3 第3章 免疫原和抗血清的制备多媒体
初级检验士考试讲义第三章免疫原和抗血清的制备
初级检验士考试讲义第三章免疫原和抗血清的制备免疫原和抗血清是免疫学和免疫检验研究中的重要概念。
免疫原是指能够诱导机体产生特异性免疫应答的物质，抗血清则是指免疫个体体液中含有特异性抗体的血清。
本文将介绍免疫原和抗血清的制备方法及其应用。
一、免疫原的制备免疫原的制备分为天然免疫原和人工合成免疫原两种方法。
天然免疫原一般是从病原微生物、细胞或组织中提取的物质，包括细胞壁、细胞器、蛋白质、多糖、核酸等。
人工合成免疫原则通过化学或生物技术手段合成类似于天然物质的分子结构，如多肽、人工合成的抗原表位等。
天然免疫原的制备需要先从源头获取样品，如从细菌培养物中分离出细胞壁或细胞膜，并用物理或化学方法脱除非免疫原的成分，得到纯净的免疫原。
有些免疫原需要通过培养细胞或组织得到，如病毒免疫原可以通过感染细胞培养物来获得。
此外，对于一些无法通过传统提取方法获取的免疫原，可以通过基因工程技术将其基因序列插入到表达宿主中，使其能够在宿主中大量表达。
人工合成免疫原的制备方法较为复杂，常用的包括固相合成和液相合成。
固相合成方法将氨基酸依次添加到固体载体上，并通过化学反应连接形成多肽链，进而得到所需的多肽免疫原。
液相合成则是将氨基酸加入反应溶液中，在适当条件下进行反应，经过一系列步骤得到多肽免疫原。
人工合成免疫原的优点是可以人为设计多肽序列，使得免疫原具有更好的抗原性和特异性。
抗血清的制备通常是将动物暴露于免疫原，促使其产生特异性抗体，然后收集动物体液中的抗体形成抗血清。
常用的动物包括小鼠、兔、猪等。
动物的免疫原既可以是天然免疫原，也可以是人工合成免疫原。
制备抗血清时，首先需要选择适当的免疫途径和免疫计划。
例如，对于小鼠和兔，多采用皮下或肌肉注射的方式给予免疫原，然后按照一定时间间隔加强免疫。
免疫原的剂量、接种时间和次数等因素都会影响抗体产生的效果，因此需要进行严格的监测和调整。
通常，在免疫完成后，可以通过采集动物体液，如血液、尿液等，将其离心分离，得到含有特异性抗体的血清。
免疫原和抗血清的制备PPT课件
（六）亲和层析
亲和层析是利用生物大分子的生物学特 异性，即生物分子间所具有的专一性亲 和力而设计的层析技术。例如抗原和抗 体、酶和酶抑制剂、酶蛋白和辅酶、 DNA 和 RNA 、激素和受体等 之间有特 殊的亲和力,在一定的条件下,二者能紧 密地结合成复合物。如果将复合物的已 知一 方固定在固相载体上,则可从溶液 中专一性地分离和提纯另一方。
上清液中含有 可溶性抗原
上清 1万—2万转/分，20到30分钟
沉淀
2. 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备
制备抗原的细胞包括正常细胞、传代细胞或 病理细胞 ( 如肿瘤细胞 )。
(1) 反复冻融法；(2) 超声破碎法；(3) 自溶 法；(4) 酶处理法；(5) 表面活性剂处理法。
( 二 ) 超速离心分离法
绵羊红细胞、细菌、毒素、寄生虫和真 菌抗原的制备
二、可溶性抗原的制备和纯化
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、细菌毒素、 酶、补体和核酸等都是良好的可溶性抗 原。
（一） 组织和细胞粗抗原的制备
1. 组织细胞抗原的制备所用组织必须是新鲜
的或低温保存的。
高速组织捣碎机
器官或者组织
处理
粉碎 研磨法
离心3000r/min，10分钟
一、佐剂的种类
1. 具有免疫原性的佐剂 如卡介苗、枯草 分支杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、 革兰阴性杆菌内毒素 ( 脂多糖 ) 和细胞 因子等。
2. 非免疫原性佐剂如氢氧化铝、磷酸铝、 磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、 藻酸钙、多聚核昔酸和胞壁肽等。
1. 福氏佐剂 (Freund adjuvant,FA) 是目 前动物免疫中最常应用的佐剂 , 可分为 福氏不完全佐剂 ( 石蜡油 + 羊毛脂 ) 和福氏完全佐剂 ( 石蜡油 + 羊毛脂 + 卡介苗 ) 两种 。
免疫原和抗血清的制备
第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
一、颗粒性抗原的制备细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。
细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。
细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。
颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。
