硝酸还原酶(Nitrate Reductase,NR)活性测定试剂盒说明书
硝酸还原酶活性的测定
硝酸还原酶活性(ug／h·g)=C×10/t·m(鲜重)
四、实验报告
1、比较在两种不同溶液中的硝酸还原酶活性，并解释。
硝酸还原酶将N03-还原为N02-，产生的N02-可 以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中， 测定反应液中的N02-含量的多少，就表示硝酸还 原酶活性的大小。
N02-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液 中磺胺与N02-形成重氮盐，重氮盐再与α-萘胺 偶联形成紫红色的偶氮染料，这种偶氮染料在 520nm处有最大吸收峰，因此选用波长520nm分光 光度法进行测定。
根据Lambert-Beer定律：物质对光的吸收，吸 收的光量与物质的浓度、溶液的厚度成比例关系， 用公式表示为
1、用直径1cm的打孔器打出油菜叶圆片100片，各投50片(先称重)至溶液
(1)磷酸缓冲液5 ml + 蒸馏水5 ml； (2)磷酸缓冲液5 ml + KNO3溶液5ml 分别将溶液(1)(2)倒入20毫升针筒内，用针筒抽气使叶圆片中的空气抽去直至叶
圆片沉于溶液中，将此溶液倒回三角瓶置于30℃恒温箱中，保温作用30min后测定 N02-含量。
叶绿体色素的性质测定和分离(P46-48)
实验三 硝酸还原酶活性的测定
一、实验原理
硝酸还原酶是植物氮代谢的关键酶，它使N03-还原成N02-，并可渗到周围的溶 液中，用磺胺显色比色法测定外界溶液中的N02-含量，可以反应该酶活性的强弱。 二、器材与试剂
油菜叶片、小白菜叶片、UV-1100型紫外/可见分光光度计、20毫升针筒 0.1 mol/L pH7.5磷酸缓冲液、O.2M KNO3溶液、磺胺试剂、α-萘胺试剂 三、方法与步骤
2、绘制标准曲线（见P34）
3、N02-含量测定 溶液(1)1ml + 磺胺试剂2ml + α-萘胺试剂2ml
硝酸还原酶(NR)活性测定试剂盒说明书
硝酸还原酶（NR）活性测定试剂盒说明书硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒说明书微量法100管/96样注意：正式测定前务必取23个预期差异较大的样本做预测定测定意义：NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。
测定原理：NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，20℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，20℃保存；试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存（如出现结晶析出，60℃90℃水浴溶解后使用）；试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：标准储备液1mL，20℃保存。
诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。
0.1umol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取 0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。
样本前处理：动植物组织样品的前处理:（1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干。
（2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
NO试剂盒说明书
NO试剂盒说明书一氧化碳试剂盒说明书(硝酸还原酶法)一.测定意义：NO化学性质活泼，体内代谢转化为硝酸盐(NO3)和亚硝酸盐(NO2),血清(NO3)与(NO2)浓度之和(NO2+NO3)才能准确代表体内(NO)水平。
血清(NO3+NO2)含量测定，国内有的单位采用金属镉还原法，但该法操作繁琐(血清需除蛋白)，反应不易控制(金属镉可将NO2进一步还原)，且不能完全将NO3还原为NO2，准确性差。
本测试法为一种灵敏、简捷、快速、稳定、易推广的方法。
二、原理：NO化学性质活泼，在体内代谢很快转化为NO2和NO3，而NO2又进一步转化为N03-,而NO2-又进一步转化为NO3-,本法利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-，通过显色深浅测定其浓度的高低。
一、试剂组成与配制：1.试剂一：液体6ml×2瓶(50T)如6ml×1瓶(25T)，-20℃以下保存。
使用前请放37℃水浴中或室温使其溶解后再用。
2.试剂二：液体6ml×2瓶(50T)如6ml×1瓶(25T)，-20℃以下保存。
使用前请放37℃水浴中或室温后再用。
混合试剂的配制：按试剂一：试剂二=1：1的比例配制，用多少配多少，配好后充分混合后待用，现用现配3、试剂三：液体12ml×1瓶(50T)如6ml×1瓶(25T)，室温保存4、试剂四：液体6ml×1瓶(50T)如3ml×1瓶(25T),室温保存5、试剂五：粉剂×1支，用时加90℃-100℃热蒸馏水20ml(50T)如10ml(25T)[注]，充分溶解，避光保存。
6、试剂六：粉剂×1支，用时加蒸馏水8ml(50T)如4ml(25T),避光冷藏保存，当颜色变成深咖啡色不可再用。
7、试剂七：液体8ml50T(4ml25T)×1瓶，室温保存。
