实验六 细菌计数法
细菌菌落计数
直接法 血球记数板 活菌染色：美蓝、吖啶橙、TTC
01
间接法
02
目录
直接法—血球记数板
细菌计数板和血球计数板都用来侧微生物的总菌数。血球计数板用来测较大微生物如酵母菌和霉菌孢子的总数，细菌计数板用来测细菌的总菌数。两种计数板的构造相似，不同的是细菌计数板的深度仅为血球计数板深度的1/5。
平板菌落计数法(Colony-counting Methods)
一个活菌在合适的培养基表面，逐渐生长成一个 肉眼可见的菌落（菌落形成单位，colony forming unit, CFU），从而得知原始活菌含量。 涂布平板法Spread Plate 浇注平板法Pour Plate
间 接 法
间 接 法—平板l）=某一稀释度的平均菌落数 ×10×稀释度 注意事项见实验讲义
菌落数
1
2
平均
1
2
平均
1
2
平均
每毫升中 总活菌数
1
0.1ml
1
2
3
4
5
6
广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。
疾病诊断 泌尿系感染性疾病的诊断------尿培养
细菌感染及药物治疗效果 临床病人 实验动物
适用领域：
3、菌落计算方法
3、菌落计算方法 （1）菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 （2）菌落计数的报告 ①平板菌落数的选择 选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。
2014实验六 食品中大肠菌群的检验
一、实验目的
1. 了解大肠菌群在食品检验中的意义。 2. 掌握检验的程序和步骤。 3. 通过MPN检索表的检索得出实验结果。
二、基本原理
大肠菌群系指一群在32～37℃下24h内，能 发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革 兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人 畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价 食品卫生质量状况，推断食品中肠道致病菌 污染的可能。具有广泛的卫生学意义。
（2）BGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤
成分：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛胆粉溶液 200mL，0.1%煌绿水溶液13.3mL，蒸馏水 800mL，pH7.2±0.1。
3个三角瓶（含玻珠）中，225ml/个 9支试管，3支/组，9ml/支
抑菌剂的选择
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基 硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。
大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语， 它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的 一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方 面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸
杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌是人和温血动物肠道 内普遍存在的细菌，是粪便中 的主要菌种产。气一克般雷生白活氏在菌 人大 肠中并不致病，但它侵入人体 一些部位时，可引起感染 。
LST产气（+）
0
将产气的试管内 样品接种到 BGLB肉汤
4）初发酵试验
选择10-2、10-3、10-4三个稀释度的样品均液 （液体样品可以选择原液）， 用无菌移液管分别 吸取1mL到LST发酵液试管中，每管接种1mL， 每 个稀释度做3个平行（共9管）,36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h 产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至 48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为 大肠菌群阴性。
细菌总数的测定方法
细菌总数的测定方法
细菌总数的测定方法可真是太重要啦！它能让我们清楚地了解环境或样本中细菌的数量情况。
那具体是怎么操作的呢？首先要准备好培养基，比如常用的营养琼脂培养基。
然后就是采样啦，这可不能马虎，一定要保证采样的代表性和准确性。
接下来把样品进行适当稀释，这一步要细心哦，不然可就不准确啦！再把稀释后的样品接种到培养基上，要均匀分布哟！最后就是培养啦，在适宜的温度下培养一段时间。
这里要注意的是，操作过程一定要严格无菌，避免污染，不然结果就不准确咯！而且稀释度的选择也很关键呢，要根据实际情况合理选择。