二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和可溶性抗原的粗提蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。
1.组织匀浆的制备通常需要先将来源于人和动物的组织和细胞破碎，再经一定的方法纯化，才能获得所需的抗原。
细胞破碎方法有：（1）高速组织捣碎机法；（2）研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。
2.细胞的破碎除上述机械捣碎获取外，尚有酶处理法，常用胃蛋白酶或胰酶，可获得游离的单个细胞。
细胞抗原分膜蛋白抗原、细胞质抗原（主要为细胞器）、细胞核与核膜抗原，制备这些抗原前均需将细胞破碎，方法有：（1）反复冻融法：-20℃冷冻，30～37℃融化（2）超声破碎法（3）自溶法（4）酶处理法：胃蛋白酶或胰酶（5）表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠3.免疫球蛋白片段的制备五种免疫球蛋白都具抗原性，皆可提取及纯化，但如分解成片段（如Fab片段、Fc片段、轻链片段等）作为免疫原可制备出分辨力更高的特异性抗血清。
制备方法有：（1）非共价键解离法：改变pH环境或用变性剂（2）共价键解离法（3）溴化氰裂解法（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶.木瓜酶可将IgG裂解成2个Fab片段及1个Fc片段；胃蛋白酶可将IgG裂解成F（ab′）2个片段及数个小片段；胰蛋白酶可将IgG切成不规则的肽链。
（二）可溶性抗原的提纯和纯化1.超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。
第3章免疫原和抗血清的制备
第3章免疫原和抗血清的制备免疫原是指能够引起机体免疫反应并激发产生特异性抗体的物质。
抗血清是指动物或人体经过免疫后所产生的含有抗体的血清。
免疫原和抗血清的制备是研究免疫学和生物制剂开发的重要环节。
本文将探讨免疫原和抗血清制备的一般原则和步骤。
1.免疫原的选择选择合适的免疫原对于制备高效的抗血清至关重要。
一般来说，免疫原应具备以下特点：(1)纯度：免疫原应具有尽可能高的纯度，以避免其他成分对免疫反应的干扰。
(2)特异性：免疫原应具有与所需抗体特异性结合的能力，以激发特异性抗体的产生。
(3)免疫原性：免疫原应具有足够的免疫原性，即能够引起机体的免疫反应。
(4)安全性：免疫原应具备足够的安全性，避免潜在风险。
根据不同的应用需求，免疫原可以是多种类型的物质，如蛋白质、多肽、核酸和糖类等。
选择合适的免疫原需要根据研究目的和预期应用来确定。
2.免疫原的制备免疫原的制备通常分为化学合成和生物提取两种方式。
(1)化学合成：对于小分子的免疫原，可以通过化学合成的方法合成。
例如，对于多肽免疫原，可以设计并合成相应的多肽序列。
化学合成的优势在于可以精确控制免疫原的结构和纯度。
(2)生物提取：对于大分子的免疫原，如蛋白质和核酸，通常采用生物提取的方法。
蛋白质可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达并纯化得到。
核酸可以通过DNA重组技术合成。
3.免疫反应的诱导免疫反应的诱导是指向机体注射免疫原以激发免疫反应。
免疫反应的诱导通常包括以下步骤：(1)免疫原的给药：将免疫原通过注射、给药或吸入等方式引入机体内。
(2)辅助剂的使用：为了增强免疫反应效果，通常会添加辅助剂。
辅助剂可改变免疫原的物理性质和免疫反应的过程。
(3)免疫程序的设计：根据需求设计免疫程序，包括免疫原的剂量、注射间隔和免疫次数等。
抗血清的制备是通过免疫动物或人体以获得抗体，从而制备含有抗体的血清。
一般来说，抗血清的制备包括以下步骤：(1)免疫动物的选择：选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子或猴子等。
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验(2019)讲义第三章免疫原和抗血清的制备
第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
一、颗粒性抗原的制备细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。
细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。
细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。
颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。
