实验报告 硝酸还原酶活性的测定word文档良心出品

首都师范大学生命科学学院实验报告

实验题目硝酸还原酶活性的测定

一、实验原理

硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于

NO 使之还原为

NO 。

NO -+ NADH + H +

— NO 2- + NAD +

+ H 2O

产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。 NO 含量的测定----磺胺法

NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。 —、实验用品

1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗

2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤

1. 分别配制反应液于小烧杯中

(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml

(2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2-

的获得

(1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。

(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气，

内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。

3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。

4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。

5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓

度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。

课程名称植物生理实验 实验时间2010331

成绩

姓名唐倪文

班级_3

学号 1090800032

NaNO 浓度为横坐标。具

试剂

管号

1

2 3 4 5 6 7 8 NaNO 母液(ml)

0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml ） 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1%磺胺(ml)

2

2 2 2 2 2 2 2 0.2 %a -萘胺 (ml) 2

2 2 2 2 2 2 2 每管亚硝酸氮含 量（卩g ） 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 每管NaNO 浓度 （卩 g/ml ） 0 0.1 0.5 1.0

2.0

3.0

4.0

5.0 光密度

0.015

0.052

0.104

0.202

0.302

0.396

0.493

小麦幼苗

完全培养液

缺N 培养液

KNO

HO KNO HO 小麦鲜重（g ） 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度

0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度 （卩 g/ml ） 1.791 1.771

0.654

0.392

亚硝态氮含量 （卩g ） 1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性

105.39

104.18

40.04

24.50

5.吸取反应液各1 ml 于试管中加入磺胺和

粉红色化合物.用比色法在520nm 下读取光密度值，从标准曲线上查得NO 的含量, 结果如下

表。 -萘胺各2 ml,60 C 水浴20min,生成

6.计算酶活性,以每小时每克鲜重所产生的NO微克数表示(NQ-/h.g )。

X (pg)

X V1 Cml)

V2 fml)

样品中醸活性= ----------------------------------

f NOrp

g Fwg-i-h-9样品鲜童(g) x酶反应时间(h)

公式中：工一从标准曲线e出反应液中亚硝态氮总量(ug) 讥一提取酶时加入的缓冲液体积(述) V2—®反应时加入的酶液体积(1111)

完全培养液，KNQ

酶活性=[(1.791/1)*10]/[0.51*(20/60)]= 105.39

完全培养液，H0

酶活性=[(1.771/1)*10]/[0.51*(20/60)]= 104.18

缺N培养液，KNO

酶活性=[(0.654/1)*10]/[0.49*(20/60)]= 40.04

缺N培养液，HO

酶活性=[(0.392/1)*10]/[0.48*(20/60)]= 24.50

将结果填入上表。

四、实验结果分析

①在完全培养液和缺N培养液中，加KNG普遍都要比加H0的酶活性高，说明KNQ 为酶促反应提供了底物，让酶促反应进行彻底。

②在完全培养液和缺N培养液中，加KNQ相互比较，加H0的相互比较，完全培养液的酶活性都要高，说明N诱导了硝酸还原酶，使之活性增大。

五、思考题

1. 依据原理，测硝酸还原酶活性的实质是以什么物质的含量来表示的？哪一步影响NO2-的浸出量？

答：①实质是以亚硝酸根（NO-）的含量来表示的。因为NO可以从组织内渗到外界溶液中并积累，因此测定反应溶液中NO的含量的增加，即表明酶活性的大小。

②真空泵抽气影响NO的浸出量。因为反复抽气放气，溶液可渗入叶组织取代叶片空气，叶片便沉于溶液底部，酶促反应可以相对完全的进行。

2.为什么做两组溶液，一组培养液中加入H20和一组培养液中加入KNO的作用是? 答：①培养时做完全培养和缺N培养是因为硝酸还原酶是诱导酶。

②实验时一组加KNO一组加H0是因为KN（3为酶促反应提供底物，让反应得以彻底

进行。

3.实验前要使材料经一定时间光照，其作用是？答：让材料进行一段时间光合作用，积累有机物。

4.小烧杯置于30C，不见光保温的原因是？

答：酶促反应在暗反应下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促使

亚硝酸镁把NO还原成NH。暗反应下反应可阻止NO-的继续反应。

5.第一次30min和第二次20min的作用是? 答①阻止NO的继续反应

②让NO和磺胺，a -萘胺反应充分，显色完全。显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色，同时也影响灵敏度。