3第3章免疫原和抗血清的制备多媒体.pptx
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免疫原和抗血清的制备PPT课件
（六）亲和层析
亲和层析是利用生物大分子的生物学特 异性，即生物分子间所具有的专一性亲 和力而设计的层析技术。例如抗原和抗 体、酶和酶抑制剂、酶蛋白和辅酶、 DNA 和 RNA 、激素和受体等 之间有特 殊的亲和力,在一定的条件下,二者能紧 密地结合成复合物。如果将复合物的已 知一 方固定在固相载体上,则可从溶液 中专一性地分离和提纯另一方。
上清液中含有 可溶性抗原
上清 1万—2万转/分，20到30分钟
沉淀
2. 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备
制备抗原的细胞包括正常细胞、传代细胞或 病理细胞 ( 如肿瘤细胞 )。
(1) 反复冻融法；(2) 超声破碎法；(3) 自溶 法；(4) 酶处理法；(5) 表面活性剂处理法。
( 二 ) 超速离心分离法
绵羊红细胞、细菌、毒素、寄生虫和真 菌抗原的制备
二、可溶性抗原的制备和纯化
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、细菌毒素、 酶、补体和核酸等都是良好的可溶性抗 原。
（一） 组织和细胞粗抗原的制备
1. 组织细胞抗原的制备所用组织必须是新鲜
的或低温保存的。
高速组织捣碎机
器官或者组织
处理
粉碎 研磨法
离心3000r/min，10分钟
一、佐剂的种类
1. 具有免疫原性的佐剂 如卡介苗、枯草 分支杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、 革兰阴性杆菌内毒素 ( 脂多糖 ) 和细胞 因子等。
2. 非免疫原性佐剂如氢氧化铝、磷酸铝、 磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、 藻酸钙、多聚核昔酸和胞壁肽等。
1. 福氏佐剂 (Freund adjuvant,FA) 是目 前动物免疫中最常应用的佐剂 , 可分为 福氏不完全佐剂 ( 石蜡油 + 羊毛脂 ) 和福氏完全佐剂 ( 石蜡油 + 羊毛脂 + 卡介苗 ) 两种 。
免疫原和抗血清制备技术.pptx
组织和细胞成分混合抗原制备程序
所用材料必须是新鲜或低温保存的
洗去血迹 及污物
脏器进行灌洗
NS内含0.5g／L NaN2
去除包 膜或结 缔组织
冷浴中组织剪碎
装入捣碎机简内高速 粉碎制成组织匀浆液
上清液 澄清
去除细胞碎片 及微小组织
3000r／min×10min
取上清液
离心
及评价
细胞破碎技术
1.酶处理法 2.冻融法 3.超声破碎法 4.表面活性剂处理
亲和层析法示意图
正常细胞 标记细胞 标记细胞 加入特异 其它蛋白 SDS-PAGE
＋ 洗滴
被酶裂解 性抗体 洗涤流失 分离蛋白
核酸抗原制备
•大分子的核酸具有免疫原性。 •提取核酸的主要步骤：
破碎细胞
核酸从细胞中游离出来 酚和氯仿
酸沉淀核
除去蛋白质 乙醇
类脂多糖抗原制备
•苯酚法提取LPS： 同温的苯酚
• 常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解 度不同）；常用33～50％饱和度的硫酸胺。
• 特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。 • 应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。
3．凝胶层析法（凝胶过滤法） •原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质， 经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种
分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时 间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝 胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分 成大、中、小三种类型。
干燥菌体 或湿菌体
水中 混匀
加热
Байду номын сангаас
激烈搅匀 冰水 加热5min 急冷
临床免疫学检验 抗血清制备PPT
标准抗原 待测抗原
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
多价诊断血清
标准抗原 待测抗原
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
Cohn乙醇分段法
