第3章免疫原和抗血清的制备多媒体
免疫原和抗血清的制备
第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
一、颗粒性抗原的制备细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。
细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。
细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。
颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。
二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和可溶性抗原的粗提蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。
1.组织匀浆的制备通常需要先将来源于人和动物的组织和细胞破碎，再经一定的方法纯化，才能获得所需的抗原。
细胞破碎方法有：（1）高速组织捣碎机法；（2）研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。
2.细胞的破碎除上述机械捣碎获取外，尚有酶处理法，常用胃蛋白酶或胰酶，可获得游离的单个细胞。
细胞抗原分膜蛋白抗原、细胞质抗原（主要为细胞器）、细胞核与核膜抗原，制备这些抗原前均需将细胞破碎，方法有：（1）反复冻融法：-20℃冷冻，30～37℃融化（2）超声破碎法（3）自溶法（4）酶处理法：胃蛋白酶或胰酶（5）表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠3.免疫球蛋白片段的制备五种免疫球蛋白都具抗原性，皆可提取及纯化，但如分解成片段（如Fab片段、Fc片段、轻链片段等）作为免疫原可制备出分辨力更高的特异性抗血清。
制备方法有：（1）非共价键解离法：改变pH环境或用变性剂（2）共价键解离法（3）溴化氰裂解法（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶.木瓜酶可将IgG裂解成2个Fab片段及1个Fc片段；胃蛋白酶可将IgG裂解成F（ab′）2个片段及数个小片段；胰蛋白酶可将IgG切成不规则的肽链。
（二）可溶性抗原的提纯和纯化1.超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。
第3章免疫原和抗血清的制备
第3章免疫原和抗血清的制备免疫原是指能够引起机体免疫反应并激发产生特异性抗体的物质。
抗血清是指动物或人体经过免疫后所产生的含有抗体的血清。
免疫原和抗血清的制备是研究免疫学和生物制剂开发的重要环节。
本文将探讨免疫原和抗血清制备的一般原则和步骤。
1.免疫原的选择选择合适的免疫原对于制备高效的抗血清至关重要。
一般来说，免疫原应具备以下特点：(1)纯度：免疫原应具有尽可能高的纯度，以避免其他成分对免疫反应的干扰。
(2)特异性：免疫原应具有与所需抗体特异性结合的能力，以激发特异性抗体的产生。
(3)免疫原性：免疫原应具有足够的免疫原性，即能够引起机体的免疫反应。
(4)安全性：免疫原应具备足够的安全性，避免潜在风险。
根据不同的应用需求，免疫原可以是多种类型的物质，如蛋白质、多肽、核酸和糖类等。
选择合适的免疫原需要根据研究目的和预期应用来确定。
2.免疫原的制备免疫原的制备通常分为化学合成和生物提取两种方式。
(1)化学合成：对于小分子的免疫原，可以通过化学合成的方法合成。
例如，对于多肽免疫原，可以设计并合成相应的多肽序列。
化学合成的优势在于可以精确控制免疫原的结构和纯度。
(2)生物提取：对于大分子的免疫原，如蛋白质和核酸，通常采用生物提取的方法。
蛋白质可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达并纯化得到。
核酸可以通过DNA重组技术合成。
3.免疫反应的诱导免疫反应的诱导是指向机体注射免疫原以激发免疫反应。
免疫反应的诱导通常包括以下步骤：(1)免疫原的给药：将免疫原通过注射、给药或吸入等方式引入机体内。
(2)辅助剂的使用：为了增强免疫反应效果，通常会添加辅助剂。
辅助剂可改变免疫原的物理性质和免疫反应的过程。
(3)免疫程序的设计：根据需求设计免疫程序，包括免疫原的剂量、注射间隔和免疫次数等。
抗血清的制备是通过免疫动物或人体以获得抗体，从而制备含有抗体的血清。
一般来说，抗血清的制备包括以下步骤：(1)免疫动物的选择：选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子或猴子等。
免疫原和抗血清的制备资料
酶对山羊免疫时不产生Ab
5.甾体激素多用兔，酶多用豚鼠
6.对动物个体的要求： 雄性 稚龄、健康、正常、无感染
二、免疫前准备
• 1.正常饲养：
3d ，观察是否健康、正常、无感染
• 2.取阴性血清：耳静脉取血
•
二、免疫剂量、时间和途径选择原则：
1.剂量：大动物0.5-1mg/只 小动物0.1-0.6mg/只
以免疫亲和层析为例 （三）免疫球蛋白片段的制备：
• 1）温和 分离亚单位：
（1）改变PH值 PH＜3或＞10，Ig亚单位自动解离 （2）利用强度性剂
