1-1 免疫血清制备及效价测定-1
免疫血清的制备及效价测定在临床免疫学检验实验教学中的应用
文 献 标 识 码 ：Ｂ
文 章 编 号 ：１６７３—４１３０（２０１３）１０—１３３６—０２
的 健 康 成 年 雄 性 家 兔 ，６只 ／组 。制 备 ］．５ 绵 羊 红 细 胞 （ＳＲＢＣ）悬 液 ４ ℃冰 箱 保 存 备 用 。 免疫 途 径 为 抽 取 １．５ ＳＲ ＢＣ悬 液 ，腹 腔 多 点 注 射 ，时 间为 ２ ｄ短 期 间 隔 免 疫 ，每 只 每 次 ２ ｍＬ，ＳＲＢＣ共 免 疫 ９次 】。 １．３ 方法 １．３．１ 收 集免 疫 血 清 于末 次 免 疫 后 两 周 采 集 兔 静 脉 血 ，置 于无 菌 容 器 ，并 做 好 标 记 ，４ Ｃ冰 箱 中 ２４ ｈ。待 血 清 析 出 后 ，收 集 血 清 分 装 成 小 瓶 ，做 好 标 记 ，一８Ｏ℃冰 箱 保 存 。 １．３．２ 血 球 凝 集 法 筛 选 抗 血 清 将 分 离 的 新 鲜 血 清 灭 活 补
高效 价 、高 特 异 度 的 免 疫 血清 是 免 疫 学 实 验 室 必 不 可 少 的 生物 制剂 ，是 高 等 医 学 院 校 学 生 免 疫 学 实 验 的重 要 内容 ｌ１】。 而 目前 ，在 各 大 医学 院 校 的 医学 实 验 课 中学 生 更 多 应用 的是 市售 的 商 品诊 断试 剂 ，虽 然 方 便 简 单 ，但 是 学 生 对 免 疫 血 清 的 制 备 、 效 价 的 鉴 定 及 制 备 的 注 意 事 项 以及 实 验 结 果 偏 移 与斌 剂 的 关 系 了 解 甚 少 ，同时 极 大 地 增 加 了实 验 费 用 。故 引导 学 生 自己 动 手 制 备 免 疫 血 清 ，对 检 验 专业 的学 生来 说很 有必 要 。 免疫 血 清 的 制 备 是 一 项 综 合 性 实 验 ，在 实 验 中 ，学 生 不 但 能 将 基 础 课 程 和 专 业 课 程 的 理 论 衔 接 起 来 ，同 时极 大 地 培 养 学 生 实 践 动 手 能 力 、科 研 创 新 能 力 和 团 队协 作 精 神 。 １ 实 验 方 案设 计 １．１ 确 定 实验 人员 ２００８级 检 验 专 业 学 生 为 实 验 的 执 行 者 ， 按 成 绩 （好 中差 ）每 ６人 分 为 一 组 ，全班 分 为 ５组 。 １．２ 教师 指 导 学 生 确 定 实 验 方 案 实 验 动 物 为 体 质 量 ２～ ３
1-1 免疫血清制备及效价测定-1
实验目的和要求
1、学习抗血清的制备方法； 2、掌握抗血清的收集和保存方法； 3、掌握免疫血清效价的测定方法。
实验原理
制备免疫血清的基本方法是将抗原注入动物体内，由动物体内特异的B淋 巴细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决 定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原决定簇受体的B淋巴细胞系产生 针对该决定簇的抗体，因此用抗原免疫动物获得的免疫血清一般为多克隆抗体 （polyclonal antibody）。
本次实验将采用溶血实验测定所获免疫血清的效价。
• 抗原的两种特性：免疫原性与抗原性
• 免疫原性的本质——异物性
• 与机体亲缘关系越远，组织结构的差异越 大，异物性越强。
实验材料
1. 40% SRBC 2. 18-22g的BALB/C系小白鼠 3. 无菌1ml 注射器 4. 抗凝剂（枸橼酸钠或肝素） 5. 新鲜豚鼠血清（作为补体用） 6. 小试管等
实验内容
1、免疫动物
初次免疫小鼠为腹腔注射40%绵羊红细胞 （SRBC）0.2ml，以后分别于第4天、第7天和第10 天时间，以相同免疫剂量、相同免疫途径加强免疫。
小鼠腹腔注射
1. 小鼠腹腔注射可以用1ml的注射器，配合4号针头。 2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的
尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。 这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损 伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器 官。 3. 尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮 下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后 在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头， 并轻微旋转针头，不要越轨。20 20年12 月12日 星期六 10时9 分59秒1 0:09:59 12 December 2020
血清抗体效价的测定
实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。
结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。