pH 乙醇浓度(%) 分段
分段组分（%） 纤维蛋原 白蛋白 α球蛋白 β球蛋白 γ 球蛋白
7.2
8
Ⅰ
61
7
8
15
9
6.8
25
Ⅱ+Ⅲ 5
4
6
48
37
Fc
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
七)、纯化抗原的鉴定： １、免疫双扩散法 ２、免疫电泳法 ３、聚丙烯酰胺凝胶电泳法
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
IgM IgG
白蛋白
Sephadex G-200凝胶
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
第3章免疫原和抗血清的制备多媒体
二、单价特异性抗血清
亲和层析法：杂抗原交联Sephar源自se 4B柱 吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗
原混合液制成固相吸附剂
思考题
1．什么是免疫原？ 2．如何制备可溶性抗原？ 3．常用的细胞破碎方法有哪些？ 4．连接半抗原的载体有哪些？制备半抗原性免疫原的方
法有哪些？ 5．纯化抗原的鉴定包括有哪些内容？ 6．什么是免疫佐剂？免疫佐剂有哪些种类？免疫佐剂的
(2)配体的选择条件： ①抗原或抗体必须单一特异性； ②抗原与抗体必须具有较高的亲和力； ③配体必须有一个适当的化学基团。
(3)抗原或抗体与支持物的结合： ①活化：溴化氰； ②接“手臂”：带“手臂”琼脂糖有氨 基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、 重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。
(4)亲和层析条件的选择： ①封闭活性基团：用无关蛋白质或三乙醇胺 过柱； ②除去未结合和结合不牢的蛋白：先用 NaHCO3洗脱，再用解脱剂处理；
生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、百 日咳杆菌及CTB、LPS和类脂A、胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白
用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly I∶C、胞壁酰二肽、细 胞因子、热休克蛋白 常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)
二、佐剂的作用机制
改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系 统。
刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。 刺激淋巴细胞增殖和分化。
多克隆抗体(polyclonal antibody,pcAb)：天然抗 原刺激多种B淋巴细胞克 隆产生的多种抗体的混合 物
多克隆抗体的产生示意图
一、免疫动物的选择
解脱剂：3mol/L 硫氰酸钾（或钠）、0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液
临床免疫学和免疫检验第三章免疫原和抗血清的制备讲义
临床免疫学和免疫检验第三章免疫原和抗血清的制备讲义第三章免疫原和抗血清的制备概述：免疫学的研究主要涉及到两个重要的组分：免疫原和抗血清。
免疫原是引发免疫反应的物质，抗血清则是由免疫反应产生的抗体。
制备免疫原和抗血清是研究免疫学的基础，也是开展临床免疫学和免疫检验的前提。
一、免疫原的制备1.病原体免疫原的制备（1）整活病原体的制备：将病原体培养至足够数量，收集后经过消毒杀菌处理，用于动物免疫或制备抗血清。
（2）灭活病原体的制备：将病原体培养至足够数量，用热、化学物质或辐射等方法使其失去活性，避免感染动物或人员，用于动物免疫或制备抗血清。
（3）病原体抗原的提取和纯化：通过培养病原体，收集其代谢产物，经过提取、纯化等步骤得到纯净的抗原物质。
2.细胞免疫原的制备（1）原代细胞制备：从动物或人体中采集组织或器官，通过细胞培养技术将细胞分离并进行传代，得到大量的细胞用于动物免疫或制备抗血清。
（2）细胞株制备：将细胞分离后，在适当的培养环境中进行无限传代，得到大量同源的细胞，用于动物免疫或制备抗血清。
（3）细胞裂解物制备：将细胞离心沉淀后，用适当的缓冲液裂解细胞释放细胞内的免疫原物质，进行纯化处理后得到制备的免疫原。
3.蛋白质免疫原的制备（1）从细胞裂解物中分离：将细胞裂解，经过离心等步骤得到细胞内的蛋白质物质，可以经过分子筛、电泳等技术得到纯净的蛋白质免疫原。
（2）基因工程蛋白质的制备：利用克隆技术将目标蛋白质的基因导入到表达系统中，通过大量表达和纯化，得到目标蛋白质。
