硝酸还原酶活性测定
硝酸还原酶(NR)活性测定试剂盒说明书
硝酸还原酶（NR）活性测定试剂盒说明书硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒说明书微量法100管/96样注意：正式测定前务必取23个预期差异较大的样本做预测定测定意义：NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。
测定原理：NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，20℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，20℃保存；试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存（如出现结晶析出，60℃90℃水浴溶解后使用）；试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：标准储备液1mL，20℃保存。
诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。
0.1umol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取 0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。
样本前处理：动植物组织样品的前处理:（1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干。
（2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
植物硝酸还原酶(NR)活力测定(活体法)
植物硝酸还原酶（NR）活力测定（活体法）一、原理硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以Nμg·g-1·h-1为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好二、仪器与用具分光光度计；真空抽气泵（或20ml注射器筒）；天平；单面刀片；保温箱（或恒温水浴）；刻度试管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。
三、试剂1. 亚硝酸钠标准液称取分析纯NaNO2 0.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀释定容至1000ml，即为每ml含NaNO2 5μg（亚硝态氮近似1μg/ml）的标准液。
2. 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液：K2HPO4 19.24g，KH2PO4 2.2g，加水溶解后定容至1000ml。
3. 1%（W/V）对-氨基苯磺酸溶液：称取10.0g加入250ml浓HCl中，用蒸馏水定容至1000ml。
4. 0.2%（W/V）α-萘胺溶液：称取2.0gα-萘胺溶于250ml冰醋酸中，用蒸馏水定容至1000ml。
5. 30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。
6. KNO3（0.1mol/L）、异丙醇（1% V/V）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称10.10g KNO3溶于1000ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加10ml异丙醇混匀。
四、方法1. 标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0-2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。
硝酸还原酶活力测定
NR活性(μg NO-2 /g鲜叶/h)
查标准曲线得NO-2浓度（μg） × 24％ ＝
0.5g × 0.5 小时× 1ml
10ml
55％
21％
九、注意事项
1.取样前叶子需进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，否则 酶活性低。 2.叶片要用打孔器取样(或用剪刀剪成大小一致的小块)。 3. 无机磷对NR活力有促进作用，因此常用磷酸缓冲液。 4. 活体法酶促反应在暗条件下进行，以防止亚硝酸盐还原为氨。 5.亚硝酸的磺胺比色法比较灵敏，显色速度受温度和酸度等因素的影
NR
NO-3+ NAD(P)H+H+
NO-2+ NAD(P)++ H2O
亚硝酸还原酶催化亚硝酸盐还原为铵：
硝酸还原酶是一种诱导酶，诱导物是 NO3- ，光照可促进硝酸盐的还原过程。
诱导酶：又称适应酶，指植物体内本来不含有，
但在特定外来物质的诱导下可以生成的酶。如硝
酸还原酶可为NO3-所诱导。
例如，水稻幼苗本无硝酸还原酶，但如果培养
植物生理生化实验
二.目的要求
1、了解NR测定对植物氮代谢的重要意义 及实际应用。 2、了解离体法和活体法测定NR的不同点。
3、掌握活体法测定NR的原理及其技术要点。
4、掌握测定过程相关仪器的使用方法。
55％ 21％ 24％
三、原理：
硝酸还原酶可以将NO3-还原成NO2-，其反应为： NO3-+NADH+H+
响。 因此标准液与样品的测定应在相同条件下进行，方可比较。
6.叶片要抽气，使叶圆片中的空气抽去而沉于溶液中。
思考题：
1．测定硝酸还原酶的材料为什么要提前一天施用
实验报告 硝酸还原酶活性的测定word文档良心出品
首都师范大学生命科学学院实验报告实验题目硝酸还原酶活性的测定一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO 使之还原为NO 。
NO -+ NADH + H +— NO 2- + NAD ++ H 2O产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。
因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。
NO 含量的测定----磺胺法NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。