①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异。
生化免疫技术----免疫血清的制备及效价测定
免疫血清的制备及效价测定制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。
由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。
制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。
因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。
测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。
第一部分、免疫血清的制备我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG抗体的制备。
Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。
可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。
在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。
【实验材料】1．动物IgG（兔源的，购买）2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物： BALB/c小鼠5．无菌 1ml 注射器6. 生理盐水，酒精棉等【实验步骤】1. 免疫程序：40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。
一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。
2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。
第二部分、免疫血清质量评价一、 效价测定抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法—）、琼脂扩散法1.操作步骤（具体见附注）⑴ 做琼脂板，打梅花孔。
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
《免疫血清的制备》课件
总结
免疫血清的制备是一项复杂的过程，需要严格的质量控制。同时，免疫血清 在疾病诊断、生物学研究等方面具有举足轻重的作用。
参考文献
• 张三，李四。免疫学。北京：人民卫生出版社，2015。 • 王五，赵六。生物制品生产技术。北京：化学工业出版社，2016。
将免疫原注射到动物体内，使其免疫产生特异性抗 体。
采血
采集免疫动物的血液，制备成免疫血清。
灌装和贮存
对免疫血清进行筛选、灌装和储存。
体外机制合成免疫血清的步骤
1
抗原制备
制备抗原并纯化，确保其具有特异性。
抗体产生
2
利用体外细胞培养方法合成特异性抗体。
3
免疫沉淀
用盐析法或其他方法将抗体沉淀下来。
纯化和灌装
4
对产生的免疫血清进行纯化和灌装。
免疫血清的质量控制
纯度检测方法
免疫电泳、SDS-PAGE等方法可以检测免疫血清 的纯度。
效价测定方法
ELISA、放射免疫测定等方法可以检测免疫血清 的效价。
免疫血清的应用案例
免疫血清在疾病诊断中的应用
检测患者血液中是否存在特定抗体，以确诊疾病。
免疫血清在生物学研究中的应用
免疫血清的制备
免疫血清是一种重要的生物制品，本课程介绍了免疫血清的制备方法、质量 控制和应用案例。
背景介绍
定义
免疫血清是从免疫动物血清或体外制备中获得的含有特异性抗体的血清。
用途和重要性
免疫血清广泛应用于疾病诊断、生物学研究等领域，对于人类健康和科学发展具有重要意义。
动物免疫血清的
免疫学实验论文——抗血清的制备及效价测定
免疫学实验抗血清的制备及其效价测定班级：生物技术1401小组：11姓名：2016年11月抗血清的制备及免疫小鼠效价检测摘要：本试验以牛血清白蛋白为抗原，对小鼠和家兔进行免疫，以制备高效价抗血清。
采用多次中程免疫使产生免疫应答小鼠的血清中抗体达到实验所需的要求，然后采集小鼠血液，从中分离出血清，从而获得抗血清。
利用间接ELISA 方法测得抗血清效价。
关键词：抗血清；间接法ELISA ；抗体效价前言：用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经三次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
酶联免疫吸附实验（ELISA ）是一种新型的免疫测定技术，利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加相应的二抗，生成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。
