3 第3章 免疫原和抗血清的制备多媒体

抗原的性质
二,免疫程序
免疫原的剂量
中间剂量范围内, 中间剂量范围内,免疫原剂量增加可获得高效价抗体
免疫间隔时间
第一次和第二次间隔10～20天 三次及以后间隔7 10天 第一次和第二次间隔10～20天,三次及以后间隔7～10天 10
免疫途径
皮内,皮ห้องสมุดไป่ตู้,肌肉,静脉,腹腔, 皮内,皮下,肌肉,静脉,腹腔,淋巴结
乳化方法: 乳化方法: 研磨法和搅拌混合法
二,佐剂的作用机制
改变抗原物理性状,延缓其降解和排除, 改变抗原物理性状,延缓其降解和排除,更有效刺激免疫系 统. 刺激单核-吞噬细胞系统,增强其处理和提呈抗原的能力. 刺激单核-吞噬细胞系统,增强其处理和提呈抗原的能力. 刺激淋巴细胞增殖和分化. 刺激淋巴细胞增殖和分化.
(三)半抗原性免疫原的鉴定
一个载体分子至少要连接20个以上的半抗原分子 一个载体分子至少要连接20个以上的半抗原分子 20
半抗原与载体的比例测定: 半抗原与载体的比例测定: 吸收光谱分析法 放射性核素标记半抗原渗入法
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂( 免疫佐剂(immunoadjuvant):预先或与 ) 抗原同时注入体内, 抗原同时注入体内,可增强机体对该抗原 的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质 称为免疫佐剂,简称佐剂( 称为免疫佐剂,简称佐剂(adjuvant). ).
二,可溶性抗原的制备和纯化
(一)可溶性抗原的制备
组织细胞抗原的制备: 组织细胞抗原的制备: 高速捣碎法- 高速捣碎法-组织捣碎机捣碎 研磨法-用玻璃匀浆器或乳钵研磨 研磨法-
组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备: 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备: 反复冻融法- ℃冻结, 反复冻融法--20℃冻结,然后室温融化 超声破碎法-超声波(1～20kHz) 超声破碎法-超声波( ～ ) 自溶法- 自溶法-自身酶系 酶处理法-溶菌酶,纤维素酶, 酶处理法-溶菌酶,纤维素酶,蜗牛酶 表面活性剂处理法- 表面活性剂处理法-SDS,去氧胆酸钠, ,去氧胆酸钠, 二乙基十六烷基溴
一,佐剂的种类
化合物:氢氧化铝,明矾,矿物油,吐温-80, 化合物:氢氧化铝,明矾,矿物油,吐温-80,弗氏不完全佐剂以及人 工合成的多聚肌苷酸: 胞苷酸(poly I:C),脂质体 工合成的多聚肌苷酸: 胞苷酸 : , 生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物,如卡介苗,短小棒状杆菌, 生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物,如卡介苗,短小棒状杆菌,百 日咳杆菌及CTB,LPS和类脂A 胞壁酰二肽等; 日咳杆菌及CTB,LPS和类脂A,胞壁酰二肽等;细胞因子及热休克蛋白 CTB 和类脂
选择性沉淀法: 选择性沉淀法: 核酸去除法-氯化锰,硫酸鱼精蛋, 核酸去除法-氯化锰,硫酸鱼精蛋, 链霉素 盐析法-硫酸铵, 盐析法-硫酸铵,硫酸钠 有机溶剂沉淀法-乙醇, 有机溶剂沉淀法-乙醇,丙酮 聚合物沉淀法- 聚合物沉淀法-聚乙二醇
凝胶过滤法: 凝胶过滤法: 利用凝胶的分子筛作用, 利用凝胶的分子筛作用,对分子量不同的蛋白质 进行分离
三,动物采血法
颈动脉采血法:家兔,绵羊, 颈动脉采血法:家兔,绵羊,山羊 心脏采血法: 家兔,豚鼠,大鼠, 心脏采血法: 家兔,豚鼠,大鼠,鸡 静脉采血法: 家兔,山羊, 静脉采血法: 家兔,山羊,绵羊
第四节 抗血清的鉴定和保存
一,抗血清的鉴定
抗体特异性的鉴定: 抗体特异性的鉴定:双向免疫扩散法 抗体效价的鉴定: 双向免疫扩散试验, 抗体效价的鉴定:凝集试验 ,双向免疫扩散试验,ELISA 抗体纯度的鉴定:SDS双向免疫扩散试验, 抗体纯度的鉴定:SDS-PAGE ,双向免疫扩散试验,免疫电泳 抗体亲合力的鉴定:平衡透析法,ELISA,RIA竞争结合试验 抗体亲合力的鉴定:平衡透析法,ELISA,RIA竞争结合试验
二,抗血清的保存
2℃～8℃保存 保存: 2℃～8℃保存:短期保存 冰冻保存:保存5 冰冻保存:保存5年 真空干燥保存:保存5 10年 真空干燥保存:保存5～10年
第五节 抗血清的纯化
抗原免疫动物制备的抗血清是成分复 杂的混合物,除含有特异性抗体外,还存 杂的混合物,除含有特异性抗体外, 在与目的抗体不相关的成分. 在与目的抗体不相关的成分.纯化目的是 除去这些不相关成分, 除去这些不相关成分,防止抗血清中其他 杂抗体干扰试验结果. 杂抗体干扰试验结果.
