体外刺激淋巴细胞增殖作用检测

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淋巴细胞转化实验原理

淋巴细胞转化实验原理
淋巴细胞转化实验是一种常用的细胞实验技术，用于研究淋巴细胞的功能和活性。

该实验主要通过处理淋巴细胞，使其进行转化和增殖，从而获得更多的细胞进行后续的功能分析和研究。

实验的原理基于淋巴细胞的自然特性和生理过程。

淋巴细胞是一类免疫细胞，起着重要的免疫调节和防御功能。

在正常情况下，淋巴细胞处于休眠状态，只有在遇到外源性刺激或免疫细胞间相互作用的信号刺激下，才会转化为活化状态，开始增殖和分化。

在淋巴细胞转化实验中，常用的处理方法是给予刺激物或相关信号物质。

这些刺激物可以是抗原、细胞因子、化合物或重组蛋白等。

通过刺激淋巴细胞，在体外条件下模拟体内的免疫应答过程。

刺激物与淋巴细胞相结合后，能够激活细胞上的相应受体和信号通路，从而引发一系列的生物学反应。

在刺激的作用下，被处理的淋巴细胞开始进入细胞周期，细胞开始增殖和分化。

通过细胞分裂和子细胞的形成，最终得到更多的活化淋巴细胞。

这些活化的淋巴细胞可以进一步用于功能分析、免疫学实验、药物筛选等。

需要注意的是，在进行淋巴细胞转化实验时，应严格控制实验条件，包括温度、细胞培养基成分、刺激物浓度和时间等。

不同类型的淋巴细胞对不同刺激物的响应可能存在差异，因此实验前应先对要研究的淋巴细胞类型进行文献调查和探索性实验，以确定最适合的刺激条件。

总之，淋巴细胞转化实验通过处理和刺激淋巴细胞，使其从休眠状态转化为活化状态，以获得更多的活化细胞进行功能分析和研究。

实验的原理基于淋巴细胞的生物学特性和免疫功能，需要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可重复性。

CCK—8法在淋巴细胞增殖检测中最佳实验条件的筛选

CCK—8法在淋巴细胞增殖检测中最佳实验条件的筛选目的筛选CCK-8法在淋巴细胞增殖检测中的最佳实验条件。

方法采用正交实验设计，对初始细胞浓度、培养时间、LPS浓度、显色时间这4个主要因素各水平对人外周血单个核细胞（PBMC）和小鼠脾细胞增殖的影响进行试验研究，对各实验组合测得的刺激指数进行方差分析。

结果CCK-8检测人PBMC 增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为2.5×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h；检测小鼠脾细胞增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为5.0×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h。

结论CCK-8法便捷、灵敏、重复性好，可作为检测淋巴细胞增殖的稳定方法。

本研究建立的CCK-8最佳实验条件可为免疫调节作用的药物体外筛选和免疫药理学作用的研究提供依据。

[Abstract] Objective To optimize the experimental conditions of CCK-8 in lymphocyte proliferation assays. Methods An orthogonal test was designed to investigate the influence of four major factors （cell density，culture period，concentration of LPS and duration of incubation with CCK-8）on cell proliferation of human PBMC and mouse splenocyte. ANOV A was carried out to analyze the stimulation indices of all experimental condition combinations. Results The optimal conditions for CCK-8 was as follows：for PBMC，cell density was 2.5×106/mL，culture period was 48 h，concentration of LPS was 1 μg/mL，and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h；and for splenocyte，cell density was 5.0×106/mL，culture period was 48 h，concentration of LPS was 1 μg/mL，and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h. Conclusion The optimized CCK-8 protocol is a sensitive，convenient and stable quantitative method to evaluate lymphocyte proliferation. This result can provide evidence in screening of immunomodulating drugs and investigation of their immunopharmacology.[Key words] CCK-8；PBMC；Lymphocyte proliferation；Orthogonal test檢测淋巴细胞增殖的方法主要有形态学检查法、放射性核素标记法和四氮唑盐比色法等。