材料与方法：实验主线：实验材料：包被缓冲液（0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液）、10ug/ml 抗原（牛血清白蛋白）、0.01M PBS 溶液、5%（w/v ）脱脂奶粉、PBST 洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01M 的PBS ）、2M H2SO4、待测抗体、HRP 标记的羊抗小鼠IgG （二抗）、底物溶液TMB 、健康小鼠酶标板、酶标仪、保鲜膜、排枪、离心管、玻璃棒、烧杯、离心机、恒温箱动物免疫抗血清的采集与分离中程免疫3次间隔一周间接法ELISA 测定抗血清的效多克隆抗体实验内容与方法：一．动物的免疫：1.1实验动物的选择选择实验动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。
选择与抗原亲缘关系远的动物，尤其在制备抗免疫球蛋白（Ig）抗体时；根据抗体的需要量选择动物，制备一抗常用动物为小鼠和家兔，制备二抗常用动物为羊和马；常用青壮年期的雄性动物。
免疫血清的制备实验报告
免疫血清的制备实验报告背景介绍免疫血清是一种含有特异性抗体的血清，它能够识别并结合特定抗原，并在机体内产生免疫反应。
免疫血清在医学、生物学研究以及临床诊断中起着重要的作用。
本文将介绍免疫血清制备的实验过程，以及关键步骤和注意事项。
材料与方法1.抗原：选择具有特定抗原性的物质，如病毒、细菌或蛋白质等。
2.动物：选择适合的动物作为免疫体，如小鼠、兔子或羊等。
3.细菌培养基：提供细菌生长所需的培养基。
4.免疫佐剂：增强机体免疫反应的物质，如佐剂CA等。
5.离心机：用于离心分离血清和细胞。
实验步骤1.抗原制备：根据实验需要，获得相应抗原物质。
如为蛋白质，可通过细菌表达系统获得目标蛋白。
如果抗原是病毒或细菌，需要先进行培养和提取。
2.免疫程序：将抗原注射给动物。
根据具体实验要求，可选择皮下注射、肌肉注射或腹腔注射等途径。
3.免疫佐剂的使用：将适量的免疫佐剂与抗原混合，增强免疫反应。
佐剂通常会激活免疫细胞，增加抗原的摄取和处理。
4.免疫程序的重复：根据需要，可进行多次免疫程序，以增加机体对抗原的免疫反应。
5.血清采集：在免疫程序完成后，采集动物的血液样本。
样本中含有免疫反应产生的抗体。
6.血清的处理：将采集到的血液样本放置在离心管中，进行离心分离。
分离后，得到的液体即为免疫血清。
结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功制备了免疫血清。
制备的免疫血清中含有特异性抗体，能够与抗原结合并产生免疫反应。
免疫血清的制备过程中有几个关键步骤需要注意：1.抗原的选择：根据实验需求选择合适的抗原。
抗原的纯度和性质会直接影响免疫血清的质量。
2.免疫佐剂的使用：合理选择免疫佐剂，能够增强机体的免疫反应，提高抗体产量。
但佐剂的过量使用可能导致免疫反应过度激活，损害动物的健康。
3.血清采集的时间点：根据实验设计，选择合适的时间点采集血液样本。
免疫反应的早期和高峰期通常是采集血清的最佳时间。
4.血清处理的注意事项：血液样本采集后，应尽快进行离心分离，以防止血液凝固。
免疫学实验抗血清制备及抗体效价检测 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术
v 10月14日 2.0ml 耳静脉
v 10月25日 2.5mL 耳静脉
一、采血
（一）心脏抽血
v 家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心 脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的 12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注 射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再 重复上述操作继续抽血，直至抽完。
v 将双扩实验结果用铅笔绘图并分析判断： （1）待测Ag中至少有几种组分？ （2）待测Ag各组分相对应的Ab的效价？
如：待测抗原组分一相对应的抗体的效价为1：X。
v 注意沉淀线的数量、部位、走向、粗细、 清晰度等。
★结果分析
v 1、本实验采用的是什么Ag、Ab？
v 2、 Ag、Ab为什么要设置一系列的 浓度 (方阵排列) ？ “效价”是指Ag的、 还是Ab的？与Ag、Ab的浓度有何关 系？
本次实验目的
1、分析待测抗原的组分数量； 2、测定各组分相应抗血清的效价。
以出现沉淀线抗体的最高稀释倍数为该抗 体效价。
1、融化凝胶、倒胶制备凝胶板（每人1板）。 2、Ag、Ab稀释（见图、4人1套）。 3、打孔、点样（加Ag、Ab，每孔8ul）。 4、37℃保温保湿扩散1d，结果观察。
记号：学号
四、免疫途径
五、免疫时间间隔
v 羊、马、鸡、猴、豚鼠、兔都是常用的免疫动物， 在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属 关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、 免疫血清的要求以及动物个体等因素。
v 免疫用动物应选适龄、健壮．最好为雄性。
v 最常用的实验动物是家兔，一般选择选择年龄在 6个月以上当年繁殖的♂性，体重2 ～3公斤，健 康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或 用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。
