第03章 污染物的生物效应检测2
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环境生物学
第三章 污染物的生物效应检测
第三节 生物的分子和细胞水平检测 第四节 生物致突变、致畸和致癌效应检测 第五节 微宇宙法
第三节 生物的分子和细胞水平检测
污染物→生物的危害→行为改变、生理、 生化反应→在分子和细胞水平上的检测
加合物 一般酶系（重要生理过程的） 解毒系统酶类诱导作用 抗氧化防御系统
优点——检测能力强、应用范围广，可检测任何化学 物与DNA的连接，尤其是可用于环境中生物样品的加 合物测定以及判断化合物的毒性，包括纯品或混合物 是否有潜在的致癌作用，同时具有极高的灵敏度，可 检测到109个碱基中的一个DNA加合物。
蛋白加合物
外周血蛋白（血红蛋白、血清白蛋白） 血红蛋白（Hb，hemoglobin）
20%以上AchE活性抑制—暴露作用存在； 50%以上AchE活性抑制—对生物的生存有危害。 胆碱酯酶水解乙酰胆碱的硫醇化合物→硫醇＋双二硫代硝基苯 甲酸（DTNB）→深黄色结合物——412nm波长检测； 与未水解的乙酰胆碱底物→棕色异羟亏酸铁的铬合物—— 540nm； 乙酰-1-C14胆碱作底物→去除未水解底物→乙酰-1-C14计数测量
免疫法
基本原理——抗原-抗体反应 根据应用技术可分为
放射免疫(RIA) 酶联免疫(ELISA) 超敏酶学放射免疫法(VS—ERISA)
免疫法的灵敏度可达到一个加合物∕107～108核苷 酸水平，所需样品的DNA量为25～50μg。
荧光法
基本原理——通过某些化合物的DNA-加合物具 荧光特性而进行定量。 常见的技术
同步荧光法 低温激光法 激光-发射荧光法。
荧光法的长处
不破坏DNA链 可区分出加合物的不同立体异构体 DNA链不同位点上的加合物
32P-后标记法（32P-postlabeling
Assay）
基本原理——先将分离出的DNA用一定的酶水解成正 常的单核苷酸和形成了加合物的单核苷酸，并进一步 将二者分离，再用32P标记的ATP将带有加合物的单 核苷酸标记，然后用双向层析、放射自显影、液闪计 数等方法定量。
最常用的测定方法——比色法
放射测量法：
其他——测压法、荧光法和电化学法
腺三磷酶（ATPase）
功能：水解ATP 方法：钼蓝法——经酶 水解释放的无机磷 酶活性——毫微摩尔无 机磷∕毫克蛋白∕小时
三、解毒系统酶类诱导作用的检测
混合功能氧化酶的诱导作用
MFO特异性不强，多种方法可以测定。 直接法 直接测定各组成成分，P-450等的含量。 代谢法 测定MFO催化反应的底物消耗量和产物生成量。 多种方法检测，综合评定MFO的作用。
谷胱甘肽过氧化酶（GPx）2
测定GPx活力有两种常用方法。
直接法，即直接测定GSH减少量，这是1959年米尔斯 （Mills）首次提纯GPx时所用的方法之一。 原理—GSH在255 nm处呈最大吸收，故可从255 nm光吸 收减少量计算GSH消耗量，从而判断酶活性。 此法灵敏度差，仅适用于纯酶活性测定。 原理—利用H2O2或有机氢过氧化物氧化GSH，同时加入 NADPH及谷胱苷肽还原酶，使氧化的GSH重新转变为 GSH，NADPH转变为NADP+，测定NAD P+在340 nm的 光吸收即可确定酶活性。 此法灵敏度高，专一性强，现已普遍使用。
Hb的生存期在120天左右
二、一般代谢酶的活性测定
特定反应中的关键酶的变化→证实污染物 的影响 酶指标 生物受到亚致死剂量毒物的暴露时
酶指标来对毒物进行生化水平上的评价 探讨毒物的作用机制
乙酰胆碱酯酶 腺三磷酶（ATPase）
乙酰胆碱酯酶
乙酰胆碱酯酶（AChE）一个很经典的毒理指标 由于有机磷农药能抑制AChE的活性，所以AChE可作为 有机磷农药污染的指标。
Fra Baidu bibliotek
间接法，
第四节 生物致突变、致畸和致癌效应检测