淋巴细胞实验报告

1. 了解淋巴细胞转化实验的基本原理和方法。

2. 掌握淋巴细胞转化实验的操作步骤。

3. 分析实验结果，探讨不同刺激条件对淋巴细胞转化能力的影响。

二、实验原理淋巴细胞转化实验是一种常用的细胞学实验方法，用于研究淋巴细胞的活性和功能。

在实验过程中，淋巴细胞受到有丝分裂原或抗原刺激后，会发生增殖和转化，从而增加细胞数量。

根据转化过程的不同，可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。

本实验采用体外诱导转化方法，通过加入化合物或病毒等诱导剂刺激淋巴细胞，观察细胞转化情况。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 人外周血- RPMI-1640培养液- 细胞分离液- 淋巴细胞刺激剂（如植物血凝素、刀豆蛋白A等）- 台盼蓝染色剂- 流式细胞仪- 显微镜2. 实验仪器：- 移液器- 培养箱- 恒温水浴箱- 染色缸- 计数板1. 淋巴细胞分离：采集人外周血，用细胞分离液进行分层，收集淋巴细胞。

2. 细胞培养：将分离的淋巴细胞用RPMI-1640培养液稀释，接种于培养皿中，置于培养箱中培养。

3. 淋巴细胞转化：向培养皿中加入淋巴细胞刺激剂，培养一段时间后，收集细胞。

4. 细胞染色：将收集的细胞用台盼蓝染色，显微镜下观察细胞形态。

5. 流式细胞仪检测：将染色的细胞用流式细胞仪检测，分析细胞转化率。

五、实验结果与分析1. 细胞形态观察：显微镜下可见，未经刺激的淋巴细胞体积较小，呈圆形或椭圆形；经过刺激的淋巴细胞体积增大，呈多边形或不规则形。

2. 流式细胞仪检测：经过刺激的淋巴细胞转化率为60%，未经刺激的淋巴细胞转化率为20%。

3. 不同刺激条件对淋巴细胞转化能力的影响：- 植物血凝素（PHA）刺激：淋巴细胞转化率为70%。

- 刀豆蛋白A（ConA）刺激：淋巴细胞转化率为65%。

- 无刺激：淋巴细胞转化率为20%。

六、实验结论本实验通过淋巴细胞转化实验，观察到淋巴细胞在受到刺激后发生转化，转化率随刺激剂的不同而有所差异。

结果表明，植物血凝素和刀豆蛋白A对淋巴细胞转化能力具有显著的促进作用。

医学免疫学实验六淋巴细胞功能检测

该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4）红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量移液器、枪头、血球计数板、计数器
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
96孔板布局
PBS孔
调零孔未刺激组刺激组
K8检测：培养结束后，每孔（调零组、未刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测定在450nm处吸光度。
优点：简便易行，仪器简单缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的转化程度。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象，所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了解T细胞功能

细胞转化实验实验报告

一、实验目的1. 了解淋巴细胞转化实验的基本原理和操作步骤。

2. 掌握淋巴细胞转化实验的观察指标和结果分析方法。

3. 通过实验，观察不同刺激条件下淋巴细胞转化率的变化，了解细胞免疫功能。

二、实验原理淋巴细胞转化实验是一种常用的细胞生物学实验方法，用于研究淋巴细胞的活性和功能。

在实验中，将外周血中的淋巴细胞与特异性抗原或刺激物共同培养，观察淋巴细胞在培养过程中的增殖情况。

淋巴细胞转化可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。

自发转化是指在无外界刺激条件下，淋巴细胞自身发生的增殖；体外诱导转化是指在体外加入抗原或刺激物，刺激淋巴细胞增殖。

三、实验材料1. 实验动物：健康小鼠，体重20-25g。

2. 试剂：淋巴细胞分离液、Ficoll分层液、RPMI-1640培养基、小鼠抗人CD3单克隆抗体、PHA（植物血凝素）、Hoechst 33342染料、胰蛋白酶等。

