清醒动物脑部微透析操作流程
脑和脊髓微透析采样技术的理论
脑和脊髓微透析采样技术的理论、方法和应用1王云综述 1 岳云2史琳审校1首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉科（100020）2比利时布鲁塞尔自由大学医学中心麻醉科1、概述全麻下中枢神经系统功能变化的研究是麻醉学领域内重要的课题之一，全麻下中枢神经系统的功能诸如学习和记忆、感觉和运动、觉醒与无意识等的变化与神经元之间的信息传递有着极大的关系。
而神经元之间的信息的传递是以递质分子的释放、识别和灭活为基础的。
神经细胞间隙是神经元之间传递信息的主要场所，因此了解全麻下中枢神经系统活动机理，必须对神经细胞间隙中的化学物质进行动态监测。
传统的神经化学的研究大多是对离体脑组织的分析，这些离体分析方法所提供的通常是一种静态的、混杂的结果，包括了细胞器、细胞浆及细胞外液中成分的总和。
随着认识的深入和材料科学的进步，人们在推挽灌流基础上发展了的微透析技术，再加上微量递质检测技术的飞速发展，使得活体动物神经递质的在线测量成为可能，从而使行为学的研究与中枢神经系统相应区域的神经递质的释放相联系起来，有利于更深层次地揭示整体动物神经活动过程中的化学调控规律。
目前，此技术已成为研究全麻下神经化学特别是神经递质和神经肽的重要手段，并开始应用于疼痛的脑和脊髓机理的研究，临床上亦有使用该技术监测脑代谢的报道。
2、脑和脊髓微透析的原理2．1原理微透析是监测活体组织细胞外化学物质变化的一种技术，它以小分子物质和水能通过半透膜顺浓度梯度扩散的原理为基础。
将透析膜植入特定区域，用组分和理化性质类似于相应组织细胞外液的溶液进行持续灌流，当待测物质的浓度在透析膜一侧较高时，这些物质就会顺浓度梯度进行扩散。
由于灌流的持续进行，透析管内的液体不断的流动更新，因此跨膜浓度梯度始终存在。
通过不断收集一定量的灌流液测定其中的待测物质的含量，从而达到对该物质的动态监测。
2．2回收率（recovery）微透析探头的透析效能可以它对待测物质的回收率来表示，通过比较透析液和探头外介质中待测物质的浓度可以确定该物质的回收率。
利用微透析技术在大鼠脑内取样的方法
利用微透析技术在大鼠脑内取样的方法本文通过查询文献并结合笔者的实际操作经验，介绍微透析技术原理，以及利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的方法。
标签：微透析；透析液；立体定位；rACC脑区；大鼠前扣带皮层（anterior cingulate cortex，ACC），尤其是其吻侧部（rostral ACC，rACC）是参与情绪情感反应的重要中枢[1-3]。
已有研究证实，rACC也是伤害性刺激传入高位中枢时形成痛厌恶情绪的重要脑区[4-6]，那么在痛情绪发生时rACC脑区神经元释放的神经递质有何变化是我们所关注的。
微透析技术正是一种可以探究这一問题的手段。
该技术是将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术，具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点[7]。
目前，微透析技术主要应用于大脑、血液、脊髓等部位[8-11]，通过定位后取样再检测，观察目标神经递质的相对变化，可在麻醉或清醒的生物体上使用。
在清醒生物体上进行微透析实验比起麻醉生物体，取得的样本会更接近于正常生理状态[12]。
但由于动物处于可自由活动的状态，存在很多不确定因素，因此实验中所需的条件和对动物的各种操作均要在不断地摸索和尝试中确定。
笔者通过查询文献并结合作者的实验操作经验，介绍利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的方法，现报道如下。
1 定位1.1 微透析探针的选取微透析探针的供应商有瑞典的CMA公司，美国的BAS公司和日本的EICOM公司，另外也有实验室采用自制的微透析探针。
本实验室采用的是EICOM公司的探针，根据定位脑区的深度和所需检测的目标神经递质的分子量大小（一般检测的神经递质为氨基酸类神经递质和单胺类神经递质），选择所需的探针规格。
EICOM公司的脑组织探针主要有三个系列，本实验室选用的探针样式为A-Z系列带有导管、内芯和导管配套的螺帽，探针规格为管长4 mm，膜长2 mm，膜材料：人造纤维素，50 kDa截留分子量，见图1。
微透析取样技术在药动学方面的应用
１ ． 统 组 成 ２系 态 下取血得到样本 ， 两者的吸收和分布会有差异 ， 然而微透析方法可 以 微透 析系统 的组成 主要分为 四个部 分 ， 微注射泵 、 微透析探针 、 微 更 加直接 的取得药物作用靶 部位的细胞外 液游离药物 的样本 ， 且用 同 收集 器以及连接 这些 部分的导管 。其中最主要 的部分是微透析探 针 。 位素法实时校正探针的 回收率 ， 使实验数据更精确且可靠性更高 ， 体现 微 透析探针有 多种类 型 ， 同心 圆型的探针ｎ是现在应 用最为广泛 的探 了微透析技术应用于脑 内药动学研究 的优越性 。 针 。这种探针是 一种顶端连有半 透膜的 同心 圆型套管 ， 主要应 用于脑 另外 ， 透析技术也 为药物在对血脑 屏障穿透性 的研 究方面提供 微 内微透析实验 。除了同心圆形探针外 还有柔性探 针 、 线性探 针 、 分流探 了更加有效的试验方法 。血脑屏障是保持 中枢神经系统 内微环境稳定 针等 ， 每种探针所应用 的条件是不 同的 ， 实验时需要根据实验的具体 的重要屏障 。也正是因为有血脑屏障 的存在 ， 在 很多药物难 以进入脑 内， 要求来选择不 同类 型的探针进 行实验 。有 些时候 在考虑到实验成本或 使一些药物无法发挥其原有的效应 。利用微透析取样技术和现代检测 技术联用 ， 以准确 的测定药物转运至脑 内的含量 ， 于研究药物对血 可 用 则实验需 要特殊类型 的探针时 ， 可以实验室 自制微透析探针 ， 也 辛亮 等人对 微透析探 针进行研究后 自制了同轴 型微 透析探针 ， 并对 此探针 脑屏障穿透性 。马爱梅等 在研究 Ｐ 糖蛋 白对卡马西平和苯妥英钠通 一 进行 了性 能评 价 ， 实验结 果显示 实验室 自制探针性能稳定 ， 可用于体 内 过大 鼠血 脑屏障 的影 响时在大 鼠的大 脑皮质内放置微透 析探针 ， 既是 微 透析研究 。