项目一 免疫血清的制备与提纯
项目一免疫血清的制备与提纯一、免疫血清的制备(Preparation of antiserum)【实验原理】将适当的免疫原物质注入动物体内，经一段时间动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为抗血清(或免疫血清)。
它在血清学检测中有广泛应用。
理想的抗血清的产生主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的应签性。
同时免疫接种时的免疫途径、抗原剂量、有无佐剂、注射次数及间隔时间等因素均可影响抗血清的质量。
制备的抗血清可直接用于某些实验，也可从中提取特异性抗体或某一组分。
下面介绍几种常用的免疫血清制备方法，免疫动物均选用家兔，这是因为：(1)其产生的血清量足够实验应用并容易驯养；(2)为采血、注射用耳血管很容易找到；(3)用兔子作免疫接种的资料较多，可方便利用；(4)能产生高效价抗体，并且可用常用的沉淀反应、凝集反应或溶血、溶菌反应等试验方法进行鉴定。
【试剂和器材】1．免疫动物2～3kg健康雄性家兔。
2．免疫原绵羊红细胞(SRBC)、OX19变形杆菌、人IgG(SPA菌体吸附)、正常人混合血清、牛血清白蛋白(BSA)、聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质抗原。
3．佐剂完全和不完全福氏(Freund)佐剂。
4．其它试剂生理盐水、70%酒精等。
5．器材注射器及针头、棉球、三角烧瓶、玻璃珠、试管、吸管、柯氏瓶(扁瓶)、Luer-lock(双联)注射器、止血钳、手术剪、手术刀等，以上器材均应高压灭菌或消毒后使用；离心机、液体旋转混合器、温箱、水浴箱、冰箱等。
【步骤和方法】(一)溶血素的制备1．制备抗原取脱纤维羊血或用阿氏(Alsever)液保存的绵羊红细胞(采血方法见附录常用实验动物采血方法)，用生理盐水洗３次，每次加2～3倍生理盐水，离心2000r/min 10min，弃上清。
最后一次按压积用生理盐水配成10%SRBC悬液，放４℃保存备用。
2．免疫动物家兔耳缘静脉注射10%SRBC悬液1ml，间隔3天，连续7次，末次免疫后2周，由耳静脉取血1ml(取血方法见附录常用实验动物采血方法)，分离血清，测定溶血素效价(见补体结合试验)，当效价≥1:2000则可放血收集血清，此法效价可达1:6000~1:10000。
免疫血清的制备
免疫血清的制备【实验原理】将适量目的抗原经合适途径注射动物，刺激动物发生免疫应答，产生特异性抗体。
抗体存在于血清中，含有目的抗体的血清称为免疫血清。
高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用。
免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。
制备方法因抗原的性质不同而异，下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。
【材料与仪器】1.健康成年家兔，雄性，体重2～3kg。
2.灭菌生理盐水、纯化人IgG（10mg／ml）、消毒酒精及碘酒、羊毛脂、石蜡油、活卡介苗（BCG）（75mg／ml）。
3.剪刀及镊子、注射器（2ml、50ml）、称量瓶（10ml）、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶（200ml）、手术器械一套、血管夹、黑丝线及塑料放血管、研钵。
【实验方法】（一）抗原及佐剂的制备1.弗氏不完全佐剂（FIA）的制备：称羊毛脂10g，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中（每瓶10ml），高压灭菌（55.21kPa20min）后保存备用。
2.弗氏完全佐剂乳化抗原（FCA－IgG）的制备：将FIA预温（60℃30min），吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG（75mg／ml）0.5ml及纯化人IgG（2.4mg／ml）2.5ml，边滴入边研磨，直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上，以不散开为合格。
（二）免疫动物1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，用酒精及碘酒消毒皮肤。
2.第一次免疫：用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂（FCA）乳化的抗原（人IgG）（简称FCA－IgG）液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。
3.第二次免疫：间隔10～14天后，于两侧腘窝及足蹊部肿大的淋巴结内注入FCA－IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。
如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及足蹊部皮下。
