细菌表面展示技术的应用研究进展

〔 K〕
库可筛选具有新的特异性或新的催化活性的酶突变 体。Y"Q 等将羧甲基纤维素酶 （ 52#=7:ZQ196Z8 M188</ 82&1 ， 5%52&1） 的突变基因与 -HV 基因融合， 呈现于 大肠杆菌表面。从这个突变体库中筛选到了具有更
〔 *B 〕 高催化活性的 5%52&1 突变体 。这为工业酶的
合肽是很有吸引力的替代途径， 因为它们可能对重 金属具有更高的亲和力和选择性。目前已知富含半 胱氨酸或组氨酸的肽对 !"# $ 和 %&# $ 有很高的亲和 力。 ’()*+&))+" 等利用呈现在大肠杆菌 ! 型菌毛亚 单位 ,-.% 上的随机九肽库筛选出新的 /0# $ 螯合肽 序列， 这些序列大多都是富含组氨酸的序列， 但又不 同于已知的任何序列， 为筛选新的金属结合序列提
〔 (〕 （ @?G%? ） 加上内部重复单位 。 @?G 单位以及 ? 端
的优点包括： 稳定的表达和外膜转运； 内部重复单位 长度可调整， 可借以调节外源蛋白和膜表面之间的 距离； 通过冰晶核形成活性试验可检测异源蛋白是 否表达在细胞表面； 表达 @?G 融合蛋白不影响膜的 结构和宿主细胞生长； @?G 可在多种革兰氏阴性菌 中表达， 并可呈现大分子蛋白。 自体转运蛋白包括多种与革兰氏阴性菌毒力有 关的蛋白， 其功能主要是粘附和水解蛋白质。其特 征是运输至细胞外膜和通过外膜分泌所需要的所有 信息都集中在蛋白本身， 不需要其它蛋白的参加， 就 能将外源蛋白转运通过革兰氏阴性菌细胞外膜， 并 将其在细胞表面稳定展示。经典的自体转运蛋白运 （ HA5FAC-D1 ） %依 输机制是， 首先 ?%端信号肽藉助 HA5 赖途径运输蛋白通过细胞质膜到达周质腔， 接着 J% 端部分在外膜组装成 ! 折叠管， 外源蛋白通过由 ! 〔 "〕 折叠管形成的通道定位 。最早发现的自体转运 蛋白是奈瑟氏菌属的 @2= 蛋白酶， 目前已发现 $# 种 具有自体转运蛋白特征的蛋白， 应用较多的为大肠 杆 菌 =@>=%" （ =K0A3-1 K -1 K-MMB3A ,K0AF% A15A） ， 此 外 还 有 大 肠 杆 菌 =2$’ ， 志贺氏菌属的
〔 11 〕 供了新思路 。合成的植物螯合肽 （ 23045*4-6 7538
=>00*+->;;90 等 从 噬 菌 体 肽 库 中 筛 选 出 具 有 H&A 和 H&< 结 合 活 性 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 蛋 白 A （ 27A） —亲和体 （ AQQ-J9"3） ， 以单体或二聚体的形式 展示在葡萄球菌表面， 重组蛋白分别具有 H&A 和 H&<
定向进化和高通量筛选提供了技术平台。 () >+ 作为全细胞吸附剂在环境方面的应用 由于生物吸附剂成本低、 易于大量制备、 功能众 多， 因而有着广泛的应用前景， 特别适合于化学物质 的分离纯化及毒物污染水源的净化等环境方面的应 用。 () >) *+ 重金属吸附剂+ 自然界存在的金属结合肽， 如金属硫蛋白 （ %19288796"7;1"; ） 和植物螯合肽 （ V6Z/ 97M61829";） ， 是细胞固定金属离子的主要金属聚集分 子， 它们具有选择性和高亲和力结合位点。吸附的 重金属离子主要包括 5<( [ ， ?J( [ ， \;( [ ， H"( [ ， 5O( [ ， 57( [ 。除了自然界存在的肽， 从头设计合成金属结