—、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml(2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2-的获得(1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。
(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气，内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。
3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。
4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。
5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。
课程名称植物生理实验 实验时间2010331成绩姓名唐倪文班级_3学号 1090800032NaNO 浓度为横坐标。
具试剂管号12 3 4 5 6 7 8 NaNO 母液(ml)0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml ） 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1%磺胺(ml)22 2 2 2 2 2 2 0.2 %a -萘胺 (ml) 22 2 2 2 2 2 2 每管亚硝酸氮含 量（卩g ） 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 每管NaNO 浓度 （卩 g/ml ） 0 0.1 0.5 1.02.03.04.05.0 光密度0.0150.0520.1040.2020.3020.3960.493小麦幼苗完全培养液缺N 培养液KNOHO KNO HO 小麦鲜重（g ） 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度 （卩 g/ml ） 1.791 1.7710.6540.392亚硝态氮含量 （卩g ） 1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性105.39104.1840.0424.505.吸取反应液各1 ml 于试管中加入磺胺和粉红色化合物.用比色法在520nm 下读取光密度值，从标准曲线上查得NO 的含量, 结果如下表。
实验八硝酸还原酶活性的测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 结论与讨论 • 参考文献
01
实验目的
了解硝酸还原酶的特性
硝酸还原酶是一种氧化还原酶，负责 将硝酸盐还原成亚硝酸盐，是植物和 微生物进行氮代谢的重要酶之一。
了解硝酸还原酶的特性，有助于深入 理解氮代谢的生物学过程，为农业生 产、生物固氮等领域提供理论支持。
预期结果
在实验前，根据相关文献和理论知识，预测实验 结果并制定预期目标。
结果比较
将实际实验结果与预期结果进行比较，分析两者 之间的差异和一致性。
结果分析
根据比较结果，分析实验中可能存在的问题和误 差来源，提出改进措施和建议。
05
结论与讨论
实验结论总结
硝酸还原酶活性在不同植物组织中存在 差异，表明该酶在不同组织中的功能和 作用可能有所不同。
03
04
在试管中加入适量的酶 液和硝酸盐底物。
将试管放入恒温水浴中， 设定适宜的温度进行反 应。
在反应过程中，定时取 样检测亚硝酸盐的生成 量。
通过分光光度计测定亚 硝酸盐的吸光度值，记 录数据。
数据记录和处理
1
记录每个取样的时间、亚硝酸盐的吸光度值。
2
根据吸光度值绘制亚硝酸盐生成曲线，计算酶活 性。
3
分析实验数据，得出硝酸还原酶活性测定的结果。
04
实验结果与分析
实验数据记录
实验数据记录表
在实验过程中，需要详细记录每 个实验步骤的实验数据，包括酶 液浓度、反应时间、反应温度等。
数据记录的准确性
确保实验数据的准确性是至关重 要的，因此需要使用精确的测量 工具和可靠的记录方法。
硝酸还原酶活性的测定.
硝酸还原酶活性的测定一、原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2NO3⎯+NADH+H→NO2⎯+NAD+H2O产生的NO2⎯可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2⎯的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2⎯含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。
二、仪器和药品721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。
0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。
α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。
三、实验步骤：1、将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。
分别置于含有下列溶液的小烧杯中。
（1）1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml（2）0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。
活体法测定植物硝酸还原酶活性
活体法测定植物硝酸还原酶活性一、原理硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以Nμg·g-1·h-1为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
二、仪器与用具分光光度计；真空抽气泵（或20ml注射器筒）；天平；单面刀片；保温箱（或恒温水浴）；刻度试管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。