4.间隔7～10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价（即试血）。
抗血清制备及抗体效价测定
(4)【实验过程】 (3)Part I . NDV 抗血清制备 (3)一、实验原理 (3)二、实验仪器、材料和试剂 (4)1. 仪器 (4)2. 材料 (4)3. 试剂 (4)三、方法和步骤 (4)（一） ............................................. NDV兔抗血清制备41. 家兔捉拿方法 (4)2. 家兔固定方法 (4)3. 初次免疫 (5)4. 二次免疫 (5)5. 终末免疫 (6)6. 试血 (6)7. 颈动脉放血 (6)8. 血清分离 (6)9. 抗血清保存 (7)（二）.............................................. NDV鼠抗血清制备71. 小白鼠的捉拿和固定 (7)2. 初次免疫 (7)3. 二次免疫 (8)4. 终末免疫 (8)5. 试血 (8)6 •放血 (9)7 •血清分离 (10)&抗血清保存 (10)Part n .琼脂双扩散实验检测抗体效价 (10)一、基本原理 (10)二、实验仪器、材料和试剂 (10)1. 仪器 (10)2. 材料 (10)3. 试剂 (10)三、方法和步骤 (10)1. 灭活鸡新城疫病毒Ulster 2C 株抗原提取 (10)2. 1%琼脂糖配制 (10)3. 倒平板 (10)4. 打孔 (10)5. 稀释抗血清 (11)6. 加样 (11)7. 孵育 (11)8. ................................................................................................................... 结果观察 (11)Part川.酶联免疫吸附试验测定NDV抗血清效价 (12)一、基本原理 (12)二、实验仪器、材料和试剂 (12)1. 仪器 (12)2. 材料 (12)3. 试剂 (12)三、方法和步骤 (12)1. 鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活抗原提取 (12)2. 抗原包被 (13)3. 封闭 (13)4. 洗板 (13)5. 稀释抗血清 (13)6. 加抗血清 (13)7. 洗板 (13)8. 加酶标二抗 (13)9. 洗板 (13)10. 显色 (13)11. 终止 (13)12. 读数 (14)13. 结果判定 (14)Part IV .免疫印迹实验鉴定抗体的特异性 (14)一、基本原理 (14)二、实验仪器、材料和试剂 (14)1. 仪器 (14)2. 材料 (14)3. 试剂 (14)(1)SDS-PAGE相关试剂： (14)(2)Western blotting相关试剂：15三、方法和步骤 (15)1. SDS-PAGE (15)2. 转膜 (16)3. 免疫检测 (16)(1 )膜的封闭 (16)(2)洗膜 (16)(3 )加入一抗 (17)(4)洗膜 (17)(5)与二级抗体作用： (17)(6)洗膜 (17)(7)Odessey近红外成像仪扫描成像 (17)【实验结果及分析】17NDV 抗血清制备及抗体效价测定扌摘要：抗血清，新城疫病毒（Newcastle disease virus , NDV 又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡 瘟病毒或禽肺脑炎病毒。
免疫试验
抗血清制备及抗体效价测定李嘉玲（华中农业大学生命科学技术学院生物技术1002班）【摘要】目的利用小鼠制备牛血清白蛋白抗血清并测定其效价。
方法以牛血清白蛋白作为抗原，通过腹腔注射免疫雄性小鼠，从而制备抗血清，通过ELISA测定抗血清的效价。
结果抗血清的最高效价1／16000。
结论通过酶联免疫吸附方法可以准确的测定抗体的效价。
【关键词】小鼠酶联免疫吸附抗血清效价Antiserum Preparation And Antibody Titer Analysis 【Abstract】Objective the antiserum were prepared against the BSA and use ELISA to analysis titer of antiserum. Method use BSA as antigen,immunized male mice by intraperitoneal injection to get antiserum,then use ELISA to analysis titer of antiserum.Result ELISA text gave a BSA antibody titer of 1／16000. Conclusion ELISA is a good way to ananlysis the titer of antibody.【Key words】mice ELISA antiserum titer前言BSA，牛血清白蛋白，一种白色结晶或类似白色冷冻干燥粉末，在酶切反应缓冲液中加入BSA，可以对酶起保护作用。
本实验主要利用其对小鼠的抗原性质制备抗血清。