显色剂的配制：需多少配多少试剂五：试剂六：试剂七=2.5：1：1.若能在一月内用完者也可以一次配成。
植物体内硝酸还原酶活力的测定
实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（ NO 3 ˉ +NADH+H ＋→ NO 2 ˉ +NAD ＋ +H 2 O ）。
产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般单位鲜重以 N μg ／（ g · h ）为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
Ⅰ离体法二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料水稻、小麦叶片、幼穗等。
（二）试剂1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO2 0.9857 g 溶于无离子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL 定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮的 1 μg ／ mL 的标准液。
2 ． 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸缓冲液： Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 30.0905 g 与 NaH 2 PO 4 · 2H2 O 2.4965 g 加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。
3 ． 1 ％磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。
4 ． 0.02 ％萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子水中，贮于棕色瓶中。
5 ． 0.1 mol/L KNO 3 溶液： 2.5275 g KNO 3 溶于 250 mL 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液。
6 ． 0.025 mol/L pH8.7 的磷酸缓冲液： 8.8640 g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O ， 0.0570 g K 2 HPO 4 · 3H 2 O 溶于 1000 mL 无离子水中。
植物硝酸还原酶 (NR)说明书-贝洛生物
2张
6 显色剂 B 液
6ml×1/瓶
12 密封袋
1个
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能
马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
植物硝酸还原酶(NR)酶联免疫分析
试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围： 6 IU/L -160 IU/L
96T
使用目的：
本试剂盒用于测定植物组织，细胞上清及相关液体样本中硝酸还原酶（NR）的含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物硝酸还原酶(NR)水平。用纯化的植物硝酸
还原酶(NR)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入硝酸还原酶
计算 以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的
OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，
即为样品的实际浓度。 注意事项 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未
大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物请避光保存。 7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9．本试剂不同批号组分不得混用。 保存条件及有效期 1．试剂盒保存：；2-8℃。 2．有效期：6 个月
硝酸还原酶活力测定
NR
NiR
硝酸还原酶催化硝酸盐还原为亚硝酸：
NR
NO-3+ NAD(P)H+H+
NO-2+ NAD(P)++ H2O
亚硝酸还原酶催化亚硝酸盐还原为铵：
硝酸还原酶是一种诱导酶，诱导物是 NO3- ，光照可促进硝酸盐的还原过程。
六、操作步骤 七、结果计算 八、思考题 九、注意事项
植物生理生化实验
二.目的要求
1、了解NR测定对植物氮代谢的重要意义 及实际应用。 2、了解离体法和活体法测定NR的不同点。
3、掌握活体法测定NR的原理及其技术要点。
4、掌握测定过程相关仪器的使用方法。
55％ 21％ 24％
三、原理：
硝酸还原酶可以将NO3-还原成NO2-，其反应为： NO3-+NADH+H+
nr可行性研究勘察初步勘察及详细勘察三个阶段工作深度和精度应分别符合选择场址要求初步设计要求及施工图设计要求可行性研究勘察初步勘察及详细勘察三个阶段工作深度和精度应分别符合选择场址要求初步设计要求及施工图设计要求可行性研究勘察初步勘察及详细勘察三个阶段工作深度和精度应分别符合选择场址要求初步设计要求及施工图设计要求102moll硝酸钾201moll的磷酸缓冲液ph75液