适合载脂蛋白Ag和胶原肽的提取 2）二硫键的解离：
适合于将轻、重链分开 3）溴化氰裂解法：
与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反应，生成溴化亚氨内酯 4）酶法裂解：
三）无羧基和氨基半抗原衍生物的制备： 1.琥珀酸酐法 2.O-（羧甲基）羟胺法 3.一氯醋酸钠法，适用于带酚基的半抗原 4.重氮化的对氨基苯甲酸法：适于带酚基的半抗原
四.佐剂：
• （一）使用佐剂的目的为提高免疫原性
佐剂本身可有或无免疫原性
（二）机理：
1.可直接或参与cell免疫反应 2.佐剂与Ag混合，可以使Ag在局部组织 的存留时间长，延长Ag的局部吸收。可持 续刺激机体，产生高滴度Ab 3.佐剂可增加Ag表面积，并改变Ag的活 性基因构型，从而增加Ag的免疫原性。
基因工程技术制备mcab为进一步减少抗体蛋白中鼠源性成分的比例可将鼠抗体的超变区基因嵌入人抗体fab架区的编码基因中再将此dna片段与人ig恒定区基因相连然后转染杂交瘤细胞使之表达嵌合的将抗体vl羧基端基因序列与vh氨基端基因序列连接成单链的抗体区基因将它转入大肠杆菌使之表达能与抗原结合的单链抗此抗体之优点是分子量很小作为异种蛋白的免疫原性较弱用于肿瘤导向治疗时易渗透入实体瘤内部其缺点是此类抗体无重链稳定区故不能介导抗体的其他效应功能
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验(2019)讲义第三章免疫原和抗血清的制备
第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
一、颗粒性抗原的制备细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。
细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。
细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。
颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。
二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和可溶性抗原的粗提蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。
1组.织匀浆的制备（1）高速组织捣碎机法；（2）研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。
2细.胞的破碎（）反复冻融法：℃冷冻，〜7融化。
（2）超声破碎法（3）自溶法（4）酶处理法：胃蛋白酶或胰酶。
（5）表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠。
3免.疫球蛋白片段的制备（）非共价键解离法：改变环境或用变性剂。
（2）共价键解离法：还原法或氧化法解离二硫键。
（3）溴化氰裂解法：溴化氰裂解蛋白质肽链。
（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。
（二）可溶性抗原的提纯和纯化超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。
选择性沉淀法：（1）核酸去除法：核糖核酸降解法更简便。
（2）盐析法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩。
（3）有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮。
（）聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物，如聚乙二醇（）G凝胶过滤法：根据分子大小进行分离纯化。
离子交换层析法：利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。
5亲.和层析法：与生物分子间不同的亲和性进行分离。
如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体等。
电泳法：蛋白质在同一环境中，分子量和电荷不同，在电场中迁移速率不同进行分离。
（三）纯化抗原的鉴定蛋白质含量测定：常用的是紫外光吸收法，该法测定和的吸光度（）值。
临床免疫学和免疫检验第三章免疫原和抗血清的制备讲义
临床免疫学和免疫检验第三章免疫原和抗血清的制备讲义第三章免疫原和抗血清的制备概述：免疫学的研究主要涉及到两个重要的组分：免疫原和抗血清。
免疫原是引发免疫反应的物质，抗血清则是由免疫反应产生的抗体。
制备免疫原和抗血清是研究免疫学的基础，也是开展临床免疫学和免疫检验的前提。
一、免疫原的制备1.病原体免疫原的制备（1）整活病原体的制备：将病原体培养至足够数量，收集后经过消毒杀菌处理，用于动物免疫或制备抗血清。
（2）灭活病原体的制备：将病原体培养至足够数量，用热、化学物质或辐射等方法使其失去活性，避免感染动物或人员，用于动物免疫或制备抗血清。
（3）病原体抗原的提取和纯化：通过培养病原体，收集其代谢产物，经过提取、纯化等步骤得到纯净的抗原物质。