二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和可溶性抗原的粗提蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。
1组.织匀浆的制备（1）高速组织捣碎机法；（2）研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。
2细.胞的破碎（）反复冻融法：℃冷冻，〜7融化。
（2）超声破碎法（3）自溶法（4）酶处理法：胃蛋白酶或胰酶。
（5）表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠。
3免.疫球蛋白片段的制备（）非共价键解离法：改变环境或用变性剂。
（2）共价键解离法：还原法或氧化法解离二硫键。
（3）溴化氰裂解法：溴化氰裂解蛋白质肽链。
（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。
（二）可溶性抗原的提纯和纯化超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。
选择性沉淀法：（1）核酸去除法：核糖核酸降解法更简便。
（2）盐析法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩。
（3）有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮。
（）聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物，如聚乙二醇（）G凝胶过滤法：根据分子大小进行分离纯化。
离子交换层析法：利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。
5亲.和层析法：与生物分子间不同的亲和性进行分离。
如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体等。
电泳法：蛋白质在同一环境中，分子量和电荷不同，在电场中迁移速率不同进行分离。
（三）纯化抗原的鉴定蛋白质含量测定：常用的是紫外光吸收法，该法测定和的吸光度（）值。
临床免疫学和免疫检验第三章免疫原和抗血清的制备讲义
临床免疫学和免疫检验第三章免疫原和抗血清的制备讲义第三章免疫原和抗血清的制备概述：免疫学的研究主要涉及到两个重要的组分：免疫原和抗血清。
免疫原是引发免疫反应的物质，抗血清则是由免疫反应产生的抗体。
制备免疫原和抗血清是研究免疫学的基础，也是开展临床免疫学和免疫检验的前提。
一、免疫原的制备1.病原体免疫原的制备（1）整活病原体的制备：将病原体培养至足够数量，收集后经过消毒杀菌处理，用于动物免疫或制备抗血清。
（2）灭活病原体的制备：将病原体培养至足够数量，用热、化学物质或辐射等方法使其失去活性，避免感染动物或人员，用于动物免疫或制备抗血清。
（3）病原体抗原的提取和纯化：通过培养病原体，收集其代谢产物，经过提取、纯化等步骤得到纯净的抗原物质。
2.细胞免疫原的制备（1）原代细胞制备：从动物或人体中采集组织或器官，通过细胞培养技术将细胞分离并进行传代，得到大量的细胞用于动物免疫或制备抗血清。
（2）细胞株制备：将细胞分离后，在适当的培养环境中进行无限传代，得到大量同源的细胞，用于动物免疫或制备抗血清。
（3）细胞裂解物制备：将细胞离心沉淀后，用适当的缓冲液裂解细胞释放细胞内的免疫原物质，进行纯化处理后得到制备的免疫原。
3.蛋白质免疫原的制备（1）从细胞裂解物中分离：将细胞裂解，经过离心等步骤得到细胞内的蛋白质物质，可以经过分子筛、电泳等技术得到纯净的蛋白质免疫原。
（2）基因工程蛋白质的制备：利用克隆技术将目标蛋白质的基因导入到表达系统中，通过大量表达和纯化，得到目标蛋白质。
二、抗血清的制备抗血清是由免疫原引发的免疫反应产生的抗体。
下面介绍几种常见的抗血清制备方法。
1.动物抗血清的制备选择适宜的动物（如小鼠、兔子、小鸡等），先注射免疫原，然后通过多次免疫，免疫记忆细胞对免疫原做出反应，最后采集动物血液得到抗血清。
2.单克隆抗体的制备将B细胞与病原体或免疫原细胞融合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞能够无限制地分裂，并能够产生单一抗体。
第三章免疫原和抗血清的制备-临床免疫学检验教案
临床免疫学检验教案
第次课授课时间：2007.9-12
第一节免疫原的制备
一、颗粒性抗原的制备
二、可溶性抗原的制备和纯化
三、半抗原性免疫原的制备
第二节免疫佐剂
一、佐剂的种类
二、佐剂的作用机制
第三节抗血清的制备
一、免疫动物的选择
二、免疫程序
三、动物采血法
第四节抗血清的鉴定和保存
一、抗血清的鉴定
二、抗血清的保存
第五节抗血清的纯化
一、特异性IgG抗体
二、单价特异性抗血清
简图简
表示意
图设问
