硝酸还原酶活性的测定(精)
硝酸还原酶活性的测定
硝酸还原酶活性(ug／h·g)=C×10/t·m(鲜重)
四、实验报告
1、比较在两种不同溶液中的硝酸还原酶活性，并解释。
硝酸还原酶将N03-还原为N02-，产生的N02-可 以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中， 测定反应液中的N02-含量的多少，就表示硝酸还 原酶活性的大小。
N02-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液 中磺胺与N02-形成重氮盐，重氮盐再与α-萘胺 偶联形成紫红色的偶氮染料，这种偶氮染料在 520nm处有最大吸收峰，因此选用波长520nm分光 光度法进行测定。
根据Lambert-Beer定律：物质对光的吸收，吸 收的光量与物质的浓度、溶液的厚度成比例关系， 用公式表示为
1、用直径1cm的打孔器打出油菜叶圆片100片，各投50片(先称重)至溶液
(1)磷酸缓冲液5 ml + 蒸馏水5 ml； (2)磷酸缓冲液5 ml + KNO3溶液5ml 分别将溶液(1)(2)倒入20毫升针筒内，用针筒抽气使叶圆片中的空气抽去直至叶
圆片沉于溶液中，将此溶液倒回三角瓶置于30℃恒温箱中，保温作用30min后测定 N02-含量。
叶绿体色素的性质测定和分离(P46-48)
实验三 硝酸还原酶活性的测定
一、实验原理
硝酸还原酶是植物氮代谢的关键酶，它使N03-还原成N02-，并可渗到周围的溶 液中，用磺胺显色比色法测定外界溶液中的N02-含量，可以反应该酶活性的强弱。 二、器材与试剂
油菜叶片、小白菜叶片、UV-1100型紫外/可见分光光度计、20毫升针筒 0.1 mol/L pH7.5磷酸缓冲液、O.2M KNO3溶液、磺胺试剂、α-萘胺试剂 三、方法与步骤
2、绘制标准曲线（见P34）
3、N02-含量测定 溶液(1)1ml + 磺胺试剂2ml + α-萘胺试剂2ml
硝酸还原酶活性的测定
将试验材料使用打孔器打成圆片，混合均
匀后分别称取2份，每+ 份1g左右，编号后按 表2加入多种试剂：
三角瓶号 0.2mmol/L磷酸缓冲液（mL） 0.2mmol/LKNO3溶液（mL） 30%三氯乙酸（mL）
1
2
4.0 4.0
5.0 5.0
1.0 0
在针筒中进行反复抽气，直到放气后叶片变 软并沉入溶液；将针筒中混合溶液和叶片取 出放入编号三角瓶中，在30℃、暗条件下保 温30min；取出后立即向2号瓶加入1mL 30% 三氯乙酸以终止酶反应。
(按顺序加试剂)
取样 称量、编号 加缓冲溶液 暗处保温 抽气
测吸光光度值
显色反应
取1mL
绘制亚硝酸钠 原则曲线
计算含量
六、成果与计算
❖ 把在原则曲线上查得旳NaNO2含量代入下式， 计算硝酸还原酶活性：
NaNO2含量(µg) ×稀释倍数 NR活性[NaNO2(µg)/鲜重(g)·h]=
样品重(g)×时间(h)
❖ 离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除 去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行 测定。因为研磨中NADH受损失，必需外加 NADH方可测定。
❖ 活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中旳 NO3-进入细胞后，被硝酸还原酶还原成NO2并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中 NO2-旳含量即可得知硝酸还原酶活性旳大小。
❖ 活体法不破坏细胞原有旳酶反应系统，NADH 可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法 简便、迅速，不需要珍贵仪器设备及低温条 件，但反复性欠佳，应作一定量旳反复。
❖ 本试验采用活体法测定硝酸还原酶活性。
二、原理
❖ 硝酸还原酶可将NO3-还原成NO2-：
❖ NO3-+NADH+H+ NR NO2- +NAD + +H2O ❖ 在一定条件下，NO2-旳生成量与硝酸还原酶
硝酸还原酶活力测定
NR活性(μg NO-2 /g鲜叶/h)
查标准曲线得NO-2浓度（μg） × 24％ ＝
0.5g × 0.5 小时× 1ml
10ml
55％
21％
九、注意事项
1.取样前叶子需进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，否则 酶活性低。 2.叶片要用打孔器取样(或用剪刀剪成大小一致的小块)。 3. 无机磷对NR活力有促进作用，因此常用磷酸缓冲液。 4. 活体法酶促反应在暗条件下进行，以防止亚硝酸盐还原为氨。 5.亚硝酸的磺胺比色法比较灵敏，显色速度受温度和酸度等因素的影
NR
NO-3+ NAD(P)H+H+
NO-2+ NAD(P)++ H2O
亚硝酸还原酶催化亚硝酸盐还原为铵：
硝酸还原酶是一种诱导酶，诱导物是 NO3- ，光照可促进硝酸盐的还原过程。
诱导酶：又称适应酶，指植物体内本来不含有，
但在特定外来物质的诱导下可以生成的酶。如硝
酸还原酶可为NO3-所诱导。
例如，水稻幼苗本无硝酸还原酶，但如果培养
植物生理生化实验
二.目的要求
1、了解NR测定对植物氮代谢的重要意义 及实际应用。 2、了解离体法和活体法测定NR的不同点。
3、掌握活体法测定NR的原理及其技术要点。