2.细胞免疫原的制备（1）原代细胞制备：从动物或人体中采集组织或器官，通过细胞培养技术将细胞分离并进行传代，得到大量的细胞用于动物免疫或制备抗血清。
（2）细胞株制备：将细胞分离后，在适当的培养环境中进行无限传代，得到大量同源的细胞，用于动物免疫或制备抗血清。
（3）细胞裂解物制备：将细胞离心沉淀后，用适当的缓冲液裂解细胞释放细胞内的免疫原物质，进行纯化处理后得到制备的免疫原。
3.蛋白质免疫原的制备（1）从细胞裂解物中分离：将细胞裂解，经过离心等步骤得到细胞内的蛋白质物质，可以经过分子筛、电泳等技术得到纯净的蛋白质免疫原。
（2）基因工程蛋白质的制备：利用克隆技术将目标蛋白质的基因导入到表达系统中，通过大量表达和纯化，得到目标蛋白质。
二、抗血清的制备抗血清是由免疫原引发的免疫反应产生的抗体。
下面介绍几种常见的抗血清制备方法。
1.动物抗血清的制备选择适宜的动物（如小鼠、兔子、小鸡等），先注射免疫原，然后通过多次免疫，免疫记忆细胞对免疫原做出反应，最后采集动物血液得到抗血清。
2.单克隆抗体的制备将B细胞与病原体或免疫原细胞融合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞能够无限制地分裂，并能够产生单一抗体。
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验讲义第三章免疫原和抗血清的制备
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验讲义第三章免疫原和抗血清的制备1.免疫原的制备免疫原是诱导免疫反应的物质，常用的免疫原有细菌、病毒、细胞组分、蛋白质等。
免疫原的制备需要经过以下几个步骤：(1)选择合适的免疫原：根据实验目的选择合适的免疫原，使其能够诱导出所需的免疫反应。
(2)免疫原的提取和纯化：根据免疫原的性质选择合适的提取和纯化方法，常见的方法有渗透法、离心法、电泳法等。
(3)免疫原的灭活：对一些病原体免疫原进行灭活，以避免使用活病原体引起感染。
(4)免疫原的标记：为了方便检测免疫原是否存在或定量测定其浓度，常常需要对免疫原进行标记，常见的标记方法有荧光标记、酶标记等。
抗血清是由动物接种免疫原后产生的抗体混合物，用于检测和分离相应的抗原。
抗血清的制备需要经过以下几个步骤：(1)动物的选择和免疫程序的制定：根据实验目的选择合适的动物种类和免疫程序，并对免疫程序进行优化。
(2)免疫原的接种：将免疫原注射到动物体内，激发其免疫系统产生抗体。
(3)血清的采集：在免疫原接种后一定时间内采集动物的血清，其中含有抗体。
(4)抗体的纯化和储存：从血清中提取抗体，常见的方法有硫酸铵沉淀、蛋白A/G纯化等。
提取的抗体要进行储存，常用的储存方法有冷冻保存、低温干燥等。
3.免疫原和抗血清的应用免疫原和抗血清在临床免疫学和免疫检验中有广泛的应用。
其中包括：(1)免疫学研究：利用免疫原和抗血清可以研究机体对抗原的免疫反应过程，探索免疫机制和疾病的发生发展规律。
(2)临床诊断：利用抗血清可以检测人体液中的抗原，从而判断是否感染其中一种病原体或患有其中一种疾病。
(3)药物研发和药物监测：利用免疫原和抗血清可以筛选药物靶点，研发新药或进行药物治疗监测。
(4)食品安全监测：利用抗血清可以检测食品中的有害物质或致病微生物，确保食品安全。
总结：免疫原和抗血清的制备是临床检验技师在开展免疫学和免疫检验工作中的基础性工作之一、免疫原的制备需要选择合适的免疫原、提取纯化并标记，而抗血清的制备需要选择合适的动物、制定免疫程序并采集血清，然后对抗体进行纯化和储存。
第3章免疫原和抗血清的制备
二、免疫程序
免疫原的剂量
中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 特异性要求高，应小量短程，可溶性抗原加用佐剂。对效价 要求高，则可大量长程加佐剂。
免疫间隔时间
第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天
免疫途径
皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结
一、特异性IgG抗体
盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：常结合盐析法 离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维 素 亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层 析柱
二、单价特异性抗血清
亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱 吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗
使包膜的渗透压改变而溶解。
优点是: 作用温和 适用于:破碎细菌、破碎细胞（提取核酸)
3、免疫球蛋白片段的制备： 非共价键解离法－改变pH 、利用强变 性剂 共价键解离法－氧化法和还原法 溴化氰裂解法 酶解法－木瓜酶 、胃蛋白酶
IgG片段的制备
1.酶裂解法：
IgG
木瓜酶
Fc+2Fab
Fc段可用于制备抗重链血清。
透析除去未反应
的半抗原
