表面展示技术

枯草芽胞杆菌( Bacillus subtilis) 是一种典型的好氧型的革兰氏阳性细菌，也是研究的最早且最深入的一种芽胞杆菌。

其中枯草芽胞杆菌168是最早发现的可作为转化的芽胞杆菌菌株，随后对其遗传转化和表达系统做了深入的研究。

1997年，日本和欧洲的几个实验室联合完成了枯草芽胞杆菌168 基因组的测序［1］。

枯草芽胞杆菌有两个生长时期: 孢子休眠期和生殖生长期。

在营养缺乏等胁迫的环境下，枯草芽胞杆菌进入休眠期形成具有抗逆作用的芽胞，在营养充足的环境下，芽胞又会进入生殖时期，即芽胞萌发重新生长成为枯草芽胞杆菌。

芽胞抗逆性非常强，在高温和酸碱等极端环境下亦能生存，由于其独特的生理特性，使之成为新型的蛋白质或酶类药物表达载体而倍受关注。

由于枯草芽胞杆菌是一种非致病性的益生菌，因此其可以作为一种生物安全的展示外源蛋白的宿主。

目前利用该菌株已成功表达了破伤风毒素［2 ～4］、不耐热肠毒素［4］、乙醛酸脱氢
芽孢杆菌属和梭菌属在受到外界应力时如营养缺乏情况下自身母细胞会形成一种休眠体即芽孢,它可以抵御外界环境因素的攻击。

年前发现炭疽芽孢杆菌的芽孢即使将其置于沸水中蒸煮一断时间后,它仍能存活下来,这一有趣的现象吸引了科学家们开始探究芽孢的耐热和抵御其他外界环境因素攻击的作用机制。

()枯草芽孢杆菌芽孢芽孢杆菌属()在饥饿或环境恶劣等逆环境下,为了抵御外界不良应力这时它的营养细胞会形成一种近椭圆形的休眠体结构即芽孢。

芽孢的结构由内到外依次是核心、皮层、芽孢衣壳和芽孢外壁。

芽孢的核心一般含有大量的染色体、酶和,但含水量却很低,主要是由于它内部的大部分
水分子都被吡啶二羧酸复合体取代掉了。

芽孢的外壁由肽聚糖构成,与营养细胞的肽聚糖组分很类似,仅在于含量上有差别。

芽孢的衣壳由至少种以上的蛋白构成,这些蛋白也被称为芽孢衣壳蛋白,它们具有抗酶解和抗药物的功能,主要受一系列调控基因和结构基因控制。

芽孢的外壁从结构上又可细分为基底层、内层、外层和层四个部分(图)。

芽孢诱导产生的整个过程大概需要将近八个小时。

芽孢的形成受一系列调节酶如激酶和磷酸酶、细胞周期及其他机制调控
芽孢形成的步骤可简单地描述成如下几个过程:第一步,包括、和在内的组氨酸感受激酶开始活化,这时组氨酸感受激酶以扩展磷转移的方式运载磷,并促使转录因子发生磷酸化。

实际上,诱发芽孢产生的调控过程很简单,因为只需要调控上游的表达就可以实现,并且都不需要考虑它的营养是否缺乏。

磷酸化调控的调节子基因很多,包括参与不均等分裂的相关蛋白和参与芽孢形成的σ因子蛋白。

不均等分裂会使营养细胞分化成个间隔区,大的是母细胞,而小的则是前孢子。

前孢子最终演化为成熟的芽孢。

随后,母细胞以一种类似吞噬作用的方式逐渐包裹前孢子。

待吞噬完成后,被母细胞吞并的前孢子则被覆盖上了一个双分子层膜。

与此同时,还产生了两个外部的保护结构:一个是前孢子内膜与外膜间肽聚糖组装成的核质;另一个是由衣壳蛋白质构成的芽孢最外保护层。

实际上,肽聚糖的前体起初是在母细胞中合成的,然后它翻转穿过前孢子外膜进入外膜与内膜间的空间,但是这种翻转机制目前仍不太清楚。

最后,母细胞破裂释放成熟的芽孢进入环境中。

此时的芽孢能够快速发芽并可通过吸收营养恢复它的增殖能力。

新近发展起来的芽孢表面展示技术,由于其具有独特的稳定性和安全性高的特点而引起广大学者的关注。

一般来说,芽孢表面这些系统主要由宿主菌、分子载体和靶蛋白组成。

目前,芽孢表面展示系统中所用的宿主菌有枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。

分子载体一般应具有如下特质:①它必须含有一个结构域可以与靶蛋白进行融合;
②必须含有一个锚定结构域可使融合蛋白固定在芽孢的表面;③分子载体和靶蛋白可以形成融合蛋白,相互功能不受影响;④还必须具有抗酶解的能力;⑤分子载体的敲除不影响芽孢的正常发芽、成熟和分化。