4、掌握测定过程相关仪器的使用方法。
55％ 21％ 24％
三、原理：
硝酸还原酶可以将NO3-还原成NO2-，其反应为： NO3-+NADH+H+
响。 因此标准液与样品的测定应在相同条件下进行，方可比较。
6.叶片要抽气，使叶圆片中的空气抽去而沉于溶液中。
思考题：
1．测定硝酸还原酶的材料为什么要提前一天施用
实验报告 硝酸还原酶活性的测定word文档良心出品
首都师范大学生命科学学院实验报告实验题目硝酸还原酶活性的测定一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO 使之还原为NO 。
NO -+ NADH + H +— NO 2- + NAD ++ H 2O产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。
因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。
NO 含量的测定----磺胺法NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。
—、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml(2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2-的获得(1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。
(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气，内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。
3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。
4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。
5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。
课程名称植物生理实验 实验时间2010331成绩姓名唐倪文班级_3学号 1090800032NaNO 浓度为横坐标。
具试剂管号12 3 4 5 6 7 8 NaNO 母液(ml)0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml ） 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1%磺胺(ml)22 2 2 2 2 2 2 0.2 %a -萘胺 (ml) 22 2 2 2 2 2 2 每管亚硝酸氮含 量（卩g ） 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 每管NaNO 浓度 （卩 g/ml ） 0 0.1 0.5 1.02.03.04.05.0 光密度0.0150.0520.1040.2020.3020.3960.493小麦幼苗完全培养液缺N 培养液KNOHO KNO HO 小麦鲜重（g ） 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度 （卩 g/ml ） 1.791 1.7710.6540.392亚硝态氮含量 （卩g ） 1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性105.39104.1840.0424.505.吸取反应液各1 ml 于试管中加入磺胺和粉红色化合物.用比色法在520nm 下读取光密度值，从标准曲线上查得NO 的含量, 结果如下表。
实验八硝酸还原酶活性的测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 结论与讨论 • 参考文献
01
实验目的
了解硝酸还原酶的特性
硝酸还原酶是一种氧化还原酶，负责 将硝酸盐还原成亚硝酸盐，是植物和 微生物进行氮代谢的重要酶之一。
了解硝酸还原酶的特性，有助于深入 理解氮代谢的生物学过程，为农业生 产、生物固氮等领域提供理论支持。
预期结果
在实验前，根据相关文献和理论知识，预测实验 结果并制定预期目标。
结果比较
将实际实验结果与预期结果进行比较，分析两者 之间的差异和一致性。
结果分析
根据比较结果，分析实验中可能存在的问题和误 差来源，提出改进措施和建议。
05
结论与讨论
实验结论总结
硝酸还原酶活性在不同植物组织中存在 差异，表明该酶在不同组织中的功能和 作用可能有所不同。
03
04
在试管中加入适量的酶 液和硝酸盐底物。
将试管放入恒温水浴中， 设定适宜的温度进行反 应。
在反应过程中，定时取 样检测亚硝酸盐的生成 量。
通过分光光度计测定亚 硝酸盐的吸光度值，记 录数据。
数据记录和处理
1
记录每个取样的时间、亚硝酸盐的吸光度值。
2
根据吸光度值绘制亚硝酸盐生成曲线，计算酶活 性。
3
分析实验数据，得出硝酸还原酶活性测定的结果。
04
实验结果与分析
实验数据记录
实验数据记录表
在实验过程中，需要详细记录每 个实验步骤的实验数据，包括酶 液浓度、反应时间、反应温度等。
数据记录的准确性
确保实验数据的准确性是至关重 要的，因此需要使用精确的测量 工具和可靠的记录方法。
硝酸还原酶活性的测定.
