酵母表面展示技术及其应用
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糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定系统
根据4段重复序列的位置不同,利用Flo1 蛋白C端含有GPI锚定附着信号的区域 , 建立了6个锚定长度不同的GPI展示系统。 根据目的蛋白的特性和展示目的选用锚 定长度不同的GPI展示系统,将目的蛋白 的C端融合到锚定序列上。
第8页
二、酵母展示系统类型
絮凝结构域锚定系统
cell-surface
应用 Application
受体 Receptor
筛选特异配体 、研究抗体结合位点
Protein recognition
抗原 Antigen
未知功能的目的基因产物 Unknown functional
product of target gene 特定病理过程相关蛋白 Protein related to specific pathological process
三、酵母表面展示技术优点
04
a-凝集素系统中外源蛋白通过二硫键与细胞壁相连, 因此可用还原 剂将二硫键打断,使目的蛋白从细胞表面解离，分离纯化方便。
05 对展示在细胞表面的单个克隆的突变特性、酶的活性无需进行蛋 白质的水溶性表达和纯化,可以直接在全细胞基础上测定，活性测 定方便。
第 11 页
四、酵母表面展示技术应用
α-凝集素 (Agα)系统
α-凝集素由Ag α1基因编码, 仅有1个核心亚基。其C端的320个氨 基酸残基 (富含丝氨酸和苏氨酸的支持区及GPI锚定蛋白附着信号 区 )与细胞壁葡聚糖共价结合,使其锚定在细胞壁上。目的蛋白的C 端与α-凝集素的N端融合,实现目的蛋白的细胞表面展示。
第6页
二、酵母展示系统类型
展示的融合蛋白相对分子质量范围大，分子数量多；研究发现相
02 对分子质量在0.93×106 Da 和136×106 Da之间的分子均可展示 于酵母菌表面,且每个酵母表面可展示104～105 个分子。
03
既可采用传统的结合-洗脱-扩增筛选方法, 也可采用荧光激活细胞 分选仪(FACS)进行筛选；
第 10 页
蛋白质的定向进化
筛选亲和力、稳定性和活性高的 突变体, 实现目的蛋白的定向进化
绘制抗原表位图谱
蛋白质间相互作用时残基的鉴定
抗体的检测及筛选
制备特异性的抗血清和多克隆抗体
新药筛选
明确一些药物的作用靶点, 筛选到治疗 该疾病的新药先导化合物或多肽药物
第 12 页
四、酵母表面展示技术应用
领域Field
表面展示蛋白 Proteins displayed on
研究多肽的性质、相互识别和作用
筛选特定功能的多肽结构, 实现蛋 白质的固定化和定向进化
酵母表面展示技术是一种真核蛋白表达系统 外源靶蛋白基因与载体基因序列融合 导入酵母细胞，诱导融合蛋白表达 融合蛋白锚定在酵母细胞壁 外源蛋白在酵母细胞表面固定化表达
第3页
二、酵母展示系统类型
酵母细胞壁结构
细胞干重的25 %, 厚度约为200nm； 外层主要由甘露糖蛋白(mannoprotein) 组成,呈纤维状,决定细胞表面特性； 内层由β-1,3和β-1,6葡聚糖(glucan)组 成,维持细胞壁的强度起骨架支持作用。
抗原决定簇 Epitope
绘制抗原表位图谱, 制备特异性的抗血清和多克隆抗体
发现未知功能基因产物的作用物质, 开展未知功能基因功能研究
明确一些药物的作用靶点, 筛选到治疗该疾病的新药 先导化合物或多肽药物
生产活菌体疫苗, 检测抗体水平,诊断某些疾病
抗体 Antibody
筛选抗原 、研究抗原特性
第ห้องสมุดไป่ตู้13 页
a-凝集素(Aga)系统
a-凝集素由核心亚基Aga1和结合亚基Aga2组成，两者通过二硫键相连。 核心亚基Aga1的C端与细胞壁葡聚糖共价结合。而目的蛋白则通过与结 合亚基Aga2的C端融合, 即目的蛋白的N端与a-凝集素Aga2结合亚基的 C端融合。
第7页
二、酵母展示系统类型
酵母絮状作用基因(Flo1)是研究得十分详尽的1个酿酒酵母的絮凝基因家族, 酵母表面展示系 统也正是基于此基因进行操作。Flo1为显性 , 编码富含丝氨酸和苏氨酸的植物凝集素样蛋白 质。从N端至C端, Flo1蛋白依次由分泌信号区、4 段重复序列区和GPI锚定附着信号区组成 。
四、酵母表面展示技术应用
领域Field Protein immobilization
Protein remediation