55％ 21％ 24％
植物的氮源
空气中含有近80%的氮气(N2),但植物却 无法直接利微生物)才能
直接同化利用分子态氮，而植物所利用的氮 源,主要来自土壤.。
植物主要利用土壤中的含氮化合物：
1、土壤中的有机含氮化合物主要
来源于动物、植物和微生物躯体的
硝酸还原酶活力的测定
实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（ NO 3 ˉ +NADH+H ＋→ NO 2 ˉ +NAD ＋ +H 2 O ）。
产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般单位鲜重以 N μg ／（ g · h ）为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
Ⅰ离体法二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料水稻、小麦叶片、幼穗等。
（二）试剂1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO 20.9857 g 溶于无离子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮的 1 μg ／ mL 的标准液。
2 ． 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸缓冲液： Na 2HPO 4· 12H 2O 30.0905 g与 NaH2PO4· 2H2 O 2.4965 g加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。
3 ． 1 ％磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。
4 ． 0.02 ％萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子水中，贮于棕色瓶中。
5 ． 0.1 mol/L KNO 3 溶液： 2.5275 g KNO 3 溶于 250 mL 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液。
6 ． 0.025 mol/L pH8.7 的磷酸缓冲液： 8.8640 g Na 2 HPO 4· 12H 2 O ， 0.0570 g K2 HPO 4· 3H 2 O 溶于 1000 mL 无离子水中。
硝酸还原酶活力的测定
硝酸还原酶活力的测定一、试剂：（1）亚硝态氮标准溶液称取1 g分析纯NaNO2溶于无离子水并定容至1000mL，然后再吸取1mL定容至1000mL,即为1μg/mL亚硝态氮的标准液。
（2）0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液称取30.0905 g Na2HPO4·12H2O与2.4965 g NaH2PO4·2H2O，加无离子水溶解后定容至1000mL。
（3）10 g/L磺胺溶液称取1.00 g磺胺溶于100mL 3mol/L HCl中（取25mL浓盐酸加无离子水定容至100mL，即为3mol/L HCl）。
（4）0.2 g/L萘基乙烯胺溶液称取0.0200 g 萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
（5）0.1mol/L KNO3溶液称取2.5275 g KNO3溶于250mL 0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液。
（6）0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液称取8.864 g Na2HPO4·12H2O和0.057 g K2HPO4·3H2O，溶于1000mL 无离子水中。
（7）提取缓冲液称取0.1211 g半胱氨酸和0.0372 g EDTA，溶于100mL 0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液。
（8）2 mg/mL NADH溶液称取2 mg NADH溶于1mL 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液(临用前配制)。
二．实验步骤（一）标准曲线制作取7支15mL干净的试管按表1顺序加入试剂，配成每管含0~2.0μg 亚硝态氮的系列标准溶液，摇匀后在25℃下保温30 min，然后在540nm下比色测定，以每管中亚硝态氮的量（μg）为横坐标（x），吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线或建立回归方程。
（二）硝酸还原酶活力测定1.酶液提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加4mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,4000r/min离心15min,上清液即为粗酶提取液2.酶反应取粗酶液0.4mL加入10mL试管中，再加入1.2mL 0.1mol/L KNO3磷酸缓冲液和0.4mL NADH溶液，在25℃水浴中准确保温30 min。
碧云天-总一氧化氮检测试剂盒说明书
