实例分析分子生物学技术的应用

IFN-β+ MEZ
生长阻滞 终末分化 失去致瘤潜能
HO-1
杂交产物的 克隆、筛选 和测序
HO-1
Biotin-21-UTP
消减杂 交探针
除去 杂交体、 过量探针、 盐和小片段
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7
Cancer Biol Ther 2003;2:S23–S37
2.提交序列
NCBI/Genbank
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NCI-H1299
day
Ad.IL-24 supernatant
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23
Mol Ther. 2004;9(3):355-67
WB
分泌作用的抑制剂
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24
Mol Ther. 2004;9(3):355-67
二硫键
C
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糖基化位点
25
Cytokine Growth Factor Rev 2003;14:35–51
IFC 7.细胞内定位
Columbia Uni
mda(melanoma differentiation associated gene)
mda-5，mda-6 (p21)，mda-7/IL-24，mda-9/syntenin
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Oncogene 1995, 11: 2477-26486 Cancer Biol Ther 2003;2:S23–S37
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Biblioteka Baidu
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5.基因的表达调控 转录水平
基因组文库 IL-24cDNA探针
PCR 测序
启动子：GCG 启动子搜索 转录起始位点：引物延伸和作图
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J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46
启动子序列
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AP-1: PKC-activated TF C/EBP: growth arrest and
6. 翻译后修饰
Overexpression, WB
L SN
PNGase F: endoglycanase F endo-O: 内-O糖苷酶
glycopeptidase F
MDA-7/IL-24蛋白可被糖基化修饰
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Mol Ther. 2004;9(3):355-6726 J Biol Chem. 2002;277(9):7341-7
Luciferase assay system
ARE： AU-rich elements
3’-UTR的ARE调节该基因在终末分化过程中的mRNA水平
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22
Oncogene. 2000;19(10):1362-8
7.分泌蛋白
Overexpression, WB
Ad.IL-24 cell lysate
生物化学与分子生物学实验技术
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1
课程安排：32学时 讲课：三次(1117, 1124, 1201) 实验：四个/四组？/加样器？/时间？
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2
实例分析 分子生物学技术的应用
-------以interleukin 24为例
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3
内容
一、基因的基本信息：发现、序列、染色体定位、表达调
terminal differentiation associated TF
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J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46
转录起始前复合物：真核生物RNA聚合酶不与DNA分子直 接结合，而需依靠众多的转录因子。
RNA pol II
转录前起始复合物
TBP TAF T F II F
控、同源性分子、修饰、降解、细胞内定位、空间结构等
等 二、基因功能研究
1.mRNA水平和蛋白质水平表达谱
2.体外生物学活性：细胞模型，调节表达水平
细胞活力、细胞增殖、细胞周期、抑瘤活性、等等
3.体内生物学活性：抑瘤活性、成血管活性、等等 三、作用机制：信号转导途径和相互作用分子
四、应用
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4
235 documents
IF 5.97
7.5 7.2 2.76 5.0 3.0
6 9.38
4.3
5.52
1.3 4.1
5.25
6.48
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5
一、mda-7/IL-24
1.发现
Subtraction hybridization
β-干扰素＋密执霉素(mezerein)
人黑色素瘤细胞HO-1 消减杂交
Paul B. Fisher
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9
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10
3.染色体定位
Data base analysis
IL-10 Family
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Cyto Growth Factor Rev. 2003, 14: 35–51
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Mol Med. 2001;7(4):271-282
4.与IL-24同源的分子
NCBI Blast, KEGG
Luciferase assay system
重要区域
NdeI-NheI是启动子转录活性的重要区域，C/EBP-b和cJUN/AP-1提高转录活性。
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J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46
cell lysates
nuclear lysates
EMSA
arrow 1：C/EBP-b arrow 2：AP-1
一致的 (*) 保守的 (:) 相似的 (.)
基因 物种 其他名称
氨基酸序列同源性
MDA-7 Mob-5 FISP
hIL-24 Human MDA-7
100% 68% 69%
rIL-24 Rat
MOB-5, C49A 68%
mIL-24 Mouse FISP
69%
100% 93% 93% 100%
精选ppCt ytokine Growth Factor Rev. 2003;14:1335–51 Immunology. 2005;114(2):166-70
C/EBP-b和cJUN/AP-1结合在mda-7/IL-24启动子上。
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J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46
IFN-β和MEZ单独或联合处理 不能显著改变启动子活性
Luciferase assay system, NB
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Oncogene. 2000;19(10):1362-8
T F II E
T F II A
TA T FB IT I A
TF II H
DN
拼板理论：一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。 转录因子之间互相结合，生成有活性和专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有 针对性地结合、转录相应的基因。
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RNA聚合酶保护法
分析启动子结构
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