三、试剂1.亚硝酸钠标准液称取分析纯NaNO20.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀释定容至1000ml，即为每ml含NaNO25μg （亚硝态氮近似1μg/ml）的标准液。
2.0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液：K2HPO419.24g，KH2PO42.2g，加水溶解后定容至1000ml。
3.1%（W/V）对-氨基苯磺酸溶液：称取1.0g加入25ml浓HCl中，用蒸馏水定容至100ml。
4.0.2%（W/V）α-萘胺溶液：称取0.2gα-萘胺溶于25ml冰醋酸中，用蒸馏水定容至100ml。
5.30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。
6.KNO3（0.1mol/L）、异丙醇（1%V/V）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称3.03gKNO3溶于300ml0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加3ml异丙醇混匀。
四、方法1.标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0-2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。
摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。
实验三 硝酸还原酶活性测定
3. 材料与试剂
两种处理的小麦： 两种处理的小麦：水 (ck)， KNO3（N） ， ） A液：磷酸缓冲液: 水: DNP溶液 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 液 磷酸缓冲液 溶液: 溶液 B液：磷酸缓冲液: KNO3: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 液 溶液
磷酸缓冲液(pH7.5): 0.2mol/L； KNO3溶液 0.2mol/L 溶液: 磷酸缓冲液 ； DNP (2-4-二硝基苯酚 溶液 1mmol/L； 蔗糖溶液 2.5mmol/L 二硝基苯酚)溶液 二硝基苯酚 溶液: ； 蔗糖溶液:
NO2-含量测定（磺胺比色法） 含量测定（磺胺比色法）
在酸性溶液中， 与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与α在酸性溶液中，NO2-与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与 萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物。该偶氮化合物在 540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。 有最大吸收峰， 有最大吸收峰 可以用分光光度计测定（
酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白， 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时 可还原NO2- ，所以在暗条件下进行反应可阻止 所以在暗条件下进行反应可阻止NO2- 的继续反 可还原 以保证测定结果的准确。 应，以保证测定结果的准确。
处 理 A液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 活性 B液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 活性
（uMol/ml）（uMol/h•gfw） ） ）
（uMol/ml）（uMol/h•gfw） ） ）
H2 O KNO3 对照 [ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD520 ） ＋ NR活性（ NO2- , uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重 ×0.5h） 活性（ 鲜重g× 活性 ） ）
植物体内硝酸还原酶活性的测定
植物体内硝酸还原酶活性的测定目的意义：硝酸还原酶是植物氮代谢中十分重要的一个酶，植物从土壤吸收硝酸盐后，首先催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，才能进一步转化变成有机含氮化合物。
在生产中可根据植物体内硝酸还原酶的活性变化，来确定氮肥的合理用量以及植物的氮素营养状况。
一、实验原理在酸性条件下，亚硝酸盐与重氮试剂对—氨基苯磺酸（或对—苯磺酰胺）及偶联试剂α-萘基乙烯二胺反应生成红色偶氮化合物。
红色偶氮化合物的颜色在2~3h内稳定，并在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
二、材料、设备及试剂1、材料川芎叶片、根茎和根。
2、设备冷冻离心机、分光光度计、天平、冰箱、恒温水浴锅、研钵、移液管、剪刀、离心管。
3、试剂(1) 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液称取30.0905g Na2HPO4·12H2O和2.4965g NaH2PO4·2H2O 加去离子水溶后，定至1L；0.1mol/L KNO3溶液称取2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液中；（避光保存）0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液称取8.8640g Na2HPO4·12H2O和0.0570g K2HPO4·3H2O（很易吸水变潮）溶于1L去离子水中；(2) 亚硝酸钠标准溶液：准备称取分析纯NaNO20.9857g 溶于无离子水后定容至1000mL，然后再吸取5ml 定溶至1000mL，即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。
(3) 1%磺胺溶液：1.0g无水对氨基苯磺酸溶于100mL 3mol/L HCl 中(25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/L HCl)；（注：磺胺比较难容，定容后最好用超声波促进溶解。