硝酸还原酶活性的测定一、原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2NO3⎯+NADH+H→NO2⎯+NAD+H2O产生的NO2⎯可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2⎯的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2⎯含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。
二、仪器和药品721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。
0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。
α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。
三、实验步骤：1、将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。
分别置于含有下列溶液的小烧杯中。
（1）1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml（2）0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。
硝酸还原酶(NR)活性测定
实验三：硝酸还原酶（NR）活性测定一、实验目的了解硝酸还原酶的活性测定的原理，掌握活体测定硝酸还原酶地方法二、实验原理硝酸还原酶是植物氮元素代谢过程中的关键酶，于作物的吸收和利用氮元素有关，他们作用于硝酸根，使之还原为亚硝酸根根：NO3-+NADH++H+ NR NO2-+NAD++H2O产生的亚硝酸根可以从组织内渗入到外界溶液中，从而测定溶液中亚硝酸根的含量的增加即为NR活性大小测定时间磺胺与亚硝酸钠形成重氮盐，再与α-奈氨偶联形成紫色物质。
反应液的酸度和温度都会对反应产生影响。
三、试剂与器材1、材料：小白菜叶片2、试剂：0.1mol/L ph7.5磷酸缓冲液，磺胺试剂、α-奈氨、0.2mol/LKNO3、NaNO2标准溶液3、器材：分光光度计、注射器、试管、天平、烧杯、移液管、恒温箱四、实验步骤1、按下列表格配置不同浓度的NaNO2溶液2、另取7支试管编号，取上述配置好的溶液各1ml，分别加入磺胺2ml、α-奈氨2ml摇匀静置30min，在520nm处比色以NaNO2终浓度为横坐标绘制标准曲线3、将小白菜叶片剪成0.5cm2大小称取两分，每份各0.5g放入另个烧杯中，一个烧杯中加入0.1ml/L磷酸缓冲液5ml再加入蒸馏水5ml，作为对照组。
林一个烧杯中加入0.1mol/L磷酸缓冲液5ml和0.2mol/LKNO3溶液5ml作为实验组。
将材料与溶液混合置于射器中抽气至材料沉入溶液。
4、将含材料的烧杯置于30℃恒温箱中30min，之后分别取1ml溶液按第二步进行NO2-含量测定5、结果分析：酶活性（NO2- μg g-1h-1）=（实验组NO2-含量-对照组NO2-含量）/材料重量（g）/时间（h）五、实验结果实验分析及感悟:由于实验过程中，移液管的混用可能会导致部分溶液污染导致实验产生误差。
叶片剪切的由于抽气不够是结果偏小。
本次试验经历了很长时间，我们从上午10点一直做到下午一点才做完。
当然经过努力的数据分析我们最终得到了我们所渴求的实验结果。
活体法测定植物硝酸还原酶活性
活体法测定植物硝酸还原酶活性一、原理硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以Nμg·g-1·h-1为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
二、仪器与用具分光光度计；真空抽气泵（或20ml注射器筒）；天平；单面刀片；保温箱（或恒温水浴）；刻度试管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。
三、试剂1.亚硝酸钠标准液称取分析纯NaNO20.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀释定容至1000ml，即为每ml含NaNO25μg （亚硝态氮近似1μg/ml）的标准液。
2.0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液：K2HPO419.24g，KH2PO42.2g，加水溶解后定容至1000ml。
3.1%（W/V）对-氨基苯磺酸溶液：称取1.0g加入25ml浓HCl中，用蒸馏水定容至100ml。
4.0.2%（W/V）α-萘胺溶液：称取0.2gα-萘胺溶于25ml冰醋酸中，用蒸馏水定容至100ml。
5.30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。
6.KNO3（0.1mol/L）、异丙醇（1%V/V）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称3.03gKNO3溶于300ml0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加3ml异丙醇混匀。