第一节 免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体 是能诱导机体产生抗体 免疫原 并能与抗体发生反应的物质 颗粒性抗原-细胞,细菌, 颗粒性抗原-细胞,细菌,寄生虫 可溶性抗原-蛋白质,糖蛋白,脂蛋白, 可溶性抗原-蛋白质,糖蛋白,脂蛋白,核酸
一,颗粒性抗原的制备
细胞抗原: 细胞抗原:绵羊红细胞 细菌抗原:菌体抗原, 细菌抗原:菌体抗原,鞭毛抗原 寄生虫体抗原: 寄生虫体抗原:虫卵
第三节 抗血清的制备
抗血清的制备是将制备好的免疫原按照 一定的免疫程序接种给所选择的动物, 一定的免疫程序接种给所选择的动物,该动 物在含有多种抗原表位的抗原刺激下, 物在含有多种抗原表位的抗原刺激下,体内 多个B 多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多 种不同表位的抗体, 种不同表位的抗体,其混合物为多克隆抗体
二,单价特异性抗血清
亲和层析法:杂抗原交联 亲和层析法:杂抗原交联Sepharose 4B柱 柱 吸附剂方法: 吸附剂方法:借助双功能试剂用不含特异抗原的抗 原混合液制成固相吸附剂
思考题
1.什么是免疫原? 什么是免疫原? 如何制备可溶性抗原? 2.如何制备可溶性抗原? 常用的细胞破碎方法有哪些? 3.常用的细胞破碎方法有哪些? 连接半抗原的载体有哪些? 4.连接半抗原的载体有哪些?制备半抗原性免疫原的方 法有哪些? 法有哪些? 纯化抗原的鉴定包括有哪些内容? 5.纯化抗原的鉴定包括有哪些内容? 什么是免疫佐剂?免疫佐剂有哪些种类? 6.什么是免疫佐剂?免疫佐剂有哪些种类?免疫佐剂的 作用机制有哪些? 作用机制有哪些? 什么是抗血清?什么是多克隆抗体? 7.什么是抗血清?什么是多克隆抗体? 如何制备抗血清? 8.如何制备抗血清? 动物采血有哪些方法? 9.动物采血有哪些方法? 10.抗血清的鉴定包括哪些内容? 10.抗血清的鉴定包括哪些内容?
(4)亲和层析条件的选择: (4)亲和层析条件的选择: 亲和层析条件的选择 封闭活性基团: ①封闭活性基团:用无关蛋白质或三乙醇胺 过柱; 过柱; ②除去未结合和结合不牢的蛋白:先用 除去未结合和结合不牢的蛋白: 洗脱,再用解脱剂处理; NaHCO3洗脱,再用解脱剂处理; 解脱剂: 硫氰酸钾(或钠), ),0.1mol/L 解脱剂:3mol/L 硫氰酸钾(或钠),0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液 pH2.4甘氨酸缓冲液
三,半抗原性免疫原的制备
半抗原(hapten):仅有抗原性而无免疫原性 : 半抗原 的物质如多肽,甾体激素,核苷, 的物质如多肽,甾体激素,核苷,某些药物等
载体(carrier):赋予半抗原以免疫原性的物质 : 载体
(一)载体
蛋白质:牛血清白蛋白,人血清白蛋白, ①蛋白质:牛血清白蛋白,人血清白蛋白,兔血清白蛋白 牛甲状腺球蛋白 血蓝蛋白 多肽聚合物:多聚赖氨酸( ②多肽聚合物:多聚赖氨酸(polylysine) ) 大分子聚合物:羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose, CMC) ③大分子聚合物:羧甲基纤维素 聚乙烯吡咯烷酮( 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP) )
(二)半抗原与载体的连接方法
①物理方法:利用通过电荷和微孔吸附半抗原 物理方法: 吸附的载体有CMC,PVP, 吸附的载体有CMC,PVP,硫酸葡聚糖等 CMC
②化学方法:利用某些功能基团将半抗原连接到载体上 化学方法: 带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原: 带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原:碳二亚胺法 戊二醛法 混和酸酐法 过碘酸氧化法 不带氨基和羧基的半抗原: 不带氨基和羧基的半抗原:用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羧 基的衍生物, 基的衍生物,再与载体连接