一、致突变效应 二、致畸效应 三、致癌效应
常见三致性毒物
致癌物 艾氏剂、苯、苯荓[a]芘 双(2-氯乙基)醚 氯乙烯单体、氯仿 二噁英 狄氏剂、异狄氏剂 亚硝胺 石棉 铬酸盐、砷化物 放射性核素、霉素、病毒 致畸物 有机汞 苯二甲酸酯 砷酸钠 硫酸镉 二噁英 2,4,5-T 醋酸苯汞 致突变物 DDT、2,4-D 苯臭氧 砷酸钠 硫酸镉 二噁英 2,4,5-T 亚硝酸盐 铅盐
谷胱甘肽硫转移酶
谷胱甘肽硫转移酶（glutathione-Stransferase GST）分布广泛。 哺乳动物中肝的可溶部分中GST的浓度最高。
四、抗氧化防御系统检测
过氧化氢酶（CAT） 谷胱甘肽过氧化酶（GPx）
过氧化氢酶（CAT）
CAT的重要作用 环境污染物对CAT活性的影响 CAT活性测定方法
一、致突变效应
基本概念
生物体的遗传物质发生了基因结构的变化称为突变 （Mutation）—广义突变的概念。
Hb-加合物最常用的测定方法
间接反映连接于DNA的加合物 动物实验中已发现有50多种化学物质可与Hb反应，致突变物 及致癌物均可与Hb连接 色谱-质谱(GC-MS，gas chromatography-mass spectroscopy)法 免疫法检测 灵敏度因化学物质和选用方法不同而异 其加合物可作为中长期暴露的指标
测量由H2O2分解所释放出的氧，在240nm波长 测定过氧化氢的吸光度； 电化学法测量过氧化氢； 容量法滴定剩余的过氧化氢等方法。
谷胱甘肽过氧化酶（GPx）1
该酶于1957年被米尔斯（Mills）从牛红细 胞中发现。 GPx主要生物学作用
清除脂类过氧化物； 可代替过氧化氢酶清除H2O2； 可防止畸变，预防衰老。
一、加合物测定
DNA-加合物的测定 蛋白加合物
DNA-加合物的测定
DNA-加合物—化学物经生物转化后的亲电 活性产物与DNA链特异位点上的共价结合 物，加合物的位点多在N-7鸟嘌吟，O-6鸟 嘌吟，N-1-或N-3-腺嘌吟。 DNA加合物测定方法
各种色谱法 免疫法 荧光法 32P-后标记法
第三章 污染物的生物效应检测
第三节 生物的分子和细胞水平检测 第四节 生物致突变、致畸和致癌效应检测 第五节 微宇宙法
第三节 生物的分子和细胞水平检测
污染物→生物的危害→行为改变、生理、 生化反应→在分子和细胞水平上的检测
加合物 一般酶系（重要生理过程的） 解毒系统酶类诱导作用 抗氧化防御系统
优点——检测能力强、应用范围广，可检测任何化学 物与DNA的连接，尤其是可用于环境中生物样品的加 合物测定以及判断化合物的毒性，包括纯品或混合物 是否有潜在的致癌作用，同时具有极高的灵敏度，可 检测到109个碱基中的一个DNA加合物。
蛋白加合物
外周血蛋白（血红蛋白、血清白蛋白） 血红蛋白（Hb，hemoglobin）
20%以上AchE活性抑制—暴露作用存在； 50%以上AchE活性抑制—对生物的生存有危害。 胆碱酯酶水解乙酰胆碱的硫醇化合物→硫醇＋双二硫代硝基苯 甲酸（DTNB）→深黄色结合物——412nm波长检测； 与未水解的乙酰胆碱底物→棕色异羟亏酸铁的铬合物—— 540nm； 乙酰-1-C14胆碱作底物→去除未水解底物→乙酰-1-C14计数测量
免疫法
基本原理——抗原-抗体反应 根据应用技术可分为
放射免疫(RIA) 酶联免疫(ELISA) 超敏酶学放射免疫法(VS—ERISA)
免疫法的灵敏度可达到一个加合物∕107～108核苷 酸水平，所需样品的DNA量为25～50μg。
荧光法
基本原理——通过某些化合物的DNA-加合物具 荧光特性而进行定量。 常见的技术
同步荧光法 低温激光法 激光-发射荧光法。
荧光法的长处
不破坏DNA链 可区分出加合物的不同立体异构体 DNA链不同位点上的加合物
32P-后标记法（32P-postlabeling
Assay）
