第三章污染物的生物效应检测
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第三章 污染物的生物效应检测 生物测试及方式 一般毒性试验 生物的分子和细胞水平检测 生物致突变、致畸和致癌效应检测 微宇宙法
第一节 生物测试及方式 生物测试的定义 生物测试的方式 生物测试的标准化
一、生物测试的定义
生物测试（Bioassay）：指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物或
剂量－效应关系和剂量－反应关系 以剂量为横坐标，以表示效应强度的计算单位或表示反应的百分率或比 值为纵坐标绘制散点图所得到的曲线，即为剂量－效应关系和剂量－反 应关系曲线。 不同的化学物或同一化学物在不同条件下，其剂量与效应或反应的相关 关系不同，可呈现不同类型的曲线。（见图 3－1，3－2，3－3，3－4）
（2）毒性分级 工业毒物：剧毒，高毒，中等毒，低毒，微毒（参照表３－１） 农药急性毒性：高毒，中毒，低毒
二、急性毒性试验 （Acute Toxicity Test） 急性毒性试验（Acute Toxicity Test）
研究化学物质大剂量一次染毒或 24 小时内多次染毒动物所引起的毒性 的试验。
环境因素单独或联合存在时所导致的影响或危害。
所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、
生态系统各级水平上的反应。
生物测试不同于常规的物理、化学检测。前者能够测定污染物对生物机
体的影响，而后者只能测定污染物的浓度。
举例：通过水污染的生物测试可获得以下数据：各种环境因素如 DO、pH、
最小致死剂量或浓度（MLD、MLC） 最大耐受剂量或浓度（LD0、LC0 ）
几个概念 绝对致死剂量或浓度 半数致死剂量或浓度 最小致死剂量或浓度 最大耐受剂量或浓度
简称 LD100、LC100 LD50、LC50 MLD、MLC LD0、LC0
死亡数 全部 50％ 个别 无一
剂量或浓度 最低 最低 最高 最高
第二节 一般毒性试验 中毒（Intoxication）
生物体受到毒物作用引起功能或器质性改变后出现的疾病状态。 中毒是各种毒性作用的综合表现，包括急性中毒、亚急性中毒、慢性中
毒。 毒性（Toxicity）指一种物质引起机体损伤的能力。 毒性作用或毒效应（Toxic Effect） 化学物引起生物体损害的总称。 危害性 有毒物质在与机体接触或使用过程中，有引起中毒的可能性。 危险性 某化学物质在正常生产使用条件下，能引起机体发生中毒的可能性。
染毒方式和受试物的配制 一般用灌胃法和人工熏气法。 受试物的配制：配制试验所需的最高剂量浓度溶液，然后依次稀释到所 需浓度。
（一）哺乳动物急性毒性试验（2） 观察指标
中毒症状：一般观察 24～48 小时，最好观察到绝大多数动物出现典型 中毒症状。
动物死亡数目和死亡时间
病理检查：对于试验时立即死亡的动物，可解剖，分析死亡原因，看是 技术事故还是中毒引起的死亡。
最大无作用剂量（Maximum No－effect Level）
指化学物在一定时间内，按照一定方式与机体接触，按照一定的检测方
法或观察指标，不能观察到任何损害作用的最高剂量。
每日容许摄入量（Acceptable Daily Intake）
最高容许浓度（Maximum Allowable Concentration）
急性毒作用带（Acute－toxic Effect Zone）
急性毒性作用带＝
半数致死量
急性毒性最小有作用剂量
比值越大，危险性越小。
慢性毒作用带（Chronic －toxic Effect Zone ）
慢性毒性作用带＝急性毒性最小有作用剂量 慢性毒性最小有作用剂量
比值越大，引起慢性毒性中毒可能性越大。
最小有作用剂量（Minimal Effect Level）
指能使机体发生某种异常变化所需要的最小剂量，即能使机体开始出现
毒性反应的最低剂量。也称中毒阈剂量（Threshold Level）。