二、抗血清的制备抗血清是由免疫原引发的免疫反应产生的抗体。
下面介绍几种常见的抗血清制备方法。
1.动物抗血清的制备选择适宜的动物（如小鼠、兔子、小鸡等），先注射免疫原，然后通过多次免疫，免疫记忆细胞对免疫原做出反应，最后采集动物血液得到抗血清。
2.单克隆抗体的制备将B细胞与病原体或免疫原细胞融合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞能够无限制地分裂，并能够产生单一抗体。
第3章免疫原和抗血清的制备
免疫期间应给予充分营养，分笼饲养标明 记号、做好记录。
二、免疫程序
免疫原的剂量
中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 特异性要求高，应小量短程，可溶性抗原加用佐剂。对效价 要求高，则可大量长程加佐剂。
免疫间隔时间
第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天
免疫途径
皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结
一、特异性IgG抗体
盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：常结合盐析法 离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维 素 亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层 析柱
二、单价特异性抗血清
亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱 吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗
使包膜的渗透压改变而溶解。
优点是: 作用温和 适用于:破碎细菌、破碎细胞（提取核酸)
3、免疫球蛋白片段的制备： 非共价键解离法－改变pH 、利用强变 性剂 共价键解离法－氧化法和还原法 溴化氰裂解法 酶解法－木瓜酶 、胃蛋白酶
IgG片段的制备
1.酶裂解法：
IgG
木瓜酶
Fc+2Fab
Fc段可用于制备抗重链血清。
透析除去未反应
的半抗原
得人工免疫原 （半抗原+载体）
2.戊二醛法：
半抗 原氨 基
N-CH-(CH2)3-CH-N
载体 氨基
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与 抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原 的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质 称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。
小结
免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的 物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质， 与载体结合后可具有免疫原性。
二、免疫程序
免疫原的剂量
中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 特异性要求高，应小量短程，可溶性抗原加用佐剂。对效价 要求高，则可大量长程加佐剂。
免疫间隔时间
第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天
免疫途径
皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结
一、特异性IgG抗体
盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：常结合盐析法 离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维 素 亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层 析柱
二、单价特异性抗血清
亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱 吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗
使包膜的渗透压改变而溶解。
优点是: 作用温和 适用于:破碎细菌、破碎细胞（提取核酸)
3、免疫球蛋白片段的制备： 非共价键解离法－改变pH 、利用强变 性剂 共价键解离法－氧化法和还原法 溴化氰裂解法 酶解法－木瓜酶 、胃蛋白酶