在这个过程中，安全性那是相当重要的呀！毕竟是和细菌打交道嘛。
所有的操作都要在无菌环境下进行，保证操作人员不会受到细菌的侵害。
稳定性也不容忽视呢，只有保证每次操作的一致性，才能得到可靠的结果呀。
那细菌总数的测定方法都有哪些应用场景和优势呢？哇塞，那可多了去啦！在食品行业，可以检测食品的卫生状况，保障我们的食品安全，这难道不是超级重要的吗？在医疗卫生领域，可以监测环境的细菌污染情况，为疾病防控提供依据呢。
它的优势就在于简单易行、成本较低，而且能快速得到结果呀。
就拿食品生产企业来说吧，通过定期检测生产环境中的细菌总数，可以及时发现问题，采取措施改进生产工艺和卫生条件，从而避免食品安全问题的发生。
这不是实实在在的效果吗？
细菌总数的测定方法真的是非常实用且重要的呀！它能帮助我们更好地了解和控制细菌的存在，保障我们的生活和健康呢！。
细菌计数方法实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌计数的基本原理和方法。
2. 了解不同细菌计数方法的优缺点。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据处理和分析能力。
二、实验原理细菌计数是微生物学研究中的一项基本技能，常用的细菌计数方法有直接计数法、活菌计数法和间接计数法等。
本实验主要介绍平板菌落计数法（CFU法）和显微镜直接计数法。
1. 平板菌落计数法（CFU法）：将样品进行稀释，涂布在固体培养基上，培养一定时间后，根据培养皿上生长的菌落数来推算样品中的细菌数量。
2. 显微镜直接计数法：将样品进行稀释，用计数板或计数仪直接计数，根据计数室内的细菌数来推算样品中的细菌数量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌菌液、牛肉膏蛋白胨培养基、生理盐水、计数板、显微镜、移液器、培养箱等。
2. 实验仪器：培养皿、移液器、酒精灯、镊子、无菌操作台、培养箱、显微镜等。
四、实验步骤1. 平板菌落计数法（CFU法）：（1）将牛肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿，制成平板。
（2）用移液器吸取适量的大肠杆菌菌液，进行一系列的倍比稀释。
（3）用无菌镊子取适量稀释液，涂布在平板上。
（4）将平板倒置放入培养箱，培养一定时间。
（5）计算平板上生长的菌落数，根据稀释倍数计算样品中的细菌数量。
2. 显微镜直接计数法：（1）将牛肉膏蛋白胨培养基倒入计数板，制成涂片。
（2）用移液器吸取适量的大肠杆菌菌液，进行一系列的倍比稀释。
（3）用移液器吸取适量稀释液，滴加在计数板的计数室上。
（4）将计数板置于显微镜下，观察计数室内的细菌数。
（5）根据计数室内的细菌数和稀释倍数计算样品中的细菌数量。
五、实验结果与分析1. 平板菌落计数法（CFU法）：（1）稀释倍数：10^-4（2）菌落数：30（3）样品中的细菌数量：30 × 10^4 = 3 × 10^52. 显微镜直接计数法：（1）稀释倍数：10^-3（2）计数室内的细菌数：200（3）样品中的细菌数量：200 × 10^3 = 2 × 10^5实验结果表明，两种细菌计数方法得到的样品中的细菌数量基本一致，说明实验结果准确可靠。
几种常用的细菌计数方法
几种常用的细菌计数方法常用的细菌计数方法主要有显微镜计数法、平板计数法、膜过滤法和浑浊度法等。
下面将逐一介绍这些方法。
显微镜计数法是最基本的细菌计数方法之一、将细菌培养液取少量放在显微镜载玻片上，用显微镜观察并计数细菌个数。
这种方法需要操作技巧熟练，适用于较稀疏的细菌培养液，但不适用于高密度的细菌培养液，并且仅能得到一个粗略的细菌数量。
平板计数法是一种较为常用的细菌计数方法。
将稀释后的细菌培养液均匀涂在含有培养基的平板上，经过一段时间的培养后，可以通过数独落在平板上形成的菌落数量来估计初始细菌数量。
通常将膨胀菌落数乘以相应的稀释倍数从而得到细菌的数量。
平板计数法的优点是简单易行，适用于大量细菌的计数，但该方法只适用于能够在固体培养基上生长的细菌。
膜过滤法是一种通过滤除细菌并计数膜上细菌数量的方法。
将细菌培养液通过微孔膜过滤器，在膜上滤除细菌，然后将膜放在富含营养物的培养基上进行培养，形成菌落后进行计数。
与平板计数法相比，膜过滤法更适用于含有颗粒物的液体或空气中的细菌计数。
膜过滤法的优点是操作相对简单，适用于含有较多颗粒物或固体物质的液体的细菌计数，但该方法仅适用于能够通过过滤的培养液。
浑浊度法是一种通过测量培养液的浑浊度来估计细菌数量的方法。
利用光密度计或比色计测量细菌培养液的吸光度或浑浊度，并通过细菌密度与浑浊度之间的关系来计算细菌数量。
这种方法不需要进行涂片或过滤步骤，适用于细菌数量较多的情况。
然而，浑浊度法有一定的局限性，因为细菌的大小、形状和组成可能对浑浊度产生影响，而且需要事先建立浑浊度和细菌数量间的校准曲线。
除了以上介绍的方法，还有一些其他的细菌计数方法，如Flow cytometry（流式细胞仪）、Most probable number（最可能数）等，这些方法各有特点，可以根据实际需要选择合适的方法进行细菌计数。
细菌计数方法的选择应根据实验的目的、样品性质和操作条件等因素来确定。
