体外刺激淋巴细胞增殖作用检测

体外刺激淋巴细胞增殖试验

1 样品配制

精确称取样品于灭过菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配制成浓度5mg/mL 的样品液。充分溶解然后以15000g离心30min，无菌条件下将上清转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成所需浓度待用。

2 小鼠淋巴细胞的制备

选取8-10周龄，体重22±1g的Balb c或C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗3~4次。将脾脏磨碎后过100目筛，过筛后的混悬液以400g/min 离心6min。吸去上清液，沉淀中按每只小鼠1.5mL的量加入氯化铵红细胞裂解液，反复冲打，静置10min后，加PBS至50mL，然后以400g/min离心6min，吸去上清液，加PBS缓冲液冲洗并离心2遍后，吸去上清，加入RPMI1640培养基（含双抗及10％胎牛血清）混匀，用细胞计数仪计数并稀释成2×106个/mL细胞液备用。

3 细胞培养

将2×106个/mL淋巴细胞悬浮液加至96孔板中，每孔加180μL，同时加入20μL样品液，以20μL PBS和20μL 60μg/mL的PHA溶液分别作阴、阳性对照。于37℃、含5%的CO

条件下培养3d，加入相应试剂测定

2

4 淋巴细胞增殖率的测定

4.1 Alamarblue试剂测定法

在上述细胞培养的96孔板中，每孔分别加入20μL Alamar Blue试剂，再培养，加Alamar Blue试剂前及变色后分别用ELISA自动读板仪测定570nm和600nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对淋巴细胞增殖率。计算公式为：

增殖率(%)=[117216×Aλ570(sample)-80586×Aλ600(sample)]

/[117216×Aλ570(control)-80586×Aλ600(control)]×100%

4.2 MTT法测定

4.2.1 MTT 溶液的配制方法

称取MTT 0.5g溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22μm滤膜过滤分装，－20℃避光保存。在配制和保存的过程中容器最好用铝箔纸包住。在用酶标仪检测结果的时候为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7 范围

内。

4.2.2 操作步骤

在上述细胞培养的96孔板中，每孔分别加入20μlMTT溶液（5mg/ml的MTT）继续培养4h（若药物与MTT能够反应可先离心后弃去培养液小心用PBS冲2-3遍后再加入含MTT的培养液），终止培养，将96孔板2000r/min离心6min，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速振荡10min 使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

计算：

增殖率（％）＝(OD570

sample /OD570

control

)×100%