最小有作用剂量>最大无作用剂量
毒作用带（Toxic Effect Level）
一种根据毒性和毒性作用特点综合评价外来化合物危险性的指标。
无损害作用（Non－adverse Effect） 不引起机体的形态，生长发育和寿命的改变；不引起机体功能容量的降低和
对额外应激状态代尝能力的损害；所引起的生物学变化一般是可逆的，当停 止接触化学物后，不能检测出机体维持体内稳态能力的降低；也不能使机体 对其他环境因素不利影响的易感性增强。 损害作用（adverse Effect） 生物体接触外来化学物期间或停止接触后，机体维持体内的稳态能力下降是 不可逆的，对某些环境因素不利影响的易感性增高，代谢速度降低和酶系的 相对活力发生异常改变
受试生物的选择 敏感性。 广泛性和大量，可获得性。 重要性，具有生态学价值。 室内容易培养和繁殖。 生物学背景资料清楚。 反应可测定性，测定标准化。 经济价值和旅游价值。
三、生物测试的标准化 影响生物测试结果的因素
受试生物 试验条件 实验室差异 生物测试的标准化
第二节 一般毒性试验 一、生物毒性的基本概念 （一）毒物与中毒 毒物（Toxicant）
按试验要求选择受试生物 常用成年大鼠或小鼠，雌雄动物同时试验，对试验动物预先观察几天后 标记编号并随机分组。
预备试验和确定剂量组 选用少量动物进行预备试验，找出引起动物 90％（或全部）死亡的剂量 （即最高剂量组剂量）和引起动物 10％死亡（或不死亡）的剂量（即最 低剂量组剂量）。 在最高剂量组剂量和最低剂量组剂量的范围内，按等比级数插入若干个 中间剂量（一般 4～6 组），从而确定正式试验的剂量组。
效应（Effect） 也称为作用，指接触一定剂量化学物后，使机体产生的生物学改变。效 应是对个体而言的，这种改变可用一定的计量单位表示。
反应（Response） 指接触一定剂量化学物后，产生某种效应并达到一定强度的个体在群体 中所占的比例。反应是对群体而言的，用百分率或比值来表示，如发病 率、死亡率等。
长期生物测试（Long Term Bioassays） 包括全部生活史的生物测试（Complete Life－cycle Bioassays）和部 分生活史的生物测试（ Partial Life－cycle Bioassays ） 目的是要测定出在持续情况下不造成有害效应的毒物最大浓度或最大 允许毒物浓度（MATC） 只能采用流动式，要保证试验的环境条件和自然界的季节变化相符合。
种测试指标。
三、亚慢性和慢性毒性试验 （一）亚慢性毒性试验（Subchronic Toxicity Test） 在相当于动物生命周期的 1/30－1/20 时间内使动物每日或反复多次接触受
试物的毒性试验。 目的：对受试物的主要毒作用，靶器官和最大无作用剂量或中毒阈剂量作出
估计。
亚慢性毒性试验程序（哺乳动物为例） 实验动物及分组 染毒剂量及实验期限 染毒途径 观察指标 试验评价
剂量－效应关系和剂量－反应（对数剂量）关系曲线图：直线型、抛物线型、S 形线型
（二）表示毒性的常用参数 1.毒性试验常用参数 致死剂量或致死浓度（Lethal Dose， LD 或 Lethal Concentration，LC） 一次染毒后引起受试动物死亡的剂量或浓度。
绝对致死剂量或浓度（LD100、LC100） 半数致死剂量或浓度（LD50、LC50）
、实验动物及分组 一般要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种。雌雄各半。 至少设 3 个剂量组和一个对照组。
染毒剂量及实验期限 高、低、中间剂量组，对照组。一般用 LD50 的 1/80～1/50 作为亚慢性 试验剂量。 大鼠 90 d，较大的动物 4～6 月。
染毒途径 经胃肠道、呼吸道及皮肤接触。
确定半数致死量（LD50）
试验结果 LD50 值越小，毒性越大。 急性毒性试验结果只能粗略地表示某化学物质的毒性，而不能全面反映 其毒性。 由于动物种属、性别、染毒方式的不同，所表现的毒性也不一致，故表 示 LD50 应注释明动物种类和染毒方式。