四、方法1.标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0-2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。
摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。
硝酸还原酶活力的测定
硝酸还原酶活力的测定一、试剂：（1）亚硝态氮标准溶液称取1 g分析纯NaNO2溶于无离子水并定容至1000mL，然后再吸取1mL定容至1000mL,即为1μg/mL亚硝态氮的标准液。
（2）0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液称取30.0905 g Na2HPO4·12H2O与2.4965 g NaH2PO4·2H2O，加无离子水溶解后定容至1000mL。
（3）10 g/L磺胺溶液称取1.00 g磺胺溶于100mL 3mol/L HCl中（取25mL浓盐酸加无离子水定容至100mL，即为3mol/L HCl）。
（4）0.2 g/L萘基乙烯胺溶液称取0.0200 g 萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
（5）0.1mol/L KNO3溶液称取2.5275 g KNO3溶于250mL 0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液。
（6）0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液称取8.864 g Na2HPO4·12H2O和0.057 g K2HPO4·3H2O，溶于1000mL 无离子水中。
（7）提取缓冲液称取0.1211 g半胱氨酸和0.0372 g EDTA，溶于100mL 0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液。
（8）2 mg/mL NADH溶液称取2 mg NADH溶于1mL 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液(临用前配制)。
二．实验步骤（一）标准曲线制作取7支15mL干净的试管按表1顺序加入试剂，配成每管含0~2.0μg 亚硝态氮的系列标准溶液，摇匀后在25℃下保温30 min，然后在540nm下比色测定，以每管中亚硝态氮的量（μg）为横坐标（x），吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线或建立回归方程。
（二）硝酸还原酶活力测定1.酶液提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加4mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,4000r/min离心15min,上清液即为粗酶提取液2.酶反应取粗酶液0.4mL加入10mL试管中，再加入1.2mL 0.1mol/L KNO3磷酸缓冲液和0.4mL NADH溶液，在25℃水浴中准确保温30 min。
实验七、硝酸还原酶活性测定
根据实验数据得出结论，分析硝酸还原酶活性的影响因素
影响因素分析
根据实验数据，分析影响硝酸还原酶活性的因素，如温度、pH值、底物浓度等。通过对比不同条件 下的活性数据，评估各因素对酶活性的影响程度。
结论得出
基于数据分析结果，得出硝酸还原酶活性测定的结论，总结实验结果，阐述实验中得出的规律和趋势 。
对比不同样品之间的硝酸还原酶活性差异
问题与改进
在实验过程中，我们也遇到了一些问题，如操作 不规范导致的误差、数据波动等。针对这些问题 ，我们应加强操作规范性，提高实验的准确性和 可重复性。
对未来实验的展望与改进建议
拓展实验内容
未来我们可以进一步研究硝酸还原酶活性在不同生长阶段、不同环境 条件下的变化，以更全面地了解其在植物生长和发育中的作用。
硝酸还原酶通常由两个组成部分：血红素蛋白和铁硫蛋白，它们共同作用将硝酸盐 还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶对环境条件敏感，如温度、pH值和抑制剂等，这些因素会影响酶的活性。
硝酸还原酶活性测定的基本原理
硝酸还原酶活性测定的基本原理 是通过测量一定时间内亚硝酸盐 的生成量来计算硝酸还原酶的活
性。
在实验条件下，加入一定量的硝 酸盐作为底物，酶促反应一段时 间后，测定亚硝酸盐的生成量。
实验七、硝酸还原酶 活性测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 数据分析与结论 • 实验总结与展望
01
实验目的
了解硝酸还原酶活性测定的原理
硝酸还原酶是植物体内一种重要的酶， 负责将硝酸盐还原成亚硝酸盐，进而 参与植物的氮代谢过程。了解硝酸还 原酶活性测定的原理有助于深入理解 植物的氮代谢机制。
02
确保所有溶液的浓度和比例符合 实验要求。
实验9 硝酸还原酶活性的测定
实验9 硝酸还原酶活性的测定一、目的学会植物组织中硝酸还原酶活性的测定方法。