IgG片段的制备
1.酶裂解法：
IgG
木瓜酶
Fc+2Fab
Fc段可用于制备抗重链血清。
透析除去未反应
的半抗原
得人工免疫原 （半抗原+载体）
2.戊二醛法：
半抗 原氨 基
N-CH-(CH2)3-CH-N
载体 氨基
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与 抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原 的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质 称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。
小结
免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的 物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质， 与载体结合后可具有免疫原性。
《疫原和抗血清制备》课件
在适宜的培养基中培养 疫原，使其大量繁殖。
提取和纯化
从培养物中提取疫原， 并进行纯化，去除杂质
。
灭活和质量控制
通过物理或化学方法灭 活疫原，并进行质量检
测和控制。
疫原的质量控制
01
02
03
04
生物学试验
进行安全性和有效性试验，确 保疫原的质量和安全性。
理化分析
进行成分分析和纯度检测，确 保符合标准要求。
特异性检测
检测抗血清的特异性，即抗血 清是否只针对特定的抗原产生 反应，避免交叉反应。
稳定性检测
检测抗血清在储存和运输过程 中的稳定性，确保抗血清的质
量和有效性。
03
疫原和抗血清的应用
疫原在疫苗研发中的应用
疫原是疫苗研发的重要原料，通过将病原微生物或其组分经 过灭活或减毒处理后制成，用于激发人体免疫系统产生特异 性抗体，预防相应疾病的发生。
在疫苗研发过程中，疫原的纯度、免疫原性和安全性是至关 重要的因素，需要经过多次试验和验证，确保疫苗的有效性 和安全性。
抗血清在疾病治疗中的应用
抗血清是指通过免疫动物或人源化抗体技术制备的特异性抗体，可用于治疗或预 防某些疾病。
抗血清可用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病，通过与相应抗原 结合，发挥中和毒素、抑制病原体增殖、调节免疫等作用，从而达到治疗疾病的 目的。
基因工程技术
利用基因工程技术改良疫 原，提高其免疫原性，降 低生产成本。
细胞培养技术
通过细胞培养技术大规模 生产抗血清，提高产量， 降低生产成本。
纳米技术
纳米技术在疫原和抗血清 的传递、存储、稳定性提 高等方面有广泛应用前景 。
未来展望和研究方向
研发新型疫原
提取和纯化
从培养物中提取疫原， 并进行纯化，去除杂质
。
灭活和质量控制
通过物理或化学方法灭 活疫原，并进行质量检
测和控制。
疫原的质量控制
01
02
03
04
生物学试验
进行安全性和有效性试验，确 保疫原的质量和安全性。
理化分析
进行成分分析和纯度检测，确 保符合标准要求。
特异性检测
检测抗血清的特异性，即抗血 清是否只针对特定的抗原产生 反应，避免交叉反应。
稳定性检测
检测抗血清在储存和运输过程 中的稳定性，确保抗血清的质
量和有效性。
03
疫原和抗血清的应用
疫原在疫苗研发中的应用
疫原是疫苗研发的重要原料，通过将病原微生物或其组分经 过灭活或减毒处理后制成，用于激发人体免疫系统产生特异 性抗体，预防相应疾病的发生。
在疫苗研发过程中，疫原的纯度、免疫原性和安全性是至关 重要的因素，需要经过多次试验和验证，确保疫苗的有效性 和安全性。
抗血清在疾病治疗中的应用
抗血清是指通过免疫动物或人源化抗体技术制备的特异性抗体，可用于治疗或预 防某些疾病。
抗血清可用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病，通过与相应抗原 结合，发挥中和毒素、抑制病原体增殖、调节免疫等作用，从而达到治疗疾病的 目的。
基因工程技术
利用基因工程技术改良疫 原，提高其免疫原性，降 低生产成本。
细胞培养技术
通过细胞培养技术大规模 生产抗血清，提高产量， 降低生产成本。
纳米技术
纳米技术在疫原和抗血清 的传递、存储、稳定性提 高等方面有广泛应用前景 。
未来展望和研究方向
研发新型疫原
免疫原和抗血清的制备多媒体
免疫原与佐剂混合
动物免疫
将免疫原与适宜的佐剂混合，以增强免疫效 果。
将免疫原和佐剂混合物注射入动物体内，刺 激机体产生免疫反应。
细胞培养
抗血清提取
采集动物脾脏或淋巴结细胞，进行细胞培养 。
收集细胞培养过程中的细胞上清液或培养液 ，提取抗血清。
基于蛋白质纯化技术的免疫原和抗血清制备方案设计
免疫原与佐剂混合
