取脱纤维羊血或用阿氏(Alsever)液保存的绵羊红细胞(采血方法见附录常用实验动物采血方法)，用生理盐水洗３次，每次加2～3倍生理盐水，离心2000r/min 10min，弃上清。

最后一次按压积用生理盐水配成10%SRBC悬液，放４℃保存备用。

2．免疫动物家兔耳缘静脉注射10%SRBC悬液1ml，间隔3天，连续7次，末次免疫后2周，由耳静脉取血1ml(取血方法见附录常用实验动物采血方法)，分离血清，测定溶血素效价(见补体结合试验)，当效价≥1:2000则可放血收集血清，此法效价可达1:6000~1:10000。

免疫血清制备

IgG类抗体的纯化 IgG类抗体的纯化
1．盐析法粗提γ球蛋白盐析法粗提γ 2．离子交换层析提取IgG ：DEAE 离子交换层析提取IgG 3．亲和层析法
抗血清的保存
①4℃保存：抗血清在鉴定纯化前可保存在4℃冰箱内，保存：抗血清在鉴定纯化前可保存在4 冰箱内，为防止细菌污染可将血清过滤除菌或加入防腐剂。为防止细菌污染可将血清过滤除菌或加入防腐剂。 4℃保存的期限为三个月或半年。保存的期限为三个月或半年。 ②冷冻保存：是常用的抗血清保存方法，将抗血清分冷冻保存：是常用的抗血清保存方法，为小包装保存于–20～ 70℃ 可保存2 为小包装保存于–20～–70℃，可保存2～3年抗体效价无明显下降，但要避免反复冻融。价无明显下降，但要避免反复冻融。 ③真空干燥保存：抗血清分装后，用真空干燥机进行真空干燥保存：抗血清分装后，干燥，制成干粉（水分 ≤ 干燥，制成干粉（水分≤ 0.2% ），密封后在普通冰箱内可保存4 箱内可保存4～5年抗体效价无明显变化。年抗体效价无明显变化。
抗原的两种特性：抗原的两种特性：免疫原性与抗原性免疫原性的本质——异物性异物性免疫原性的本质与机体亲缘关系越远，与机体亲缘关系越远，组织结构的差异越大，异物性越强。越大，异物性越强。
影响抗原免疫应答的因素
理化特性化学性质分子量大小结构的复杂性分子构象物理状态遗传、年龄、性别与健康状态免疫方法剂量、途径、次数以及免疫佐剂的选择
（二）目的蛋白质的提纯
1．超速离心 2．选择性沉淀法 3. 凝胶层析法 4．离子交换层析 5．亲和层析
Back
免疫佐剂
佐剂（ adjuvant）佐剂（ adjuvant ）与抗原一起或预先注入机体时可有效增强免疫应答的强度或改变免疫应答的类型的非特异性免疫增强剂佐剂本身可以有免疫原性，佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。疫原性。

免疫血清的制备

免疫血清的制备【实验原理】将适量目的抗原经合适途径注射动物，刺激动物发生免疫应答，产生特异性抗体。

抗体存在于血清中，含有目的抗体的血清称为免疫血清。

高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用。

免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。

制备方法因抗原的性质不同而异，下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。

【材料与仪器】1.健康成年家兔，雄性，体重2～3kg。

2.灭菌生理盐水、纯化人IgG（10mg／ml）、消毒酒精及碘酒、羊毛脂、石蜡油、活卡介苗（BCG）（75mg／ml）。

3.剪刀及镊子、注射器（2ml、50ml）、称量瓶（10ml）、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶（200ml）、手术器械一套、血管夹、黑丝线及塑料放血管、研钵。

【实验方法】（一）抗原及佐剂的制备1.弗氏不完全佐剂（FIA）的制备：称羊毛脂10g，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中（每瓶10ml），高压灭菌（55.21kPa20min）后保存备用。

2.弗氏完全佐剂乳化抗原（FCA－IgG）的制备：将FIA预温（60℃30min），吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG（75mg／ml）0.5ml及纯化人IgG（2.4mg／ml）2.5ml，边滴入边研磨，直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上，以不散开为合格。

（二）免疫动物1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，用酒精及碘酒消毒皮肤。

2.第一次免疫：用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂（FCA）乳化的抗原（人IgG）（简称FCA－IgG）液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

3.第二次免疫：间隔10～14天后，于两侧腘窝及足蹊部肿大的淋巴结内注入FCA－IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。

如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及足蹊部皮下。

4.间隔7～10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价（即试血）。

NDV抗血清制备和抗体效价检测

NDV抗血清制备及抗体效价测定摘要：抗血清（免疫血清），是指含有免疫蛋白的血清。

抗体效价指抗体的物理状态及其在体内的滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。

关键词抗血清抗体效价免疫0、引言凡是能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质被称为抗原。

当机体受抗原刺激后，会在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，这个球蛋白则被称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。

而含有Ig的血清称免疫血清，也叫抗体。

抗体效价则是指抗体的物理状态及其在体内的滞留时间。

将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。

待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清。

由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。

1、实验仪器、材料和试剂1.1仪器2.5mL 和1mL 注射器，碘酒，75％酒精棉球，镊子、剪刀、止血钳及各种手术剪，250mL 无菌三角瓶，10mL无菌小烧杯，50mL 无菌尖底离心管，1ml、200μL和10μL移液枪和tips，家兔固定槽，家兔解剖台，棉线，温箱，离心机，96孔聚苯乙烯酶标板，酶标仪，洗板机、电泳仪，垂直电泳槽，电转膜仪，水平摇床，无菌培养皿，凝胶成像系统。