应避光保存！）(4) 0.02%萘基乙烯胺溶液：0.02g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
(5) 提取缓冲液：0.1211g半胱胺酸、0.0372g EDTA溶于100mL 0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液中。
硝酸还原酶测定 (2)
实验5 硝酸还原酶活性的测定【实验目的】掌握硝酸还原酶活性测定的两种方法，加深对硝酸还原酶在植物体氮素代谢中作用的理解。
【实验原理】硝酸还原酶（nitrate reductase,NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，（NO3-+NADH + H+→NO2-+NAD ++H2O）。
产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（or 对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（or 萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般单位鲜重以Nμg/（g﹒h）为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
Ⅰ离体法【材料设备】（三）试剂1、NaNO2标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.1g溶于无离子水后定容至100ml，然后再吸取1ml用蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO21μg，用时稀释之。
2、0.1mol/L PH7.5的磷酸缓冲液，Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000mL。
3、1%（m/V）对氨基苯磺酸（磺胺酸）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol/L的HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol/LHCL）。
4、0.02%（m/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100mL 去离子水中，贮于棕色瓶中。
5、0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L Ph7.5的磷酸缓冲液中.6、0.025mol/L Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12H2O，0.0570g KH2PO4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中。
实验七、硝酸还原酶活性测定
根据实验数据得出结论，分析硝酸还原酶活性的影响因素
影响因素分析
根据实验数据，分析影响硝酸还原酶活性的因素，如温度、pH值、底物浓度等。通过对比不同条件 下的活性数据，评估各因素对酶活性的影响程度。
结论得出
基于数据分析结果，得出硝酸还原酶活性测定的结论，总结实验结果，阐述实验中得出的规律和趋势 。
对比不同样品之间的硝酸还原酶活性差异
问题与改进
在实验过程中，我们也遇到了一些问题，如操作 不规范导致的误差、数据波动等。针对这些问题 ，我们应加强操作规范性，提高实验的准确性和 可重复性。
对未来实验的展望与改进建议
拓展实验内容
未来我们可以进一步研究硝酸还原酶活性在不同生长阶段、不同环境 条件下的变化，以更全面地了解其在植物生长和发育中的作用。
硝酸还原酶通常由两个组成部分：血红素蛋白和铁硫蛋白，它们共同作用将硝酸盐 还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶对环境条件敏感，如温度、pH值和抑制剂等，这些因素会影响酶的活性。
硝酸还原酶活性测定的基本原理
硝酸还原酶活性测定的基本原理 是通过测量一定时间内亚硝酸盐 的生成量来计算硝酸还原酶的活
性。
在实验条件下，加入一定量的硝 酸盐作为底物，酶促反应一段时 间后，测定亚硝酸盐的生成量。
实验七、硝酸还原酶 活性测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 数据分析与结论 • 实验总结与展望
01
实验目的
了解硝酸还原酶活性测定的原理
硝酸还原酶是植物体内一种重要的酶， 负责将硝酸盐还原成亚硝酸盐，进而 参与植物的氮代谢过程。了解硝酸还 原酶活性测定的原理有助于深入理解 植物的氮代谢机制。
02
确保所有溶液的浓度和比例符合 实验要求。
植物体内硝酸还原酶活力的测定
实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（ NO 3 ˉ +NADH+H ＋→ NO 2 ˉ +NAD ＋ +H 2 O ）。
产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般单位鲜重以 N μg ／（ g · h ）为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
Ⅰ离体法二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料水稻、小麦叶片、幼穗等。
（二）试剂1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO2 0.9857 g 溶于无离子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL 定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮的 1 μg ／ mL 的标准液。
2 ． 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸缓冲液： Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 30.0905 g 与 NaH 2 PO 4 · 2H2 O 2.4965 g 加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。