免疫血清具有高效中和病毒、抑制病毒复制、防止病毒感染 的作用，同时具有高度特异性和稳定性。
免疫血清的制备方法
免疫原的制备
选择适合的抗原，免疫原的纯度和浓度都会影响抗体的产生。
免疫动物的接种
选择适合的动物进行接种，接种途径和剂量对抗体产生也有影响。
免疫细胞的筛选和培养
筛选出产生特异性抗体的细胞系，并进行培养扩增。
免疫原和抗血清的制备多媒体
xx年xx月xx日
目录
• 免疫原的制备 • 抗血清的制备 • 多媒体展示 • 相关技术介绍 • 实验方案设计 • 总结与展望
01
免疫原的制备
免疫原的性质
1 2 3
免疫原应为抗原
免疫原应为具有免疫原性的物质，可诱导机体 产生针对其的特异性抗体。
免疫原的免疫剂量
免疫原的免疫剂量对免疫效果会产生影响，合 适的免疫剂量能够诱导机体产生适量且有效的 抗体。
免疫原的免疫次数
为获得足够的免疫效果，常常需要多次免疫， 以增强和维持抗体水平。
免疫原的制备方法
原核表达系统
01
利用原核表达系统，如大肠杆菌表达系统，可高效表达基因工
程重组抗原。
真核表达系统
02
真核表达系统表达的抗原具有真核细胞的特性，其翻译后修饰
加工过程更接近天然抗原。
免疫原和抗血清的制备多媒体
采集的血液静置或离心，使血清自然 析出，去除纤维蛋白凝块，得到澄清 的血清。
抗血清纯化方法
盐析法
01
通过调整盐浓度，使抗原与抗体复合物沉淀，达到纯
化目的。
凝胶过滤法
02 利用凝胶孔径大小，使抗原与抗体复合物通过凝胶时
得以分离纯化。
亲和层析法
03
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过层析柱进行
纯化。
抗血清保存与使用
针对不同免疫原，制定合适的免疫方 案，包括免疫剂量、途径、次数和时 间间隔等。
严格控制实验条件
实验操作过程中应严格遵守操作规程 ，确保实验条件的稳定性和一致性。
加强抗血清保存和使用管理
抗血清的保存和使用条件对抗血清的 效价和稳定性至关重要，应建立严格 的抗血清管理制度。
06
未来发展趋势预测与展望
新技术新方法在制备中应用前景
抗原处理
对抗原进行纯度检测、结构鉴定 和活性测定，确保其符合制备要 求。
免疫佐剂应用
佐剂种类
选择适合的免疫佐剂，如弗氏佐剂、铝佐剂等，以增强抗原的免疫原性。
佐剂与抗原乳化
将佐剂与抗原按一定比例混合，并进行乳化处理，以确保佐剂与抗原充分结合 。
动物免疫方案
动物选择
选择适合的动物种类，如小鼠、大鼠、兔等，作 为免疫原制备的实验动物。
基因工程技术
利用基因工程技术制备具有特定抗原性的免疫原，提高抗体的特异 性和亲和力，是制备免疫原和抗血清的重要方向。
蛋白质组学技术
应用蛋白质组学技术研究抗原和抗体的相互作用，有助于发现新的 抗原和抗体，为制备免疫原和抗血清提供更多选择。
新型佐剂的应用
开发新型佐剂，提高免疫原的免疫原性和抗体的效价，是制备高效价 抗血清的关键。
抗血清纯化方法
盐析法
01
通过调整盐浓度，使抗原与抗体复合物沉淀，达到纯
化目的。
凝胶过滤法
02 利用凝胶孔径大小，使抗原与抗体复合物通过凝胶时
得以分离纯化。
亲和层析法
03
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过层析柱进行
纯化。
抗血清保存与使用
针对不同免疫原，制定合适的免疫方 案，包括免疫剂量、途径、次数和时 间间隔等。
严格控制实验条件
实验操作过程中应严格遵守操作规程 ，确保实验条件的稳定性和一致性。
加强抗血清保存和使用管理
抗血清的保存和使用条件对抗血清的 效价和稳定性至关重要，应建立严格 的抗血清管理制度。
06
未来发展趋势预测与展望
新技术新方法在制备中应用前景
抗原处理
对抗原进行纯度检测、结构鉴定 和活性测定，确保其符合制备要 求。
免疫佐剂应用
佐剂种类
选择适合的免疫佐剂，如弗氏佐剂、铝佐剂等，以增强抗原的免疫原性。
佐剂与抗原乳化
将佐剂与抗原按一定比例混合，并进行乳化处理，以确保佐剂与抗原充分结合 。
动物免疫方案
动物选择
选择适合的动物种类，如小鼠、大鼠、兔等，作 为免疫原制备的实验动物。
基因工程技术
利用基因工程技术制备具有特定抗原性的免疫原，提高抗体的特异 性和亲和力，是制备免疫原和抗血清的重要方向。
蛋白质组学技术
应用蛋白质组学技术研究抗原和抗体的相互作用，有助于发现新的 抗原和抗体，为制备免疫原和抗血清提供更多选择。
新型佐剂的应用
开发新型佐剂，提高免疫原的免疫原性和抗体的效价，是制备高效价 抗血清的关键。
免疫原和抗血清的制备
离子交换层析法： 利用蛋白质带电荷不同进行分离 离子交换剂（带有离子基团）：在惰性载体上引入带有 电荷的活性基团即离子交换剂 离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂 阳离子交换剂 — 带负电荷，与阳离子交换 阴离子交换剂 — 带正电荷，与阴离子交换