微 透析系统建立成 功后 ， 因为药 物在探针 内外存 在浓度 为 了收集透析液 ， 检测卡马西平和苯妥英钠在脑 内的浓度 ； 又是为 了将 Ｐ 糖蛋白拮抗剂 ） 局部应用 于靶部位 。经过腹腔注射卡马西 差 ， 系处 于不平衡 的状 态 ， 体 透析液中的药物也只是靶器官细胞外液中 维拉帕米 （一 ２ｍ ／ ） ｋ ５ｍ ／ ） ｋ 用 药 物的一部分 ， 需要测定微透 析探针 的相对 回收率。而微透 析探针 平 （０ ｇ ｇ 和苯妥英 钠 （０ ｇ ｇ 收集 透析液后 ， 高效液相 色谱进 故 结果显示 ： 应用 维拉帕米后 ， 卡马西平和苯妥英钠 在脑 内的浓 的相对 回收率受到很多 因素 的影响 ， ： 如 温度” 、Ｈ 待测物质 的相 行分析 ， ｐ 值ｕ 、 在大 鼠的脑 细胞外液 中 ， 马西平 和苯妥英钠 分别在 卡 对分子质 量 、 的半径 和长度ｕ 、 探针 灌流液的组成和灌流速度 、 微透析 度都 有所上升 ， 膜 的性 质 以及生 物体本 身一些因素 的影响等 。所 以还 需要对探针的 ６ ｍｉ［１ ４± ．８ ｐ ／ 】 ９ ｍｉ［１ ７± ．１ ￣ ／ ］ ３ ｒｉ［１ ８ － ０ ｎ（． Ｏ２ ） ．ｍｌ ０ ｎ（． ０３ ）ｘ ｍ１和 ０ ｎ（ ． ７ ｇ ， ８ ｇ ａ ０４ 相对 回收率进行校正口 ， 到较为准确 的实验结果 。 哪 以得 ０３ ） ｇｍ １６ ｍｉ［１５ ＋ ．２ ￣ ／ １ １０ ｎ（．１ Ｏ１ ） ｇｍ１内 药 ．０ ￣ ／ ｌ，０ ｎ（ ． ＿ ２ ） ｇ ，５ ｍｉ［Ｏ９ ± ．９ ￣ ／ ］ ４０ ｍｌ １ ． ３技术特点 物浓度与未 添加维 拉帕米的脑细胞外液中卡马西平 ６ ｒｉ［１ ５ Ｏ２ ） ０ ｎ（． ± ．１ ａ ４ 在药动学研究 中 ， 的方 法往往 是以收集血液 、 传统 尿液等或则是采 ｐ ／ ］９ ｍｉ［１５ ￣ ． ） ｇｍ］ 苯 妥 英 钠 ３ ｍｉ［Ｏ８ － ．Ｏ ￣ ／ ］ ￣ ｍ１ ０ ｎ（ ． ０２ Ｉ ／ １ ｇ ， ２ ２ｘ 和 ０ ｎ（．０． ２ ） ｇｍ１ ０ ， 取组织匀 浆的方法来研 究药物在体内的变化过程。 即在给药后不 同时 ６ ｍｉ［１ ４ Ｏ２ ） ｇｍ １１０ ｎ（．２ ０１ ） ｇｍ］ ０ ｎ（． ± ．３ ￣ ／ ｌ，５ ｍｉ［Ｏ７ ＿ ．５ Ｉ ／ １ ２ ＋ ｘ 的药物浓度相 比具 间点采取血样 或者活检组织制成 匀浆 ， 测定 血浆或组织匀浆 中的药物 有统计学 差异 ， 明维拉 帕米 的应用 可以提高卡马西 平和苯妥英钠通 说 浓度， 以血浆 药物浓度或则组 织匀浆药物浓 度对时间绘制 药物浓度一 过大 鼠的血脑屏障。因此 ， 以推 断出 Ｐ 糖 蛋 白限制 了卡马��
宠物疾病诊疗-电解质及血气检查--采血
静脉血采集
应用：
为了获得静脉血样本进行分析。
常用解剖部位：
颈静脉、前肢头静脉、后肢外侧隐静脉、 后肢内侧隐静脉
常用部位
颈静脉
颈外静脉是位于颈静脉沟内的浅表大静脉，颈静脉沟位
于颈部两侧，气管的背外侧。
颈静脉采血方法
小型犬和猫俯卧保定与桌子上，以便 进行颈静脉穿刺术。紧靠腕关节上方抓住 前肢，并将前肢拉出桌子边缘。伸展动物 的颈部，使其鼻子朝向天花板。
头静脉采血方法
左右头静脉是位于前肢头侧面的浅表静脉，很容易进行静 脉穿刺。
头静脉穿刺的保定方法
保定人员应站在将要抽血肢的对侧，用一只 手臂环绕动物的颈部以保定其头部，并使其远离 抽血肢。用另一只手臂抓住动物的肘部向前推， 使该肢伸展。
用手握住前肢，将头静脉向外翻转并压迫， 使静脉充血扩张。
固定头静脉
中型犬可俯卧或坐在桌子上，用一个 手臂环绕犬的身体，使之贴着保定人员的身 体，另一只手保定头部，使其鼻子朝向天花 板。
大型犬可坐在地上，保定人员跨在全身 上，将其鼻子朝向天花板
在胸腔入口处按压气管外侧的颈静脉沟，使静脉 充血扩张。
用酒精消毒，触摸扩张的静脉，摸清它从下颌角 到胸腔入口处的路径。
针尖斜面向上，针头与静脉成20 ° -30°角刺入。 血样采集完后，立刻放松压迫静脉的手，停止抽 吸，从静脉内拔出针头。轻轻压住静脉穿刺点约60s。
保定者用一只手伸展猫的颈背，另一只手屈 曲上面的后肢。穿刺者抓住靠近桌面的后肢跖部 ，并使其伸展。
保定人员对腹股沟部施压，压紧内侧隐静脉 使之充血扩张。
外侧隐静脉穿刺的合理保定姿势
动物侧卧保定，四朝向静脉穿刺者，背部靠 近保定人员。
保定人员用一只手抓住动物两前肢，轻轻提起 使其离开桌面，同时用同一只手的前臂对动物的颈部 施压以保定动物。用另一只手抓住位于上方的后肢。
线性微透析探针用户指南(上)
LM线性探针用户指南02/06转A-1340介绍微透析采样的应用起源于神经科对于大脑内部组织的研究。
微透析采样技术在药代动力学中的应用已被证明有许多优势：比如频率更高的采样数据点，更加纯净的样品，以及样品在每次研究中在被试动物体内更少的损耗。
BAS线性组织探针适用于对于外周组织的体内采样：例如真皮层、皮下组织、肌肉、肝脏等器官。
微透析探针由一截短的中空透析纤维分别与窄孔的入口和出口管连接而成。
与组织周围体液中成分相近的灌注液以恒定的流速泵入并通过探针。
小分子量分析物可以在探针内外自由扩散，而大分子如蛋白质或蛋白质化合物则被透析膜排除在探针外。
进入透析管内的分子被连续流动的灌流液不断带出。
透析所得液体将被收集起来以供分析。
设计标准探针透析膜的有效长度有10毫米或5毫米两种。
设计长的入口和出口管能够在用于清醒的动物时，使得探针在皮下组织更容易外化。
纤维骨架有助于增加探针植入时的强度。
塞子在纤维骨架延伸的一端密封探针。
这个塞子可防止在手术中有体液进入探针。
它需要在探针连接到注射推进器并被灌注液体前切断。
半透膜纤维骨架临时塞子（保护探头在植入）探针制备半透膜的腔体内涂有一层甘油保护膜。
在去除之前，甘油可能会干扰实验结果或影响恢复。
因此在体内研究中，探针植入时一般不需要冲洗。
甘油会在组织的正常恢复过程中代谢吸收（通常在植入手术完成数天后）。
由于需要去除塞子，因此不建议对进行体内研究的探针进行预处理。
此外，一旦润湿，半透膜将变得更加柔软和难于操作。