得人工免疫原 （半抗原+载体）
2.戊二醛法：
半抗 原氨 基
N-CH-(CH2)3-CH-N
载体 氨基
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与 抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原 的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质 称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。
小结
免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的 物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质， 与载体结合后可具有免疫原性。
免疫原制备和抗血清的制备
可溶性抗原的制备：粗提
细胞破碎
细胞破碎 方法 原理 保内水分形成冰晶， 内外浓度改变，破坏 细胞膜和胞内颗粒 液体局部减压引发内 部液体流动，涡旋形 成消失产生压力 消化 与脂蛋白形成微泡改 变细胞膜通透性 操作要点 -20℃/30-37℃ 速冻慢融 反复2次 1-20kHz 间歇进行 溶菌酶：G+ 纤维素酶：真菌 蜗牛酶：酵母菌、植物 SDS 去氧胆酸钠 二乙基十六烷基溴 适用范围 不适用
离子交换层析
带离子基团的离子交换 固定相：离子交换剂（树脂/凝胶/纤维素） 剂，吸附交换带相反电 流动相：含离子的待分离蛋白溶液 荷的蛋白
抗原/抗体 生物分子间专一亲合力 酶/底物（酶抑制剂） 特异性+可筛层析： 具有三维空间多孔 网状结构的物质。
离子交换层析
一、颗粒性抗原的制备 第一节 免疫原 的制备 二、可溶性抗原的制备 三、人工抗原的制备
免疫原：诱导机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
天然抗原
混合体 须提纯
颗粒性抗原 细胞 细菌 寄生虫
可溶性抗原 蛋白质 多糖
脂类 核酸
人工抗原
人工结合抗原 人工合成抗原 人工重组抗原
一、颗粒性抗原的制备
绵羊红细胞SRBC：常用，溶血素
①亲和层析法：将杂抗原交联到琼脂糖凝胶
4B上，装柱，抗血清过柱，洗脱。
②吸附法：交联杂抗原混合液制备固相吸附剂，
加到抗血清中，结合杂抗体去除。
二、IgG类抗体纯化
盐析法：粗提γ球蛋白。 离子交换层析法：QAE-sephadex（交联葡聚糖凝胶 少量提取+大量制备 亲和层析法： SPA-sepharose-4B/纯化抗原-sepharose-4B
+ + + + +
2.2 免疫原和抗血清的制备
思考题
佐剂的生物学作用是什么？ 常用的抗血清制备的免疫途径有哪些？
1. 福氏佐剂 (Freund adjuvant,FA) 是目 前动物免疫中最常应用的佐剂 , 可分为 福氏不完全佐剂 ( 石蜡油 + 羊毛脂 ) 和福氏完全佐剂 ( 石蜡油 + 羊毛脂 + 卡介苗 ) 两种 。 2. 细胞因子佐剂 细胞因子佐剂与抗原 合用 , 可 以更有效地激发机体的免疫 功能 , 增强免疫反应。
三、动物采血法
动物免疫 3~5 次后, 如抗血清抗体效价经测 定合格后即可放血。如血清效价不理想可追 加免疫 1~2 次后再行放血。应选择在末次免 疫后 5~7 天及时采血, 否则抗体效价会下降。
目前较常用的采血方法有以下三种。
1. 颈动脉放血法 这是最常用的方法。 2. 心脏采血法 一只家兔一次可取血 20~30ml。 3. 静脉多次采血法 家兔可取耳中心静脉 , 山羊和绵羊可取颈静脉采血。
③抗血清的要求 : 抗血清可分为 R(rabbit) 型与H (horse) 型。R 型抗血清能和很小量的抗原结合, 形 成可见的沉淀线 , 具有 较宽的抗原抗体比例范围 ； H 型抗血清用于沉淀反应 , 较难掌握 , 因而极少应 用。 ④抗原的选择: 对蛋白质抗原 , 大部分动物皆适 合, 较常用的是家兔与山羊； ⑤甾体激素及酶 : 简体激素免疫多用家兔 , 酶类 免疫多用豚鼠。
(四) 凝胶过滤
凝胶过滤又名分子筛层析，凝胶是具有 三维空间多孔网状结构的物质，经过处 理平衡后，装入层析柱内成为分子筛的 支撑物。
(五) 离子交换层析
离子交换层析是利用一些带电离子基团 的凝胶或纤维素，吸附交换带有相反电 荷的蛋白质抗原。
初级检验技师临床免疫学和免疫检验第三章免疫原和抗血清的制备
初级检验技师临床免疫学和免疫检验第三章免疫原和抗
血清的制备
免疫原和抗血清的制备是临床免疫学和免疫检验中非常重要的一环。
免疫原是指引起机体免疫反应的物质，而抗血清是指从动物体内提取的具有特定抗原结合能力的血清。
制备免疫原和抗血清的目的是为了研究免疫学和进行免疫诊断。
一、免疫原的制备
1.天然免疫原的制备
2.人工合成免疫原的制备
人工合成免疫原是通过人工手段合成或改造蛋白质、多肽、核酸或多糖等，以模拟天然免疫原的结构和功能。
常用方法有化学合成、酶切、递归合成等。
1.抗原免疫动物的选择
在制备抗血清之前，首先需要选择合适的动物作为免疫对象。
常用的动物有小鼠、兔、大鼠等。
选择免疫动物时需要考虑其抗原性、稳定性以及生产抗血清的成本和效果等因素。
2.免疫程序
免疫程序分为原位免疫和外位免疫两种。
原位免疫是将免疫原直接注入动物体内，常见的方法有肌肉注射、皮下注射、腹腔注射等。