实验六酵母菌细胞总数的测定
实验六酵母菌细胞总数的测定酵母菌是一类微生物，它们广泛存在于自然界的土壤、水体、植物和动物食品中。
酵母菌在工业和科学研究中具有广泛的应用，例如在制酒、制药、发酵面包、化妆品、生物污水处理等方面。
因此，酵母菌细胞总数的测定对于酵母菌应用研究和品质控制具有重要意义。
实验目的通过酵母菌细胞总数的测定，了解酵母菌数量的变化和生长规律，掌握测定方法和技巧，为酵母菌的应用研究和品质控制提供实验数据和参考。
实验原理通过显微镜观察菌落计数法和板层法两种方法来测定酵母菌细胞总数。
一、菌落计数法方法：取不同体积的发酵液，经稀释后均匀涂布于琼脂平板上，在适宜温度下培养一定时间后，计算生长菌落数。
计算公式：细胞总数=平均菌落数× 菌群系数× 稀释倍数其中：平均菌落数：每平板上的平均菌落数菌群系数：每1个菌落所包含的菌体数稀释倍数：制成平板时的涂布稀释倍数二、板层法方法：亚硫酸氢钠和碘化钾混合后加入琼脂，使其形成带有抑菌区的琼脂层，经过金属条温度下降至约40℃后加入酵母悬浮液，均匀涂布于琼脂平板上，在适宜温度下培养一定时间后，计算生长菌落数。
计算公式：细胞总数=（下限+上限）/2× 1/涂布量下限：最小生长菌落数涂布量：菌液在琼脂平板上均匀涂布的数量实验步骤1. 酵母菌培养将酵母菌培养在适宜的培养基上，70摄氏度处理，然后加入液体培养基中，继续孵育，并记录生长周期。
（1）首先制备连续稀释物，在组织均一切割后，加入纯水或盐水中，制作成一定稀释度的悬浮液。
（2）取0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、2ml不同的稀释液，在常规琼脂平板表面均匀下板培养。
（3）在培养箱中适当的温度下培养，3~5天后，通过显微镜计算每个菌落的数量。
（4）根据菌落数，统计酵母菌细胞总数。
3. 板层法（1）准备带抑菌区的琼脂平板，和2-3ml的酵母悬浮液。
（2）用真空过滤器将酵母悬浮液过滤到无菌锥形瓶中，测定菌体数量，并按需稀释。
细菌数量测定---标准平板计数法
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样 接种量即可换算出样品中的含菌数。由 于待测样品往往不易完全分散成单个细 胞。所以平板菌落计数法结果往往偏低。 现在常使用菌落形成单位。
三、实训仪器和材料
1、仪器：恒温培养箱。高压蒸汽灭菌锅，
电热套、托盘天平 吸量管、烧杯、三角瓶、培养皿、试管、 试管架、酒精灯 2试剂：大肠杆菌悬液、牛肉膏蛋白胨培 养基（营养琼脂培养基），生理盐水、盐 酸、氢氧化钠、蒸馏水
2、倒平板：在上述平皿中倒入熔化并冷 却至50℃左右的琼脂培养基约15~20 mL，置 水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，于37℃ 培养箱中倒置培养24h。
（五）计数
取出平皿，观察并计算菌落数。一般 选择平皿上长有30~300个菌落的稀释度 计算每毫升的菌落数最合适。
算出同一稀释度2个平皿上的菌落平 均数，并按下列公式计算： 活菌落数/mL=同一稀释度2个平皿上 的菌落平均数×稀释倍数×5
检验结果
稀释度
10-4
1 2 平均 1
10-5
2 平均 1
10-6
2 平均Biblioteka 菌落数活菌数 /mL
活菌落数/mL=同一稀释度2个平皿上的菌落平均数×稀释倍数×5
在上述平皿中倒入熔化并冷却至50左右的琼脂培养基约1520ml置水平位置迅速旋动混匀待凝固后于37培养箱中倒置培养24h
细菌数量测定---标准 平板计数法
一、实训目的
1、掌握菌液稀释的方法和步骤。
2、掌握浇混接种的操作步骤。 3、掌握菌落计数的原理与方法
二、实训原理
平板菌落计数法是将待测样品经适当 稀释后，其中的微生物充分分散为单个 细胞，取一定量的稀释液接种到平板上， 经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形 成的肉眼可见的菌落，即代表原样品中 的一个单细胞。
细菌计数方法
细菌计数方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1细菌计数1.计数器测定法：即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。
由于计数室的容积是一定的，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。
本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。
4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。
细菌计数方法
细菌计数1.计数器测定法：即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。
由于计数室的容积是一定的，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。
本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。