对于体外研究，临时塞子必须在灌注液体前去除。
将探针浸入水、林格氏液或人工脑脊髓液中，同时灌注相应溶液30分钟（2μL/ min），即可除去甘油。
探测效率微透析采样通常不会在平衡条件下进行，因此探针内的溶液将与周围组织液产生浓度差。
灌注液的流速通常过快，使得它在探针内外样品浓度达到平衡之前带走样品。
透析液中分析物的浓度相对于样品基质中的浓度称为回收（recovery）。
微透析技术
微透析技术一、微透析技术微透析(Microdialysis)技术是一种将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术。
具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点。
可在麻醉或清醒的生物体上使用，特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。
目前已成为实验神经生理学和神经化学的重要研究工具之一, 它可提供递质释放、摄取和代谢的必要信息。
1、主要原理以透析原理作为基础，通过对插入生物体内中的微透析探头在非平衡条件下进行灌流，物质沿浓度梯度逆向扩散，使被分析物质穿过膜扩散进入透析管内,并被透析管内连续流动的灌流液不断带出，从而达到活体组织取样的目的。
2、微透析系统及其特点2.1、微透析系统装置主要由微量泵、微透析探头、收集器、连接管及配套设备组成。
2.1.1、微量泵以注射泵为佳,有利于减少恒流泵和蠕动泵的波动, 流速一般为1~5μl/min。
2.1.2、微透析探头有直线性探头、环形探头、同心型探头等不同的类型(微透析管因实验对象不同而形状大小各异)；按照探头的形状分为穿颅探头、U型探头、I型探头、环形探头等。
目前普遍应用的是同心型探头，微透析探头通常是由一管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成双层管道；长度一般为1～10 cm。
半透膜由再生纤维素、聚碳酸酯或聚丙烯腈制成, 载留分子量5～10 KD不等。
实际应用需根据具体组织和待测物选择不同的微透析探头。
微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体( in vivo)、实时( real time) 和在线(on line) 取样, 特别适用于研究生命过程的动态变化。
微透析技术的优点是活体取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等。
该技术的另一大优点是样品的采集与分析过程既可在位又可离位进行。
此外微透析技术的独到之处是可以单独取得细胞外液, 因此可对体内神经递质的释放量进行动态监测, 具有重要的生物学意义。
脑内微透析采样技术
对高K+的影响
高K+能诱导神经元产生去极化进而释放 神 经 递 质 增 加 ， 研 究 发 现 当 灌 流 液 中 K+ 浓度由30mM增加到100mM，灌流液中DA、 5-HT、Ach、NA等释放迅速增加。同时发 现氨基酸类物质释放也增加。
应用脑电刺激的影响
通过电刺激脑内神经投射通路促 进神经递质的释放。
TTX是一种神经毒素，能够阻断Na+通道， 抑制神经元的电活动，减少神经递质的 释放。根据文献报道，TTX对DA，5-HT等 这类递质的释放有较高的敏感性。而对 氨基酸如谷基酸、牛磺酸等物质的释放 无效。
对Ca2+的依赖性
Ca2+的内流与神经递质的释放有密切的关 联，降低细胞外Ca2+浓度能抑制突触神经 递 质 的 释 放 。 实 验 发 现 用 不 含 Ca2+ 的 Ringer's 液 灌 流 发 现 灌 流 液 中 递 质 如 DA 、 5-HT、Ach、NA等释放逐渐消失。
样品检测
透析样品可直接用HPLC-电化学/荧光/紫 外检测技术或其他高灵敏度微量化学分 析法测定。对于某些含量极低的物质， 可增加回收率的方法来弥补灵敏度的不 足。如可加长透析膜的有效长度、改变 灌流速度，也可使用药方法（如在灌流 液中添加摄取阻断剂）以提高待测物质 含量。
微量采样的定量方法
在微透析实验中，我们通常关心的是药 物或行为操作所引起的神经递质释放的 变化，这种变化可以用相对于基础浓度 的百分数表示。也可以通过计算透析回 收率，将透析液中物质的浓度转换成脑 内细胞外的实际浓度。
微透析与传统的灌流方法相比 具有：
由于灌流液并不直接与脑组织接触，其 对脑组织损害较小。
微透析样品通过透析膜过滤而得到，样 品避免受到大分子物质如蛋白质、酶类 等污染，透析样品可直接进样测试。
猫咪肾衰的透析治疗
小动物透析机在猫咪肾衰竭的治疗上，除了用药、输液外，对于体内排毒的需要，透析也是必不可少的，肾衰竭影响肾的滤过作用，若不能及时将营养和毒素过滤出来分别输送至体内和排出体外，将会对机体造成进一步的损害，透析分为血液透析和腹膜透析两种，在若干年前，腹膜透析一直是肾衰透析的主要方法，近年随着血液透析技术的不断完善，血液透析液逐渐被运用于医疗中。
一、血液透析血液透析（HD）是急慢性肾衰竭，少尿或无尿期肾病等最有效的肾脏替代治疗方法之一，而血液透析治疗已成为人医学领域中最成功的器官替代治疗方法，而在动物方面仍属空白。
肾脏替代治疗的目的是通过清除血循环内的尿毒症毒素以阻止它们在组织中的蓄积，血液透析将动物血液与透析液分别引入人造半透膜的两侧，作逆向流动，通过扩散、对流、吸附作用实现半透膜两侧溶质的移动，通过超滤作用实现水的清除。
血液透析步骤待动物麻醉苏醒后，测定血压，根据动物体表面积选择合适的体外循环管路及人工肾，并进行透析液A、B液浓度检查。
开机自检：打开水处理开关，进行水处理预冲。
将透析机打开，按要求进行机器自检。
血液透析管路的安装：检查血液透析器及血液管路外包装无破损后按照体外循环的血流方向依次安装，使其一端与动脉端相连，另一端与静脉端相连。
透析液管道分别与透析器的透析液室出入口相连，然后把动脉端段嵌在血泵上，将静脉捕气室固定好，血液透析器静脉端朝上。
管路预冲：启动血液透析机，用生理盐水洗净透析管路和透析器血室气体。
待生理盐水预后进行闭式循环，最后用肝素盐水预冲。
透析前测定动物基础凝血功能检查，ACT：108S，检查血液透析导管，用注射器回抽检查血流并推注首剂量肝素，5分钟后重检ACT值为262S，达到理想值后，准备连机引血。