讨论
讲解免疫原的制备20 min
讲解免疫佐剂20 min
讲解抗血清的制备20 min
讲解抗血清的鉴定和保存20 min
讲解抗血清的纯化20 min
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质颗粒性
抗原-细胞、细菌、寄生虫可溶性抗原一
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸
免疫佐剂(immunoadjuvant):预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗
原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物
质称为免疫佐剂，简称佐剂
(adjuvant )。
第3章免疫原和抗血清的制备
二、免疫程序
免疫原的剂量
中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 特异性要求高，应小量短程，可溶性抗原加用佐剂。对效价 要求高，则可大量长程加佐剂。
免疫间隔时间
第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天
免疫途径
皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结
一、特异性IgG抗体
盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：常结合盐析法 离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维 素 亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层 析柱
二、单价特异性抗血清
亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱 吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗
使包膜的渗透压改变而溶解。
优点是: 作用温和 适用于:破碎细菌、破碎细胞（提取核酸)
3、免疫球蛋白片段的制备： 非共价键解离法－改变pH 、利用强变 性剂 共价键解离法－氧化法和还原法 溴化氰裂解法 酶解法－木瓜酶 、胃蛋白酶
IgG片段的制备
1.酶裂解法：
IgG
木瓜酶
Fc+2Fab
Fc段可用于制备抗重链血清。
透析除去未反应
的半抗原
得人工免疫原 （半抗原+载体）
2.戊二醛法：
半抗 原氨 基
N-CH-(CH2)3-CH-N
载体 氨基
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与 抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原 的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质 称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。
小结
免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的 物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质， 与载体结合后可具有免疫原性。
临床免疫学和免疫检验第三章免疫原和抗血清的制备讲义
临床免疫学和免疫检验第三章免疫原和抗血清的制备讲
义
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第三章免疫原和抗血清的制备
一、引言
本章主要阐述了免疫原和抗血清的制备。
这包括定位免疫原的位点，构建分子免疫试剂，考察抗原特异性及抗血清的制备方法等。
首先要先了解免疫原的性质，以及它们的位点，只有位点的准确认定，才可以继而构建分子免疫试剂。
这些分子免疫试剂能够特异性检测抗原，而后经过合理的疫苗工艺，在动物体内形成抗血清，从而达到抗毒作用。
二、定位免疫原的位点
1.基因测序技术
基因测序技术（Sequencing Technolog）是用来鉴定染色体上不同物质或分子的一种技术，它可以帮助确定免疫原的精确位点。
如果综合应用多种鉴定技术，就可以更准确的定位免疫原的位点，并且可以有效筛选出慢性病毒感染病人的抗原性分子及其相关物质。
2.单克隆抗体。
初级检验技师临床免疫学和免疫检验第三章免疫原和抗血清的制备
初级检验技师临床免疫学和免疫检验第三章免疫原和抗
血清的制备
免疫原和抗血清的制备是临床免疫学和免疫检验中非常重要的一环。
免疫原是指引起机体免疫反应的物质，而抗血清是指从动物体内提取的具有特定抗原结合能力的血清。
制备免疫原和抗血清的目的是为了研究免疫学和进行免疫诊断。