4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
细菌计数方法
细菌计数1、计数器测定法:即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内,用显微镜观察计数。
由于计数室的容积就是一定的(O、1mm3),因而根据计数器刻度内的细菌数,可计算样品中的含菌数。
本法简便易行,可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数,也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:电子计数器的工作原理就是测定小孔中液体的电阻变化,小孔仅能通过一个细胞,当一个细胞通过这个小孔时,电阻明显增加,形成一个脉冲,自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确,但它只识别颗粒大小,而不能区分就是否为细菌。
因此,要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法,就是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液,作一系列的倍比稀释,然后将定量的稀释液进行平板培养,根据培养出的菌落数,可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高,就是一种检测污染活菌数的方法,也就是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意:①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数,过多或过少均不准确;②为了防止菌落蔓延,影响计数,可在培养基中加入O.001％2,3,5一氯化三苯基四氮唑(TTC);③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验,就是最常用的活菌计数法。
4、比浊法比浊法就是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比,与光密度成正比,所以,可用光电比色计测定菌液,用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷,但只能检测含有大量细菌的悬浮液,得出相对的细菌数目,对颜色太深的样品,不能用此法测定。
5、测定细胞重量法此法分为湿重法与干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重;干重法系单位体积培养物经离心后,以清水洗净放人干燥器加热烘干,使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品,就是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
细菌菌落计数实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握细菌菌落计数的原理和方法。
2. 学会使用平板菌落计数法对细菌进行计数。
3. 了解不同细菌的生长特性和培养条件。
二、实验原理细菌菌落计数是微生物学中常用的实验方法，通过在固体培养基上培养细菌，观察并计数菌落，从而了解样品中细菌的数量。
实验原理基于以下步骤：1. 样品处理：将待测样品进行适当的稀释，以使菌落数量达到可计数的范围。
2. 接种：将稀释后的样品涂布在固体培养基上，使菌落分散生长。
3. 培养和观察：在一定条件下培养涂布后的培养基，观察菌落生长情况。
4. 计数：选择平均菌落数在30～300之间的平板进行计数，计算菌落数。
三、实验材料1. 样品：实验室自备的细菌样品。
2. 培养基：营养琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨培养基等。
3. 仪器：无菌操作台、移液管、培养皿、酒精灯、恒温培养箱等。
4. 其他：无菌水、酒精、生理盐水、无菌棉签等。
四、实验方法1. 样品处理：将待测样品进行适当的稀释，以使菌落数量达到可计数的范围。
2. 接种：用无菌棉签将稀释后的样品涂布在固体培养基上，使菌落分散生长。
3. 培养和观察：将涂布后的培养基置于恒温培养箱中，在一定条件下培养。
4. 计数：观察菌落生长情况，选择平均菌落数在30～300之间的平板进行计数。
五、实验步骤1. 样品处理：取1mL待测样品，加入9mL无菌水中，进行10倍稀释。
2. 接种：用无菌棉签蘸取稀释后的样品，涂布在营养琼脂培养基上。
3. 培养和观察：将涂布后的培养基置于37℃恒温培养箱中，培养24小时。
4. 计数：观察菌落生长情况，选择平均菌落数在30～300之间的平板进行计数。
六、实验结果1. 样品1：菌落总数为100个。
2. 样品2：菌落总数为200个。
3. 样品3：菌落总数为150个。
七、实验分析1. 样品1的菌落总数较少，可能是因为样品中细菌数量较少或细菌生长条件不适宜。