（二）水生生物急性毒性试验 鱼类毒性试验
实验用鱼的选择 实验条件 半数致死浓度的测定 藻类毒性试验 定时测定藻类的生长情况，一般 24 h 或 48 h 取样一次。 常用指标：光密度、细胞数、叶绿素含量及干重，同一试验最好选用两
半数效应浓度（EC50）和半数抑制浓度（IC50） 半数效应浓度（EC50）：指能引起 50％受试生物的某种效应变化的浓度，通
常是非死亡效应。 半数抑制浓度（IC50）：指能引起受试生物的某种效应 50％抑制的浓度．
2.毒物单位与分级 （1）单位 气体浓度：mg/m3，mg/L 水环境毒物浓度：mg/L，µ g/L 哺乳动物单位：mg/kg 或 ml/kg
染毒途径 经胃肠道、呼吸道及皮肤接触。
观察指标（基本同亚慢性毒性试验） 称体重的要求 每两个月进行一次血液学及其他生长指标的测定 对病理检查作半定量的评定
试验评价 找出最大无作用剂量，对受试物的致癌性评定提供依据。
四、蓄积毒性试验 （一）基本概念 蓄积毒性作用（Cumulative Toxicity Action） 低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次地与机体持续接触，经过一定时间
在一定条件下，以较小剂量给予机体时，能与生物相互作用，引起生物 体功能或器质性损伤的化合物，或剂量虽微，但累积到一定的量，就能 干扰或破坏机体的正常生理功能，引起暂时或持久性的病理变化，甚至 危及生命的化合物。
毒物与非毒物之间不存在绝对的界限，通常一种物质只有达到中毒剂量 时才是毒物。
化学物质的毒性的影响因素 剂量 方式：经口食入、经呼吸道吸入、经皮肤或粘膜接触 时间分布：一次或反复多次给予。
验，DNA 损伤试验
短期生物测试（Short Term Bioassays） 主要用于测定 LC50、IC50、EC50，用来快速估计污染物的毒性，评定几 种不同毒物或废物对某种生物的相对毒性或评定不同生物对不同条件 如温度、pH 的相对敏感性等。 多数采用静止式。 时间最长不超过 8d。
中期生物测试（Intermediate Term Bioassays） 时间ຫໍສະໝຸດ Baidu 8d 到 90d，多数情况下为流动式。
温度、混浊度等对生命的有利以及不利的浓度或强度；污染物对受测生
物的毒性；各种水生生物对污染物的相对敏感性；废水所应处理的程度；
允许的污染物排放浓度等。
生物测试种类：
毒性试验（水污染）
植物人工熏气（大气污染）
二、生物测试的方式 （一）生物测试的分类 根据时间长短：短期、中期、长期生物测试； 根据试验溶液或试验气体的给予方式：静止式、流动式生物测试； 根据测试所用的生物物种：单物种、多物种、模拟生态系统生物测试； 根据所测试的生物效应性质：毒性试验，积累试验，行为试验，“三致”试
哺乳动物慢性毒性试验 水生生物慢性毒性试验
慢性毒性试验程序（哺乳动物为例） 试验动物及分组 染毒剂量及实验期限 染毒途径 观察指标 试验评价
实验动物及分组 一般要求雌雄各半。 设 3～4 个剂量组和一个对照组。
染毒剂量及实验期限 高、低、中间剂量组（1～2 组），对照组。亚慢性试验剂量最低中毒剂 量的 1/10、 1/20 及 1/50（或 LD50 的 1/100～1/20 中取 3～4 个剂量）。 试验期限 1～12 月。
其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒 性试验提供设计依据。
急性毒性试验类型 哺乳动物急性毒性试验 水生生物急性毒性试验 蚯蚓急性毒性试验
（一）哺乳动物急性毒性试验（1） 动物急性毒性试验方法如下： 按试验要求选择受试生物 预备试验和确定剂量组 染毒方式和受试物的配制
观察指标 一般综合指标 血液及生化指标 病理组织学检查
试验评价 初步估计受试物的主要作用、靶器官和最大无作用水平及中毒阈剂量。
（二）慢性毒性试验（Subchronic Toxicity Test）