3. 仪器：离心机、显微镜、培养箱、酶标仪等。

四、实验步骤1. 分离淋巴细胞：取小鼠外周血，加入Ficoll分层液，离心分离出单个核细胞层。

再用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。

2. 细胞培养：将分离出的淋巴细胞加入RPMI-1640培养基，调整细胞浓度为1×10^6个/ml。

将细胞悬液分装到24孔培养板中，每孔100μl。

3. 诱导转化：向部分孔中加入PHA，作为诱导剂；另部分孔不加诱导剂，作为对照。

将培养板放入培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养48小时。

4. 染色：向培养板中滴加Hoechst 33342染料，室温染色30分钟。

5. 观察与计数：在显微镜下观察细胞形态，计数每孔细胞总数和转化细胞数。

五、实验结果与分析1. 对照组细胞呈圆形，细胞核染色质均匀，细胞转化率低。

2. 诱导组细胞呈多边形，细胞核染色质致密，细胞转化率高。

结果表明，PHA能够有效诱导淋巴细胞转化，提高细胞免疫功能。

六、实验结论1. 本实验成功实现了淋巴细胞转化实验，掌握了实验操作步骤和观察指标。

医学免疫实验(T细胞增殖实验、核素法、MTT法)

3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法
3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法
原理：当淋巴细胞受分裂原(PHA等)或特异性抗原刺激发生转化时，必然伴有DNA的大量合成，若将具有放射性的3H-TdR加到培养液内，则可被作为合成DNA的原料而摄入转化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量(以脉冲数cpm表示)，就能客观地反映淋巴细胞对刺激物的应答水平。
MTT法
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
淋巴细胞的功能测定技术
T细胞+PHA
培养，淋巴母细胞转化
染色 +3H-TdR
计数转化细胞百分率测定cpm值
测定OD值
谢谢！
医学免疫实验
作业
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用，请设计一个方案证实之（从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角度考虑）。
T细胞增殖实验 3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法（核素法） MTT法
T细胞增殖实验
原理：又称T细胞转化试验。T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继变化，在24~48h细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞变化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细胞增殖又叫淋巴细胞转化。据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。 (1) 非抗原性刺激物:如植物血凝素(PHA)、刀豆素 A(ConA)、美洲商陆(PWM)、脂多糖(LPS)，通称促有丝分裂原。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B细胞，PHA和 ConA刺激T细胞增殖。 (2) 抗原性刺激物:如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤风类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗原等。

MMT

实验步骤
1. 无菌制作脾细胞悬液 1）无菌条件下取试验各组脾脏 2）在盛有10 ml 4℃ Hank's液的烧杯中将脾以眼科剪剪碎 , 经200 目尼龙网轻柔研磨后过筛 , 收集细胞悬液, 将滤液以1 500 r/min 离心5 min。 3）倒去上清液体, 观察沉淀细胞体积。以10:1 体积比加入红细胞裂解液混匀。 4）静置2 min 后, 立即加入4 ℃ 10 ml Hank's液, 以 1 500 r/ min 离心5 min。 5）倒去上清液体, 用Hank's液反复洗涤细胞2 次。 6）最后一次离心前进行细胞计数 , DMEM培养基重悬细胞, 调整细胞浓度为5×10^6/ ml
MTT法：活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶以MTT为底物，形成蓝色的甲臜（ Formazan ）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经 DMSO 溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定 OD570 的值 , 来间接反映活细胞数量。

ConA 刺激淋巴细胞 → 出现淋巴细胞转化现象→加入MTT→活化的淋巴细胞使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 → 二甲基亚砜溶解细胞中的甲瓒→酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其OD值

预பைடு நூலகம்结果：

淋巴细胞悬液的制备 : 无菌取肝素抗凝外周血 5 ml, 沿管壁缓慢加入到含 6 ml淋巴细胞分离液的离心管中 ,两液之间形成界面 ; 2 000 r/min 离心 20 min, 收集分离液界面上富含淋巴细胞的液体加于另一离心管中 , 1 000 r/min离心 7 min, 弃上清 ; 淋巴细胞用 Hank's 液洗涤二次后加入 DMEM完全培养液 ,配制成细胞数 5 × 10^6 /ml 的单细胞悬液。（ Hank's 液是一种平衡盐溶液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等）

淋巴细胞增殖实验报告

淋巴细胞增殖实验报告一、实验目的本实验旨在通过体外培养淋巴细胞，观察不同刺激条件下淋巴细胞增殖的情况，探讨淋巴细胞增殖与免疫应答的关系，为进一步研究免疫调节机制提供实验依据。

二、实验材料1. 实验动物：昆明种小鼠，体重20-25g，雌雄不限。

2. 试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、淋巴细胞分离液、植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、ELISA试剂盒等。

3. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪等。

三、实验方法1. 淋巴细胞分离：取小鼠颈椎脱臼处死，无菌操作下取出脾脏，加入胰蛋白酶消化，离心洗涤，再用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。

2. 淋巴细胞培养：将分离得到的淋巴细胞用RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10^6个/mL，加入PHA或ConA作为刺激剂，分别设置无刺激组、PHA刺激组、ConA刺激组等。

3. 细胞增殖观察：将培养的淋巴细胞置于CO2培养箱中培养，分别在24h、48h、72h、96h和120h取样，用倒置显微镜观察细胞形态变化，并计算细胞数量。

4. ELISA检测：取培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞因子（如IL-2、IFN-γ等）含量。

5. 流式细胞术检测：取培养的淋巴细胞，用荧光标记的抗体检测T细胞亚群（如CD4+、CD8+等）和细胞周期分布。

四、实验结果1. 细胞形态观察：随着培养时间的延长，淋巴细胞在PHA或ConA刺激下逐渐转变为淋巴母细胞，细胞体积增大，核仁明显，细胞浆内出现空泡。

2. 细胞增殖：在PHA或ConA刺激下，淋巴细胞数量显著增加，且呈时间依赖性。

3. 细胞因子检测：ELISA结果显示，在PHA或ConA刺激下，培养上清液中IL-2、IFN-γ等细胞因子含量显著升高。

4. 流式细胞术检测：流式细胞术结果显示，在PHA或ConA刺激下，T细胞亚群CD4+和CD8+的比例发生改变，且细胞周期分布发生变化。

免疫学实验——淋巴细胞功能检测

材料: 1.肝素(100单位/毫升)、淋巴细胞分层液人的正常血液 2.0.5%绵羊红细胞悬液(用Hanks液配制), Hanks 液 3.吸收过的胎牛血清:取经56℃30分钟加热灭活后的胎牛血清加半量压积兔红细胞混合后， 37℃水浴20分钟，2000转/分离心10分钟，取上清液即成。 4. 灭菌注射器，针头，试管，吸管等。
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B细胞产生抗体能力的测定
ELISPOT法
原理：ELISPOT全称为酶联免疫斑点试验，可用于测定产生IgG和IgM抗体的B细胞。其方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性B细胞。如果B细胞产生抗体，抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。
方法
1.抗原包被: 37C° 2h，或4C°过夜。固相载体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。 2.抗体生成细胞培育:加入适量抗体生成细胞，37C°, 5%CO. ，3~4h，或过夜。洗涤，去除为与固相结合的细胞。 3.测定斑点产生细胞:加二抗，37C° ，5%CO.2，2~3h。加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。 4计数: 24h后用10~30倍显微镜下计数斑点形成细胞。
淋巴细胞功能检测
实验任务
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T淋巴细胞增殖的角度考虑) .
淋巴细胞功能检测
•T细胞增殖（转化）实验 •绵羊红细胞玫瑰花环试验 •B细胞产生抗体能力的测定 •细胞因子的检测
T细胞增殖（转化）实验
原理：T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继变化，在 24~48h细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞变化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细胞增殖又叫淋巴细胞转化。据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。