外位免疫是将免疫原注射到免疫动物前肢的足底或韧带等处，以提高免疫效果。
3.抗血清的采集和分离
免疫程序完成后，可以采集免疫动物的血清进行进一步处理。
采集血清时可以使用静脉置管或心脏穿刺等方法。
采集到的全血需要经过离心分离得到血清，然后经过过滤和冷藏等步骤进行保存。
4.抗血清的纯化
为了获得纯净的抗血清，需要对采集到的血清进行纯化处理。
常用的方法有硫酸铵沉淀、硫酸沉淀、亲和层析、凝胶过滤等。
通过这些方法，可以去除血清中的不想要的成分，得到高纯度的抗血清。
免疫原和抗血清的制备多媒体
免疫原与佐剂混合
动物免疫
将免疫原与适宜的佐剂混合，以增强免疫效 果。
将免疫原和佐剂混合物注射入动物体内，刺 激机体产生免疫反应。
细胞培养
抗血清提取
采集动物脾脏或淋巴结细胞，进行细胞培养 。
收集细胞培养过程中的细胞上清液或培养液 ，提取抗血清。
基于蛋白质纯化技术的免疫原和抗血清制备方案设计
免疫原与佐剂混合
免疫血清具有高效中和病毒、抑制病毒复制、防止病毒感染 的作用，同时具有高度特异性和稳定性。
免疫血清的制备方法
免疫原的制备
选择适合的抗原，免疫原的纯度和浓度都会影响抗体的产生。
免疫动物的接种
选择适合的动物进行接种，接种途径和剂量对抗体产生也有影响。
免疫细胞的筛选和培养
筛选出产生特异性抗体的细胞系，并进行培养扩增。
免疫原和抗血清的制备多媒体
xx年xx月xx日
目录
• 免疫原的制备 • 抗血清的制备 • 多媒体展示 • 相关技术介绍 • 实验方案设计 • 总结与展望
01
免疫原的制备
免疫原的性质
1 2 3
免疫原应为抗原
免疫原应为具有免疫原性的物质，可诱导机体 产生针对其的特异性抗体。
免疫原的免疫剂量
免疫原的免疫剂量对免疫效果会产生影响，合 适的免疫剂量能够诱导机体产生适量且有效的 抗体。
免疫原的免疫次数
为获得足够的免疫效果，常常需要多次免疫， 以增强和维持抗体水平。
免疫原的制备方法
原核表达系统
01
利用原核表达系统，如大肠杆菌表达系统，可高效表达基因工
程重组抗原。
真核表达系统
02
真核表达系统表达的抗原具有真核细胞的特性，其翻译后修饰
加工过程更接近天然抗原。
免疫原和抗血清的制备多媒体
抗血清纯化方法
盐析法
01
通过调整盐浓度，使抗原与抗体复合物沉淀，达到纯
化目的。
凝胶过滤法
02 利用凝胶孔径大小，使抗原与抗体复合物通过凝胶时
得以分离纯化。
亲和层析法
03
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过层析柱进行
纯化。
抗血清保存与使用
针对不同免疫原，制定合适的免疫方 案，包括免疫剂量、途径、次数和时 间间隔等。
严格控制实验条件
实验操作过程中应严格遵守操作规程 ，确保实验条件的稳定性和一致性。
加强抗血清保存和使用管理
抗血清的保存和使用条件对抗血清的 效价和稳定性至关重要，应建立严格 的抗血清管理制度。
06
未来发展趋势预测与展望
新技术新方法在制备中应用前景
抗原处理
对抗原进行纯度检测、结构鉴定 和活性测定，确保其符合制备要 求。
免疫佐剂应用
佐剂种类
选择适合的免疫佐剂，如弗氏佐剂、铝佐剂等，以增强抗原的免疫原性。
佐剂与抗原乳化
将佐剂与抗原按一定比例混合，并进行乳化处理，以确保佐剂与抗原充分结合 。
动物免疫方案
动物选择
选择适合的动物种类，如小鼠、大鼠、兔等，作 为免疫原制备的实验动物。
基因工程技术
利用基因工程技术制备具有特定抗原性的免疫原，提高抗体的特异 性和亲和力，是制备免疫原和抗血清的重要方向。
蛋白质组学技术
应用蛋白质组学技术研究抗原和抗体的相互作用，有助于发现新的 抗原和抗体，为制备免疫原和抗血清提供更多选择。
新型佐剂的应用
开发新型佐剂，提高免疫原的免疫原性和抗体的效价，是制备高效价 抗血清的关键。
免疫原和抗血清的制备
离子交换层析法： 利用蛋白质带电荷不同进行分离 离子交换剂（带有离子基团）：在惰性载体上引入带有 电荷的活性基团即离子交换剂 离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂 阳离子交换剂 — 带负电荷，与阳离子交换 阴离子交换剂 — 带正电荷，与阴离子交换
增加离子强度（增 加介导常数）或减 少pH(减少蛋白质电 荷），使蛋白质从 离子交换剂上解吸 附
6％～7％可沉淀IgM，8％～12％可沉淀IgG，12％～ 15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。最突
出的应用是用3％～4％的PEG沉淀免疫复合物，未结
合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速
测定比浊法和循环免疫复合物测定法。
层析法： 凝胶层析法：
利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质 进行分离
（二）可溶性抗原的纯化