透析完成后回血操作：插入无菌针头，调整血流量至2ml/min，关闭血泵，用血透钳夹住动脉端，并将动脉端与生理盐水相连，打开血泵，用生理盐水全程回血后夹住静脉端。
用准备好的无菌纱布、弹力绷带等对手术部位进行包扎。
小动物活体成像操作说明手册
小动物活体成像操作说明手册第七部分操作7.1准备程序图7.1麻醉准备程序在开始麻醉程序之前，做一些准备程序可以帮助实验顺利进行，请参看图7.1 1) 请把不用的出气口用特制的黑色橡胶塞塞住。
(PN10168) 2) 把锥形通气口的位置对准。
3) 在麻醉程序开始前对照图片确保出气支管位置正确。
4) 确认气体循环管没有打结阻塞和松动。
5) 确认蒸发器内有足够的乙氟醚(Isoflurane)，如果需要注入请参看下一节。
7.2蒸发器注入程序警告:不能在正在进行氧气供应时向蒸发器内灌注液体乙氟醚(Isoflurane)。
注入前，关闭供应打开前面板上两个阀门开关监视流量计。
当流量球在指示管中的底部保持不动时说明已无气体流动，此时可以进行注入。
警告:只有当蒸发器控制旋钮处于关的位置才可以进行注入，在注入过程中不能打开任何氧气供应。
警告:只能使用乙氟醚(Isoflurane)不要使用其它麻醉气体，使用其它麻醉剂可能会导致危险。
警告:在处理剩余的麻醉剂时实验室要具备良好的通风条件，建议遵照已公布的安全条例进行操作，当丢弃剩余的乙氟醚(Isoflurane)时使用蒸发器使用手册上推荐的合适的化学容器。
警告:使用时XGI,8麻醉系统要保持直立状态。
蒸发器注入步骤1) 如图7.2所示，确保氧气供应被切断，可以在源头或减压阀处关掉它。
2) 如图7.3所示，确保蒸发器开关处于关的位置。
3) 打开两个前面板的阀门开关释放XGI,8的氧气，如图7.4所示可以看到阀门处于打开位置，流量计指示氧气已放完后，关闭这两个阀门开关。
4) 反时针旋转卸掉蒸发器的螺丝帽(如图7.5)。
确认试剂是乙氟醚(Isoflurane)，缓慢的倒进灌入口，透过玻璃指示窗随时观察乙氟醚(Isoflurane)的水平线，注意不要超过最大允许线。
如图7.6所示。
5) 注意:如果蒸发器在灌注前是干的，水平线在开始会轻微下落因为内部的棉芯会吸收一部分试剂。
6) 当乙氟醚(Isoflurane)达到玻璃指示窗上的最大标线时，表明蒸发器已灌注满。
小鼠脑内兴奋性氨基酸的体外微透析法测定(精)
小鼠脑内兴奋性氨基酸的体外微透析法测定*在动物缺血缺氧性脑损伤的研究中，有关脑内兴奋性氨基酸毒性的研究近年来取得了很大进展。
许多证据表明，缺血缺氧可导致动物脑内兴奋性氨基酸持续升高，细胞膜上离子通道病理性开放，细胞内Ca2+超载，最后造成急性期神经元水肿和退变［1，2］。
因此，对脑内兴奋性氨基酸含量的测定已成为目前研究缺血缺氧性脑损伤及内源性保护机制的重要手段之一。
为了深入研究缺血缺氧性脑损伤的机制，以及内源性的缺血缺氧耐受机制，我们建立了小鼠脑内兴奋性氨基酸的体外微透析-高效液相色谱(high performance liquid chromatograph, HPLC)快速测定方法，并应用于急性重复缺氧小鼠研究中。
材料与方法(一)仪器：1050 A型液相色谱仪，美国惠普公司(Hewllet-Packard)产品。
WZS-50型微量注射机(灵敏度：±5 μL/h)浙江医科大学医疗器械厂产品。
(二)试剂：氨基酸标准品、邻苯二甲醛(o-phthaldialdehyde, OPA)、硼酸为美国Sigma公司产品，巯基乙醇、甲醇、无水乙酸钠等均为国产分析纯试剂。
(三)样品制备：1.急性重复缺氧动物样品的制备：将昆明小鼠(体重16.00～22.00 g)置于含有新鲜空气，经过标定的125 mL广口瓶中，以橡皮塞密闭，一出现喘呼吸立即取出，并随即转移到另一相似体积的、含有新鲜空气的广口瓶中，密闭。
如此重复1次或4次后立即断头，将鼠头迅速置于液氮罐中，隔夜取出。
冰浴条件下取脑组织约400 mg，加入冰冷的超纯水1.5 mL，匀浆。
匀浆液立即置于4℃保存，4 h内透析。
2.空白对照样品的制备：空白对照组动物除不经缺氧处理外其它处理同缺氧组。
(四)微透析实验：1.微透析探头：选用瑞典Camegie Medicine公司生产的CMA/10型同心圆微透析探头，透析膜长4 mm,外直径0.5 mm。
2.透析探头体外回收率的测定：将透析探头分别置于不同浓度的氨基酸标准混合液中，用微注射机以1.0 μL/min速度向探头内灌流生理盐水，在0～4℃条件下收集透析液，用HPLC法测定透析液中谷氨酸(glutamate, Glu)与天门冬氨酸(aspartate, Asp)含量，观察探头外氨基酸浓度对探头回收率的影响。
微透析技术在药物动力学和药物代谢研究中的应用
微透析技术在药物动力学和药物代谢研究中的应用微透析技术是近年来应用于药物动力学和药物代谢研究中的一项新兴技术，该项技术在药物代谢和药代动力学研究领域中已取得重大的进展并有广阔得应用前景，本文概述了微透析技术的基本原理及特点，并重点介绍了其在药物代谢和药动学研究中的应用。
标签：微透析；药动学；药物代谢微透析(Microdialysis，MD)技术是近些年来临床上发展起来的一种新型取样技术，其原理与透析相同，可通过器官与组织中的体液进行连续、动态取样，取得的透析液较为纯净，且均为小分子物质，能与HPLC/MS或HPLC联用,组成HPLC/MS或HPLC联用新技术进行原位在线分析，具有“微创、高效、实时、活体”等特点。
在麻醉或清醒的生物体上进行深部组织的操作以及重要器官的生化研究具有重要的意义。
随着近年来微透析技术的不断发展，该项技术在临床上的推行也越来越广泛。
目前微透析技术在药物代谢和中药药动学研究领域同样发挥着重要的作用[1]。
1基本原理微透析技术是以透析原理作为基础的在体取样技术，是在非平衡条件下即流出的透析液中待测化合物的浓度低于它在探针膜周围样品基质中的浓度，灌注埋在组织中的微透析探针，组织中的待测化合物沿浓度梯度扩散进入透析液，被连续不断地带出，从而达到从活体组织中取样的目的[2]，通过测定流出液即透析液中待测物的浓度来研究组织中待测物的水平。
这是一种动态连续的取样方法。