芽孢表面展示系统中的外源蛋白也叫靶蛋白。

针对靶蛋白而言,一般并无特别要求,选择的对象应从实验需要出发。

相对于芽孢表面展示系统来说,噬菌体或细菌表面展示系统都存在着一个明显的缺陷,那就是这些系统中形成的融合蛋白都必须至少要穿过细胞质膜才能锚定在宿主的表面,这容易导致有些融合蛋白由于无法穿过细胞质膜进而就不能有效定位在噬菌体或细菌的表面。

例如那些细胞周质中快速折叠的蛋白或疏水部位深埋在细胞膜的蛋白往往都不能有效地穿过细胞质膜。

芽孢表面展示技术发展较晚,但其却具有如下诸多优点:①芽孢结构比较特殊没有细胞膜结构,所以当它与外源蛋白融合后形成的融合蛋白在固定到芽孢表面的过程中避免了折叠不正确和定位不准确的问题;②其次,由于芽孢具有抗可逆环境等特性,因而它还会提高融合蛋白的稳定性如热稳定性、耐有机溶剂等,尤其在制备生物催化剂方面;③最后,被展示的外源蛋白或多肽范围分布
较广,它还可展示多聚体类的蛋白。

孢表面展示技术应用领域和其他微生物细胞表面展示系统相比,芽孢表面展示系统已被广泛应用于诸多领域,概况地说主要是生物分析和生物医学领域。

具体地是,芽孢表面展示系统可用于活性疫苗和抗体的产生、多肽或蛋白库高通量筛选、生物催化剂、生物传感器、生物检测器、重金属离子和化学物质的生物吸附等
由于枯草芽孢杆菌的遗传学背景和芽孢的结构信息都比较清楚,所以用它产的芽孢来构建芽孢表面展示系统也就更容易实现。

年,意大利那不勒斯菲里德里克第二大学研究小组首次报道了来自枯草芽孢杆菌外层衣壳蛋白可以用作分子载体将破伤风梭菌破伤风毒素单位展示在芽孢的表面,并且每个芽孢上约展示有×个融合蛋白分子。

新型芽孢表面展示系统不仅稳定性和展示效率高,而且易于纯化,这些优势促使芽孢表面展示系统为锚定其他的生物分子提供了新的选择。

年,英国伦敦大学皇家霍洛威学院研究小组发现枯草芽孢杆菌的外层衣壳蛋白也能够将破伤风梭菌破伤风毒素单位和大肠杆菌不耐热肠毒素单位展示在芽孢的表面,他们发现不同种类的抗原都能被固定在芽孢的表面,而且获得的重组芽孢还可以充当黏膜免疫的一个载体工
具。

年,韩国首尔大学研究小组证实枯草芽孢杆菌衣壳蛋白能将四聚体的链霉素锚定在芽孢的表面。

年,中国江苏大学宁德刚研究小组发现枯草芽孢杆菌外层衣壳蛋白具有充当分子载体的能力,可成功将绿色荧光蛋白展示在芽孢的表面。

同年,瑞士帝斯曼公司的研究小组阐述了芽孢衣壳内层蛋白草酸脱羧酶()不仅能够展示动物饲料中常用的植酸酶,还能展示来自大肠杆菌的四聚体β葡萄糖醛酸酶。

有趣的是,芽孢表面展示的与植酸酶的融合蛋白分子数目要多于与植酸酶的融合蛋白分子数目。

一般来说,和常用来展示抗原制备活性疫苗,而则用来锚定功能性酶蛋白制备全细胞催化剂。

截止目前,已报道的枯草芽孢杆菌芽孢表面展示系统的实例见表。

虽说芽孢表面展示系统拥有一些得天独厚的优势,但是其也存在一些
需要改进甚或改善的地方。

具体问题如下:①孢表面展示系统所用的分子载体来源较少,不利于大量蛋白的展示;②该系统展示功能性酶蛋白所获得的酶活一般较酵母或细菌表面展示系统所得的偏低,这本身与枯草表达系统研究的不透彻有关;③产芽孢的诱导培养基成本较高。

芽孢表面展示系统作为新近发展起来的一种微生物表面展示系统,它已用于口服疫苗的研制、抗体的生产、生物传感器的构建及全细胞催化剂等领域。

近年来,已有学者利用芽孢表面展示技术构建β-半乳糖苷酶和乙酰神经氨酸醛缩酶枯草芽孢杆菌芽孢表面展示系统,并将芽孢表面展示系统分别用于生产辛烷基β-半乳糖苷和乙酰神经氨酸,使得目标产物的产量大幅度提高。