3 ． 1 ％磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。
4 ． 0.02 ％萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子水中，贮于棕色瓶中。
5 ． 0.1 mol/L KNO 3 溶液： 2.5275 g KNO 3 溶于 250 mL 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液。
6 ． 0.025 mol/L pH8.7 的磷酸缓冲液： 8.8640 g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O ， 0.0570 g K 2 HPO 4 · 3H 2 O 溶于 1000 mL 无离子水中。
硝酸还原酶活性的测定
实验二、硝酸还原酶活性的测定-活体法[原理]：硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml；3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）；4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中；5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中；6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中；7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法]摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。
2.样品中硝酸还原酶活力测定1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。
硝酸还原酶活力的测定
硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶是一种催化硝酸还原反应的酶，它在许多生物体中具有重要的功能。
测定硝酸还原酶活力是研究生物体硝酸还原代谢的关键方法之一。
本文将介绍测定硝酸还原酶活力的原理、方法和应用。
一、原理硝酸还原酶活力的测定原理基于硝酸还原酶催化硝酸还原为亚硝酸的反应。
该反应可以测定硝酸还原酶活力的大小。
一般使用还原性染料作为指示剂，如甲基蓝(Methylthioninium chloride)、二甲基对苯二胺(Diaminobenzidine)等。
这些染料在还原状态下呈现出不同的颜色，可以通过测量吸光度的变化来间接测定硝酸还原酶活力。
二、方法1.准备工作（1）制备硝酸还原酶提取液：从待测生物组织中提取硝酸还原酶，常用的提取液包括磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液等。
（2）制备工作液：一般为硝酸还原酶提取液、辅酶(NADH)溶液、染料溶液等混合制备的试剂。
2.测定步骤（1）取一定量的硝酸还原酶提取液加入工作液中，使最终反应体系中硝酸还原酶的浓度适宜。
（2）将反应体系在适当的温度下孵育一定时间，使反应达到平衡。
（3）加入染料溶液，使反应体系中的染料还原。
（4）立即测量反应体系中染料的吸光度，记录下初始吸光度值。
（5）在一定时间内，每隔一段时间重复步骤(3)和(4)，记录下吸光度值。
（6）根据吸光度的变化，绘制反应体系中染料吸光度随时间的曲线。
（7）根据曲线的斜率，计算出硝酸还原酶的活力。
三、应用硝酸还原酶活力的测定在许多领域中有重要的应用价值。
1.农业领域：硝酸还原酶活力的测定可以用于评估土壤中硝酸盐的还原能力，从而指导农作物的施肥管理。
2.食品安全领域：硝酸还原酶活力的测定可以用于检测食品中硝酸盐的含量，从而评估食品的安全性。
3.环境科学领域：硝酸还原酶活力的测定可以用于评估水体和土壤中硝酸盐的还原能力，从而研究生态系统的健康状况。
4.医学领域：硝酸还原酶活力的测定可以用于评估人体内硝酸盐的代谢水平，从而研究心血管疾病等疾病的发生机制。
实验报告-硝酸还原酶活性的测定
首都师范大学生命科学学院实验报告课程名称植物生理实验实验时间2010.3.31 成绩姓名唐倪文班级3 学号1090800032 实验题目硝酸还原酶活性的测定一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO3-使之还原为NO2-。
NO3- + NADH++ H+ → NO2-+ NAD++ H2O产生的NO2-可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。
因此，测定反应液中NO2-含量的增加即表明酶活性的大小。
NO2-含量的测定----磺胺法NO2-与磺胺和 -萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm下读取光密度值。
二、实验用品1.材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2.仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液枪，tip头（两种规格：1000μl，200μl）三、实验步骤1.分别配制反应液于小烧杯中(1)0.1M磷酸缓冲液5ml + 蒸馏水5ml(2)0.1M磷酸缓冲液5ml + 0.2MKNO35ml2. NO2-的获得(1)称取新鲜叶片0.5g共四份,剪成小片,分别置于小烧杯内的反应液中。
(2)在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部,溶液即可渗入组织内取代其中的空气,内部产生的NO2-可渗透到外部溶液中。
3.将小烧杯转到30℃温箱,使其不见光,保温20min。
4.用5μg/ml NaNO2母液配制标准梯度溶液5、4 、 3 、 2 、 1 、 0.5 、0.1、0 μg/ml。