以低剂量外来化合物，长期与试验动物接触，观察其对试验动物所产生的生 物学效应的试验。
目的：确定最大无作用剂量。 慢性毒性试验类型
第一节 生物测试及方式 生物测试的定义 生物测试的方式 生物测试的标准化
一、生物测试的定义
生物测试（Bioassay）：指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物或
剂量－效应关系和剂量－反应关系 以剂量为横坐标，以表示效应强度的计算单位或表示反应的百分率或比 值为纵坐标绘制散点图所得到的曲线，即为剂量－效应关系和剂量－反 应关系曲线。 不同的化学物或同一化学物在不同条件下，其剂量与效应或反应的相关 关系不同，可呈现不同类型的曲线。（见图 3－1，3－2，3－3，3－4）
（2）毒性分级 工业毒物：剧毒，高毒，中等毒，低毒，微毒（参照表３－１） 农药急性毒性：高毒，中毒，低毒
二、急性毒性试验 （Acute Toxicity Test） 急性毒性试验（Acute Toxicity Test）
研究化学物质大剂量一次染毒或 24 小时内多次染毒动物所引起的毒性 的试验。
环境因素单独或联合存在时所导致的影响或危害。
所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、
生态系统各级水平上的反应。
生物测试不同于常规的物理、化学检测。前者能够测定污染物对生物机
体的影响，而后者只能测定污染物的浓度。
举例：通过水污染的生物测试可获得以下数据：各种环境因素如 DO、pH、
最小致死剂量或浓度（MLD、MLC） 最大耐受剂量或浓度（LD0、LC0 ）
几个概念 绝对致死剂量或浓度 半数致死剂量或浓度 最小致死剂量或浓度 最大耐受剂量或浓度
简称 LD100、LC100 LD50、LC50 MLD、MLC LD0、LC0
死亡数 全部 50％ 个别 无一
剂量或浓度 最低 最低 最高 最高
第二节 一般毒性试验 中毒（Intoxication）
生物体受到毒物作用引起功能或器质性改变后出现的疾病状态。 中毒是各种毒性作用的综合表现，包括急性中毒、亚急性中毒、慢性中
毒。 毒性（Toxicity）指一种物质引起机体损伤的能力。 毒性作用或毒效应（Toxic Effect） 化学物引起生物体损害的总称。 危害性 有毒物质在与机体接触或使用过程中，有引起中毒的可能性。 危险性 某化学物质在正常生产使用条件下，能引起机体发生中毒的可能性。
染毒方式和受试物的配制 一般用灌胃法和人工熏气法。 受试物的配制：配制试验所需的最高剂量浓度溶液，然后依次稀释到所 需浓度。
（一）哺乳动物急性毒性试验（2） 观察指标
中毒症状：一般观察 24～48 小时，最好观察到绝大多数动物出现典型 中毒症状。
动物死亡数目和死亡时间
病理检查：对于试验时立即死亡的动物，可解剖，分析死亡原因，看是 技术事故还是中毒引起的死亡。
最大无作用剂量（Maximum No－effect Level）
指化学物在一定时间内，按照一定方式与机体接触，按照一定的检测方
法或观察指标，不能观察到任何损害作用的最高剂量。
每日容许摄入量（Acceptable Daily Intake）
最高容许浓度（Maximum Allowable Concentration）
急性毒作用带（Acute－toxic Effect Zone）
急性毒性作用带＝
半数致死量
急性毒性最小有作用剂量
比值越大，危险性越小。
慢性毒作用带（Chronic －toxic Effect Zone ）
慢性毒性作用带＝急性毒性最小有作用剂量 慢性毒性最小有作用剂量
比值越大，引起慢性毒性中毒可能性越大。
最小有作用剂量（Minimal Effect Level）
指能使机体发生某种异常变化所需要的最小剂量，即能使机体开始出现
毒性反应的最低剂量。也称中毒阈剂量（Threshold Level）。
最小有作用剂量>最大无作用剂量
毒作用带（Toxic Effect Level）