表面展示技术的概况
表面展示技术()是指通过基因工程技术将外源蛋白或多肽定位到噬
菌体、细胞或芽孢表面的一种技术。

自在年首次发现噬菌体能够作为一种展示外源蛋白或多肽的载体后,其他噬菌体展示技术、酵母表面展示技术和细菌表面展示技术便应运而生。

表面展示技术之所以受到人们的欢迎,主要是由于其可被广泛应用于活性疫苗的研制、肽库的筛选、抗体的生产、作为去除有害物质和重金属离子的吸附剂、全细胞催化剂和生物传感器等领域。

噬菌体表面展示技术
噬菌体(Bacteriophases，又称Phages)是指一类寄生在原核生物体内的病毒。

噬菌体展示技术(Phase display technology)是指将外源蛋白或多肽通过与噬菌体衣壳蛋白融合后其被展示在噬菌体颗粒的表面,形成的融合蛋白中的外源蛋白或多肽仍保留了自身的生物活性的一种分子生物学技术
噬菌体展示技术缺点：具体如下:①外源蛋白或多肽与衣壳蛋白融合后,在表达过程存在无法预测的偏性;②被展示的外源蛋白或多肽分子量不能太大,否则会影响噬菌体的组装并降低它感染宿主的能力;③在构建肽文库时,存在限制容量的弊端。

细菌表面展示技术
细菌表面展示系统主要分为革兰氏阴性菌表面展示系统和革兰氏阳性菌表面展示系统。

芽胞表面展示技术是将外源目的蛋白编码基因与含有自身启动子的芽胞外套蛋白基因融合，构建融合基因表达载体，然后将这种载体转化产芽胞的宿主菌株，得到的重组菌株在生孢培养基中培养时，外源
目的基因就会在外套蛋白基因启动子的启动下表达，并通过与外套蛋白偶联的作用将外源蛋白展示在芽胞的表面。

由于芽胞独特的抗逆性，使得展示在芽胞表面的外源蛋白也具有相应的抗逆性。

革兰氏阳性菌表面展示系统
这些细胞壁蛋白都具有相同的保守特质即端含有一个引导细胞壁蛋白穿过细胞膜的信号肽和端含有一个将细胞壁蛋白固定在细胞壁上的分选信号肽。

因此,革兰氏阳性菌表面展示系统又可以分为C端融合和N端融合。

革兰氏阴性展示系统由于每种分子载体都具有不同的特性,所以这些特性就决定了它们只能用在一些特殊的用途中。

是革兰氏阴性菌表面展示系统应用最多的宿主菌,因为其表达系统成熟,操作相对简单由于革兰氏阳性菌的细胞壁外仅有一层质膜,所以其细胞壁上的分子载体与外源蛋白或多肽形成的融合蛋白可以很容易地穿过质膜,这就大大提高了融合蛋白定位的准确率。

其次,可展示一些大分子外源蛋白;第三,革兰氏阳性菌具有较厚的肽聚糖层,有利于对环境中重金属离子的吸附。

同样地,革兰氏阳性菌细胞壁厚的特点有时又会导致转化效率低的问题,因此这在构建丰富度高的多肽库时很难操作;此外,革兰氏阳性菌中的诸如枯草芽孢杆菌会分泌产生大量的蛋白酶,这些蛋白酶的出现有时会对外源蛋白的稳定性造成破坏影响。

革兰氏阳性展示系统的缺点
由于革兰氏阳性菌在进行遗传操作时难度比较大,所以目前仅有少数几种革兰氏阳性菌被用作表面展示的宿主菌。

母表面展示技术是一种利用真核微生物作为宿主的表面展示系统。

其基本原理也是通过将外源蛋白的编码序列与酵母细胞壁上的分子载体融合,分子载体上的信号肽引导融合蛋白定位在酵母细胞的表面。

优点:①关于它的遗传学背景研究得很清楚,和它相关的一些分子生物学技术也发展比较成熟,因此容易实现外源蛋白在它表面的展示;②可
以展示糖基化和二硫键异构化修饰的真核生物蛋白;③展示的外源蛋白分子量分布范围广,可达×～×;④酵母细胞表面展示的目标蛋白分子数目多达～;⑤酵母颗粒大,因而可用流式细胞仪进行快速的筛选;
⑥酵母是菌种之一,安全无毒,有利于活性疫苗、全细胞催化剂和疾病治疗等方面的研究。

酵母表面展示系统优点明显,但缺点也很突出,具体如下所述:①展示外源蛋白的范围比较窄,由于它是真核生物会对外源蛋白发生或糖基化修饰,所以往往只能用来生产不含糖基化位点的功能性蛋白;②当外源蛋白是真核功能性酶蛋白时又会存在过度糖基化的可能性,进而导致外源蛋白酶活性的丧失;③遗传稳定性差,在传代过程中容易丢失。

芽孢表面展示技术是指通过重组技术将外源蛋白或多肽与芽孢上的衣壳蛋白融合进而被固定在芽孢表面的一种表面展示技。