总一氧化氮检测试剂盒产品简介：总一氧化氮检测试剂盒(Total Nitric Oxide Assay Kit, 即Nitrate/Nitrite Assay Kit)采用了硝酸盐还原酶(Nitrate reductase)还原硝酸盐(nitrate)为亚硝酸盐(nitrite)，然后通过经典的Griess reagent检测亚硝酸盐，从而测定出总一氧化氮。
一氧化氮本身极不稳定，在细胞内很快代谢为硝酸盐(Nitrate)和亚硝酸盐(Nitrite)，通过上述方法检测出硝酸盐和亚硝酸盐的总量，就可以推算出总的一氧化氮的量。
本试剂盒采用了NADPH依赖性硝酸盐还原酶(NADPH dependent nitrate reductase)。
高浓度的NADPH会干扰后续的检测，消除NADPH的一种常用方法就是使用Lactate dehydrogenase (LDH)清除NADPH。
本试剂盒采用了LDH清除NADPH的方法，使检测结果更加准确。
对亚硝酸盐的检测下限达到2微摩尔/升，在2-80微摩尔/升的范围内有很好的线性关系。
浓度过高的样品可以适当稀释后再进行检测。
样品范围广，可以检测细胞裂解液、组织裂解液、细胞或组织的培养液、血清、血浆或尿液等中一氧化氮的含量。
酚红和10%血清对测定无明显干扰。
样品需要量少。
根据样品中一氧化氮的浓度不同，仅需0-60微升样品。
检测速度快，仅需约80分钟即可完成检测。
本试剂盒采用了间接的一氧化氮检测方法，如需检测细胞内实际的一氧化氮水平，可以采用碧云天生产的DAF-FM DA (NO荧光探针)(S0019)。
保存条件：-20℃保存，一年有效。
NADPH，Nitrate Reductase，NaNO2 (1M)，Griess Reagent I 和Griess Reagent II需避光保存。
NADPH配制成溶液后必须分装并-70℃保存。
注意事项：RPMI 1640等含有较高浓度硝酸盐的培养液容易对本试剂盒的检测产生干扰，请尽量避免。
硝酸还原酶活力的测定
硝酸还原酶活力的测定1、试剂：（1）亚硝态氮标准溶液称取1 g分析纯NaNO2溶于无离子水并定容至1000mL，然后再吸取1mL定容至1000mL,即为1μg/mL亚硝态氮的标准液。
（2）0、1mol/L pH7、5的磷酸缓冲液称取30、0905 g Na2HPO412H2O与2、4965 g NaH2PO42H2O，加无离子水溶解后定容至1000mL。
（3）10 g/L磺胺溶液称取1、00 g 磺胺溶于100mL3mol/L HCl中（取25mL浓盐酸加无离子水定容至100mL，即为3mol/L HCl）。
（4）0、2 g/L萘基乙烯胺溶液称取0、0200 g 萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
（5）0、1mol/L KNO3溶液称取2、5275 g KNO3 溶于250mL 0、1mol/L pH7、5的磷酸缓冲液。
（6）0、025mol/L pH8、7的磷酸缓冲液称取8、864 g Na2HPO412H2O和0、057 g K2HPO43H2O，溶于1000mL无离子水中。
（7）提取缓冲液称取0、1211 g半胱氨酸和0、0372 gEDTA，溶于100mL 0、025mol/L pH8、7的磷酸缓冲液。
（8）2 mg/mL NADH溶液称取2 mg NADH溶于1mL 0、1mol/L pH7、5的磷酸缓冲液(临用前配制)。
2．实验步骤（1）标准曲线制作取7支15mL干净的试管按表1顺序加入试剂，配成每管含0~2、0μg亚硝态氮的系列标准溶液，摇匀后在25℃下保温30 min，然后在540nm下比色测定，以每管中亚硝态氮的量（μg）为横坐标（x），吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线或建立回归方程。
试剂管号1234567亚硝酸钠标准液/mL00、20、40、81、21、62、0蒸馏水/mL2、01、81、61、20、80、40、010g/L磺胺/mL44444440、2g/L萘基乙烯胺/mL4444444每管含亚硝态氮量/μg00、20、40、81、21、62、0（2）硝酸还原酶活力测定1、酶液提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加4mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,4000r/min离心15min,上清液即为粗酶提取液2、酶反应取粗酶液0、4mL加入10mL试管中，再加入1、2mL 0、1mol/L KNO3磷酸缓冲液和0、4mL NADH溶液，在25℃水浴中准确保温30 min。
硝酸还原酶(NR)活性的测定
硝酸还原酶(NR)活性的测定
制作人： 车永梅 单 位： 生命科学学院
一、实验目的
了解硝酸还原酶在氮代谢中的地位，掌握硝酸还
原酶活性测定的方法。
二、实验原理
植物吸收的硝酸根离子，首先通过硝酸还原酶的 催化，被还原成亚硝酸根离子。其反应如下： NO3-+NADH+H+ → NO2-+NAD++H2O 产生的亚硝酸根离子可以从组织内渗到外界溶液中， 测定反应液中亚硝酸含量，通过一定公式计算就可 得硝酸还原酶活性的大小。
2. 取样
3. NaNO2 含量测定
五、实验结果
按下式计算酶活性： NR活性（gNO2-/gFW· h）＝
查表值×(46/69) 材料鲜重（g）×反应时间
六、思考题
1.NR活性测定时取材前为什么要进行一段时间光合
作用？ 2.测定Байду номын сангаас促反应时为什么要在暗处保温？ 3.NR活性测定时加入磺胺、盐酸萘乙二胺和KNO3 的作用各是什么？
试剂（ml）
试管号
1
0 1 2 2 0
2
0.1 0.9 2 2 0.5
3
0.2 0.8 2 2 1
4