基本原理——先将分离出的DNA用一定的酶水解成正 常的单核苷酸和形成了加合物的单核苷酸，并进一步 将二者分离，再用32P标记的ATP将带有加合物的单 核苷酸标记，然后用双向层析、放射自显影、液闪计 数等方法定量。
最常用的测定方法——比色法
放射测量法：
其他——测压法、荧光法和电化学法
腺三磷酶（ATPase）
功能：水解ATP 方法：钼蓝法——经酶 水解释放的无机磷 酶活性——毫微摩尔无 机磷∕毫克蛋白∕小时
三、解毒系统酶类诱导作用的检测
混合功能氧化酶的诱导作用
MFO特异性不强，多种方法可以测定。 直接法 直接测定各组成成分，P-450等的含量。 代谢法 测定MFO催化反应的底物消耗量和产物生成量。 多种方法检测，综合评定MFO的作用。
谷胱甘肽过氧化酶（GPx）2
测定GPx活力有两种常用方法。
直接法，即直接测定GSH减少量，这是1959年米尔斯 （Mills）首次提纯GPx时所用的方法之一。 原理—GSH在255 nm处呈最大吸收，故可从255 nm光吸 收减少量计算GSH消耗量，从而判断酶活性。 此法灵敏度差，仅适用于纯酶活性测定。 原理—利用H2O2或有机氢过氧化物氧化GSH，同时加入 NADPH及谷胱苷肽还原酶，使氧化的GSH重新转变为 GSH，NADPH转变为NADP+，测定NAD P+在340 nm的 光吸收即可确定酶活性。 此法灵敏度高，专一性强，现已普遍使用。
Hb的生存期在120天左右
二、一般代谢酶的活性测定
特定反应中的关键酶的变化→证实污染物 的影响 酶指标 生物受到亚致死剂量毒物的暴露时
酶指标来对毒物进行生化水平上的评价 探讨毒物的作用机制
乙酰胆碱酯酶 腺三磷酶（ATPase）
乙酰胆碱酯酶
乙酰胆碱酯酶（AChE）一个很经典的毒理指标 由于有机磷农药能抑制AChE的活性，所以AChE可作为 有机磷农药污染的指标。
Fra Baidu bibliotek
间接法，
第四节 生物致突变、致畸和致癌效应检测
一、致突变效应 二、致畸效应 三、致癌效应
常见三致性毒物
致癌物 艾氏剂、苯、苯荓[a]芘 双(2-氯乙基)醚 氯乙烯单体、氯仿 二噁英 狄氏剂、异狄氏剂 亚硝胺 石棉 铬酸盐、砷化物 放射性核素、霉素、病毒 致畸物 有机汞 苯二甲酸酯 砷酸钠 硫酸镉 二噁英 2,4,5-T 醋酸苯汞 致突变物 DDT、2,4-D 苯臭氧 砷酸钠 硫酸镉 二噁英 2,4,5-T 亚硝酸盐 铅盐
谷胱甘肽硫转移酶
谷胱甘肽硫转移酶（glutathione-Stransferase GST）分布广泛。 哺乳动物中肝的可溶部分中GST的浓度最高。
四、抗氧化防御系统检测
过氧化氢酶（CAT） 谷胱甘肽过氧化酶（GPx）
过氧化氢酶（CAT）
CAT的重要作用 环境污染物对CAT活性的影响 CAT活性测定方法
一、致突变效应
基本概念
生物体的遗传物质发生了基因结构的变化称为突变 （Mutation）—广义突变的概念。
Hb-加合物最常用的测定方法
间接反映连接于DNA的加合物 动物实验中已发现有50多种化学物质可与Hb反应，致突变物 及致癌物均可与Hb连接 色谱-质谱(GC-MS，gas chromatography-mass spectroscopy)法 免疫法检测 灵敏度因化学物质和选用方法不同而异 其加合物可作为中长期暴露的指标
测量由H2O2分解所释放出的氧，在240nm波长 测定过氧化氢的吸光度； 电化学法测量过氧化氢； 容量法滴定剩余的过氧化氢等方法。
谷胱甘肽过氧化酶（GPx）1
该酶于1957年被米尔斯（Mills）从牛红细 胞中发现。 GPx主要生物学作用
清除脂类过氧化物； 可代替过氧化氢酶清除H2O2； 可防止畸变，预防衰老。
一、加合物测定
DNA-加合物的测定 蛋白加合物
DNA-加合物的测定
DNA-加合物—化学物经生物转化后的亲电 活性产物与DNA链特异位点上的共价结合 物，加合物的位点多在N-7鸟嘌吟，O-6鸟 嘌吟，N-1-或N-3-腺嘌吟。 DNA加合物测定方法
各种色谱法 免疫法 荧光法 32P-后标记法