简单地说，微透析技术的原理就相当于在组织中创造了一个“毛细血管”[3]，使化合物在浓度差的作用下扩散而进入此毛细血管,然后随液体流动带出体外进行检测原理及其系统组成微透析技术不同于以往传统的研究手段,它是一种动态连续取样方法。
简单地说,微透析技术的原理就是创造一个“人造血管”[1],使待测化合物在浓度差的作用下扩散而出入此“人造血管”。
在体微透析技术首先在组织中植入具有半透膜的探头(probe)装置，透析膜能允许小分子物质及水分通过，体外微流泵能允许一定的灌流也通过探头，由于透析膜两侧存在浓度差，物质会从高浓度方向向低浓度方向扩散。
宠物医院常见检查操作流程
宠物医院常见检查操作流程：血常规操作流程一、采样1.根据医生处方领取EDTA抗凝管。
(江南博哥)2.根据动物体型选用合适的静脉采集静脉血。
注意采血时间不能过长负压不能过大。
3.将血液沿着侧壁注入抗凝管，注入后盖紧帽盖并上下颠倒4-5次充分混匀。
4.样品编号。
编号方式：如在样本未放入样本室前屏幕显示为3，则该样本编号为3.（二）血球仪计数(江南博哥)1.填写使用登记表。
2.上下颠倒4-5次抗凝管。
3.打开SYSMEX血球仪样本室。
4.打开盖帽。
将样本放入样本室，然后关闭样本。
5.在操作界面选择动物种类，样本编号。
选定后按下“运行”按键进行分析计数。
6.机器提示“吸样完成取出样本”字样后，取出样本放于试管架上。
7.SYSMEX血球仪分析结束后撕下机器打印的数据，填写血常规报告单。
报告单一式两份一份送医生处一份留在化验室保存。
8.整理工作台面。
生化检验操作流程（一）采样1.根据医生的化验处方单领取肝素锂抗凝管。
2.根据动物体型选用合适的静脉血管采集静脉血液。
注意采血时间不能过长，负压不能过大，以免造成血凝和溶血。
3.将血液沿侧壁注入抗凝管，注入后盖紧帽盖，并上下颠倒4到5次充分混匀。
4.样本编号。
编号方式为样本的病例号编号。
（二）样本检验1.使用“IDXX State spin”离心机对样本进行离心。
血液样本采用"NORMAL"或"HARD SPIN"选项，尿液样本采用“URINE SEDIMENT”选项。
2.样本离心后，将血浆移到样品杯中。
3.填写使用登记表核生化板使用记录表。
4.移去IDXX生化仪防尘罩，选择"NEW SAMPLE"，选择动物种类，输入病例编号，放入试纸板，安置tip，吸样，检测。
5.IDXX生化仪分析结束后，撕下机器打印的数据，填写生化检验报告单，报告单一式两份，一份交与医生处，一份留在化验室保存。
6.整理工作台面。
显微镜检查操作流程。
动物微透析仪器操作步骤(精)
动物微透析仪器操作步骤（供参考）1.去除老鼠头皮，清洁头盖骨。
在头盖骨上面选定的位置打小孔。
2.把探针底座埋入上面的孔里面。
在孔的附近打2-3个很浅的孔，旋入小螺丝，目的是增加探针底座的与头盖骨的粘合力。
用粘和剂固定探针底座。
重要的是：需要精确选准探针埋置的部位，才能够得到最多的微透析样品。
3.再把探针插入探针底座。
4.根据实验需要，选择泵控制器的流速。
把泵控制器上面的连接扁线插入泵的插孔。
5.在注射器中灌入实验需要的液体，放在泵架子上面。
6.设置自动恒温冷冻收集仪的参数。
7.把老鼠放入清醒系统的笼子内。
注射器----探针，探针----自动恒温冷冻收集器，上面两者之间用管子和接头连接。
8.检查无误。
接通泵控制器电源，微透析仪器开始工作。
微透析实验与许多实验不同，很多方面取决于操作者的技能水平。
1.埋置探针的部位要准确。
埋置探针的深度也要准确。
选择探针的膜长度需要合适。
目的是得到最多的微透析样品。
2.操作探针需要细心，需要避免探针膜的损坏，从而延长探针的寿命和使用次数。
3.探针使用前的处理。
以及在使用间隔时候的处理，冲洗，浸泡..，目的也是延长探针的寿命和使用次数。
4.在连接注射器、探针、液体选择开关、自动恒温冷冻收集仪，等等系统的时候，需要细心，连接管、接头，与上述物件，套/插时候，一方面，需要防止漏液和堵塞，另一方面，也要防止连接管和接头的损坏。
5.探针，连接管，接头，是消耗品，细心、正确的操作方法，能够延长它的使用寿命好次数。
6.灌流液体的配制，流速的选择。
自动恒温冷冻收集仪的参数（延时时间，收集时间，间隔时间，等）选择。
等等，都需要学习和自己经验的积累总结。
尤其是埋置探针，是得到微透析液体的重要步骤，操作者的手法非常重要。
要使实验成功，操作者的技能水平的重要性，比仪器本身还要重要。
优秀的操作者，容易得到微透析液，量多质好，消耗品（探针、连接管、接头）的使用寿命长、次数多。
微透析技术与方法
（三）麻醉
1.非复原性（急性实验 acute preparation）
用 chloral hydrate 或 urethane麻醉，麻醉时间较长
实验进行中，用加温毯或台灯将动物体温维持在 37 °C。
手术（30min），然后等 2 小时作基础值测定期 （baseline period）,看(单胺释出量)有否趋于稳定， 然后药物注射之后，继续测定 2 小时左右的给药 测定期（post-drug）。
tubing)； 5.透析膜（Dialysis membrane）； 6.环氧乙烷（epoxy adhesive）； 7.注射针头。
（二）透析泵 1.流速稳定且缓慢，介于 1-5μl/min 2.快速的前进/后退模式，连续而可调整的流速，
和微调控制选择（microprocessor control option）
2. 人工脑积液 (artificial cerebrospinal liquid, aCSF)
• 140 mM NaCl
• 3.0 mM KCl
• 1.2-3.4 mM CaCl2 • 1.0 mM MgCl2
• 1.2 mM Na2HPO4 • 0.27 mM NaH2PO4 • 7.2 mM glucose
无论是术后 4 天纹状体的 DA,还是术后 7 天海 马回的 5-HT，其基本的释出量仍都与钙离子相关， 暗示它们都源自神经元
HPLC-ED 分析单胺及其代谢物实验。(A)单胺及其代谢物标准品。(B)纹 状体透析液。1. norepinephrine; 2. epinephrine; 3. dopamine; 4. DOPAC;
5. 5-HIAA; 6. HVA; 7. 3-MT(3-methoxytyramine); 8. 5-HT.