表面展示蛋白 Proteins displayed on
cell-surface
应用 Application
脂肪酶 Lipase 淀粉酶 Amylase 木聚糖酶 Xylanase 纤维素酶 Cellulase
《XXXXXXXX》课程汇报——
酵母表面展示技术及其应用
Reporter：XXX 2020.XX.XX
CONTENT
1 技术概念与基本原理
2 酵母表面展示系统
3 酵母表面展示技术优点
4 酵母表面展示技术应用
第2页
一、技术概念与基本原理
Surface Display
基因操作技术
以融合蛋白形式展现
独立空间结构和生物活性
Flo1蛋白N端絮凝功能区系统由分泌信号区、Flo1 蛋白絮凝功能区及目的 蛋白插入位点组成。目的蛋白的N端与Flo1蛋白的絮凝功能区融合,融合蛋 白通过絮凝功能区与细胞壁的甘露聚糖非共价作用而诱导细胞黏附。
第9页
三、酵母表面展示技术优点
酵母是真核生物 ,具有翻译后修饰所需的细胞器和酶, 使基因的多 01 样性通过正确折叠的蛋白质准确展示出来，使得表达偏差小。
生产全细胞催化剂, 提高酶的稳定性、表达水平和活性，
实现多步底物转化
融合报告蛋白和启动子 Recombinant reporter protein and promoter
构建生物传感器
目的蛋白的突变基因群 Mutational gene clusters of
target protein
筛选亲和力、稳定性和活性高的突 变体, 实现目的蛋白的定向进化
第4页
二、酵母展示系统类型
根据外源目的蛋白与酵母细胞壁蛋白的融合部位不同，可分为：
凝集素系统(agglu-tinin system)
α-凝集素 (Agα)系统 a-凝集素(Aga)系统
絮凝素系统(flocculin system)
糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定系统 絮凝结构域锚定系统
第5页
二、酵母展示系统类型
根据4段重复序列的位置不同,利用Flo1 蛋白C端含有GPI锚定附着信号的区域 , 建立了6个锚定长度不同的GPI展示系统。 根据目的蛋白的特性和展示目的选用锚 定长度不同的GPI展示系统,将目的蛋白 的C端融合到锚定序列上。
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二、酵母展示系统类型
絮凝结构域锚定系统
cell-surface
应用 Application
受体 Receptor
筛选特异配体 、研究抗体结合位点
Protein recognition
抗原 Antigen
未知功能的目的基因产物 Unknown functional
product of target gene 特定病理过程相关蛋白 Protein related to specific pathological process
三、酵母表面展示技术优点
04
a-凝集素系统中外源蛋白通过二硫键与细胞壁相连, 因此可用还原 剂将二硫键打断,使目的蛋白从细胞表面解离，分离纯化方便。
05 对展示在细胞表面的单个克隆的突变特性、酶的活性无需进行蛋 白质的水溶性表达和纯化,可以直接在全细胞基础上测定，活性测 定方便。
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四、酵母表面展示技术应用
α-凝集素 (Agα)系统
α-凝集素由Ag α1基因编码, 仅有1个核心亚基。其C端的320个氨 基酸残基 (富含丝氨酸和苏氨酸的支持区及GPI锚定蛋白附着信号 区 )与细胞壁葡聚糖共价结合,使其锚定在细胞壁上。目的蛋白的C 端与α-凝集素的N端融合,实现目的蛋白的细胞表面展示。
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二、酵母展示系统类型
展示的融合蛋白相对分子质量范围大，分子数量多；研究发现相
02 对分子质量在0.93×106 Da 和136×106 Da之间的分子均可展示 于酵母菌表面,且每个酵母表面可展示104～105 个分子。
03
既可采用传统的结合-洗脱-扩增筛选方法, 也可采用荧光激活细胞 分选仪(FACS)进行筛选；
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蛋白质的定向进化
筛选亲和力、稳定性和活性高的 突变体, 实现目的蛋白的定向进化
绘制抗原表位图谱