本实验采用的抗体效价测定方法是ELISA，该方法操作渐渐，价格低廉，可进行大批量实验。
且使用方便，无放射性危害，有较高的敏感性和特异性。
1.材料与方法1.1材料与仪器适用适龄、健壮的雄性小鼠完全弗氏佐剂BSA PBST HRP标记羊抗鼠IgG 0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液洗涤液底物溶液2MH SO酶标仪酶标板保鲜膜排枪241.2方法1.2.1抗原制备完全弗氏佐剂：石蜡油（3—6份）、羊毛脂（1份）、卡介苗（3—5mg/ml）配制方法：石蜡油+羊毛脂（溶化按比例吸取）+ 卡介苗→混合→分装→保存1.2.2免疫制备抗血清1.2.2.1免疫途径小鼠腹腔注射：以左手抓取小鼠，使腹部朝上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推0.5~1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液。
免疫血清的制备实验报告
实验报告实验名称多克隆抗体的制备一（抗血清制备）实验日期院系专业班级姓名学号一、实验目的了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术。
二、实验器材试剂：酒精棉球、NDV灭活油乳剂疫苗、麻醉剂器材：兔笼、注射器、剃毛剪、手术刀、止血钳、手术剪（组织剪、眼科剪）、动脉夹、眼科剪、动脉导管、纱布、棉线、细线、培养箱、冰箱、结扎细线、离心机、温箱三、实验原理1.机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产体液免疫和细胞免疫的过程。
一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构——抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。
2.将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。
抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。
抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。
待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。
3.由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体。
4.多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。
对于免疫原性较弱的可溶性抗原（如蛋白质类抗原）要加入佐剂，以增强免疫性。
3. 放37度温箱温浴，是为了让血液内纤维蛋白原收缩，降低血清和红细胞的粘连，从而使使血清更容易与红细胞分离，不易产生溶血现象。
4. 在4℃冰箱内放置使血清析出，低温有利于稳定抗体等蛋白质的结构，防止其变性而丧失功能。
免疫学实验抗血清制备及抗体效价检测ppt 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术
实验三：抗体效价检测
（一） 间接ELISA法测定 （二）双向免疫扩散试验测定
ELISA原理
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay， 简称ELISA)是在免疫酶技术的基础上发展起 来的一种新型的免疫测定技术。ELISA过程包括抗 原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体( 抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的 底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收 计算抗体(抗原)的量。
双扩实验步骤
1、融化凝胶、倒胶制备凝胶板（每人1板）。 2、Ag、Ab稀释（见图、4人1套）。 3、打孔、点样（加Ag、Ab，每孔8ul）。 4、37℃保温保湿扩散1d，结果观察。
记号：学号
01
ck
Ab低浓度 Ag高浓度
Ab高浓度 Ag低浓度
Ag：牛血清白蛋白
Ag稀释示意图
0.10ml
生
0.10ml
动物抓取方式
动物控制和免疫演示……
实验二：抽血、放血，分离抗血清
颈静脉或颈动脉采血
尾 部 采 血
（一）耳静脉抽血
• 用于小量抽血，验血测抗体效价，以便决 定加强免疫或放血。
• 与耳静脉注射方式相反。
（二）心脏抽血
• 家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心 脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的 12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注 射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再重 复上述操作继续抽血，直至抽完。
实验一 免疫抗体的制备及效价检测.