。对于小鼠呼吸道合胞病毒的
保护免疫也是利用此策略， 在肉葡萄球菌表面呈现 人呼吸道合胞病毒 , 亚型的 $ 糖蛋白的肽段， 同时 和 534 的肽段共表达。经鼻免疫小鼠， 出现显著的
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微生物学免疫学进展 #??M 年第 @@ 卷第 # 期E E G+9& -0 [-6+9J-9: H..>09:， [)3 #??M ， \9:D @@ ， B9D #
化表面展示系统。本文介绍目前应用较多的冰晶核 蛋白和自体转运蛋白。 @?G 是一种膜蛋白， 发现于欧氏杆菌、 假单胞杆 菌和黄单胞菌属。在过冷的水中， 它能使宿主细胞 形成冰晶核。@?G 由 ? 端结构域、 J 端结构域及中 央结构域组成。其中 ? 端结构域负责锚定于细胞 表面， 中央结构域是由 &%、 (9%、 $& 个残基周期性组 成的重复结构， 是冰晶核形成的模板。已经有几种 @?G 的呈现系统得到应用， 如 @?G 全长序列， 只包括 ?%和 J%末端的序列 @?G%?J ， @?G%?J 加上内部重复
〔 X〕 成孕烯醇酮 。利用展示在细菌表面的酶突变体
。将耶尔森氏 菌 属 热 休 克 蛋 白 ?&@AB
的第 CD E FA 氨基酸 （ %?5/" 限制性表位） ， 与 ,-/ .,/!和 534 融合， 呈现在沙门氏菌表面， 免疫小鼠 可诱导 出 3 细 胞 反 应， -GH/# 分 泌， 脾 3 细胞增 生
! ! 运用 >?= 重组技术在噬菌体、 细菌、 真菌、 病毒 等微生物表面呈现外源蛋白或多肽， 已在微生物学、 分子生物学、 疫苗学和生物技术等方面得到了广泛 应用。噬菌体表面展示技术比较成熟， 已成功地用 于抗原表位筛选， 酶抑制剂和受体拮抗剂分离， 细胞 信号转导途径以及抗体工程研究等。但其本身存在 一些缺陷， 如多肽或蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合 表达时， 存在不可预测的偏性， 特别是对于某些真核 细胞蛋白的表达更是如此； 另外， 展示蛋白的大小也 受到限制， 蛋白过大会影响噬菌体的装配及感染能 力。细菌表面展示系统是继噬菌体表面展示系统之 后发展起来的， 其呈现载体多样， 可根据不同需要呈 现蛋白或多肽。近年来其应用已扩展到重组细菌疫 苗， 多肽库筛选， 全细胞吸附剂， 全细胞催化剂以及 作为诊断的细胞固相试剂等多个领域。 !" 细菌表面展示系统 目前有多种细菌表面展示系统可供利用， 除了 以往对细菌的外膜蛋白、 脂蛋白、 表面附属结构亚单 位如鞭毛、 菌毛等研究较多外， 近几年又开发出多种 新的表面展示系统。研究较多的有冰晶核蛋白 （ @5A 1B5.A,C-D1 EFDCA-1， @?G ） 、 自体转运蛋白 （ =BCDCF,13% EDFCAF） 、 H%层蛋白等。此外， 尚有研究利用枯草杆菌 的芽胞外膜， I%型大肠杆菌和变形杆菌的细胞膜来 展示外源蛋白。每种展示系统都有其自身的缺点， 例如展示蛋白大小的限制， 错误定位， 形成包涵体， 外膜不稳定等， 因此需要开发新的系统， 以进一步优
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微生物学免疫学进展 "##) 年第 ’’ 卷第 " 期! ! GFD2 -1 N-5FD7-D. @++B1D.， N,O "##) ， PD.6 ’’ ， ?D6 "