免疫细胞功能检测技术

免疫细胞功能检测技术在现代医学领域，对免疫细胞功能的检测是一项至关重要的工作。

免疫细胞就像是我们身体内的“卫士”，它们时刻守护着我们的健康，抵御着各种病原体的入侵。

而了解这些“卫士”的工作状态和能力，对于诊断疾病、评估治疗效果以及探索新的治疗方法都具有极其重要的意义。

接下来，让我们一起深入了解一下免疫细胞功能检测技术。

免疫细胞包括多种类型，如 T 细胞、B 细胞、NK 细胞（自然杀伤细胞）、巨噬细胞等。

每种免疫细胞都有其独特的功能和作用机制，因此针对不同类型的免疫细胞，检测技术也有所不同。

T 细胞功能检测是免疫细胞功能检测中的重要部分。

其中一种常见的方法是淋巴细胞增殖实验。

这就好比是观察 T 细胞在受到刺激后是否能积极“生长壮大”。

通过在体外给 T 细胞特定的刺激物，比如植物血凝素（PHA）等，然后观察细胞的增殖情况。

如果 T 细胞能够迅速增殖，说明它们具有较强的反应能力，反之则可能提示免疫功能存在异常。

细胞毒性 T 细胞（CTL）杀伤活性测定也是评估 T 细胞功能的重要手段。

想象一下 CTL 就像是训练有素的“杀手”，专门攻击被病原体感染的细胞或者癌细胞。

检测它们的杀伤活性，可以通过放射性核素释放法、乳酸脱氢酶释放法等。

这些方法能够直观地反映出 CTL 消灭“敌人”的能力。

再来说说 B 细胞功能检测。

B 细胞的主要功能是产生抗体。

检测血清中各类免疫球蛋白（Ig）的水平，如 IgG、IgA、IgM 等，能够间接反映 B 细胞的功能状态。

另外，通过检测 B 细胞对抗原的反应能力，比如测定抗体产生的量和亲和力，也可以评估B 细胞的功能是否正常。

NK 细胞作为机体天然免疫的重要组成部分，其功能检测也不容忽视。

NK 细胞具有直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的能力。

常用的检测方法有放射性核素标记法、流式细胞术等。

这些方法可以帮助我们了解 NK 细胞的活性和数量，从而判断其在免疫防御中的作用是否正常发挥。

除了上述针对单个免疫细胞类型的检测方法，还有一些综合性的检测技术。

淋巴细胞体外增殖的特点

淋巴细胞体外增殖的特性
通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂细胞的，只有在异常情况下才能发现。

外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。

体外培养时经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。

外周血中的淋巴细胞经过68-72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。

淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(ConA) 、脂多糖(LPS)白细胞介素2 ( IL - 2) 、植物血凝素(PHA) 、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。

pbmc增殖实验原理

pbmc增殖实验原理
PBMC增殖实验是一种常用的细胞生物学实验，用于研究外周血
单个核细胞（PBMC）的增殖能力。

PBMC是一种混合细胞群，包括淋
巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。

进行PBMC增殖实验的原理主
要包括以下几个方面：
1. PBMC分离和培养，首先，从外周血中分离PBMC，通常采用
密度梯度离心法。

然后将PBMC进行培养，提供适当的营养物质和生
长因子，以促进其生长和增殖。

2. 刺激因子的作用，在培养PBMC的过程中，可以加入不同的
刺激因子，如激活剂、抗原或药物等，以模拟体内的免疫应答过程。

这些刺激因子可以激活PBMC，促进其增殖和分化。

3. 测定增殖活性，通过不同的方法来测定PBMC的增殖活性，
常用的方法包括MTT法、放射性核素标记法、流式细胞术等。

这些
方法可以定量或定性地评估PBMC的增殖能力。

4. 数据分析和解释，最后，对实验结果进行数据分析和解释，
比较不同条件下PBMC的增殖活性，探讨刺激因子对PBMC增殖的影
响，从而揭示PBMC在免疫应答中的作用和调控机制。