0.4 0.6 2 2 2
5
0.6 0.4 2 2 3
6
0.8 0.2 2 2 4
7
1 0 2 2 5
NaNO2标准液(5微克／ml) 蒸馏水 对氨基苯磺酸(或磺胺) 盐酸萘乙二胺(或α-萘胺) 每管含NaNO2的微克数
亚硝酸离子的测定用比色法。其反应如下： 对氨基苯磺酸(或磺胺)+2H++NO2- → 叠氮化合物 叠氮化合物+α-萘胺（或盐酸萘乙二胺） → 偶氮化 合物(红色) 生成的红色偶氮化合物在520nm波长比色，其光密 度值与NO2-含量成正比。
硝酸还原酶(NR)活性测定
实验三：硝酸还原酶（NR）活性测定一、实验目的了解硝酸还原酶的活性测定的原理，掌握活体测定硝酸还原酶地方法二、实验原理硝酸还原酶是植物氮元素代谢过程中的关键酶，于作物的吸收和利用氮元素有关，他们作用于硝酸根，使之还原为亚硝酸根根：NO3-+NADH++H+ NR NO2-+NAD++H2O产生的亚硝酸根可以从组织内渗入到外界溶液中，从而测定溶液中亚硝酸根的含量的增加即为NR活性大小测定时间磺胺与亚硝酸钠形成重氮盐，再与α-奈氨偶联形成紫色物质。
反应液的酸度和温度都会对反应产生影响。
三、试剂与器材1、材料：小白菜叶片2、试剂：0.1mol/L ph7.5磷酸缓冲液，磺胺试剂、α-奈氨、0.2mol/LKNO3、NaNO2标准溶液3、器材：分光光度计、注射器、试管、天平、烧杯、移液管、恒温箱四、实验步骤1、按下列表格配置不同浓度的NaNO2溶液2、另取7支试管编号，取上述配置好的溶液各1ml，分别加入磺胺2ml、α-奈氨2ml摇匀静置30min，在520nm处比色以NaNO2终浓度为横坐标绘制标准曲线3、将小白菜叶片剪成0.5cm2大小称取两分，每份各0.5g放入另个烧杯中，一个烧杯中加入0.1ml/L磷酸缓冲液5ml再加入蒸馏水5ml，作为对照组。
林一个烧杯中加入0.1mol/L磷酸缓冲液5ml和0.2mol/LKNO3溶液5ml作为实验组。
将材料与溶液混合置于射器中抽气至材料沉入溶液。
4、将含材料的烧杯置于30℃恒温箱中30min，之后分别取1ml溶液按第二步进行NO2-含量测定5、结果分析：酶活性（NO2- μg g-1h-1）=（实验组NO2-含量-对照组NO2-含量）/材料重量（g）/时间（h）五、实验结果实验分析及感悟:由于实验过程中，移液管的混用可能会导致部分溶液污染导致实验产生误差。
叶片剪切的由于抽气不够是结果偏小。
本次试验经历了很长时间，我们从上午10点一直做到下午一点才做完。
当然经过努力的数据分析我们最终得到了我们所渴求的实验结果。
硝酸还原酶活性的测定
实验二、硝酸还原酶活性的测定-活体法[原理]：硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml；3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）；4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中；5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中；6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中；7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法]摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。
2.样品中硝酸还原酶活力测定1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。
硝酸还原酶(NR)活性的测定
硝酸还原酶(NR)活性的测定硝酸还原酶(NR)活性的测定主要采用光度法和荧光法。
光度法测定硝酸还原酶活性的步骤如下：1. 准备0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)。
2. 准备硝酸钠(NaNO3)的不同浓度标准溶液。
3. 取一定量的细胞提取物，加入适量的磷酸盐缓冲液，使得体积总量达到一定的体积。
4. 在一条白色或透明的96孔板中，分别加入相同体积的磷酸盐缓冲液和不同浓度的NaNO3标准溶液。
5. 加入适量的细胞提取物到每一孔中，混匀。
6. 在适当的温度下孵育一定的时间。
7. 加入 Griess 试剂（硫酸铁铵与草酰胺的混合溶液）到每个孔中。
8. 在深色环境下，测量每个孔的吸光度值。
9. 利用吸光度值与所加入的NaNO3标准溶液浓度之间的关系，绘制标准曲线。
10. 根据待测样品的吸光度值及标准曲线，计算出硝酸还原酶活性。
荧光法测定硝酸还原酶活性的步骤如下：1. 准备0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)。
2. 准备硝酸钠(NaNO3)的不同浓度标准溶液。
3. 取一定量的细胞提取物，加入适量的磷酸盐缓冲液，使得体积总量达到一定的体积。
4. 在一条黑色的96孔板中，分别加入相同体积的磷酸盐缓冲液和不同浓度的NaNO3标准溶液。
5. 加入适量的细胞提取物到每一孔中，混匀。
6. 在适当的温度下孵育一定的时间。
7. 加入荧光探针（如草酰胺二乙酸盐,DAF-FM DA）到每个孔中。
8. 在荧光酶标仪中，设置适当的激发波长和发射波长，测量每个孔的荧光强度。
9. 利用荧光强度与所加入的NaNO3标准溶液浓度之间的关系，绘制标准曲线。
10. 根据待测样品的荧光强度及标准曲线，计算出硝酸还原酶活性。
植物硝酸还原酶(NR)活力测定(活体法)
