关于酵母表面展示技术课件

酵母细胞表面展示与生物吸附
环境污染物的生物修复是以酶促降解或生物吸附 为基础的，例如微生物对重金属的吸附就包括两 种途径: ( 1) 与细胞表面复合物结合，( 2) 逐 渐吸收在细胞内进行消化。然而通过胞内消化降 解有毒物质必须使细胞内酶，蛋白质或污染物跨 越细胞膜这一屏障，比较缓慢及效率低而且不可 重复利用。利用表面展示技术能较好地解决这一 问题，吸附蛋白直接展示在细胞表面，不仅使吸 附过程快捷高效还可以利用回复剂如EDTA 对其 进行处理使之不断重复利用。
絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源 蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表 面，此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统 和絮凝结构域锚定系统。GPI锚定系统是利用 絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源 蛋白，此系统与凝集素展示相似; 絮凝结构 域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识 别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并以非共价作 用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物
酵母表面展示系统的应用
酵母表面展示与酒精发酵 传统的酒精发酵是以淀粉质谷物或糖蜜为原
料。随着燃料酒精需求的日益增长，以天然 纤维素类资源生产酒精的研究也日益受到人 们重视。由于纤维素类物质是自然界中一种 潜在的可再生资源，对解决未来能源问题有 着巨大的潜力，因此，天然纤维素酒精发酵 具有重要意义。Fujita 等成功地将三种纤维 素水解酶同时展示在酿酒酵母表面，从而构 建了能够增效和按顺序降解纤维素的全细胞 生物催化剂。
关于酵母表面展示 技术
细胞表面是细胞内外的功能界面。一些表面蛋白 横穿过质膜，另一些以共价或非共价结构与细胞
表面复合物结合一起。细胞能够锚定特定的表面 蛋白，并且能将其限制在细胞表面的特定区域。 在生物技术中，细胞表面通常用于研究蛋白跨膜 的机理。酵母细胞表面展示技术是近年来发展较
快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是将外 源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列 融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运 到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞
外源蛋白
酵母表面展示系统适合展示各种真核蛋白，包括酶、细 胞识别因子、受体、抗体、抗原等，被广泛地应用于蛋 白质工程、全细胞催化、生物转化、细胞吸附、分子识 别、生物治疗、信号转导、生物传感器和疫苗等领域。 外源蛋白与载体蛋白的融合方式有 C 末端融合、N 末端 融合、插入融合。对某些外源蛋白，选择恰当的融合方 式可以明显改善展示效果或蛋白的功能特性，如 Aga2p 蛋白有良好的柔性，外源蛋白可以以 N 末端或 C 末端 两种方式与其融合。研究表明抗 CD3ε单链抗体融合于 Aga2p 蛋白C末端时，其亲和力较天然蛋白降低 30～100 倍[5]，而融合于N末端时活性得以恢复。
表面，在医药、食品、生物燃料等多个工业领域 都有广泛的应用前景。
原理
酵母是单细胞真核生物,根据交配型的差 异分为两种单倍体:MATα和MATa,其细胞 表面分别表达α-凝集素和a-凝集素,它 们可以介导细胞之间的交配融合。酵母 表面展示系统应用的是酿酒酵母的a-凝 集素,外源蛋白借助它在细胞表面得到展 示。a-凝集素由核心亚单位(Aga1)和结 合亚单位(Aga2)两部分组成,Aga1共有 725个氨基酸,它与酵母细胞壁的β-葡聚 糖共价连接。Aga2共有69个氨基酸,它通 过两个二硫键与Aga1结合,表达于酵母细 胞表面。Aga2的N端部分参与二硫键的形 成,外源蛋白通过与Aga2的C端融合可展 示于酵母细胞表面。
酵母表面展示系统的类型
最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集 素展示表达和絮凝素展示表达
凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编 码凝集素C端编码序列(含GPI锚定信号序列) 连接后插入质粒载体的信号肽下游， 融合蛋 白诱导表达后， 信号肽引导嵌合蛋白向细胞 外分泌， 由于融合蛋白C末端存在含GPI锚定 信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵 母细胞壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵 母细胞表面。
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载体蛋白
酵母细胞表面包被着一层坚硬的细胞壁，由内 层的葡聚糖骨架和外层的甘露糖蛋白构成。甘露 糖蛋白主要包括两类蛋白质：一种以非共价方式 松散地结合于细胞壁，可以用SDS 抽提；另一类 蛋白必需以 β-1,3 或β-1,6 葡聚糖酶消化细 胞壁后才能抽提，这类蛋白常含有 GPI 锚定区 域。α-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如Cwp1p， Cwp2p，Tip1p 等都属于 GPI 家族蛋白，外源蛋 白与它们融合后可被共价锚定于细胞表面，这些 蛋白是常用的酵母表面展示载体蛋白。
酵母表面展示系统与新药筛选
将未知功能的目的基因产物或特定病理过程相关 蛋白产物展示在酵母表面，对cDNA 表达文库或 突变体库进行筛选，能发现与这些未知功能的基 因产物或病理过程相关产物发生相互作用的物质， 有助于对未知基因功能的研究，并能发现一些药 物作用的新靶点，或筛选到治疗疾病的新药先导 化合物 。Visintin 等将酵母表面展示技术与酵 母双杂交技术相结合，将抗体的单链（scFv） 片断连接到转录因子VP16 的激活结构域( AD) 上， 将抗原连接到酵母LexA的结合结构域( DB) 上，以His3 和LacZ 为报告基因， 建立抗原抗 体相互作用的展示方法。当抗原- 抗体发生相互 作用时，AD 和DB 的结合将启动报告基因的表达， 可通过营养缺陷培养基进行检测。这种方法从 scFv 突变体展示库中将有可能筛选到抗原特异 的抗体，为疫苗及抗体类药物的研制提供良好的 平台。
酵母表面展示系统基本组成
宿主细胞 酿酒酵母一直被认为是安全的模式生物（GRAS）而广泛
应用于食品工业和医药工业，也是目前常见的用于酵母 表面展示的宿主细胞。除酿酒酵母外，近年来酵母展示 平台已被拓展至某些能利用甲醇作为单一碳源和能量来 源的细胞株，如巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母。与酿酒酵 母相比，嗜甲醇酵母细胞株具有更优越的发酵特性，如 能够在廉价的碳源中生长和更高的细胞培养密度，这些 特性使其在需要大规模发酵的应用中更具优势，例如展 示异源酶作为全细胞催化剂。另外，毕赤酵母对外源蛋 白的 O-糖基化程度更高，因而对展示的外源酶具有更好 的稳定效果。