一、免疫原的制备
1.天然免疫原的制备
2.人工合成免疫原的制备
人工合成免疫原是通过人工手段合成或改造蛋白质、多肽、核酸或多糖等，以模拟天然免疫原的结构和功能。
常用方法有化学合成、酶切、递归合成等。
1.抗原免疫动物的选择
在制备抗血清之前，首先需要选择合适的动物作为免疫对象。
常用的动物有小鼠、兔、大鼠等。
选择免疫动物时需要考虑其抗原性、稳定性以及生产抗血清的成本和效果等因素。
2.免疫程序
免疫程序分为原位免疫和外位免疫两种。
原位免疫是将免疫原直接注入动物体内，常见的方法有肌肉注射、皮下注射、腹腔注射等。
外位免疫是将免疫原注射到免疫动物前肢的足底或韧带等处，以提高免疫效果。
3.抗血清的采集和分离
免疫程序完成后，可以采集免疫动物的血清进行进一步处理。
采集血清时可以使用静脉置管或心脏穿刺等方法。
采集到的全血需要经过离心分离得到血清，然后经过过滤和冷藏等步骤进行保存。
4.抗血清的纯化
为了获得纯净的抗血清，需要对采集到的血清进行纯化处理。
常用的方法有硫酸铵沉淀、硫酸沉淀、亲和层析、凝胶过滤等。
通过这些方法，可以去除血清中的不想要的成分，得到高纯度的抗血清。
免疫原和抗血清的制备多媒体
免疫原与佐剂混合
动物免疫
将免疫原与适宜的佐剂混合，以增强免疫效 果。
将免疫原和佐剂混合物注射入动物体内，刺 激机体产生免疫反应。
细胞培养
抗血清提取
采集动物脾脏或淋巴结细胞，进行细胞培养 。
收集细胞培养过程中的细胞上清液或培养液 ，提取抗血清。
基于蛋白质纯化技术的免疫原和抗血清制备方案设计
免疫原与佐剂混合
免疫血清具有高效中和病毒、抑制病毒复制、防止病毒感染 的作用，同时具有高度特异性和稳定性。
免疫血清的制备方法
免疫原的制备
选择适合的抗原，免疫原的纯度和浓度都会影响抗体的产生。
免疫动物的接种
选择适合的动物进行接种，接种途径和剂量对抗体产生也有影响。
免疫细胞的筛选和培养
筛选出产生特异性抗体的细胞系，并进行培养扩增。
免疫原和抗血清的制备多媒体
xx年xx月xx日
目录
• 免疫原的制备 • 抗血清的制备 • 多媒体展示 • 相关技术介绍 • 实验方案设计 • 总结与展望
01
免疫原的制备
免疫原的性质
1 2 3
免疫原应为抗原
免疫原应为具有免疫原性的物质，可诱导机体 产生针对其的特异性抗体。
免疫原的免疫剂量
免疫原的免疫剂量对免疫效果会产生影响，合 适的免疫剂量能够诱导机体产生适量且有效的 抗体。
免疫原的免疫次数
为获得足够的免疫效果，常常需要多次免疫， 以增强和维持抗体水平。
免疫原的制备方法
原核表达系统
01
利用原核表达系统，如大肠杆菌表达系统，可高效表达基因工
程重组抗原。
真核表达系统
02
真核表达系统表达的抗原具有真核细胞的特性，其翻译后修饰
加工过程更接近天然抗原。
免疫原和抗血清的制备多媒体
抗血清纯化方法
盐析法
01
通过调整盐浓度，使抗原与抗体复合物沉淀，达到纯
化目的。
凝胶过滤法
02 利用凝胶孔径大小，使抗原与抗体复合物通过凝胶时
得以分离纯化。
亲和层析法
03
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过层析柱进行
纯化。
抗血清保存与使用
针对不同免疫原，制定合适的免疫方 案，包括免疫剂量、途径、次数和时 间间隔等。
严格控制实验条件
实验操作过程中应严格遵守操作规程 ，确保实验条件的稳定性和一致性。
加强抗血清保存和使用管理
抗血清的保存和使用条件对抗血清的 效价和稳定性至关重要，应建立严格 的抗血清管理制度。
06
未来发展趋势预测与展望
新技术新方法在制备中应用前景
抗原处理
对抗原进行纯度检测、结构鉴定 和活性测定，确保其符合制备要 求。
免疫佐剂应用
佐剂种类
选择适合的免疫佐剂，如弗氏佐剂、铝佐剂等，以增强抗原的免疫原性。
佐剂与抗原乳化
将佐剂与抗原按一定比例混合，并进行乳化处理，以确保佐剂与抗原充分结合 。
动物免疫方案
动物选择
选择适合的动物种类，如小鼠、大鼠、兔等，作 为免疫原制备的实验动物。
基因工程技术
利用基因工程技术制备具有特定抗原性的免疫原，提高抗体的特异 性和亲和力，是制备免疫原和抗血清的重要方向。
蛋白质组学技术
应用蛋白质组学技术研究抗原和抗体的相互作用，有助于发现新的 抗原和抗体，为制备免疫原和抗血清提供更多选择。
新型佐剂的应用
开发新型佐剂，提高免疫原的免疫原性和抗体的效价，是制备高效价 抗血清的关键。
免疫原和抗血清的制备
离子交换层析法： 利用蛋白质带电荷不同进行分离 离子交换剂（带有离子基团）：在惰性载体上引入带有 电荷的活性基团即离子交换剂 离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂 阳离子交换剂 — 带负电荷，与阳离子交换 阴离子交换剂 — 带正电荷，与阴离子交换
增加离子强度（增 加介导常数）或减 少pH(减少蛋白质电 荷），使蛋白质从 离子交换剂上解吸 附