一种根据毒性和毒性作用特点综合评价外来化合物危险性的指标。
无损害作用（Non－adverse Effect） 不引起机体的形态，生长发育和寿命的改变；不引起机体功能容量的降低和
对额外应激状态代尝能力的损害；所引起的生物学变化一般是可逆的，当停 止接触化学物后，不能检测出机体维持体内稳态能力的降低；也不能使机体 对其他环境因素不利影响的易感性增强。 损害作用（adverse Effect） 生物体接触外来化学物期间或停止接触后，机体维持体内的稳态能力下降是 不可逆的，对某些环境因素不利影响的易感性增高，代谢速度降低和酶系的 相对活力发生异常改变
受试生物的选择 敏感性。 广泛性和大量，可获得性。 重要性，具有生态学价值。 室内容易培养和繁殖。 生物学背景资料清楚。 反应可测定性，测定标准化。 经济价值和旅游价值。
三、生物测试的标准化 影响生物测试结果的因素
受试生物 试验条件 实验室差异 生物测试的标准化
第二节 一般毒性试验 一、生物毒性的基本概念 （一）毒物与中毒 毒物（Toxicant）
按试验要求选择受试生物 常用成年大鼠或小鼠，雌雄动物同时试验，对试验动物预先观察几天后 标记编号并随机分组。
预备试验和确定剂量组 选用少量动物进行预备试验，找出引起动物 90％（或全部）死亡的剂量 （即最高剂量组剂量）和引起动物 10％死亡（或不死亡）的剂量（即最 低剂量组剂量）。 在最高剂量组剂量和最低剂量组剂量的范围内，按等比级数插入若干个 中间剂量（一般 4～6 组），从而确定正式试验的剂量组。
效应（Effect） 也称为作用，指接触一定剂量化学物后，使机体产生的生物学改变。效 应是对个体而言的，这种改变可用一定的计量单位表示。
反应（Response） 指接触一定剂量化学物后，产生某种效应并达到一定强度的个体在群体 中所占的比例。反应是对群体而言的，用百分率或比值来表示，如发病 率、死亡率等。
长期生物测试（Long Term Bioassays） 包括全部生活史的生物测试（Complete Life－cycle Bioassays）和部 分生活史的生物测试（ Partial Life－cycle Bioassays ） 目的是要测定出在持续情况下不造成有害效应的毒物最大浓度或最大 允许毒物浓度（MATC） 只能采用流动式，要保证试验的环境条件和自然界的季节变化相符合。
种测试指标。
三、亚慢性和慢性毒性试验 （一）亚慢性毒性试验（Subchronic Toxicity Test） 在相当于动物生命周期的 1/30－1/20 时间内使动物每日或反复多次接触受
试物的毒性试验。 目的：对受试物的主要毒作用，靶器官和最大无作用剂量或中毒阈剂量作出
估计。
亚慢性毒性试验程序（哺乳动物为例） 实验动物及分组 染毒剂量及实验期限 染毒途径 观察指标 试验评价
剂量－效应关系和剂量－反应（对数剂量）关系曲线图：直线型、抛物线型、S 形线型
（二）表示毒性的常用参数 1.毒性试验常用参数 致死剂量或致死浓度（Lethal Dose， LD 或 Lethal Concentration，LC） 一次染毒后引起受试动物死亡的剂量或浓度。
绝对致死剂量或浓度（LD100、LC100） 半数致死剂量或浓度（LD50、LC50）
、实验动物及分组 一般要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种。雌雄各半。 至少设 3 个剂量组和一个对照组。
染毒剂量及实验期限 高、低、中间剂量组，对照组。一般用 LD50 的 1/80～1/50 作为亚慢性 试验剂量。 大鼠 90 d，较大的动物 4～6 月。
染毒途径 经胃肠道、呼吸道及皮肤接触。
确定半数致死量（LD50）
试验结果 LD50 值越小，毒性越大。 急性毒性试验结果只能粗略地表示某化学物质的毒性，而不能全面反映 其毒性。 由于动物种属、性别、染毒方式的不同，所表现的毒性也不一致，故表 示 LD50 应注释明动物种类和染毒方式。
（二）水生生物急性毒性试验 鱼类毒性试验