5.吸取不同浓度的NaNO21ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α-萘胺试剂2ml，混合均匀，在60℃水浴中保温20min，于比色杯中，在520nm下进行比色，读取光密度，然后做出光密度—浓度曲线，以光密度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。
具体步骤及结果如下表和下图所示。
试剂管号1 2 3 4 5 6 7 8 NaNO2母液(ml) 0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(ml) 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 01％磺胺(ml) 2 2 2 2 2 2 2 20.2％α-萘胺(ml)2 2 2 2 2 2 2 2每管亚硝酸氮含量（μg）0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0每管NaNO2浓度（μg/ml）0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 光密度0 0.015 0.052 0.104 0.202 0.302 0.396 0.493 标准曲线：5. 吸取反应液各1 ml于试管中加入磺胺和 -萘胺各2 ml,60℃水浴20min,生成粉红色化合物.用比色法在520nm下读取光密度值，从标准曲线上查得NO2-的含量，小麦幼苗完全培养液缺N培养液KNO3H2O KNO3H2O小麦鲜重(g) 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度（μg/ml）1.791 1.771 0.654 0.392亚硝态氮含量（μg）1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性105.39 104.18 40.04 24.506.计算酶活性,以每小时每克鲜重所产生的NO2-微克数表示（ NO2- /h.g）。
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高等植物硝酸还原酶的模型
NR-含钼的黄素蛋白 辅基是黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）
高等植物硝酸还原酶的模型
研究趋势
【英文篇名】Determination Method of Nitrate Reductase Activity in the Leaves of Camptotheca acuminata 【作者中文名】孙世芹; 阎秀峰; 【作者单位】东北林业大学; 东北林业大学 哈尔滨; 150040; 【文献出处】东北林业大学学报, Journal of Northeast Forestry University, 编辑部邮箱 2004年 03期 期刊荣誉：中文核心期刊要目总览 ASPT来源刊 中国期刊方阵 CJFD收录刊 【关键词】喜树; 硝酸还原酶; 体内法; 【英文关键词】Camptotheca acuminata; Nitrate reductase; In vivo method; 【摘要】以喜树 (Camptothecaacuminata)为材料 ,探讨了用体内法测定其叶片硝酸还 原酶活性的若干问题 ,比较分析了硝酸盐诱导、2 ,4 -二硝基苯酚、三氯乙酸及煮沸等 因素对硝酸还原酶活性测定结果的影响 ,以寻求体内法测定喜树叶片硝酸还原酶活性的 最佳条件。试验表明 ,体内法是一种操作简便、准确可靠的测定喜树叶片硝酸还原酶活 性的方法 ,为进一步研究喜树的氮代谢奠定了基础。
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实验器材
1. 天平
2. 真空泵
3. 分光光度计 4. 恒温箱 5. 剪刀 6. 试管 7. 三角瓶 8. 移液管
主要试剂
0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液 0.2mol/L KNO3
磺胺试剂
α-萘胺试剂
亚硝酸钠标准液
实验步骤
亚硝酸钠标准液 磺胺试剂 α-萘胺试剂
体积
1ml
2ml
2ml
1. 标准曲线绘制
亚硝酸钠标准液浓度0、0.5、1.0、2.0、3.0ug/ml，即共5管 溶液。 混匀上述溶液，静置20min； 520nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
实验步骤
2. 酶的诱导与还原反应
1.
2. 3. 4. 5. 6.
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
将实验材料用水洗净，吸水纸吸干； 配制对照液(5ml PBS + 5mlH20)和诱导液(5ml PBS + 5ml KNO3)，置于 两个烧杯中； 用剪刀将叶片剪成边长为0.4cm的正方形小块，天平上称取0.5g重的两等 份，分别投入到上述两烧杯中； 将盛有叶片的两个烧杯进行真空抽气30min，最好使叶片沉入烧杯底部， 30℃ 恒温箱中保温30min。 从两烧杯中分别吸取1ml反应液，注入两只试管中； 再分别依次加入2ml磺胺试剂和2ml α-萘胺试剂，混匀后室温静置20min;
实验七、硝酸还原酶活性测定
实验目的：
掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法; 巩固分光光度计的使用方法。
硝酸还原酶(NR)，是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶， 催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，在植物的氮素代谢中发 挥重要作用，与作物有效吸收和利用氮素肥料有关，对农作物产 量和品质有重要影响，硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施 肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。
实验原理
在一定条件下，NO2 的生成量与硝酸还原酶活性 呈正相关。 NO2 可从组织渗透到外界溶液中，通过测 定溶液中NO2含量的增加检测该酶活性。 NO2含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下， NO2与磺胺和α－萘胺反应，生成红色化合物，在520nm 下比色测定。