6％～7％可沉淀IgM，8％～12％可沉淀IgG，12％～ 15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。最突
出的应用是用3％～4％的PEG沉淀免疫复合物，未结
合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速
测定比浊法和循环免疫复合物测定法。
层析法： 凝胶层析法：
利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质 进行分离
（二）可溶性抗原的纯化
超速离心法：根据抗原比重特点进行分离 差速离心法－低速和高速离心交替进行 适用用于分离大小差别较大的抗原：大分子抗原 （IgM(800kD)、C1q(410kD)),小分子抗原（载脂蛋白A28.3kD) 特点：方法较简单，但分辨率不高，沉淀系数在同一个数量 级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗 制品提取。 密度梯度离心法－区带离心法 离心时先将样品溶液臵于一个由梯度材料（蔗糖、甘油）形 成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于 梯度柱中 可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率
柱
二、抗血清的保存
2℃～8℃保存：短期保存
冰冻保存：保存5年
真空干燥保存：保存5～10年
多克隆抗体的实际意义： 预防：治疗感染性疾病（人工被动免疫）
如：破伤风抗毒素血清（副作用是超敏反应）
诊断：肥大氏反应（诊断伤寒、副伤寒）
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用于人体的佐剂:氢氧化铝,明矾, I:C,胞壁酰二肽, 用于人体的佐剂:氢氧化铝,明矾,poly I:C,胞壁酰二肽,细 胞因子, 胞因子,热休克蛋白 常用于动物实验的佐剂:弗氏佐剂(Freund's adjuvant) 常用于动物实验的佐剂:弗氏佐剂
弗氏佐剂(Freund,s adjuvant): 弗氏佐剂 : 弗氏完全佐剂- 弗氏完全佐剂-羊毛脂与液体石蜡的混合物 弗氏不完全佐剂- 弗氏不完全佐剂-弗氏完全佐剂加卡介苗
第三节 抗血清的制备
抗血清的制备是将制备好的免疫原按照 一定的免疫程序接种给所选择的动物, 一定的免疫程序接种给所选择的动物,该动 物在含有多种抗原表位的抗原刺激下, 物在含有多种抗原表位的抗原刺激下,体内 多个B 多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多 种不同表位的抗体, 种不同表位的抗体,其混合物为多克隆抗体
一,佐剂的种类
化合物:氢氧化铝,明矾,矿物油,吐温-80, 化合物:氢氧化铝,明矾,矿物油,吐温-80,弗氏不完全佐剂以及人 工合成的多聚肌苷酸: 胞苷酸(poly I:C),脂质体 工合成的多聚肌苷酸: 胞苷酸 : , 生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物,如卡介苗,短小棒状杆菌, 生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物,如卡介苗,短小棒状杆菌,百 日咳杆菌及CTB,LPS和类脂A 胞壁酰二肽等; 日咳杆菌及CTB,LPS和类脂A,胞壁酰二肽等;细胞因子及热休克蛋白 CTB 和类脂
(二)半抗原与载体的连接方法
①物理方法:利用通过电荷和微孔吸附半抗原 物理方法: 吸附的载体有CMC,PVP, 吸附的载体有CMC,PVP,硫酸葡聚糖等 CMC
②化学方法:利用某些功能基团将半抗原连接到载体上 化学方法: 带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原: 带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原:碳二亚胺法 戊二醛法 混和酸酐法 过碘酸氧化法 不带氨基和羧基的半抗原: 不带氨基和羧基的半抗原:用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羧 基的衍生物, 基的衍生物,再与载体连接
二,抗血清的保存
2℃～8℃保存 保存: 2℃～8℃保存:短期保存 冰冻保存:保存5 冰冻保存:保存5年 真空干燥保存:保存5 10年 真空干燥保存:保存5～10年
第五节 抗血清的纯化
抗原免疫动物制备的抗血清是成分复 杂的混合物,除含有特异性抗体外,还存 杂的混合物,除含有特异性抗体外, 在与目的抗体不相关的成分. 在与目的抗体不相关的成分.纯化目的是 除去这些不相关成分, 除去这些不相关成分,防止抗血清中其他 杂抗体干扰试验结果. 杂抗体干扰试验结果.