实验用鱼的选择 实验条件 半数致死浓度的测定 藻类毒性试验 定时测定藻类的生长情况，一般 24 h 或 48 h 取样一次。 常用指标：光密度、细胞数、叶绿素含量及干重，同一试验最好选用两
半数效应浓度（EC50）和半数抑制浓度（IC50） 半数效应浓度（EC50）：指能引起 50％受试生物的某种效应变化的浓度，通
常是非死亡效应。 半数抑制浓度（IC50）：指能引起受试生物的某种效应 50％抑制的浓度．
2.毒物单位与分级 （1）单位 气体浓度：mg/m3，mg/L 水环境毒物浓度：mg/L，µ g/L 哺乳动物单位：mg/kg 或 ml/kg
染毒途径 经胃肠道、呼吸道及皮肤接触。
观察指标（基本同亚慢性毒性试验） 称体重的要求 每两个月进行一次血液学及其他生长指标的测定 对病理检查作半定量的评定
试验评价 找出最大无作用剂量，对受试物的致癌性评定提供依据。
四、蓄积毒性试验 （一）基本概念 蓄积毒性作用（Cumulative Toxicity Action） 低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次地与机体持续接触，经过一定时间
在一定条件下，以较小剂量给予机体时，能与生物相互作用，引起生物 体功能或器质性损伤的化合物，或剂量虽微，但累积到一定的量，就能 干扰或破坏机体的正常生理功能，引起暂时或持久性的病理变化，甚至 危及生命的化合物。
毒物与非毒物之间不存在绝对的界限，通常一种物质只有达到中毒剂量 时才是毒物。
化学物质的毒性的影响因素 剂量 方式：经口食入、经呼吸道吸入、经皮肤或粘膜接触 时间分布：一次或反复多次给予。
验，DNA 损伤试验
短期生物测试（Short Term Bioassays） 主要用于测定 LC50、IC50、EC50，用来快速估计污染物的毒性，评定几 种不同毒物或废物对某种生物的相对毒性或评定不同生物对不同条件 如温度、pH 的相对敏感性等。 多数采用静止式。 时间最长不超过 8d。
中期生物测试（Intermediate Term Bioassays） 时间ຫໍສະໝຸດ Baidu 8d 到 90d，多数情况下为流动式。
温度、混浊度等对生命的有利以及不利的浓度或强度；污染物对受测生
物的毒性；各种水生生物对污染物的相对敏感性；废水所应处理的程度；
允许的污染物排放浓度等。
生物测试种类：
毒性试验（水污染）
植物人工熏气（大气污染）
二、生物测试的方式 （一）生物测试的分类 根据时间长短：短期、中期、长期生物测试； 根据试验溶液或试验气体的给予方式：静止式、流动式生物测试； 根据测试所用的生物物种：单物种、多物种、模拟生态系统生物测试； 根据所测试的生物效应性质：毒性试验，积累试验，行为试验，“三致”试
哺乳动物慢性毒性试验 水生生物慢性毒性试验
慢性毒性试验程序（哺乳动物为例） 试验动物及分组 染毒剂量及实验期限 染毒途径 观察指标 试验评价
实验动物及分组 一般要求雌雄各半。 设 3～4 个剂量组和一个对照组。
染毒剂量及实验期限 高、低、中间剂量组（1～2 组），对照组。亚慢性试验剂量最低中毒剂 量的 1/10、 1/20 及 1/50（或 LD50 的 1/100～1/20 中取 3～4 个剂量）。 试验期限 1～12 月。
其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒 性试验提供设计依据。
急性毒性试验类型 哺乳动物急性毒性试验 水生生物急性毒性试验 蚯蚓急性毒性试验
（一）哺乳动物急性毒性试验（1） 动物急性毒性试验方法如下： 按试验要求选择受试生物 预备试验和确定剂量组 染毒方式和受试物的配制
观察指标 一般综合指标 血液及生化指标 病理组织学检查
试验评价 初步估计受试物的主要作用、靶器官和最大无作用水平及中毒阈剂量。
（二）慢性毒性试验（Subchronic Toxicity Test）
以低剂量外来化合物，长期与试验动物接触，观察其对试验动物所产生的生 物学效应的试验。
目的：确定最大无作用剂量。 慢性毒性试验类型