在体微透析结合HPLC测定小鼠纹状体细胞外尿嘧啶含量
在体微透析结合HPLC测定小鼠纹状体细胞外尿嘧啶含量王天琳;吴春福【摘要】Objective To establish a method for the determination of uracil by using microdialysis and highperformance liquid chromatographic ( HPLC ) system. Methods The analysis was performed on VertiSep reversedphase GES-C18 column (150 mm × 4. 6 mm,5 μm), the mobile phase was acetonitrile-sodium dihydrogen phosphate (0. 02 mol/L) (2:98) ,pH value was 3 ～4. The flow rate was 0. 8 mL/min. UV detection was performed at 260 nm,and column temperature was 0 ～5 ℃. Results The retention time of uracil was 4. 5 min, the linear range was 0. 05 ～1.0 μg/mL. Conclusion This method is accurate, sensitive and simple with a good reproducibility, and can be applied for analysis of uracil in brain microdialysis sample.%目的利用在体微透析结合高效液相色谱法建立检测小鼠纹状体细胞外尿嘧啶含量的方法.方法色谱柱为反向VertiSep GES-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钠(2: 98),调pH值为3～4,流速为0.8 mL/min,检测波长为260 nm.柱温:0～5 ℃.结果尿嘧啶的保留时间约为4.5 min,且在0.05～1.0 μg/mL范围内线性关系良好(R2=0.998 4).结论该方法准确、灵敏、方便,重复性好,可用于脑微透析样品中尿嘧啶的含量测定.【期刊名称】《实用药物与临床》【年(卷),期】2011(014)001【总页数】2页(P41-42)【关键词】在体微透析;高效液相色谱法;尿嘧啶;纹状体【作者】王天琳;吴春福【作者单位】解放军总医院药品保障中心,北京,100853;沈阳药科大学神经药理实验室,沈阳,110016【正文语种】中文尿嘧啶是RNA特有的碱基，是中枢神经系统中最重要的神经递质之一，除参与核苷酸的从头合成通路外，还可作为嘧啶核苷酸补救合成通路的基质，也是磷酸卵磷脂(PC)和脑磷脂(PE)合成通路中的重要物质［1-2］。
微透析仪器技术指标
微透析仪器技术指标高速钻机.转速：1500---30000转/分钟之间选择。
特点：稳定，无抖动，声音非常轻。
可以正向或者反向转动。
恒温加热垫.温度范围：24---45度。
温度精度：小于0.1度。
数字显示：3位。
泵控制器.（有单个控制器和四联控制器2种规格，四联控制器便宜）流速范围：0.1uL---100uL/分钟之间有16档选择（注射器是1mL 规格时），充分满足使用要求。
当注射器是0.5mL规格时，可以流速低到0.05uL/分钟。
泵推3个注射器.：一个泵可以同时推动3个注射器注射器规格. 有3个规格：0.5mL. 1mL. 2.5mL探针规格.脑探针：大鼠. 2mm膜长.和4mm膜长。
小鼠. 1mm膜长. 2mm膜长. 4mm膜长.线性探针：膜长5mm. 膜长10mm. 用于皮下等等。
环型探针：膜长10/20/30/50 mm四种。
用于大动物。
分流探针：膜长25mm。
用于胆液等。
血管探针：膜长5mm. 膜长10mm。
恒温冷冻收集仪. 恒温摄氏4度。
可以放置48个收集管。
可以1个针，或者2个针同时收集。
每个收集管的收集时间：0.1---99.9分钟之间选择。
收集管有2种规格：塑料250uL和玻璃300uL.清醒系统.有2种：普通型—由2个小圆柱组成，依靠动物的拖带转动。
它有设计上的缺陷，即：漏液和转动的矛盾。
如果调节密封紧，可以不漏液，但是不容易转动，堵塞管子。
如果调节密封松，使转动灵活，但是容易漏液；所以，缺点是，2个圆柱之间容易漏液和粘连不动；或者容易使管子堵塞，使实验前功尽弃。
高级型(MD-1404)----是美国BAS公司的独特设计。
由光电传感器和马达组成，使鼠笼朝老鼠运动的反方向转动，保证管子畅通，并且没有漏液。
避免普通型的缺点。
本套仪器不需要计算机配合使用，操作简单方便，流速0.05---100uL/分钟，完全满足需要。
取小鼠脑组织
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。
其实过程与大鼠近似，我的经验是：1.?材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等；2.?步骤：处死小鼠，取头颅；剪开皮肤，漏出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。
3.?注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。
做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。
先麻醉小鼠剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。
具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。
然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。
用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。