多克隆抗体(polyclonal 多克隆抗体 antibody,pcAb):天然抗 : 原刺激多种B 原刺激多种B淋巴细胞克 隆产生的多种抗体的混合 物
多克隆抗体的产生示意图
一,免疫动物的选择
抗原来源与动物种属的关系
种属差异越远,免疫原性越强 种属差异越远,
动物个体的选择
适龄,健康, 适龄,健康,体重符合要求
(2)配体的选择条件: (2)配体的选择条件: 配体的选择条件 抗原或抗体必须单一特异性; ①抗原或抗体必须单一特异性; ②抗原与抗体必须具有较高的亲和力; 抗原与抗体必须具有较高的亲和力; 配体必须有一个适当的化学基团. ③配体必须有一个适当的化学基团.
(3)抗原或抗体与支持物的结合: (3)抗原或抗体与支持物的结合: 抗原或抗体与支持物的结合 活化:溴化氰; ①活化:溴化氰; 手臂" 手臂" ②接"手臂":带"手臂"琼脂糖有氨 基琼脂糖,羧基琼脂糖,溴乙酰琼脂糖, 基琼脂糖,羧基琼脂糖,溴乙酰琼脂糖, 重氮盐衍生物琼脂糖,疏基琼脂糖. 重氮盐衍生物琼脂糖,疏基琼脂糖.
一,特异性IgG抗体 特异性 抗体
盐析法:硫酸铵盐析法, 盐析法:硫酸铵盐析法,硫酸钠盐析法 凝胶过滤法: 凝胶过滤法:常结合盐析法 离子交换层析法: 纤维素, 离子交换层析法:DEAE纤维素,QAE-sephadex,QAE纤 纤维素 , 纤 维素 亲和层析法:纯化抗原或 交联Sepharose 4B制成亲和层 亲和层析法:纯化抗原或SPA交联 交联 制成亲和层 析柱
二,可溶性抗原的制备和纯化
(一)可溶性抗原的制备
组织细胞抗原的制备: 组织细胞抗原的制备: 高速捣碎法- 高速捣碎法-组织捣碎机捣碎 研磨法-用玻璃匀浆器或乳钵研磨 研磨法-
组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备: 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备: 反复冻融法- ℃冻结, 反复冻融法--20℃冻结,然后室温融化 超声破碎法-超声波(1～20kHz) 超声破碎法-超声波( ～ ) 自溶法- 自溶法-自身酶系 酶处理法-溶菌酶,纤维素酶, 酶处理法-溶菌酶,纤维素酶,蜗牛酶 表面活性剂处理法- 表面活性剂处理法-SDS,去氧胆酸钠, ,去氧胆酸钠, 二乙基十六烷基溴
二,单价特异性抗血清
亲和层析法:杂抗原交联 亲和层析法:杂抗原交联Sepharose 4B柱 柱 吸附剂方法: 吸附剂方法:借助双功能试剂用不含特异抗原的抗 原混合液制成固相吸附剂
思考题
1.什么是免疫原? 什么是免疫原? 如何制备可溶性抗原? 2.如何制备可溶性抗原? 常用的细胞破碎方法有哪些? 3.常用的细胞破碎方法有哪些? 连接半抗原的载体有哪些? 4.连接半抗原的载体有哪些?制备半抗原性免疫原的方 法有哪些? 法有哪些? 纯化抗原的鉴定包括有哪些内容? 5.纯化抗原的鉴定包括有哪些内容? 什么是免疫佐剂?免疫佐剂有哪些种类? 6.什么是免疫佐剂?免疫佐剂有哪些种类?免疫佐剂的 作用机制有哪些? 作用机制有哪些? 什么是抗血清?什么是多克隆抗体? 7.什么是抗血清?什么是多克隆抗体? 如何制备抗血清? 8.如何制备抗血清? 动物采血有哪些方法? 9.动物采血有哪些方法? 10.抗血清的鉴定包括哪些内容? 10.抗血清的鉴定包括哪些内容?
