清醒动物脑部微透析操作流程

清醒动物脑部微透析操作流程

一、微透析技术基本原理

微透析技术是一种在体微量化学采样与检测技术，由西班牙之Delgado 及瑞典之Ungerstedt 等人于1972年自更早的压抽导管（push-pull

cannula）改进而来。其基本的原理（如右图

所示）：选择具有一定截留分子量的纤维半透

膜制成的探针埋入待测的组织区域，以恒定速

度向探头内灌注与组织液成分相近的等渗灌

流液，当灌流液流经探头前端透析膜时，组织

内小分子量生物活性物质即顺浓度梯度从膜

外扩散入膜内，并随灌流液被引流至探针外，

按一定的时间间隔连续收集透析液，检测其中

待测生物活性物质水平，可监测该区域内细胞

外生物活性物质浓度的经时变化过程。

二、实验材料

1. 麻醉、定位手术：

异氟烷麻醉系统（含麻醉空气泵、麻醉机、脑立体定位/回收面罩、麻醉诱导盒、异氟烷）、废气回收系统（含活性碳过滤罐、气体回收器或气体回收泵）、颅钻（含钻头）、冷光源、显微镜、体温维持仪、脑部微透析或微注射动物手术器械包（主要含#3号手术刀柄、11#手术刀片、手术剪、精细剪、撑开器、组织镊、三角缝针、缝线、止血钳、微型凝血器、十字小螺丝刀、灭菌盒、动物剃毛器、碘伏、酒精棉球、无菌干棉球、）

2. 微透析：

微透析泵、1-5mL规格注射器、探针及配件（导管、导管帽、锁紧螺帽、探针夹持器、导管定位适配器）、低温冷冻收集器、样品收集管、连接管路、管路接头、清醒活动装置（含动物活动笼）、牙科水泥（含牙托粉和牙托水）、灌流液

3. 个人防护：

一次性乳胶手套、实验服、鞋套、口罩、帽子

三、操作步骤

1、动物准备

（1）动物麻醉与固定：①将脑立体定位/回收面罩安装于动物适配器上，面罩入口与出口分别连接麻醉系统和废气回收系统，如下图2所示；②快速诱导麻醉：手提动物尾根部，将动物放入麻醉诱导盒，打开麻醉系统（氧气流量调节：大鼠一般为500-700ml/min，小鼠一般

为300-500ml/min，异氟烷浓度调为4-5%），通入异氟烷麻醉气体，一般5min左右，动物即进入深度麻醉状态（可通过动物的呼吸、眼角反射、摇晃诱导盒综合判断动物的状态）；

（2）动物固定：将麻醉气体转换开关通向脑立体定位/回收面罩，调节异氟烷维持麻醉浓度（大鼠一般2-2.5%，小鼠一般为1-1.5%），从诱导盒取出动物，通过“固定门齿、压鼻梁、左右耳道插入耳杆”三部位固定动物头部；固定时，务必使动物头部处于水平状态（具体操作详见第（5）步）；

（3）备皮：①用剃毛器将头部手术部位及周边部位的毛发剔除干净；②依次用碘伏、酒精棉球消毒；

（4）暴露颅骨：①用手术刀片沿颅面中线切开头皮，切口长度约1cm，剔除颅骨表面的软结缔组织，再用无菌干棉球轻轻擦拭颅骨表面，即可清晰地看到前囟（Bregma）部位的十字缝线和后囟（Lambda）部位的人字缝线；

（5）定位调节：此步骤对于精确将探针定位到目标核团非常重要，可通过几个操作确定，①首先，保证动物的鼻尖与适配器的中心线在一条直线上；②夹持一根注射针，针尖刚好接触前囟点，然后以此点为标准，依次沿前囟→后囟的方向移动，在中间和后囟再取两个点，观察针尖是否也刚好接触这两个点，否则需调节适配器的高度；③左、右耳杆高度应一致、位置需对称保持平衡；④用拇指和食指轻捏动物左右额面，摇晃头部，看是否晃动，否则需调节鼻杆固定；