植物硝酸还原酶（NR）活力测定（活体法）一、原理硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以Nμg·g-1·h-1为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好二、仪器与用具分光光度计；真空抽气泵（或20ml注射器筒）；天平；单面刀片；保温箱（或恒温水浴）；刻度试管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。
三、试剂1. 亚硝酸钠标准液称取分析纯NaNO2 0.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀释定容至1000ml，即为每ml含NaNO2 5μg（亚硝态氮近似1μg/ml）的标准液。
2. 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液：K2HPO4 19.24g，KH2PO4 2.2g，加水溶解后定容至1000ml。
3. 1%（W/V）对-氨基苯磺酸溶液：称取10.0g加入250ml浓HCl中，用蒸馏水定容至1000ml。
4. 0.2%（W/V）α-萘胺溶液：称取2.0gα-萘胺溶于250ml冰醋酸中，用蒸馏水定容至1000ml。
5. 30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。
6. KNO3（0.1mol/L）、异丙醇（1% V/V）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称10.10g KNO3溶于1000ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加10ml异丙醇混匀。
四、方法1. 标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0-2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。
硝酸还原酶活性的测定(精)
酸性
重氮盐 ＋ α- 萘胺
紫红色偶氮染料
（颜色在2～3小时内稳定）
比色测定，得到 NO2- 的含量
磺胺比色法
【实验步骤】
1. 样品处理
⑴ 叶片水洗吸干 钻孔得小圆片（直径1cm） 称取2份，每份0.4g
⑵ 取2只三角瓶
NO.1: 磷酸缓冲液 5ml ＋蒸馏水 5ml NO.2: 磷酸缓冲液 5ml ＋0.2M KNO3 5ml
作业：
测定硝酸还原酶活性时，反应过程中为何要在避光 条件下进行？
⑶ 加入叶片 ⑷ 抽气至叶片沉淀（抽气彻底，以使溶液与质膜充分接触，使反应
顺利进行）
⑸ 30℃避光保温30min Nhomakorabea2. NO2- 含量测定
反应液1ml 磺胺试剂2ml α- 萘胺2ml
搅匀，静置30min
比色A520
3. 计算
C×反应液总体积（10ml） ＝ 反应时间（0.5hr）×样品重量（g）
实验三 硝酸还原酶活性的测定 （活体法）
【实验原理】
本身不存在该酶，外加 NO3-，诱导生成
硝酸还原酶（NR）是植物氮素代谢作用中的关键性的酶 ，该酶为诱导酶。
NO3- NR NO2-
NO2- 可以从细胞中很快地分泌到反应液中，故只要测 定反应液中的 NO2- 的增加，可计算该酶活性的大小。
NO2- ＋ 磺胺
ug / g·FW·h
4. 标准曲线绘制 配制 5，4，3，2，1，0.5，0ug/ml NaNO2
反应液1ml 磺胺试剂2ml α- 萘胺2ml
搅匀，静置30min
比色A520
磺胺比色法比较灵敏，显色速度易受温度，酸 度等因素得影响，故要严格控制实验条件：标准液 与样品反应液同时反应、比色）
硝酸还原酶检测试剂盒(萘胺比色法)
硝酸还原酶(NR)检测试剂盒(萘胺比色法)简介：硝酸还原酶(Nitrate reductase，NR)是一种氧化还原酶，可分为参与硝酸盐同化的同化型还原酶和催化以硝酸盐为活体氧化的最终电子受休的硝酸盐呼吸异化型(呼吸型)还原酶。
硝酸还原酶是植物氮素代谢中氮素同化的关键酶，该酶与作物吸收利用氮肥有关，对作物的产量和质量有影响，因此可以把硝酸还原酶的活力当作营养诊断养、农田施肥或作物育种的生理生化指标。
Leagene 硝酸还原酶(NR)检测试剂盒(萘胺比色法)检测原理是NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，其反应如下：NO3-+NADH+H+→NO2-+NAD++H2O产生的亚硝酸盐与磺胺、萘胺在酸性条件下定量生成稳定的红色偶氮化合物，于分光光度计检测吸光度，以吸光度变化所需萘胺进行计算。
该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中硝酸还原酶活性，尤其适用于植物体内硝酸还原酶的活力。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、蒸馏水2、离心管或试管3、匀浆器或研钵4、恒温箱或水浴锅5、低温离心机6、比色杯7、分光光度计编号名称TE050350TTE0503100TStorage试剂(A): 亚硝态氮标准(100μg/ml)1ml1ml 4℃试剂(B): NR Lysis buffer 250ml500ml RT试剂(C): NR Assay buffer 30ml50ml RT试剂(D): 硝酸盐缓冲液35ml80ml RT试剂(E): NADH 2支3支-20℃试剂(F): NR终止液30ml60ml RT 避光使用说明书1份操作步骤(仅供参考)：1、准备样品：①植物样品：取植物组织(根系)清洗干净，切碎，置于冰箱。