生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。
然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。
取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。
宠物医院核磁共振MR检查SOP流程-精品001
核磁共振（MR）检查SOP流程流程说明：1、医疗前台接待当有宠主进来时，微笑着为宠主开门，并说“您好！有什么可以帮到您”或是“您好！你的狗狗/猫猫怎么了:指引宠主购买病历本，填写宠物信息；选择合适的科室进行挂号。
然后将宠主引至医疗区，引导给医生。
2、医生接诊2.1生化检查在完成基础检查完毕后，医生根据基础检查结果，及后面的麻-醉需要，进行进一步的生化检查。
2.1.1如果生化检查结果正常，即可进行麻-醉。
2.1.2如果生化检查结果异常，需要针对性治疗，并且通过再次生化检查确认正常之后，方可进行麻-醉。
2.2X-RAY/DR检查需要全身检查，确认是否存在铁磁性物质存在。
221通过X-RAY/DR检查，如果存在铁磁性物质，则需要进行去除。
如果不能去除或者去除不掉的，则禁止MR检查。
222通过X-RAY/DR检查，如果不存在铁磁性物质，则可进行MR检查。
3、医生开具MR检查化验单同时满足生化结果正常和身体内外不存在铁磁性物质时，意味着可进行MR扫描。
医生开具MR检查化验单，宠主在接诊分院付费。
4、接诊医生填写《核磁共振检查申请单》，见附表1。
5、宠主携带所有检查报告单及《核磁共振检查申请单》到核磁中心进行检查。
6、转诊医生再次核查宠物信息及初步检查结果。
7、在确认无误的情况下，监督宠主签署《核磁共振检查安全知情同意书》及《麻■醉风险协议》。
8、进行吸入式麻■醉。
9、MR扫描/加强扫描根据《核磁共振检查申请单》进行扫描，或根据平扫结果，判断是否需要加强扫描。
如果需要添加加强扫描，及时与宠主沟通，主人缴费后进行加强扫描。
10、一般情况下获取报告时间为24小时，若病情复杂，获取报告时间需另行通知。
附件1:宠物医院磁共振（MRI）检查申请MRI号：宠物医院磁共振（MRI）检查注意事项1.下列情况的宠物及宠主，禁止进入检查室，禁止进行检查和陪伴患者检查：•体内已植入或留有任何金属物品（如：眼球内金属异物、血管结扎银夹等）；•体内或体表安装有任何电子装置者（如：心脏起搏器、生物刺■激器等）；•体内或体表含有其他不明材质的物品者（如：假牙、节育环、化妆品、护发剂等）；•病情危急需立即抢救者，但不能自主配合、不能保持安静不动者；•3个月内的妊娠妇女；•有严重幽闭恐惧症者；2.有手术史者，必须如实告知，有无将金属或电子物品及其他材质的物品留在体内。
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清醒动物脑部微透析操作流程
一、微透析技术基本原理
微透析技术是一种在体微量化学采样与检测技术，由西班牙之Delgado 及瑞典之Ungerstedt 等人于1972年自更早的压抽导管（push-pull
cannula）改进而来。
其基本的原理（如右图
所示）：选择具有一定截留分子量的纤维半透
膜制成的探针埋入待测的组织区域，以恒定速
度向探头内灌注与组织液成分相近的等渗灌
流液，当灌流液流经探头前端透析膜时，组织
内小分子量生物活性物质即顺浓度梯度从膜
外扩散入膜内，并随灌流液被引流至探针外，
按一定的时间间隔连续收集透析液，检测其中
待测生物活性物质水平，可监测该区域内细胞
外生物活性物质浓度的经时变化过程。
二、实验材料
1. 麻醉、定位手术：
异氟烷麻醉系统（含麻醉空气泵、麻醉机、脑立体定位/回收面罩、麻醉诱导盒、异氟烷）、废气回收系统（含活性碳过滤罐、气体回收器或气体回收泵）、颅钻（含钻头）、冷光源、显微镜、体温维持仪、脑部微透析或微注射动物手术器械包（主要含#3号手术刀柄、11#手术刀片、手术剪、精细剪、撑开器、组织镊、三角缝针、缝线、止血钳、微型凝血器、十字小螺丝刀、灭菌盒、动物剃毛器、碘伏、酒精棉球、无菌干棉球、）
2. 微透析：
微透析泵、1-5mL规格注射器、探针及配件（导管、导管帽、锁紧螺帽、探针夹持器、导管定位适配器）、低温冷冻收集器、样品收集管、连接管路、管路接头、清醒活动装置（含动物活动笼）、牙科水泥（含牙托粉和牙托水）、灌流液
3. 个人防护：
一次性乳胶手套、实验服、鞋套、口罩、帽子
三、操作步骤
1、动物准备
（1）动物麻醉与固定：①将脑立体定位/回收面罩安装于动物适配器上，面罩入口与出口分别连接麻醉系统和废气回收系统，如下图2所示；②快速诱导麻醉：手提动物尾根部，将动物放入麻醉诱导盒，打开麻醉系统（氧气流量调节：大鼠一般为500-700ml/min，小鼠一般
为300-500ml/min，异氟烷浓度调为4-5%），通入异氟烷麻醉气体，一般5min左右，动物即进入深度麻醉状态（可通过动物的呼吸、眼角反射、摇晃诱导盒综合判断动物的状态）；
（2）动物固定：将麻醉气体转换开关通向脑立体定位/回收面罩，调节异氟烷维持麻醉浓度（大鼠一般2-2.5%，小鼠一般为1-1.5%），从诱导盒取出动物，通过“固定门齿、压鼻梁、左右耳道插入耳杆”三部位固定动物头部；固定时，务必使动物头部处于水平状态（具体操作详见第（5）步）；
（3）备皮：①用剃毛器将头部手术部位及周边部位的毛发剔除干净；②依次用碘伏、酒精棉球消毒；
（4）暴露颅骨：①用手术刀片沿颅面中线切开头皮，切口长度约1cm，剔除颅骨表面的软结缔组织，再用无菌干棉球轻轻擦拭颅骨表面，即可清晰地看到前囟（Bregma）部位的十字缝线和后囟（Lambda）部位的人字缝线；
（5）定位调节：此步骤对于精确将探针定位到目标核团非常重要，可通过几个操作确定，①首先，保证动物的鼻尖与适配器的中心线在一条直线上；②夹持一根注射针，针尖刚好接触前囟点，然后以此点为标准，依次沿前囟→后囟的方向移动，在中间和后囟再取两个点，观察针尖是否也刚好接触这两个点，否则需调节适配器的高度；③左、右耳杆高度应一致、位置需对称保持平衡；④用拇指和食指轻捏动物左右额面，摇晃头部，看是否晃动，否则需调节鼻杆固定；
（6）定位钻孔：①参考脑立体定位图谱，
精确找准目标核团（比如海马）水平方向的