免疫球蛋白片段的制备: 免疫球蛋白片段的制备: 非共价键解离法-改变pH 非共价键解离法-改变pH ,利用强变 性剂 共价键解离法-氧化法和还原法 共价键解离法- 溴化氰裂解法 酶解法- 酶解法-木瓜酶 ,胃蛋白酶
(二)可溶性抗原的纯化
超速离心法: 超速离心法: 差速离心法- 差速离心法-低速和高速离心交替进行 密度梯度离心法- 密度梯度离心法-区带离心法
多克隆抗体(polyclonal 多克隆抗体 antibody,pcAb):天然抗 : 原刺激多种B 原刺激多种B淋巴细胞克 隆产生的多种抗体的混合 物
多克隆抗体的产生示意图
一,免疫动物的选择
抗原来源与动物种属的关系
种属差异越远,免疫原性越强 种属差异越远,
动物个体的选择
适龄,健康, 适龄,健康,体重符合要求
第三章 免疫原和抗血清的制备
第一节 免疫原的制备 一,颗粒性抗原的制备 二,可溶性抗原的制备和纯化 三,半抗原性免疫原的制备 第二节 免疫佐剂 一,佐剂的种类 二,佐剂的作用机制 第三节 抗血清的制备 一,免疫动物的选择 二,免疫程序 三,动物采血法
第四节 抗血清的鉴定和保存 一,抗血清的鉴定 二,抗血清的保存 第五节 抗血清的纯化 特异性IgG IgG抗体 一,特异性IgG抗体 二,单价特异性抗血清 思考题 小结
离子交换层析法: 离子交换层析法: 利用蛋白质带电荷不同进行分离 离子交换剂: 离子交换剂: 离子交换纤维素,离子交换凝胶, 离子交换纤维素,离子交换凝胶,离子交换树脂
亲和层析法: 亲和层析法:利用生物大分子之间具有的专一性亲和力 (1)亲和层析支持物的选择: (1)亲和层析支持物的选择: 亲和层析支持物的选择 ①非特异性吸附低; 非特异性吸附低; ②液体流速快; 液体流速快; ③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定; 在各种pH和高浓度盐溶液中稳定; pH和高浓度盐溶液中稳定 ④有合适丰富的化学基团,与蛋白质或其它化合物结 有合适丰富的化学基团, 合; ⑤有丰富的微孔,以增加结合容量. 有丰富的微孔,以增加结合容量. 最常用的支持物是Separose4B 最常用的支持物是Separose4B
用于人体的佐剂:氢氧化铝,明矾, I:C,胞壁酰二肽, 用于人体的佐剂:氢氧化铝,明矾,poly I:C,胞壁酰二肽,细 胞因子, 胞因子,热休克蛋白 常用于动物实验的佐剂:弗氏佐剂(Freund's adjuvant) 常用于动物实验的佐剂:弗氏佐剂
弗氏佐剂(Freund,s adjuvant): 弗氏佐剂 : 弗氏完全佐剂- 弗氏完全佐剂-羊毛脂与液体石蜡的混合物 弗氏不完全佐剂- 弗氏不完全佐剂-弗氏完全佐剂加卡介苗
一,特异性IgG抗体 特异性 抗体
盐析法:硫酸铵盐析法, 盐析法:硫酸铵盐析法,硫酸钠盐析法 凝胶过滤法: 凝胶过滤法:常结合盐析法 离子交换层析法: 纤维素, 离子交换层析法:DEAE纤维素,QAE-sephadex,QAE纤 纤维素 , 纤 维素 亲和层析法:纯化抗原或 交联Sepharose 4B制成亲和层 亲和层析法:纯化抗原或SPA交联 交联 制成亲和层 析柱
电泳法: 电泳法: 利用分子量和电荷量不同进行分离
(三)纯化抗原的鉴定
蛋白含量测定:紫外吸收法,双缩脲法, 蛋白含量测定:紫外吸收法,双缩脲法,酚试剂法 分子量测定:SDS-PAGE,凝胶过滤 分子量测定:SDS-PAGE, 纯度鉴定:醋酸纤维膜电泳,SDS-PAGE, 纯度鉴定:醋酸纤维膜电泳,SDS-PAGE,毛细管电 泳,等电聚焦,高效液相层析 等电聚焦, 免疫活性鉴定:双向免疫扩散,免疫电泳, 免疫活性鉴定:双向免疫扩散,免疫电泳,ELISA
(2)配体的选择条件: (2)配体的选择条件: 配体的选择条件 抗原或抗体必须单一特异性; ①抗原或抗体必须单一特异性; ②抗原与抗体必须具有较高的亲和力; 抗原与抗体必须具有较高的亲和力; 配体必须有一个适当的化学基团. ③配体必须有一个适当的化学基团.
(3)抗原或抗体与支持物的结合: (3)抗原或抗体与支持物的结合: 抗原或抗体与支持物的结合 活化:溴化氰; ①活化:溴化氰; 手臂" 手臂" ②接"手臂":带"手臂"琼脂糖有氨 基琼脂糖,羧基琼脂糖,溴乙酰琼脂糖, 基琼脂糖,羧基琼脂糖,溴乙酰琼脂糖, 重氮盐衍生物琼脂糖,疏基琼脂糖. 重氮盐衍生物琼脂糖,疏基琼脂糖.