按植物组织：NR Lysis buffer 比例，加入预冷的NR Lysis buffer，冰浴情况下充分匀浆或研磨。
离心，留取上清液即为硝酸还原酶粗提液，4℃保存待用。
NR试剂盒方法
硝酸还原酶（NR）活性检测试剂盒说明书微量法BC0085100T/48S诱导剂储备液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，-20℃保存。
试剂二：液体2.5mL×1瓶，-20℃保存。
试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。
标准液：NaNO2标准储备液1mL，10μmol/mL，-20℃保存。
诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。
标准液的配制：将标准储备液稀释为1.5、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1μmol/mL 浓度的标准溶液。
NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋+H2O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α - 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
钵、冰和蒸馏水。
一、样品测定的前处理1、取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30min，取出样本，滤纸吸干。
（根据需要进行诱导处理）2、称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴研磨，4000g，4℃离心10min，取上清冰上放置待测。
二、测定步骤1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在EP管或96孔板中加入下列试剂）第1页，共2页混匀，显色20min，540nm处比色，计算（A测定-A对照）。
注意：空白管只需测一次。
三、NR活性计算：1. 标准曲线的绘制：以标准溶液浓度为x轴，以ΔA（A标准管-A空白管）为y轴绘制标准曲线，得到线性回归方程y=kx+b。
将（A测定-A对照）带入方程中，计算出x（μmol/mL）。
实验三硝酸还原酶活性测定
（uMol/ml）（uMol/h•gfw）
（uMol/ml）（uMol/h•gfw）
6. 注意事项
① 抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中； ② 硝酸还原过程应在黑暗中进行；
③ 磺胺试剂和α-萘胺试剂加入时，注意顺序；
④ 正确使用分光光度计； ⑤ 避免移液管使用交叉感染。
7. 思考题
1） 为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进行？ 2） NR酶活性（ NO2- ，uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重g×0.5h）
公式中的0.5 h 指哪一个？
酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时 可还原NO2- ，所以在暗条件下进行反应可阻止NO2- 的继续反 应，以保证测定结果的准确。
1. 实验目的意义
硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写NR）是硝酸盐同化中第一 个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植 物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响， 因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之 一，也可作为品种选育的指标之一。
掌握硝酸还原酶活性的测定方法 了解硝酸还原酶的特性
（不稳定，见光容易分解，测定需迅速。）
当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成 直线关系。 NO2-含量标准曲线： [ NO2- ](µ mol/ml) = 0.0026＋0.359OD540 [NO2-] (µ mol/ml)×稀释倍数 鲜重(g)×时间(h)
NR活性(NO2- , µmol/h•gfw) =
实验3 硝酸盐和光诱导对硝酸还原 酶（NR）活性的影响
硝酸还原酶
植物从土壤中吸收的 NO3－ 必须经代谢性还原才能被利用， 因为细胞组分中的N均呈高度还原态，而NO3－中的N为高度 氧化态。
苏州格锐思亚硝酸还原酶试剂盒说明书
亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）试剂盒说明书（货号：G0408F分光法24样）一、产品简介：亚硝酸还原酶（NiR，EC1.7.2.1）是一类能催化亚硝酸盐还原的氧化还原酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。
亚硝酸还原酶可将NO2-还原为NO，使样品中参与对–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成（粉）红色偶氮化合物的NO2-减少，根据颜色深浅即540nm处吸光值的变化可反应亚硝酸还原酶的活性。