超速离心法：根据抗原比重特点进行分离 差速离心法－低速和高速离心交替进行 适用用于分离大小差别较大的抗原：大分子抗原 （IgM(800kD)、C1q(410kD)),小分子抗原（载脂蛋白A28.3kD) 特点：方法较简单，但分辨率不高，沉淀系数在同一个数量 级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗 制品提取。 密度梯度离心法－区带离心法 离心时先将样品溶液臵于一个由梯度材料（蔗糖、甘油）形 成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于 梯度柱中 可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率
柱
二、抗血清的保存
2℃～8℃保存：短期保存
冰冻保存：保存5年
真空干燥保存：保存5～10年
多克隆抗体的实际意义： 预防：治疗感染性疾病（人工被动免疫）
如：破伤风抗毒素血清（副作用是超敏反应）
诊断：肥大氏反应（诊断伤寒、副伤寒）
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。 刺激淋巴细胞增殖和分化。
多克隆抗体(polyclonal antibody,pcAb)：天然抗 原刺激多种B淋巴细胞克 隆产生的多种抗体的混合 物
多克隆抗体的产生示意图
一、免疫动物的选择
二、单价特异性抗血清
亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱 吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗
原混合液制成固相吸附剂
思考题
1．什么是免疫原？ 2．如何制备可溶性抗原？ 3．常用的细胞破碎方法有哪些？ 4．连接半抗原的载体有哪些？制备半抗原性免疫原的方
法有哪些？ 5．纯化抗原的鉴定包括有哪些内容？ 6．什么是免疫佐剂？免疫佐剂有哪些种类？免疫佐剂的
生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、百日 咳杆菌及CTB、LPS和类脂A、胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白
用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly I∶C、胞壁酰二肽、细 胞因子、热休克蛋白 常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)
二、佐剂的作用机制
颗粒性抗原－细胞、细菌、寄生虫 可溶性抗原－蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸
一、颗粒性抗原的制备
细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵
二、可溶性抗原的制备和纯化
（一）可溶性抗原的制备
组织细胞抗原的制备： 高速捣碎法－组织捣碎机捣碎 研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨
组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备： 反复冻融法－-20℃冻结，然后室温融化 超声破碎法－超声波（1～20kHz） 自溶法－自身酶系 酶处理法－溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶 表面活性剂处理法－SDS、去氧胆酸钠、 二乙基十六烷基溴
第四节 抗血清的鉴定和保存
第3章免疫原和抗血清的制备多媒体
一、抗血清的鉴定
抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法 抗体效价的鉴定：凝集试验 、双向免疫扩散试验、ELISA 抗体纯度的鉴定：SDS-PAGE 、双向免疫扩散试验、免疫电泳 抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验
二、抗血清的保存
(4)亲和层析条件的选择： ①封闭活性基团：用无关蛋白质或三乙醇胺 过柱； ②除去未结合和结合不牢的蛋白：先用 NaHCO3洗脱，再用解脱剂处理；
解脱剂：3mol/L 硫氰酸钾（或钠）、 0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液
电泳法： 利用分子量和电荷量不同进行分离
（三）纯化抗原的鉴定
蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法 分子量测定：SDS-PAGE、凝胶过滤 纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电 泳、等电聚焦、高效液相层析 免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA
合； ⑤有丰富的微孔，以增加结合容量。
最常用的支持物是Separose4B
(2)配体的选择条件： ①抗原或抗体必须单一特异性； ②抗原与抗体必须具有较高的亲和力； ③配体必须有一个适当的化学基团。