2. 样品2的菌落总数较多，可能是因为样品中细菌数量较多或细菌生长条件适宜。
细菌总数的测定实验报告
细菌总数的测定实验报告细菌总数的测定实验报告引言：细菌是一类微生物，广泛存在于自然界中的各种环境中，包括土壤、水体、空气以及人体等。
了解细菌总数对于环境和人体健康的评估具有重要意义。
本实验旨在通过一系列操作，测定样品中细菌总数，并探讨不同环境条件对细菌生长的影响。
材料与方法：1. 样品准备：收集不同环境中的样品，如土壤、水样、空气等。
2. 细菌培养基制备：根据实验需要选择适当的培养基，如琼脂培养基、大肠杆菌培养基等，并按照说明书的要求制备。
3. 细菌培养：将样品分别接种于培养基上，利用无菌技术将细菌均匀涂布于培养基表面。
4. 培养条件：将培养皿置于恒温箱中，温度设定为适合细菌生长的范围，通常为37摄氏度。
5. 培养时间：根据实验需要，培养时间可设定为24小时、48小时或更长时间。
6. 细菌计数：使用显微镜和计数室对培养皿中的细菌进行计数。
结果与讨论：通过实验我们得到了不同环境样品中的细菌总数。
结果显示，不同样品中的细菌总数存在显著差异。
土壤样品中的细菌总数最高，水样中次之，而空气中的细菌总数最低。
这与我们的预期相符，因为土壤是细菌的重要栖息地，水样中常常含有大量的微生物，而空气中的微生物数量较少。
此外，我们还观察到不同培养基对细菌生长的影响。
在琼脂培养基上，细菌呈现出较好的生长情况，菌落形成较为明显。
而在大肠杆菌培养基上，菌落数量较少，生长情况较差。
这说明不同培养基的成分和营养物质含量对细菌的生长具有重要影响，选择适当的培养基对于细菌的培养和研究至关重要。
另外，我们还发现培养时间对细菌总数的测定结果有一定影响。
随着培养时间的延长，细菌数量逐渐增加，但增长速度逐渐减缓。
这可能是由于细菌在培养基中的生长周期和繁殖速度有限所致。
因此，在进行细菌总数测定时，选择合适的培养时间非常重要，以避免细菌数量的低估或高估。
结论：通过本实验，我们成功测定了不同环境样品中的细菌总数，并探讨了不同因素对细菌生长的影响。
接种方法——精选推荐
实验六、微生物细胞数量的平板培养计数微生物菌种纯化保藏一、微生物细胞数量的平板培养计数法（一） 、实验目的了解微生物细胞数量的稀释平板培养计数方法、接种方法，确定不同土壤样品中细菌、 放线菌、霉菌等的细胞数量，学习鉴别不同微生物的菌落特征。
、实验材料（二）1．样品：过筛风干的大田土和过筛新鲜的园艺土；植物种子等。
2．培养基：3．试剂：5mL 1%重铬酸钾溶液分装在 15×150 试管中，灭菌备用；20mg/mL 链霉素溶液 过滤除菌后，分装在1.5mL Enpendorff管中备用。
4．其他灭菌物品：90mL 无菌水分装于 300mL 三角瓶中（含 30～40 粒玻璃珠）；4.5mL 无菌水分装于 15×150 试管中；Φ=9cm的培养皿；1mL 吸管；滴管；1mL 枪头 5．仪器与材料：lmL移液器、天平、称量纸、记号笔、玻璃刮铲等。
、实验原理（三）微生物细胞数量的测定通常包括总细胞计数法、比浊法和活菌计数法三种方法。
其中血 球计数板法在前面实验中已作过详细介绍，而本实验则要求大家重点掌握活菌计数法。
稀释平板计数法是根据微生物在固体培养基表面所形成的单个菌落这一培养特征而设 计的， 其前提是必须由一个单细胞繁殖形成一个菌落， 即一个菌落代表一个单细胞。
计数时， 首先将待测样品制成一系列均匀的稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞充分散开，以保证 每个细胞能完全单独存在，否则一个菌落就不能代表一个细胞，然后选择合适的稀释度和稀 释液接种到培养基平板中，使其均匀分布于平板培养基内。
最后经过一段时间的培养，统计 相应稀释度平板上的菌落数目，即可计算出样品的含菌数。
因此该方法包括了含菌样品稀释 液的制备、培养基平板接种、培养和计数及微生物细胞数量的计算等四个步骤，常用于某些 成品如杀虫菌剂的检定、生物制品的检验、土壤含菌量的测定以及食品、水源等污染程度的 检验等。
在稀释平板计数法的进行过程中， 通常需要根据不同的分离目的采取不同的微生物细胞 接种方法，即表面涂布法和混菌法，或称为表面接种法和基内接种法。
细菌计数简述
细菌计数【目的要求】1、掌握倾注培养法、活菌计数法和光电比浊计数法。
2、熟悉菌落形成单位（cfu）含义。
【器材和试剂】1、器材无菌平皿（直径90mm）、孵育箱、水浴箱、菌落计数仪、无菌刻度吸管、灭菌空试管、坐标纸。
2、培养基普通营养琼脂（每支15ml）、液体培养基。
3、其他待检样品，如饮用水、饮料、食品、药品、化妆品等。
【步骤和方法】1、倾注培养和活菌计数（1）按食品微生物学检验和医药化妆品检验国家标准（GB）的要求处理样品，如固体标本用无菌研钵研碎制成匀浆、油脂类物品用分散剂Tween-80、医药标本宜加入消除药物作用的中和剂等。
所有操作过程必须严格无菌，防止污染。
（2）将标本用无菌生理盐水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀释。
（3）取不同稀释度液体1ml注于直径90mm的无菌平皿，迅速加入已熔化并冷却至50℃的营养琼脂15ml，立即在平面上向同一方向平稳转动，使之混匀，待凝固后翻转平板。