实验一免疫抗体的制备及效价检测一．教学目标：本实验是单克隆抗体技术的免疫阶段的过程，为单克隆抗体技术提供免疫淋巴细胞。
了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术，掌握双向免疫扩散法测定抗体的效价。
二．重点难点：给小鼠注射抗原的实验操作，小鼠心脏取血的实验操作。
载玻片琼脂凝胶板打孔实验操作。
三．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。
四．教学内容:实验原理机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。
一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。
当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。
抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。
完全福氏佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。
通常制备抗体时常用完全福氏佐剂加强免疫。
抗原、抗体在合适的浓度和比例条件下，抗原和其相应的抗体在有固相支持的液相环境中各自发生扩散。
分子双向扩散接触时形成肉眼可见的沉淀线反应。
抗体的效价即时指与固定浓度的抗原发生沉淀反应时所需的最小抗体浓度。
实验步骤1．动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠。
免疫作好标号。
分笼饲养。
2．抗原的选择：将抗原（纤维素酶）稀释为4 mg/ml，即可与佐剂混合制成乳剂用于动物免疫。
3．佐剂和抗原乳剂的制备佐剂完全福氏佐剂：轻矿物油（石腊油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；灭活结核杆菌10 mg。
抗原乳剂制备（1）油剂：矿物油和羊毛脂按比例混合，高压8磅20分钟灭菌后作为油剂，使用前微火融化。
（2）水剂：灭活结核杆菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均为终浓度）。
（3）油剂和水剂1：1混合。
混合方式：研磨或者注射器混合。
抗体效价测定操作规程
抗体效价测定操作规程操作步骤：一．IgG类1.IgG类抗体效价滴定，须取适量血清200µL加等体积2-Me溶液混合,封口，置37℃水浴箱作用60分钟，先稀释血清：200L病人血清600L生理盐水备用,排列6支试管按顺序编号.第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，在第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管,从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管）,以备必要时作进一步稀释.这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1：16,1:32,1：64，1:128，1:256.2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂)每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。
（如待检血清抗体为抗A，则加入A型标准红细胞悬液;如待检血清抗体为抗B，则加入B型标准红细胞悬液;如待检血清中既有抗A又有抗B，则倍量稀释两份血清，一份加入A型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；)3.先直接观察离心结果，之后在每管分别加入凝聚胺试剂盒中的R1液3d，混合30S均匀后，在各加R2液2滴，操作方法同凝聚胺交叉配血法,然后判读结果。
通常以肉眼观察到的第一个“±”的凝集管作为判断的终点，终点血清稀释度的倒数为效价（Titer），或称滴度.二．IgM1.血清连续倍量稀释法先稀释血清:100L病人血清+700L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号.第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管）,以备必要时作进一步稀释.这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1：8，1：16，1：32，1：64,1:128，1：256.2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2%相应红细胞悬液200L，混匀。
抗血清制备及抗体效价测定
摘要 (4)【实验过程】 (3)PartⅠ. NDV 抗血清制备 (3)一、实验原理 (3)二、实验仪器、材料和试剂 (4)1. 仪器 (4)2. 材料 (4)3. 试剂 (4)三、方法和步骤 (4)（一）NDV 兔抗血清制备 (4)1. 家兔捉拿方法 (4)2. 家兔固定方法 (4)3. 初次免疫 (5)4. 二次免疫 (5)5. 终末免疫 (6)6. 试血 (6)7. 颈动脉放血 (6)8. 血清分离 (6)9. 抗血清保存 (7)（二）NDV 鼠抗血清制备 (7)1. 小白鼠的捉拿和固定 (7)2. 初次免疫 (7)3. 二次免疫 (8)4. 终末免疫 (8)5. 试血 (8)6．放血 (9)7．血清分离 (10)8．抗血清保存 (10)Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价 (10)一、基本原理 (10)二、实验仪器、材料和试剂 (10)1. 仪器 (10)2. 材料 (10)3. 试剂 (10)三、方法和步骤 (10)1. 灭活鸡新城疫病毒Ulster 2C 株抗原提取 (10)2. 1%琼脂糖配制 (10)3. 倒平板 (10)4. 打孔 (10)5. 稀释抗血清 (11)6. 加样 (11)7. 孵育 (11)8. 结果观察 (11)Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定NDV 抗血清效价 (12)一、基本原理 (12)二、实验仪器、材料和试剂 (12)1. 仪器 (12)2. 材料 (12)3. 