增加离子强度（增 加介导常数）或减 少pH(减少蛋白质电 荷），使蛋白质从 离子交换剂上解吸 附
6％～7％可沉淀IgM，8％～12％可沉淀IgG，12％～ 15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。最突
出的应用是用3％～4％的PEG沉淀免疫复合物，未结
合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速
测定比浊法和循环免疫复合物测定法。
层析法： 凝胶层析法：
利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质 进行分离
（二）可溶性抗原的纯化
超速离心法：根据抗原比重特点进行分离 差速离心法－低速和高速离心交替进行 适用用于分离大小差别较大的抗原：大分子抗原 （IgM(800kD)、C1q(410kD)),小分子抗原（载脂蛋白A28.3kD) 特点：方法较简单，但分辨率不高，沉淀系数在同一个数量 级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗 制品提取。 密度梯度离心法－区带离心法 离心时先将样品溶液臵于一个由梯度材料（蔗糖、甘油）形 成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于 梯度柱中 可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率
柱
二、抗血清的保存
2℃～8℃保存：短期保存
冰冻保存：保存5年
真空干燥保存：保存5～10年
多克隆抗体的实际意义： 预防：治疗感染性疾病（人工被动免疫）
如：破伤风抗毒素血清（副作用是超敏反应）
诊断：肥大氏反应（诊断伤寒、副伤寒）
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• 反复冷冻法：将细胞或整块组织置-20℃ 冰箱内冻结，然后置室温融化，如此反复 两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可 冻融破碎。
• 超声破碎法：利用超声波机械振动的原理 使细胞破碎。常用于处理微生物和组织的 细胞。
自溶法：利用组织和微生物的自身酶系统，在一 定PH和温度下，使其细胞裂解。
• 酶处理法：溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等， 在一定的条件下能消化细菌和组织细胞。
• 细胞抗原一般分为三个部分：膜蛋白抗原、 细胞质抗原（细胞器）和细胞核与核膜抗 原。
组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备： 反复冻融法－-20℃冻结，然后室温融化 超声破碎法－超声波（1～20kHz） 自溶法－自身酶系 酶处理法－溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶 表面活性剂处理法－SDS、去氧胆酸钠、 二乙基十六烷基溴
• 表面活性剂处理法：常用十二烷基硫酸钠等表 面活性剂处理。
（二）可溶性抗原的纯化
超速离心法： 差速离心法－低速和高速离心交替进行 密度梯度离心法－区带离心法
超速离心分离法
• 常用于分离亚细胞成分及大分子蛋白。
• 差速离心法：用于分离大小差异较大的抗 原颗粒
• 梯度密度离心法：区带分离法，通过梯度 密度离心，使各类分子量的颗粒分离。 （梯度柱）。
第三章 免疫原和抗血清的制备
第一节 免疫原的制备 一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化 三、半抗原性免疫原的制备
第二节 免疫佐剂 一、佐剂的种类 二、佐剂的作用机制
第三节 抗血清的制备 一、免疫动物的选择 二、免疫程序 三、动物采血法
第四节 抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定 二、抗血清的保存
合； ⑤有丰富的微孔，以增加结合容量。
最常用的支持物是Separose4B（琼脂糖珠）
(2)配体的选择条件： ①抗原或抗体必须单一特异性； ②抗原与抗体必须具有较高的亲和力； ③配体必须有一个适当的化学基团。
亲和层析
• 抗原或抗体与支持物的结合
• 将抗原或抗体结合到支持物上的方法达数 十种，可归纳为载体结合法、物理吸附法、 交联法和网络法。
颗粒性抗原－细胞、细菌、寄生虫 可溶性抗原－蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸
一、颗粒性抗原的制备