一个稀释度接种两个平板。
（4）置35℃孵育18~24h，计数菌落形成单位（colony forming unit，cfu），求出每毫升或每克标本中所含活菌数。
1ml标本中活菌数=全平板cfu×稀释倍数（5）菌落计数方法：1）平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要使用放大镜检查，以防遗漏。
记下各平板上的菌落数后，应求出同一稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。
2）在求同一稀释度的平均数时，若其中一个平板有较大片状菌落时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。
3）若片状菌落不足平板一半，而其余一半中菌落数分布均匀，则计数后乘2代表全平板菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。
（6）不同稀释度平均菌落数的确认：1）平均菌落数在30~300之间：①若两个稀释度的比值＜2，报告两个稀释度的平均菌落数，如表1-3-1例2；若比值≥2，应报告两个稀释度中较大菌落数者，如表1-3-1例3、例4.②当只有一个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，即以该平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表1-3-1例1。
细菌计数——精选推荐
细菌计数细菌计数试验⽅案1 菌种葡萄球菌菌株（分离奶⽜乳房炎奶样），由本实验室筛选保藏．2 培养基平板培养基：普通营养琼脂．液体培养基：普通⾁汤．3 仪器和器具分光光度计；摇床；试管；移液器；青霉素瓶．4 ⽅法4.1 接种：将菌接种于平板培养基上,37℃培养24 h后，在试管中加⼊10ml液体培养基选取平板培养单个菌落2－3个进⾏接种，接种后37℃、震摇培养．4.2 离⼼：将液体培养的细菌部分⽆菌分装离⼼管，3000rpm离⼼10分钟，弃上清，沉淀⽤⽣理盐⽔/PBS重悬，适当调整浓度，进⾏OD 值测定；另外⼀部分液体培养细菌进⾏活菌计数⽤。
4.3 菌体最适吸收波长测定：以⽣理盐⽔/PBS做对照调零，取适当稀释浓度菌液，对其进⾏Uv波长（300-900nm）扫描测定OD值(表1)，据此确定其最⼤光吸收波长并⽤于以后各步OD值的测定．表1 细菌不同波长扫描的光吸收值波长/nm 300 350 400 450 460 470 480 490 500 550 600 OD值4.4 菌体⽣长曲线测定：取盛有10mL普通⾁汤的试管13个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、22、24h。
⽤移液器分别准确吸取20µL菌液加⼊已编号的13个试管中，于37℃下振荡培养。
然后分别按对应时间将试管取出，⽴即按上述步骤离⼼，进⾏OD值测定，同时进⾏作平板计数。
(表2)4.4.1 平板计数：将每⼀时间菌液再梯度稀释(根据菌种⽽定，⼀般⾄lO-4、lO-5、lO-6、lO-7)，分别吸取0．5mL涂平板(三个平⾏)，取平均数进⾏活菌的准确计数。
4.4.2 OD值测定：将⽣理盐⽔/PBS倾倒⼊⽐⾊杯中，选⽤最适吸收波长分光光度计上调节零点，作为空⽩对照，并对不同时间培养液从0h起依次进⾏测定，对浓度⼤的菌悬液⽤⽣理盐⽔/PBS适当稀释后测定，使其OD值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。
细菌、霉菌与酵母菌计数方法,大肠杆菌检测
1、称取供试品10g，置0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，用超声仪器使其充分混匀，作为供试液。
2、取均匀供试液，进一步稀释成1：10、1：102、1：103等适宜的稀释级。
分别取供试液和连续三级稀释的供试液各1ml，置平皿中。
每稀释级和阴性对照各作3个平皿，3、灭菌后的培养基45~50℃水浴加热，待其融化后，倾倒约15ml于已加入供试液的平皿中，混匀，待凝固后，倒置培养。
4、倒置培养箱中培养48小时，分别再24小时及48小时点计菌落数，一般以48小时菌落数为准。
菌数报告规则细菌选取平均菌落数再30~300之间的稀释级，霉菌选取平均菌落数在30~100之间的稀释级作为报告均属计算的依据。
如有一个稀释级别在30~300（30~100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如果同时有2各稀释级在30~300（30~100）之间时，按下式计算两级比值。
比值=高稀释级的平均菌落数稀释倍数低稀释级的平均菌落数稀释倍数当比值≤2时，以两稀释级的均值报告，当比值＞2时，以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有3各稀释级的平均菌落数均在30~300之间时，以后2各稀释级计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各细菌数每1g不得过1000cfu。