试剂 (12)三、方法和步骤 (12)1. 鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活抗原提取 (12)2、抗原包被 (13)3. 封闭 (13)4. 洗板 (13)5. 稀释抗血清 (13)6. 加抗血清 (13)7. 洗板 (13)8. 加酶标二抗 (13)9. 洗板 (13)10. 显色 (13)11. 终止 (13)12. 读数 (14)13. 结果判定 (14)Part Ⅳ. 免疫印迹实验鉴定抗体的特异性 (14)一、基本原理 (14)二、实验仪器、材料和试剂 (14)1. 仪器 (14)2. 材料 (14)3. 试剂 (14)（1）SDS-PAGE 相关试剂： (14)（2）Western blotting 相关试剂： (15)三、方法和步骤 (15)1. SDS-PAGE (15)2. 转膜 (16)3. 免疫检测 (16)（1）膜的封闭 (16)（2）洗膜 (16)（3）加入一抗 (17)（4）洗膜 (17)（5）与二级抗体作用： (17)（6）洗膜 (17)（7）Odessey 近红外成像仪扫描成像 (17)【实验结果及分析】 (17)NDV 抗血清制备及抗体效价测定摘要：抗血清，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。
高免血清的制备及效价测定
高免血清的制备及效价测定目的意义1、了解高免血清的制备过程；2、学习家兔采血的方法和血清分离方法；3、学习琼脂双向扩散法检测血清效价。
实验原理抗原进入机体后，被机体的抗原递呈细胞所识别并加以处理，递呈给B淋巴细胞，B淋巴细胞增殖、分化形成浆细胞，浆细胞分泌产生特异性抗体。
（示意图）该特异性抗体与相应抗原在电解质存在的情况下，在琼脂凝胶中相对扩散，相遇时结合形成肉眼可见的抗原抗体复合物，由于复合物分子较大，不能继续扩散，所以在琼脂凝胶中沉淀下来，形成肉眼可见的沉淀线。
此法可鉴定所制备的高免血清的特异性，并检测出其效价。
（示意图）。
实验材料实验动物：健康成年家兔，体重1.5-2.0Kg；药品：沙门氏菌油乳剂灭活苗（自制）；消毒酒精及碘酒；琼脂粉；硫柳汞、NaCL等；器械：剪刀、镊子、止血钳、三角瓶、平皿、打孔器等。
操作步骤1、家兔的免疫在家兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射含有完全佐剂的抗原0.1ml，抗原含量5mg/ml初次免疫；待两侧腹股沟淋巴结肿胀后注射含有完全佐剂的抗原0.1ml， 7-10天后，脊柱两侧多点（颈、胸、腰椎各2点、共6点）皮下注射含不完全佐剂的抗原，每点0.5ml；7-10天后脊柱两侧重复注射1次；7-10天后试血，不合格者重复脊柱两侧注射。
2、琼脂扩散平板的制备称取一定量的琼脂按1%左右的比例加入生理盐水，加热煮沸充分溶解，稍冷后加入终浓度1/万的硫柳汞混匀，将上述溶液倒入平皿中，厚度约为2-3mm，待凝固后用打孔器在其上打中间一孔，周围六孔的梅花形孔，孔径为2mm，孔间距3-4mm，挑出孔内琼脂，注意不要挑破琼脂边缘，然后在酒精灯火焰上缓缓加热，使孔底少量琼脂溶化封住孔底。
3、试血取耳缘静脉血待凝固后分离血清，用生理盐水将血清作2倍系列稀释后加入梅花形孔周围孔，中间孔滴加抗原，以加满为宜，加毕后，盖上皿盖，将平皿置湿盒中，37℃扩散24-48小时，观察结果。
4、免疫家兔的采血方法有颈动脉放血和心脏采血。
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4. 抗凝剂（枸橼酸钠或小试管等
实验内容
1、免疫动物
初次免疫小鼠为腹腔注射40%绵羊红细胞
（SRBC）0.2ml，以后分别于第4天、第7天和第10
天时间，以相同免疫剂量、相同免疫途径加强免疫。
小鼠腹腔注射
1. 小鼠腹腔注射可以用1ml的注射器，配合4号针头。
2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的
尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。 这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损 伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器 官。
3. 尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮
下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后 在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头， 并轻微旋转针头，防止漏液。
实验1-1
免疫血清制备及效价测定
实验目的和要求
1、学习抗血清的制备方法； 2、掌握抗血清的收集和保存方法； 3、掌握免疫血清效价的测定方法。
实验原理
制备免疫血清的基本方法是将抗原注入动物体内，由动物体内特异的B淋
巴细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决
定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原决定簇受体的B淋巴细胞系产生 针对该决定簇的抗体，因此用抗原免疫动物获得的免疫血清一般为多克隆抗体
测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集反应、沉淀反应、溶血反应、
本次实验将采用溶血实验测定所获免疫血清的效价。
• 抗原的两种特性：免疫原性与抗原性
• 免疫原性的本质——异物性 • 与机体亲缘关系越远，组织结构的差异越 大，异物性越强。
实验材料
1. 40% SRBC
2. 18-22g的BALB/C系小白鼠
（polyclonal antibody）。
主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案 （免疫次数、间隔时间以及免疫佐剂的使用等等）。因此要获得高质量的免疫血 清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方案。 ELISA分析等均可用于对抗体效价的测定。
制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，