1.2材料家兔，小鼠1.3试剂鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗，0.01M PBS（pH7.2），包被液——0.01M碳酸盐缓冲液，洗涤液——0.01M PBST，封闭液——含1％牛血清白蛋白（BSA）的PBST，酶标二抗，四甲基联苯胺（3,3’,5, 5’-Tetramethylbenzidine, TMB）显色液和1M H2SO4、SDS-PAGE相关试剂、Western blotting相关试剂。

免疫试验

抗血清制备及抗体效价测定李嘉玲（华中农业大学生命科学技术学院生物技术1002班）【摘要】目的利用小鼠制备牛血清白蛋白抗血清并测定其效价。

方法以牛血清白蛋白作为抗原，通过腹腔注射免疫雄性小鼠，从而制备抗血清，通过ELISA测定抗血清的效价。

结果抗血清的最高效价1／16000。

结论通过酶联免疫吸附方法可以准确的测定抗体的效价。

【关键词】小鼠酶联免疫吸附抗血清效价Antiserum Preparation And Antibody Titer Analysis 【Abstract】Objective the antiserum were prepared against the BSA and use ELISA to analysis titer of antiserum. Method use BSA as antigen,immunized male mice by intraperitoneal injection to get antiserum,then use ELISA to analysis titer of antiserum.Result ELISA text gave a BSA antibody titer of 1／16000. Conclusion ELISA is a good way to ananlysis the titer of antibody.【Key words】mice ELISA antiserum titer前言BSA，牛血清白蛋白，一种白色结晶或类似白色冷冻干燥粉末，在酶切反应缓冲液中加入BSA，可以对酶起保护作用。

本实验主要利用其对小鼠的抗原性质制备抗血清。

本实验采用的抗体效价测定方法是ELISA，该方法操作渐渐，价格低廉，可进行大批量实验。

且使用方便，无放射性危害，有较高的敏感性和特异性。

1.材料与方法1.1材料与仪器适用适龄、健壮的雄性小鼠完全弗氏佐剂BSA PBST HRP标记羊抗鼠IgG 0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液洗涤液底物溶液2MH SO酶标仪酶标板保鲜膜排枪241.2方法1.2.1抗原制备完全弗氏佐剂：石蜡油（3—6份）、羊毛脂（1份）、卡介苗（3—5mg/ml）配制方法：石蜡油+羊毛脂（溶化按比例吸取）+ 卡介苗→混合→分装→保存1.2.2免疫制备抗血清1.2.2.1免疫途径小鼠腹腔注射：以左手抓取小鼠，使腹部朝上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推0.5~1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液。

免疫球蛋白IgG的提取-1

免疫球蛋白IgG的提取-1一、目的及要求了解和掌握免疫球蛋白的提取方法。

二、概念抗体是在抗原物质刺激下，人或脊椎动物免疫系统的浆细胞产生的，能与抗原发生特异性反应的免疫球蛋白，主要存在于人和动物的血清及其体液中。

三、免疫血清的制备（一）动物的选择实验室常用的动物是家兔和羊，有时也用豚鼠或鸡，大量制备商品性抗血清时，可采用马、牛等大动物。

对动物的基本要求是：1、与抗原物质的种属关系越远越好；2、发育成熟、健壮、体重合乎规定，如家兔要求体重在2～3Kg以上；3、最好为成年雄性动物，如用雌性动物，则不得用怀孕者。

（二）抗原的种类、质量要求及用量1、抗原的种类抗原是决定所制备免疫血清特异性的关键，在免疫前必须进行鉴定。

制备免疫血清的抗原可以分为以下三类：1）微生物抗原：如细菌、病毒、立克次氏体、螺旋体、真菌等；2）组织抗原：主要是各种蛋白质或蛋白质复合物，如各种酶类、激素、结缔组织成分、血浆蛋白、肿瘤组织等；3）免疫球蛋白抗原：这种抗原在免疫荧光和免疫酶技术中应用最广；2、抗原的纯度抗原纯度要高，应用病原微生物时，应选择抗原性强、稳定和标准的菌株或毒株。

细菌性抗原应避免有培养基成分，培养病毒的组织尽量采用与被免疫动物同种的组织，培养用的生长液也应避免含有抗原性强的物质，用Hank ′s氏液等为好。

3、抗原的用量抗原量过小，不能有效地刺激机体产生抗体；抗原量过大，也影响抗体的产生，所以抗原量要适当。

抗原用量视抗原种类、剂型和注射途径而异。

采用弗氏佐剂，剂量较小，一次注射剂量以1mg/kg体重为宜，不加佐剂的剂量要大10倍以上。

静脉注射剂量要小些，以免引起动物死亡。

（三）免疫的途径与方法免疫途径应是多种多样的，如静脉、腹腔、肌肉、皮内、皮下和淋巴结等，但肌肉和皮内两种途径较少应用。

目前一般倾向于小剂量、多点、多途径的方法，但具体应视抗原的生物学特性和理化特性来决定。

酶、毒素等生物活性抗原，一般不宜采用静脉注射。