(3)抗原或抗体与支持物的结合： ①活化：溴化氰； ②接“手臂”：带“手臂”琼脂糖有氨 基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、 重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与 抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原 的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质 称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。
一、佐剂的种类
化合物:氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂以及人工 合成的多聚肌苷酸∶ 胞苷酸(poly I∶C)、脂质体
2℃～8℃保存：短期保存 冰冻保存：保存5年 真空干燥保存：保存5～10年
第五节 抗血清的纯化
抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂 的混合物，除含有特异性抗体外，还存在 与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除 去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂 抗体干扰试验结果。
一、特异性IgG抗体
盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：常结合盐析法 离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维 素 亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层 析柱
凝胶过滤法： 利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进
行分离
离子交换层析法： 利用蛋白质带电荷不同进行分离
离子交换剂： 离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂
亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力 (1)亲和层析支持物的选择：
①非特异性吸附低； ②液体流速快； ③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定； ④有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结
作用机制有哪些？ 7．什么是抗血清？什么是多克隆抗体？ 8．如何制备抗血清？ 9．动物采血有哪些方法？ 10．抗血清的鉴定包括哪些内容？
第3章免疫原和抗血清的制备多媒体
3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
2020/11/26
第3章免疫原和抗血清的制备多媒体
抗原来源与动物种属的关系
种属差异越远，免疫原性越强
动物个体的选择
适龄、健康、体重符合要求
抗原的性质
二、免疫序
免疫原的剂量
中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体
免疫间隔时间
第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天
免疫途径
皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结
三、动物采血法
颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊 心脏采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、鸡 静脉采血法： 家兔、山羊、绵羊
免疫球蛋白片段的制备： 非共价键解离法－改变pH 、利用强变 性剂 共价键解离法－氧化法和还原法 溴化氰裂解法 酶解法－木瓜酶 、胃蛋白酶
（二）可溶性抗原的纯化
超速离心法： 差速离心法－低速和高速离心交替进行 密度梯度离心法－区带离心法
选择性沉淀法： 核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋、链
霉素 盐析法－硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮 聚合物沉淀法－聚乙二醇
第3章免疫原和抗血清的制备多媒体
第四节 抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定 二、抗血清的保存
第五节 抗血清的纯化 一、特异性IgG抗体 二、单价特异性抗血清
思考题 小结
第3章免疫原和抗血清的制备多媒体
第一节 免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体 并能与抗体发生反应的物质
第3章免疫原和抗血清的 制备多媒体
2020/11/26
第3章免疫原和抗血清的制备多媒体
第一节 免疫原的制备 一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化 三、半抗原性免疫原的制备
第二节 免疫佐剂 一、佐剂的种类 二、佐剂的作用机制
第三节 抗血清的制备 一、免疫动物的选择 二、免疫程序 三、动物采血法