二、材料用具及仪器药品木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、洗耳球0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）、0.2mol/L KNO3）；磺胺试剂、a-苯胺试剂，NaNO2标准溶液：a—萘胺试剂配制：0.2克a—萘胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。
磺胺试剂配制：取1克磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml.NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解，定量至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水定量至1000ml，该溶液每ml含有NaNO25ug，用时稀释之。
磷酸缓冲液：贮备液A：0.2mol/L NaH2PO4溶液（27.8g NaH2PO4·H2O配成1000ml）。
贮备液B：0.2 mol/L Na2HPO4溶液（53.65g Na2HPO4·7H2O或Na2HPO4·12H2O 配成1000ml）取A液16ml+B液84ml，用水稀释至200ml三、原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于NO—3还原于NO—2NO—3+NADH+NO—2+NAD++H2O产生的NO-2可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2的含量的高低，即表明酶活性的大小。
NO-2含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺sulfanil—amide）比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO2。
四、方法步骤1．将新鲜叶片（蓖麻、烟草、木茨叶等）水洗，用吸水纸吸干水分，然后用1cm的钻孔器钻取的圆片，在天平上称取等量的叶圆片两份，每份0.5克，（或每份取50个叶圆片），分别置于含有下列溶液的三角瓶中，（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml。
硝酸还原酶活力的测定
硝酸还原酶活力的测定1、试剂：（1）亚硝态氮标准溶液称取1 g分析纯NaNO2溶于无离子水并定容至1000mL，然后再吸取1mL定容至1000mL,即为1μg/mL亚硝态氮的标准液。
（2）0、1mol/L pH7、5的磷酸缓冲液称取30、0905 g Na2HPO412H2O与2、4965 g NaH2PO42H2O，加无离子水溶解后定容至1000mL。
（3）10 g/L磺胺溶液称取1、00 g 磺胺溶于100mL3mol/L HCl中（取25mL浓盐酸加无离子水定容至100mL，即为3mol/L HCl）。
（4）0、2 g/L萘基乙烯胺溶液称取0、0200 g 萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
（5）0、1mol/L KNO3溶液称取2、5275 g KNO3 溶于250mL 0、1mol/L pH7、5的磷酸缓冲液。
（6）0、025mol/L pH8、7的磷酸缓冲液称取8、864 g Na2HPO412H2O和0、057 g K2HPO43H2O，溶于1000mL无离子水中。
（7）提取缓冲液称取0、1211 g半胱氨酸和0、0372 gEDTA，溶于100mL 0、025mol/L pH8、7的磷酸缓冲液。
（8）2 mg/mL NADH溶液称取2 mg NADH溶于1mL 0、1mol/L pH7、5的磷酸缓冲液(临用前配制)。
2．实验步骤（1）标准曲线制作取7支15mL干净的试管按表1顺序加入试剂，配成每管含0~2、0μg亚硝态氮的系列标准溶液，摇匀后在25℃下保温30 min，然后在540nm下比色测定，以每管中亚硝态氮的量（μg）为横坐标（x），吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线或建立回归方程。
试剂管号1234567亚硝酸钠标准液/mL00、20、40、81、21、62、0蒸馏水/mL2、01、81、61、20、80、40、010g/L磺胺/mL44444440、2g/L萘基乙烯胺/mL4444444每管含亚硝态氮量/μg00、20、40、81、21、62、0（2）硝酸还原酶活力测定1、酶液提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加4mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,4000r/min离心15min,上清液即为粗酶提取液2、酶反应取粗酶液0、4mL加入10mL试管中，再加入1、2mL 0、1mol/L KNO3磷酸缓冲液和0、4mL NADH溶液，在25℃水浴中准确保温30 min。
实验报告-硝酸还原酶活性的测定
实验报告-硝酸还原酶活性的测定实验目的：通过测定差示分光光度法下重铬酸钾氧化还原的反应，间接测定硝酸还原酶的活性。