（6）定位钻孔：①参考脑立体定位图谱，

精确找准目标核团（比如海马）水平方向的

X、Y坐标点（AP值和ML值），此点即为导

管或探针植入的点；②钻孔：选择与导管的

杆外径尺寸近似的钻头（比如导管的杆外径

为0.6mm，则可以选择0.8mm直径的钻头）；

同时，需另外钻两个孔安置固定螺丝（同样，

需选择与螺丝直径尺寸近似的钻头，比如螺

丝直径为1mm，则钻头可以选择0.8mm），

这两个孔的位置与植入导管的孔一般成正三角形（如下图3所示），此步操作的目的是增加导管基座与颅骨的粘合力，使导管不容易脱落。值得注意的是：钻孔时，双手垂直握住颅钻手柄或通过颅钻夹持器固定手柄，切忌用力过大，因为大小鼠颅骨均很薄，约0.5mm左右，用力过大很容易伤到脑组织，且会大量出血；缓慢用力，当孔转开时，有很强的落空感，此时应停止向下用力，可调整钻头旋转方向，对孔的边缘做适当休整。

2、植入探针

（1）植入螺丝：选择规格合适的小螺丝，用十字螺丝刀将螺丝固定于颅骨里（如图4所示）；

（2）植入导管：导管植入前，使用注射器的尖头刺破脑组织表面的硬脑膜，然后将用导管夹持器夹紧导管头部固定，按计算好的目标核团的Z坐标（DV值）垂直植入导管；

（3）牙科水泥固定：骨螺丝和导管均植入完毕后，按适当比例混合牙托粉和牙托水，将骨螺丝和导管一起粘合在颅骨表面，为了确保固定牢固，牙科水泥需添加到导管头上两个孔的高度（如下图5所示）。等待牙科水泥凝固后，方可松开导管夹持器或退出定位器，之后缓慢插入导管帽；

（4）伤口缝合：根据伤口和牙科水泥固定的实际情况，缝合皮肤，并在伤口周围可适当涂

抹靑链霉素，防止伤口感染；

（5）动物恢复：①上述步骤完成后，解除动物头部固定，关闭麻醉系统和废气回收系统，约5分钟之内，动物即可苏醒；②将手术后的动物单独放于活动笼饲养，可每日注射1次抗菌素，等待动物恢复3-5天后，可进行清醒动物的微透析。

3、微透析

（1）微透析探针的准备：打开包装后，首先进行探针检测：①准备1mL或者2mL的注射器，装满双蒸水，固定于微透析泵；②用管路接头和管路连接探针的入口与注射器针头；③低速（1-2ul/min）向探针开始注射双蒸水约5-10min，若观察到整个探针膜表面有湿润或“流泪”现象，探针出口无双蒸水流出，这是正常现象，并非探针膜有破损；若观察到探针膜某处成“股”状流出双蒸水，说明探针膜有破损或漏洞，应更换探针；④若前一步骤检测的现象正常，停止注射，将探针浸入双蒸水约5min后，以同样速度重新开始注射几分钟，若观察到探针的出口有双蒸水流出，则证明探针良好，可以继续使用；

▲特别注意：①检测时，切忌使用生理盐水、PBS或其它缓冲液进行注射，否则易损坏探针膜；②检测时，切忌错误地将注射器连接探针的出口；③探针正式使用前，须排除气泡：在探针出口不连接任何管路或管路接头时，直接往探针的入口充气，即可排除探针膜内的气泡，否则气泡会导致回收率降低；

（2）灌流液的准备：常用非缓冲人工脑脊液（aCSF）或生理盐水作灌流液，其中CSF灌流液配方如下：

• 140 mM NaCl

• 3.0 mM KCl

• 1.2-3.4 mM CaCl2

• 1.0 mM MgCl2

• 1.2 mM Na2HPO4

• 0.27 mM NaH2PO4

• 7.2 mM glucose

• pH 7.4

▲特别注意：①切忌使用PBS缓冲液，容易形成磷酸钙盐导致探针堵塞；②灌流液在使用前，需进行脱气处理，否则容易导致探针膜内充满气泡，降低回收率。

（3）连接好微透析泵、注射器、清醒活动装置、样品低温收集器等装置；

（4）动物恢复后，将动物放于动物诱导盒，用异氟烷快速诱导麻醉后，取出导管帽，插入准备好的探针，连接好探针的出入口以及用系绳或者马甲固定好动物，即可开始进行透析；（5）灌流速度通常在0.5-5ul/min，一般选择1-2ul/min，流速过低易引起膜表面“固体”物聚集，回收率低；流速过高，膜内外没有充分的平衡时间，同样会导致回收率过低，更值得注意的是，若探针的出口连接的管路过长（大于150cm），高速灌流会导致压力过大，损坏探针膜，因此建议探针出口连接样品收集器的管路长度不超过150cm；

（6）开始灌流后，由于各连接部件存在死体积，且需要一定的平衡时间，所以通常选择在30min后的样品，具体采样时间、采集体积、间隔采样时间可根据实验需求而定。