总的来说，PBMC增殖实验的原理是通过培养PBMC并加入刺激因子，测定其增殖活性，从而研究PBMC在免疫应答中的生物学特性和调控机制。

这种实验方法在免疫学和临床医学研究中具有重要的应用价值。

淋巴细胞转化实验实验报告

淋巴细胞转化实验实验报告淋巴细胞转化实验实验报告研究背景•淋巴细胞转化实验是一项常用的细胞学实验方法，用于研究淋巴细胞的活性和功能。

•该实验可以模拟淋巴细胞在体外受到刺激后的免疫应答，探索淋巴细胞的增殖和分化过程。

实验目的•通过淋巴细胞转化实验，了解淋巴细胞的活化和增殖能力。

•探究不同刺激条件对淋巴细胞转化能力的影响，如不同抗原、细胞因子等。

实验材料和方法•材料：新鲜淋巴细胞、RPMI-1640培养基、抗原、细胞因子等。

•方法：1.收集新鲜淋巴细胞，并进行细胞计数。

2.将淋巴细胞与培养基混合，在适宜的培养条件下培养。

3.接种不同刺激条件的实验组和对照组。

4.每隔一定时间，观察和记录细胞的形态变化、增殖情况等。

5.根据实验需要，进行细胞活性检测、流式细胞术等实验。

实验结果•不同刺激条件下，淋巴细胞转化率和增殖能力存在差异。

•特定抗原或细胞因子的刺激可以显著增强淋巴细胞的转化能力。

•细胞形态学观察显示：活化的淋巴细胞具有较大的体积和丰富的浆质。

实验讨论•淋巴细胞转化实验结果表明淋巴细胞对刺激条件敏感。

•抗原或细胞因子的刺激可以模拟免疫应答过程，有助于研究免疫系统的功能和异常。

•实验结果为淋巴细胞转化实验提供了一定的参考依据，可进一步扩展研究方向和方法。

结论•淋巴细胞转化实验是一项重要的细胞学实验方法，用于研究淋巴细胞的活性和功能。

•细胞转化实验结果显示不同刺激条件对淋巴细胞转化能力具有影响，这为进一步研究免疫系统提供了指导。

以上是本次淋巴细胞转化实验的报告，请查阅。

实验验证实验设计•实验组：将淋巴细胞与特定抗原处理，观察转化情况。

•阴性对照组：将淋巴细胞与无刺激物处理。

•正性对照组：将淋巴细胞与活化剂处理。

实验操作1.材料准备：–收集新鲜淋巴细胞。

–准备适宜培养基、抗原、细胞因子和活化剂。

2.细胞处理：–取适量淋巴细胞，计数并调整细胞浓度。

–实验组：将淋巴细胞与特定抗原处理，按照实验要求浓度进行处理。

Lu 淋巴细胞体外增殖功能检测

DNA合成检测法
DNA复制完成、蛋白合成，为有丝分裂作准备
RNA转录、蛋白合成为DNA 复制做准备
DNA合成期增殖期的细胞需要大量核苷酸
DNA合成检测法
利用在细胞培养过程中掺入放射性（如 3H-Tdr 掺入法）或
非放射性的核苷类似物（如 Brdu 掺入实验），直接检测 DNA合成水平变化
刺激淋巴细胞增殖
Day 3:
CCk8检测细胞增殖
将细胞浓度分别调节为 2x106 /mL和4x106 /mL，加入96 孔板，每孔90μL，加入25μg/mL或50μ g/mL ConA溶液10 μL ，细胞培养箱（37℃，5%CO2)中孵育72h。培养期间可观察细胞增殖情况。
美洲商陆激活人和小鼠T和B细胞 G-菌测定小鼠B细胞检测人B细胞
葡萄球菌蛋白A（SPA）G+菌
高浓度时，经丝裂原受体与B细胞结合，多克隆诱导B细胞增殖和分化；低浓度时， BCR特异性识别TI-1抗原的B细胞能竞争结合到足够抗原量被激活；感染初期（在TD-Ag免疫应答启动前）快速产生特异性抗体
的BrdU水平
LPS 2D 3D 12.05
0.65 Medium
5.77
BrdU 7AAD Flow cytometric analysis of DNA content (propidium iodide) and DNA synthesis (BrdU) after two or three days of stimulation
细胞染色法
利用荧光染色可穿透细胞膜的特性染色细胞，当细胞分裂
时，荧光标记物被平均分配到两个子代细胞中，其荧光强度是亲代细胞的一半，如CFSE染色细胞
C3He anti-u 10

淋巴细胞转换实验报告

一、实验目的本次实验旨在通过体外培养和刺激外周血淋巴细胞，观察并分析淋巴细胞在特定刺激条件下的转化情况，从而了解细胞免疫的功能和状态。

二、实验材料1. 实验试剂：- 外周血采集管- RPMI-1640培养基- 胎牛血清- 植物血凝素（PHA）- 青霉素-链霉素溶液- 0.25%胰蛋白酶- 台盼蓝染液- 计数板- 显微镜2. 实验仪器：- 酶标仪- 培养箱- 水浴箱- 移液器- 微量离心机三、实验方法1. 外周血采集：采集受试者外周血，将采集管置于室温下静置2小时，使红细胞自然沉降。

2. 淋巴细胞分离：将上层血浆转移至新的离心管中，加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10分钟，然后加入胎牛血清终止消化。

3. 淋巴细胞洗涤：将消化后的细胞悬液离心洗涤，去除未结合的细胞碎片和红细胞。

4. 淋巴细胞培养：将洗涤后的淋巴细胞悬液转移至培养瓶中，加入适量的RPMI-1640培养基和PHA，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48小时。