蛋白质间相互作用时残基的鉴定
抗体的检测及筛选
制备特异性的抗血清和多克隆抗体
新药筛选
明确一些药物的作用靶点, 筛选到治疗 该疾病的新药先导化合物或多肽药物
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四、酵母表面展示技术应用
领域Field
表面展示蛋白 Proteins displayed on
研究多肽的性质、相互识别和作用
筛选特定功能的多肽结构, 实现蛋 白质的固定化和定向进化
酵母表面展示技术是一种真核蛋白表达系统 外源靶蛋白基因与载体基因序列融合 导入酵母细胞，诱导融合蛋白表达 融合蛋白锚定在酵母细胞壁 外源蛋白在酵母细胞表面固定化表达
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二、酵母展示系统类型
酵母细胞壁结构
细胞干重的25 %, 厚度约为200nm； 外层主要由甘露糖蛋白(mannoprotein) 组成,呈纤维状,决定细胞表面特性； 内层由β-1,3和β-1,6葡聚糖(glucan)组 成,维持细胞壁的强度起骨架支持作用。
抗原决定簇 Epitope
绘制抗原表位图谱, 制备特异性的抗血清和多克隆抗体
发现未知功能基因产物的作用物质, 开展未知功能基因功能研究
明确一些药物的作用靶点, 筛选到治疗该疾病的新药 先导化合物或多肽药物
生产活菌体疫苗, 检测抗体水平,诊断某些疾病
抗体 Antibody
筛选抗原 、研究抗原特性
第ห้องสมุดไป่ตู้13 页
a-凝集素(Aga)系统
a-凝集素由核心亚基Aga1和结合亚基Aga2组成，两者通过二硫键相连。 核心亚基Aga1的C端与细胞壁葡聚糖共价结合。而目的蛋白则通过与结 合亚基Aga2的C端融合, 即目的蛋白的N端与a-凝集素Aga2结合亚基的 C端融合。
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二、酵母展示系统类型
酵母絮状作用基因(Flo1)是研究得十分详尽的1个酿酒酵母的絮凝基因家族, 酵母表面展示系 统也正是基于此基因进行操作。Flo1为显性 , 编码富含丝氨酸和苏氨酸的植物凝集素样蛋白 质。从N端至C端, Flo1蛋白依次由分泌信号区、4 段重复序列区和GPI锚定附着信号区组成 。
四、酵母表面展示技术应用
领域Field Protein immobilization
Protein remediation
表面展示蛋白 Proteins displayed on
cell-surface
应用 Application
脂肪酶 Lipase 淀粉酶 Amylase 木聚糖酶 Xylanase 纤维素酶 Cellulase
《XXXXXXXX》课程汇报——
酵母表面展示技术及其应用
Reporter：XXX 2020.XX.XX
CONTENT
1 技术概念与基本原理
2 酵母表面展示系统
3 酵母表面展示技术优点
4 酵母表面展示技术应用
第2页
一、技术概念与基本原理
Surface Display
基因操作技术
以融合蛋白形式展现
独立空间结构和生物活性
Flo1蛋白N端絮凝功能区系统由分泌信号区、Flo1 蛋白絮凝功能区及目的 蛋白插入位点组成。目的蛋白的N端与Flo1蛋白的絮凝功能区融合,融合蛋 白通过絮凝功能区与细胞壁的甘露聚糖非共价作用而诱导细胞黏附。
第9页
三、酵母表面展示技术优点
酵母是真核生物 ,具有翻译后修饰所需的细胞器和酶, 使基因的多 01 样性通过正确折叠的蛋白质准确展示出来，使得表达偏差小。
生产全细胞催化剂, 提高酶的稳定性、表达水平和活性，
实现多步底物转化
融合报告蛋白和启动子 Recombinant reporter protein and promoter
构建生物传感器
目的蛋白的突变基因群 Mutational gene clusters of
target protein
筛选亲和力、稳定性和活性高的突 变体, 实现目的蛋白的定向进化
第4页
二、酵母展示系统类型
根据外源目的蛋白与酵母细胞壁蛋白的融合部位不同，可分为：
凝集素系统(agglu-tinin system)
α-凝集素 (Agα)系统 a-凝集素(Aga)系统
絮凝素系统(flocculin system)
糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定系统 絮凝结构域锚定系统
第5页
二、酵母展示系统类型