每1ml不得过100cfu。
霉菌和酵母菌数每1g或1ml不得过100cfu。
大肠xx每1g或1ml不得检出。
0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。
1、取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50~100个作阳性对照，第三份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。
培养18~24小时.阴性对照应无菌生长。
2、取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm-紫外光下观察。
细菌记数实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌菌落总数的测定方法；2. 了解样品稀释和涂布平板的原理；3. 学会使用显微镜进行菌落计数；4. 分析实验数据，得出实验结论。
二、实验原理细菌菌落总数是指在一定条件下，单位体积内生长的细菌菌落数量。
本实验采用稀释涂布平板法测定样品中的细菌菌落总数。
具体步骤如下：1. 样品处理：将样品进行适当稀释，使菌悬液中的细菌数量达到可计数的范围；2. 涂布平板：将稀释后的菌悬液均匀涂布在平板表面；3. 培养：将涂布好的平板置于适宜的温度下培养一定时间，使细菌生长形成菌落；4. 计数：使用显微镜观察菌落，根据菌落的大小、形态等特征进行计数；5. 计算细菌菌落总数：根据稀释倍数和计数结果，计算样品中的细菌菌落总数。
三、实验材料1. 样品：含细菌的液体样品；2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；3. 稀释剂：生理盐水；4. 平板：直径为90mm的平板；5. 灭菌器、培养箱、显微镜、移液器、酒精灯、试管等。
四、实验步骤1. 样品处理：取一定量的样品，用生理盐水进行适当稀释；2. 涂布平板：取适量稀释后的菌悬液，用无菌移液器均匀涂布在平板表面；3. 培养：将涂布好的平板倒置，置于37℃的培养箱中培养24小时；4. 计数：使用显微镜观察菌落，根据菌落的大小、形态等特征进行计数；5. 计算细菌菌落总数：根据稀释倍数和计数结果，计算样品中的细菌菌落总数。
五、实验结果与分析1. 实验结果：通过观察显微镜下的菌落，对每个平板上的菌落进行计数，得到如下数据：- 第1个平板：50个菌落- 第2个平板：60个菌落- 第3个平板：55个菌落2. 数据分析：根据实验数据，计算细菌菌落总数。
假设样品稀释倍数为10^-3，则每个平板上的菌落总数为：- 第1个平板：50 × 10^3 = 5 × 10^4- 第2个平板：60 × 10^3 = 6 × 10^4- 第3个平板：55 × 10^3 = 5.5 × 10^4由于实验过程中存在一定的误差，我们可以取平均值作为最终结果：细菌菌落总数= (5 × 10^4 + 6 × 10^4 + 5.5 × 10^4) / 3 = 5.67 × 10^4六、实验结论通过本次实验，我们掌握了细菌菌落总数的测定方法，了解了样品稀释和涂布平板的原理，学会了使用显微镜进行菌落计数。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验六细菌计数法
菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
目录
菌落总数介绍
检验方法
说明（一）样品的处理和稀释：
（二）倾注培养
（三）计数和报告
菌落总数介绍
菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
检验方法
菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。
检验方法参见：GB4789.2-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》
说明
（一）样品的处理和稀释：
1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。
用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。
2．无菌操作：操作中
必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。
所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。
样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。
操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。
琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。
固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。
在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。
为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。
5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。
如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。
（二）倾注培养
1．操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。
同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。
待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。
2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。
如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。
倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml 较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。
倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。
3．为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。
4．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。
培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。
培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h 后，培养基失重不应超过15％。
5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。
在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。
注意事项：（1）操作要快而准，包括材料、加样、倒培养基。
（2）吸液体时液体不能进入吸头。
（3）样品稀释时一定要混匀。
（4）倒培养基前，瓶口要过火焰。
（5）一定要有空白对照。
（6）培养基温度控制，培养基薄厚。
（7）检测时一定要使平皿完全暴露于空气中。
（三）计数和报告
1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。
可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。
2．到达规定培养时间，应立即计数。
如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。
3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。
4．若所有稀释度均不在计数区间。
如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告
之。
如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。
如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。
有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。
5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。
如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。
6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。
如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。
7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。
再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。
8．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。
固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm）报告。
扩展阅读：
1
依据国标GB/T4789.2-2010《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》
2
SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》。