生化实验实验三-蛋白质颜色反应及沉淀反应

实验三蛋白质颜色反应及沉淀反应

一、目的

1、掌握鉴定蛋白质的原理及方法。

2、熟悉蛋白质的沉淀反应。

3、进一步掌握蛋白质的有关性质。

二、原理

蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸种类不同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同的颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物质是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。

多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定性被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。

三、实验器材

1、鸡蛋白

2、试管

3、吸管

4、滴管

5、水浴锅等

四、实验试剂

1、卵清蛋白液：将鸡蛋白用蒸馏水稀释20-40倍，2-3层纱布过滤，滤液冷藏备用。

2、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100ml。

3、10%氢氧化钠溶液：10g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至100ml。

4、浓硝酸：比重1.42。

5、1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水，稀释至100ml。

6、饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml加硫酸铵至饱和。

7、95%乙醇。

8、结晶氯化钠。

9、1%醋酸铅：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。

10、饱和苦味酸溶液。

11、1%醋酸溶液：冰醋酸1ml用蒸馏水稀释至100ml。

五、操作

1、颜色反应：

A、双缩脲反应：蛋白质分子中含有肽键，与两分子尿素经过加热形成的双缩脲的结构相似，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物。

取一支试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。

B、黄色反应：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸。遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物。

于一试管中加蛋白质溶液10滴及浓硝酸3-4滴，加热，冷却后再加10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化。

C、茚三酮反应：蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及α-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。

取1ml蛋白质溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。

2、沉淀反应：

A、蛋白质盐析作用：向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。

取蛋白质溶液5ml，加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵溶液的浓度为50%饱和），微微摇动试管，使溶液混合静置数分钟，球蛋白析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。

B、乙醇沉淀蛋白质：乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。

取蛋白质溶液1ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀。观察有无沉淀析出。

C、重金属盐沉淀蛋白质：蛋白质与中金属离子结合成不溶性盐类而沉淀。

取试管2支各加蛋白质溶液2ml，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加1%CuSO4溶液至有沉淀生成。

D、生物碱试剂沉淀蛋白质：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。

于1支试管中加2ml蛋白质溶液及1%醋酸溶液4-5滴，再加饱和苦味酸溶液数滴，观察结果。

六、实验结果记录

七、思考题

1、简述茚三酮与蛋白质进行颜色反应的原理。

2、维持蛋白质胶体溶液稳定性的因素有哪些？乙醇、重金属盐及生物碱试剂破坏蛋白质胶体溶液稳定性的机理是什么？