第三章 免疫原和抗血清的制备
第一节 免疫原的制备 一,颗粒性抗原的制备 二,可溶性抗原的制备和纯化 三,半抗原性免疫原的制备 第二节 免疫佐剂 一,佐剂的种类 二,佐剂的作用机制 第三节 抗血清的制备 一,免疫动物的选择 二,免疫程序 三,动物采血法
第四节 抗血清的鉴定和保存 一,抗血清的鉴定 二,抗血清的保存 第五节 抗血清的纯化 特异性IgG IgG抗体 一,特异性IgG抗体 二,单价特异性抗血清 思考题 小结
三,动物采血法
颈动脉采血法:家兔,绵羊, 颈动脉采血法:家兔,绵羊,山羊 心脏采血法: 家兔,豚鼠,大鼠, 心脏采血法: 家兔,豚鼠,大鼠,鸡 静脉采血法: 家兔,山羊, 静脉采血法: 家兔,山羊,绵羊
第四节 抗血清的鉴定和保存
一,抗血清的鉴定
抗体特异性的鉴定: 抗体特异性的鉴定:双向免疫扩散法 抗体效价的鉴定: 双向免疫扩散试验, 抗体效价的鉴定:凝集试验 ,双向免疫扩散试验,ELISA 抗体纯度的鉴定:SDS双向免疫扩散试验, 抗体纯度的鉴定:SDS-PAGE ,双向免疫扩散试验,免疫电泳 抗体亲合力的鉴定:平衡透析法,ELISA,RIA竞争结合试验 抗体亲合力的鉴定:平衡透析法,ELISA,RIA竞争结合试验
乳化方法: 乳化方法: 研磨法和搅拌混合法
二,佐剂的作用机制
改变抗原物理性状,延缓其降解和排除, 改变抗原物理性状,延缓其降解和排除,更有效刺激免疫系 统. 刺激单核-吞噬细胞系统,增强其处理和提呈抗原的能力. 刺激单核-吞噬细胞系统,增强其处理和提呈抗原的能力. 刺激淋巴细胞增殖和分化. 刺激淋巴细胞增殖和分化.
免疫球蛋白片段的制备: 免疫球蛋白片段的制备: 非共价键解离法-改变pH 非共价键解离法-改变pH ,利用强变 性剂 共价键解离法-氧化法和还原法 共价键解离法- 溴化氰裂解法 酶解法- 酶解法-木瓜酶 ,胃蛋白酶
(二)可溶性抗原的纯化
超速离心法: 超速离心法: 差速离心法 差速离心法-低速和高速离心交替进行 密度梯度离心法- 密度梯度离心法-区带离心法
第一节 免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体 是能诱导机体产生抗体 免疫原 并能与抗体发生反应的物质 颗粒性抗原-细胞,细菌, 颗粒性抗原-细胞,细菌,寄生虫 可溶性抗原-蛋白质,糖蛋白,脂蛋白, 可溶性抗原-蛋白质,糖蛋白,脂蛋白,核酸
一,颗粒性抗原的制备
细胞抗原: 细胞抗原:绵羊红细胞 细菌抗原:菌体抗原, 细菌抗原:菌体抗原,鞭毛抗原 寄生虫体抗原: 寄生虫体抗原:虫卵
抗原的性质
二,免疫程序
免疫原的剂量
中间剂量范围内, 中间剂量范围内,免疫原剂量增加可获得高效价抗体
免疫间隔时间
第一次和第二次间隔10～20天 三次及以后间隔7 10天 第一次和第二次间隔10～20天,三次及以后间隔7～10天 10
免疫途径
皮内,皮下,肌肉,静脉,腹腔, 皮内,皮下,肌肉,静脉,腹腔,淋巴结
(4)亲和层析条件的选择: (4)亲和层析条件的选择: 亲和层析条件的选择 封闭活性基团: ①封闭活性基团:用无关蛋白质或三乙醇胺 过柱; 过柱; ②除去未结合和结合不牢的蛋白:先用 除去未结合和结合不牢的蛋白: 洗脱,再用解脱剂处理; NaHCO3洗脱,再用解脱剂处理; 解脱剂: 硫氰酸钾(或钠), ),0.1mol/L 解脱剂:3mol/L 硫氰酸钾(或钠),0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液 pH2.4甘氨酸缓冲液
(三)半抗原性免疫原的鉴定
一个载体分子至少要连接20个以上的半抗原分子 一个载体分子至少要连接20个以上的半抗原分子 20
半抗原与载体的比例测定: 半抗原与载体的比例测定: 吸收光谱分析法 放射性核素标记半抗原渗入法
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂( 免疫佐剂(immunoadjuvant):预先或与 ) 抗原同时注入体内, 抗原同时注入体内,可增强机体对该抗原 的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质 称为免疫佐剂,简称佐剂( 称为免疫佐剂,简称佐剂(adjuvant). ).