X、Y坐标点（AP值和ML值），此点即为导
管或探针植入的点；②钻孔：选择与导管的
杆外径尺寸近似的钻头（比如导管的杆外径
为0.6mm，则可以选择0.8mm直径的钻头）；
同时，需另外钻两个孔安置固定螺丝（同样，
需选择与螺丝直径尺寸近似的钻头，比如螺
丝直径为1mm，则钻头可以选择0.8mm），
这两个孔的位置与植入导管的孔一般成正三角形（如下图3所示），此步操作的目的是增加导管基座与颅骨的粘合力，使导管不容易脱落。
值得注意的是：钻孔时，双手垂直握住颅钻手柄或通过颅钻夹持器固定手柄，切忌用力过大，因为大小鼠颅骨均很薄，约0.5mm左右，用力过大很容易伤到脑组织，且会大量出血；缓慢用力，当孔转开时，有很强的落空感，此时应停止向下用力，可调整钻头旋转方向，对孔的边缘做适当休整。
2、植入探针
（1）植入螺丝：选择规格合适的小螺丝，用十字螺丝刀将螺丝固定于颅骨里（如图4所示）；
（2）植入导管：导管植入前，使用注射器的尖头刺破脑组织表面的硬脑膜，然后将用导管夹持器夹紧导管头部固定，按计算好的目标核团的Z坐标（DV值）垂直植入导管；
（3）牙科水泥固定：骨螺丝和导管均植入完毕后，按适当比例混合牙托粉和牙托水，将骨螺丝和导管一起粘合在颅骨表面，为了确保固定牢固，牙科水泥需添加到导管头上两个孔的高度（如下图5所示）。
等待牙科水泥凝固后，方可松开导管夹持器或退出定位器，之后缓慢插入导管帽；
（4）伤口缝合：根据伤口和牙科水泥固定的实际情况，缝合皮肤，并在伤口周围可适当涂
抹靑链霉素，防止伤口感染；
（5）动物恢复：①上述步骤完成后，解除动物头部固定，关闭麻醉系统和废气回收系统，约5分钟之内，动物即可苏醒；②将手术后的动物单独放于活动笼饲养，可每日注射1次抗菌素，等待动物恢复3-5天后，可进行清醒动物的微透析。
3、微透析
（1）微透析探针的准备：打开包装后，首先进行探针检测：①准备1mL或者2mL的注射器，装满双蒸水，固定于微透析泵；②用管路接头和管路连接探针的入口与注射器针头；③低速（1-2ul/min）向探针开始注射双蒸水约5-10min，若观察到整个探针膜表面有湿润或“流泪”现象，探针出口无双蒸水流出，这是正常现象，并非探针膜有破损；若观察到探针膜某处成“股”状流出双蒸水，说明探针膜有破损或漏洞，应更换探针；④若前一步骤检测的现象正常，停止注射，将探针浸入双蒸水约5min后，以同样速度重新开始注射几分钟，若观察到探针的出口有双蒸水流出，则证明探针良好，可以继续使用；
▲特别注意：①检测时，切忌使用生理盐水、PBS或其它缓冲液进行注射，否则易损坏探针膜；②检测时，切忌错误地将注射器连接探针的出口；③探针正式使用前，须排除气泡：在探针出口不连接任何管路或管路接头时，直接往探针的入口充气，即可排除探针膜内的气泡，否则气泡会导致回收率降低；
（2）灌流液的准备：常用非缓冲人工脑脊液（aCSF）或生理盐水作灌流液，其中CSF灌流液配方如下：
• 140 mM NaCl
• 3.0 mM KCl
• 1.2-3.4 mM CaCl2
• 1.0 mM MgCl2
• 1.2 mM Na2HPO4
• 0.27 mM NaH2PO4
• 7.2 mM glucose
• pH 7.4
▲特别注意：①切忌使用PBS缓冲液，容易形成磷酸钙盐导致探针堵塞；②灌流液在使用前，需进行脱气处理，否则容易导致探针膜内充满气泡，降低回收率。
（3）连接好微透析泵、注射器、清醒活动装置、样品低温收集器等装置；
（4）动物恢复后，将动物放于动物诱导盒，用异氟烷快速诱导麻醉后，取出导管帽，插入准备好的探针，连接好探针的出入口以及用系绳或者马甲固定好动物，即可开始进行透析；（5）灌流速度通常在0.5-5ul/min，一般选择1-2ul/min，流速过低易引起膜表面“固体”物聚集，回收率低；流速过高，膜内外没有充分的平衡时间，同样会导致回收率过低，更值得注意的是，若探针的出口连接的管路过长（大于150cm），高速灌流会导致压力过大，损坏探针膜，因此建议探针出口连接样品收集器的管路长度不超过150cm；
（6）开始灌流后，由于各连接部件存在死体积，且需要一定的平衡时间，所以通常选择在30min后的样品，具体采样时间、采集体积、间隔采样时间可根据实验需求而定。
4、管路和探针的清洁和保养
（1）探针：透析结束后，应立即取出探针，用导管帽插入导管封闭。
取出的探针置于双蒸水中，用双蒸水在1-2ul/min的速度下冲洗过夜（保持原管路的连接一起冲洗），充分排尽整个管路及探针中的盐分，然后取下探针，置于新鲜双蒸水中保持湿润状态，于4℃冰箱中保存（目的是防止探针膜收缩）。
（2）转环：在上述双蒸水过夜冲洗完成后，再用100%丙酮以1-2ul/min的速度冲洗约1个小时（切忌使用次氯酸冲洗），之后自然晾干，密封其出入口，置于低温条件保存，否则易长菌，导致后续微透析时回收率降低。
（3）管路：在第（1）步完成后，用次氯酸冲洗约0.5个小时，然后再用双蒸水冲洗约1个小时，清除残留的次氯酸，之后密封其出入口，置于低温条件保存，否则易长菌，导致后续微透析时回收率降低。
5、回收率的测定（体外）
在aCSF液中加入所要透析的目标物的标准物品（已知浓度），将探针置于此溶液中，在相同灌流速度（Ringer’s液）、相同外界温度的条件下进行透析，收集透析出来的样品，测定目标物的的浓度，从而可得此条件下该探针的相对回收率。
▲影响回收率的因素：
☐目标物的特性，如分子量大小、溶解性
☐微透析膜的特性，如材质、孔径、长度（0.5-10mm）
☐灌流速度，一般为0.5-5ul/min，一般在30-60min后开始收集
☐灌流液的化学成分、PH值等……
四、注意事项
微透析实验与许多实验不同，很多方面取决于操作者的技能水平，特别值得注意的有以下几点：
1、埋置探针的位置（AP、ML、DV值）要准确，选择合适的探针膜长，一般来说，在目标部位纵向跨度范围内，膜长选择越长，回收率越高；
2、探针操作时，需要特别细心，避免探针膜的损坏，从而延长探针的寿命和使用次数；
3、探针使用前的预处理，以及在使用间隔期间的处理、冲洗、浸泡，目的也是延长探针的寿命和使用次数；
4、连接管路时，需仔细检查，防止漏液和堵塞，同时也要防止连接管和接头的损坏。
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