实验原理：硝酸还原酶是一种以二价铁离子为电子受体的酶，能将NO2-还原为NO，是硝化作用的逆反应。
硝酸还原酶活性含量的测定常用于土壤、水环境等环境污染的检测。
本实验采用差示分光光度法来测定硝酸还原酶活性。
本实验中的差示分光光度法，利用重铬酸钾通过氧化还原反应，证明硝酸还原酶活性的存在。
重铬酸钾可以与硫酸铵和硝酸根离子反应，生成过氧化双铬离子和金属铵盐，同时溶液中的硝酸根离子被还原成氨氮产生气体释放出来。
通过测定溶液中氨氮的浓度，就可以计算出硝酸还原酶的活性含量。
实验步骤：1.准备A、B、C三个样品液。
A液：葡萄糖酸钙0.2g、1.5ml缓冲溶液、0.3ml菌液，加水至50ml。
B液：A液中再加菌液0.1ml。
C液：A液中再加无菌蒸馏水0.1ml代替菌液。
2.分别在三个位于水浴中的试管中加入A、B、C液各5ml并在水浴中孵育30分钟。
3.在孵育A液和C液试管的时间中，用硫酸铵和硝酸铵配制1%的硝酸根离子的溶液，重铬酸钾以及0.05%的草酸铁溶液。
4.在孵育后立即对A、B、C液各加入10ml配制好的硝酸根离子溶液。
5.再依次加入相同体积的重铬酸钾、草酸铁溶液，灵敏管测定氨氮的相对吸收值。
实验结果：样品重铬酸钾溶液的吸光度草酸铁溶液的吸光度比值氨氮浓度（mg/L）A 0.87 0.28 3.11 4.7B 0.77 0.25 3.08 4.6C 0.05 0.03 1.67 2.5实验分析：由上表可知，A、B两个样品的吸光度比值相差不太明显，说明A液中添加的0.1ml菌液对硝酸还原酶的活性没有显著的提高作用，而C液则比较显著地破坏了硝酸还原酶的活性，其氨氮浓度只有A、B两个样品的一半。
通过本次实验的差示分光光度法测定硝酸还原酶活性的方法，我们发现添加微生物菌液可以提高硝酸还原酶的活性，而加入无菌蒸馏水则会对其产生损害。
实验二、植物体内硝酸还原酶活力的测定(精)
2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4
0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
实验步骤：
1. 酶的提取
1g小麦叶片(剪碎放入欲冷的研钵)
加8ml提取液充分研磨，纱布过滤
收集匀浆液于4000rpmx20min,取上清液(粗酶液)
2. 酶反应
反应体系 粗酶液 对照组1 1ml KNO3 1.6ml NADH 磷酸缓 冲液 — 0.4ml
结果计算
X × V /V × V 3 2 1 -1 -1 样品中酶活性（µ g· g · h ）= W×t(h)
X —反应液酶催化产生的亚硝态氮总量（µ g）； V1——提取酶时加入的缓冲液体积（ml）； V2——酶反应时加入的粗酶液体积（ml）；
V3——颜色反应时的体原理：硝酸还原酶（NR）是植物氮素同 化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐 还原为亚硝酸盐： NO3- +NADH + H+ +H2O
NR
NO2- +NAD+
离体法
实验材料:
新鲜小麦叶片(小麦幼苗提前3天用0.05M KNO3浇灌)
主要步骤
标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入 试剂，配成0-2.0µ g的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀 以亚硝态氮浓度（µ g/mL）为横坐标（X），吸光值
植物细胞
NO3—
呼吸代谢
NADH NAD
NO2—
NO3—
NO2—
外界溶液
实验材料
蜀葵的新鲜叶片
配置溶液
对照组： 0.1M pH7.5磷酸缓冲液5ml+蒸 馏水5ml+ 25mM蔗糖溶液0.1ml +异丙醇 0.1ml 反应组：0.1M KNO3溶液10ml+ 25mM蔗 糖溶液0.1ml +异丙醇0.1ml
硝酸还原酶活性的测定
实验二、硝酸还原酶活性的测定-活体法[原理]：硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml；3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）；4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中；5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中；6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中；7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法]摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。
2.样品中硝酸还原酶活力测定1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。
硝酸还原酶活性的测定(精)
酸性
重氮盐 ＋ α- 萘胺
紫红色偶氮染料
（颜色在2～3小时内稳定）
比色测定，得到 NO2- 的含量
磺胺比色法
【实验步骤】
1. 样品处理
⑴ 叶片水洗吸干 钻孔得小圆片（直径1cm） 称取2份，每份0.4g