细菌表面展示技术的应用研究进展
刘向昕， 展德文 综述；张兆山 ! 审校 （ 军事医学科学院生物工程研究所， 北京! (###;( ）
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!"#$， 沙门氏菌的 %"&’ 等。许多研究结果表明， 自 体转运蛋白是展示外源蛋白的理想工具， 因为其呈 现系统不需要其他蛋白的参与， 且能转运较大分子 量的蛋白， 并保持它们的抗原性和生物学功能。 !" 细菌表面展示技术的应用 在开发出多种呈现系统的同时， 细菌表面展示 技术的应用研究近年来取得了显著进展。 () *+ 在免疫学和疫苗学中的应用 () *) *+ 活菌疫苗载体 + 细菌表面呈现抗原在疫苗 设计方面具有独特的优势， 在细菌表面的多肽抗原 更易被免疫系统识别； 细菌的外膜蛋白， 脂多糖和分 泌的毒素具有强免疫原性， 可作为所呈现外源蛋白 的免疫佐剂。已利用两种类型的细菌研制开发活菌 苗—致病菌减毒株、 非致病共生菌或食品级细菌。 致病菌减毒株， 如沙门氏菌和分枝杆菌， 是非常 有吸引力的外源蛋白活载体， 能够引起抗病毒、 细菌 和寄生虫的体液和细胞免疫。利用 ,-.,/!， 将几 乎全长的幽门螺杆菌 （ !" #$%&’( ） 尿素酶 , （ 0#12&1 ,， 0#1,） 或 0#1, 的一个 3 细胞表位同霍乱毒素 4 亚单位 （ 56781#2 97:"; 4 &<=<;"9， 534 ） 融合展示在减 毒沙门氏菌表面， 攻毒后， 使免疫小鼠幽门螺杆菌水 平明显下降， 而在沙门氏菌细胞浆中表达 0#1, 则 没有效果
〔 D〕
。但将分枝杆菌和沙门氏菌作为活菌疫苗载
体， 需考虑到在婴儿和无免疫应答人群中应用的安 全性。 非致病性共生菌或食品级细菌， 包括某些链球 菌、 葡萄球菌和乳酸杆菌。它们使用安全， 但免疫原 性较弱。近年来研制开发的二代疫苗输送系统， 通 过共表达粘附因子辅助锚定粘膜上皮， 来提高抗体 反应。如利用链球菌的表面蛋白 %A ， 在链球菌表面 共展示免疫调节因子肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素 4 亚单位 （ ?129/8"2=81 1;91#797:"; 4 &<=<;"9， ’34 ） 和 ?-! I * J@*(B 的 !> 区域， 免疫小鼠后产生的 !> 特 异性抗体 -J$ 比分别表达 ’34 和 !> 的两种菌的混 合物免疫后产生的 !> 特异性抗体 -J$ 高 D 倍。表 明只有在共表达于同一细菌表面时才能发挥 ’34 的粘膜佐剂作用
〔 C〕 敏感性超过了目前商用的诊断抗原 。在大肠杆
菌表面 利 用 ";9"Q"; 展 示 经 典 猪 热 病 毒 （ 582&&"M28 &R";1 S1N1# N"#<&， 5PG!） 包膜出#43; 展示酶作为全细胞催化剂 在酶的进化方法中， 将酶展示在活细胞表面具 有很大的优越性： 酶底物不需要通过膜屏障， 就可以 和酶相互作用； 可省去酶的准备和纯化步骤； 筛选到 的酶特异性突变体， 可以同时获得其相应的基因。 U7&1 等在大肠杆菌表面利用自体转运蛋白 ,-/ .,/! 展示牛肾上腺皮质铁氧还蛋白， 它在细菌表 面自动形成有活性的二聚体， 加入皮质铁氧还蛋白 还原酶和 VDKB 5WV**,* 后， 能有效的将胆固醇合