二、试剂盒的组成和配制：试剂名称规格保存要求备注提取液液体50mL×1瓶4℃保存试剂一粉体mg×2支4℃保存临用前甩几下使粉体落入底部，每支加1.5mL提取液溶解。
试剂二粉剂mg×1支4℃保存临用前甩几下使粉体落入底部，再加2mL提取液溶解。
试剂三试剂三Amg×2支试剂三Bmg×2支4℃保存临用前一支试剂A和B分别用1mL蒸馏水完全溶解，再把1mL试剂B倒入1mL试剂A中混成试剂三mix(一周内用完)。
试剂四粉体g×1瓶4℃保存临用前加3mL蒸馏水溶解。
试剂五液体12mL×1瓶4℃保存临用前，可依据待检测样本数量，把试剂五和六等比例混合成无色的反应mix（注意观察，若变粉色，则不能使用）。
两天之内用完。
试剂六液体12mL×1瓶4℃保存标准品粉体mg×1支4℃保存若重新做标曲，则用到该试剂。
三、所需的仪器和用品：可见分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、可调式移液器、天平、研钵、水浴锅、低温离心机。
四、亚硝酸还原酶（NiR）活性测定：建议正式实验前选取2个样本做预测定，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！1、样本制备：①组织样本：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。
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货号：QS1800 规格：50管/24样硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒说明书
分光光度法
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。
测定原理：
O；产生的亚硝酸NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +N AD＋ +H
2
盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α- 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
自备实验用品及仪器：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，-20℃保存。
试剂二：液体4mL×1瓶，-20℃保存。
试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存，（如出现结晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）；
试剂四：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂五：标准储备液1mL，-20℃保存。
诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL 蒸馏水，充分混匀。
0.1μmol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取 0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。
样品测定的前处理：
组织的前处理：
（1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30min，取出样本，滤纸吸干。
（一般不要诱导处理，预测定结果没有活性则需要诱导处理）
（2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
细菌或培养细胞的前处理：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
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1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
注意：标准管和空白管只需测一次，每个测定管设一个对照管。
NR活性计算：
（1）按样本鲜重计算：
单位定义：每小时每g鲜重样品中催化产生 1μmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。
NR（μmol/h/g 鲜重）= (C标准管×V1)×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W
（2）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每小时每mg组织蛋白催化产生 1μmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。
NR（μmol/h/mg prot）= (C标准管×V1)×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(V1×Cpr)÷T=0.2×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr
C标准管：标准管浓度，0.1μmol/mL；V1：加入样本体积：0.1mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。
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