⑵ 取2只三角瓶
NO.1: 磷酸缓冲液 5ml ＋蒸馏水 5ml NO.2: 磷酸缓冲液 5ml ＋0.2M KNO3 5ml
实验三 硝酸还原酶活性的测定 （活体法）
【实验原理】
本身不存在该酶，外加 NO3-，诱导生成
硝酸还原酶（NR）是植物氮素代谢作用中的关键性的酶 ，该酶为诱导酶。
NO3- NR NO2-
NO2- 可以从细胞中很快地分泌到反应液中，故只要测 定反应液中的 NO2- 的增加，可计算该酶活性的大小。
NO2- ＋ 磺胺
⑶ 加入叶片 ⑷ 抽气至叶片沉淀（抽气彻底，以使溶液与质膜充分接触，使反应
顺利进行）
⑸ 30℃避光保温30min
2. NO2- 含量测定
反应液1ml 磺胺试剂2ml α- 萘胺2ml搅匀，静置30min来自比色A5203. 计算
C×反应液总体积（10ml） ＝ 反应时间（0.5hr）×样品重量（g）
ug / g·FW·h
4. 标准曲线绘制 配制 5，4，3，2，1，0.5，0ug/ml NaNO2
反应液1ml 磺胺试剂2ml α- 萘胺2ml
搅匀，静置30min
比色A520
磺胺比色法比较灵敏，显色速度易受温度，酸 度等因素得影响，故要严格控制实验条件：标准液 与样品反应液同时反应、比色）
作业：
测定硝酸还原酶活性时，反应过程中为何要在避光 条件下进行？
实验6植物体内硝酸还原酶活力的测定
实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（ NO 3 ˉ +NADH+H ＋→ NO 2 ˉ +NAD ＋ +H 2 O ）。
产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反映如下：生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一样单位鲜重以 N μg ／（ g · h ）为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
Ⅰ离体法二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料水稻、小麦叶片、幼穗等。
（二）试剂1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO2 g 溶于无离子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL 定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮的 1 μg ／ mL 的标准液。
2 ． mol/L pH 的磷酸缓冲液： Na 2 HPO 4 · 12H 2 O g 与 NaH 2 PO 4 · 2H 2 O g 加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。
3 ． 1 ％磺胺溶液： g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。
4 ．％萘基乙烯胺溶液： g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子水中，贮于棕色瓶中。
5 ． mol/L KNO 3 溶液： g KNO 3 溶于 250 mL mol/L 的磷酸缓冲液。
6 ． mol/L 的磷酸缓冲液： g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O ， g K 2 HPO 4 · 3H 2 O 溶于 1000 mL 无离子水中。
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作业：
测定硝酸还原酶活性时，反应过程中为何要在避光 条件下进行？
⑶ 加入叶片 ⑷ 抽气至叶片沉淀（抽气彻底，以使溶液与质膜充分接触，使反应
顺利进行）
⑸ 30℃避光保温30min
2. NO2- 含量测定
反应液1ml 磺胺试剂2ml α- 萘胺2ml
搅匀，静置30min
比色A520
3. 计算
C×反应液总体积（10ml） ＝ 反应时间（0.5hr）×样品重量（g）
实验三 硝酸还原酶活性的测定 （活体法）
【实验原理】
本身不存在该酶，外加 NO3-，诱导生成
硝酸还原酶（NR）是植物氮素代谢作用中的关键性的酶 ，该酶为诱导酶。
NO3- NR 到反应液中，故只要测 定反应液中的 NO2- 的增加，可计算该酶活性的大小。
NO2- ＋ 磺胺
ug / g·FW·h
4. 标准曲线绘制 配制 5，4，3，2，1，0.5，0ug/ml NaNO2
反应液1ml 磺胺试剂2ml α- 萘胺2ml
搅匀，静置30min
比色A520
磺胺比色法比较灵敏，显色速度易受温度，酸 度等因素得影响，故要严格控制实验条件：标准液 与样品反应液同时反应、比色）
酸性
重氮盐 ＋ α- 萘胺
紫红色偶氮染料
（颜色在2～3小时内稳定）
比色测定，得到 NO2- 的含量
磺胺比色法
【实验步骤】
1. 样品处理
⑴ 叶片水洗吸干 钻孔得小圆片（直径1cm） 称取2份，每份0.4g
⑵ 取2只三角瓶
NO.1: 磷酸缓冲液 5ml ＋蒸馏水 5ml NO.2: 磷酸缓冲液 5ml ＋0.2M KNO3 5ml