细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵
颗粒性抗原的制备
颗粒性抗原包括人和各种动物细胞抗原以及 各种细菌抗原和寄生虫体抗原。
• 细胞抗原：（绵羊红细胞）一般情况下经 生理盐水洗净，配制一定浓度的细胞悬液， 即可应用。
第五节 抗血清的纯化 一、特异性IgG抗体 二、单价特异性抗血清
思考题 小结
• 基本要求： • 掌握：免疫原、抗血清的制备过程。
• 掌握：抗血清的鉴定方法、抗血清的纯化 方法
第一节 免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体 或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏 淋巴细胞发生特异性反应的物质。
• 通过凝胶分子筛作用，大、中、 小三类分子彼此较易分开。
离子交换层析
• 离子交换层析是利用一些带电离子集团的 凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白 质抗原。
• 1、具有离子交换集团的纤维素。 • 2、具有离子交换集团的交联葡萄糖、琼脂
糖和聚丙烯酰胺。 • 3、被覆以离子化物质的细粉。 • 4、凝胶合成的高度交联树脂。
免疫原的制备
• 细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。
• 鞭毛抗原需用0．3%~0．5%的甲醛处理；菌体 抗原加温100℃2~2．5h去除鞭毛抗原；毒素抗原 则在杀菌后再加0．5%~1．0%氯化钙溶液等。
• 颗粒抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂 作皮内注射。
二、可溶性抗原的制备和纯化
• 蛋白质、糖蛋白、细菌毒素、酶、补体和 核酸都是良好的可溶性抗原。
• 这些蛋白质多为复杂的蛋白组成，免疫前 需进行纯化。
二、可溶性抗原的制备和纯化
（一）
组织细胞抗原的制备： 高速捣碎法－组织捣碎机捣碎 研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨
二、可溶性抗原的制备和纯化
• 高速组织捣碎机法： • 将组织加盐水装入捣碎机筒内，间断进行离心，
凝胶过滤法： 利用凝胶的分子质带电荷不同进行分离
离子交换剂： 离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂
凝胶过滤
• 分子筛层析，具有三维空间 多孔网状结构的物质。
• 将含多种分子量的样品溶液 缓慢流经凝胶柱时，各分子 在柱内进行两种不同运动， 垂直向下移动和无定向扩散运动。
选择性沉淀法： 核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋白、
链霉素 盐析法－硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮 聚合物沉淀法－聚乙二醇
选择沉淀法
• 采用各种沉淀剂或某些条件促使抗原成分 沉淀的方法。
• 核酸去除法：可采用氯化锰、硫酸鱼精蛋 白等核酸提取沉淀剂，而核糖核酸降解法 更简单（采用DNA或RNA酶）
亲和层析
• 是利用生物大分子的生物学特异性，即生 物分子间具有的专一性亲和力的层析技术。
• 在一定条件下，二者能紧密结合成复合物， 如将复合物的已知一方固定在固相载体上， 则可从溶液中专一性地分离和提纯另一方。
亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力 (1)亲和层析支持物的选择：
①非特异性吸附低； ②液体流速快； ③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定； ④有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结
• 有机溶剂沉淀法：使用的有机溶剂多为乙 醇或丙酮。
选择沉淀法
• 盐析沉淀法 经典的蛋白质纯化分离技术 抗原的初筛：用不同饱和度的硫酸钠或硫酸
铵使蛋白抗原进行初筛。 • 提取丙种球蛋白:（IgG95%以上）将
33%~50%饱和度硫酸胺沉淀物经去盐后 可直接用于抗体试剂。 • 抗原的浓缩：通过加入硫酸铵，将其沉淀 下来，以利于进一步纯化。
每次30到6 0分钟，时间过长会导致产热。
• 研磨法： • 用玻璃均浆器或乳钵研磨，经过旋转、压挤将
组织粉碎。 • 组织均浆液要离心沉淀，沉淀物组织和细胞碎
片，上清液为提取可溶性抗原的材料。
二、可溶性抗原的制备和纯化
• 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备
• 制备抗原的细胞包括正常的细胞、传代细 胞或肿瘤细胞。