5. 淋巴细胞计数：培养结束后，用台盼蓝染液对淋巴细胞进行染色，计数活细胞数量。

6. 淋巴细胞转化率计算：计算转化细胞的数量与总细胞数量的比值，即为淋巴细胞转化率。

四、实验结果1. 淋巴细胞数量：实验组淋巴细胞数量显著高于对照组（P<0.05），说明PHA刺激可以促进淋巴细胞增殖。

2. 淋巴细胞转化率：实验组淋巴细胞转化率显著高于对照组（P<0.05），说明PHA刺激可以促进淋巴细胞转化。

五、实验分析1. 淋巴细胞转化实验结果显示，PHA刺激可以显著促进淋巴细胞增殖和转化，这与淋巴细胞在免疫反应中的作用相符。

2. 实验结果表明，淋巴细胞转化率可以作为评价机体细胞免疫功能的一个重要指标。

六、实验结论本次实验通过体外培养和刺激外周血淋巴细胞，成功观察到了淋巴细胞在特定刺激条件下的转化情况，为研究细胞免疫功能提供了实验依据。

七、实验注意事项1. 实验过程中，需严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性。

CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化

CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化薛妮娜;董凯;来芳芳;黄蕊;陈晓光【摘要】研究不同刺激剂对人外周血淋巴细胞增殖与活化的影响.采用密度离心法分离人外周血淋巴细胞,并采用1μmol/L 的CFSE进行标记,通过流式细胞术技术检测刺激剂抗CD3/28抗体、植物血凝素(PHA)和佛波酯(PMA)培养72 h对淋巴细胞分裂与增殖的影响.并采用ELISA法检测不同刺激剂对淋巴细胞上清IFNγ质量浓度的影响.0.125 μg/mL的抗CD3/28抗体和5或10 μg/mL的PHA可以显著诱导CFSE绿色荧光逐渐递,形成类似"五指峰"样图谱,说明这两者具有很强的诱导淋巴细胞分裂与增殖的作用.相比之下,单用PMA促进淋巴细胞分裂与增殖的作用较弱.此外,抗CD3/28抗体、PHA和PMA均可增加淋巴细胞IFNγ的分泌,但其作用强度如下:抗CD3/28抗体>PHA>PMA.采用CFSE标记法检测淋巴细胞增殖的实验,得出抗CD3/28抗体和PHA是高效的淋巴细胞活化刺激剂,而且最佳质量浓度分别为0.125 μg/mL和10 μg/mL.%The aim of this pa per is to investigate the effect of different stimulants on the proliferation and activation of human peripheral blood lymphocytes. Human peripheral blood lymphocytes were isolated by density centrifugation and labeled with CFSE with the final concentratio n of 1μmol/L. Flow cytometry analysis was used to detect the division and proliferation of lymphocytes after administration of anti-CD3/28 antibody, phytohemagglutinin (PHA) and phorbol ester (PMA) for 72 h. In addition, IFNγ content that reflects the acti vation of T lymphocytes was detected by ELISA method.And found that 0.125μg/mL of anti-CD3/28 antibody and 5 or 10μg/mL of PHA could induce the gradual reduction of green fluorescence, with a "Multi-peak" pattern inflow cytometry analysis, the results indicated that both anti-CD3/28 antibody and PHA are potential had strong stimulants for lymphocyte division and proliferation. In comparison, the role of PMA alone in promoting lymphocyte division and proliferation was weak. Furthermore, anti-CD3/28 antibody, PHA and PMA almost could increase the IFNγ secretion from lymphocytes. However, anti-CD3/28 antibody was the most stimulator,PHA, and PMA was the weakest agent for stimulating the production of IFNγ in lymphocytes. In the CFSE-based proliferative assays for assessment of T cell function, this paper concluded that both anti-CD3/28 antibody and PHA were effective stimulants for the proliferation and activation of lymphocytes, with the optimal concentrations of 0.125 μg/mL and 10 μg/mL, respectively.【期刊名称】《哈尔滨商业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(033)002【总页数】6页(P129-134)【关键词】淋巴细胞增殖;CFSE;干扰素γ;流式细胞术【作者】薛妮娜;董凯;来芳芳;黄蕊;陈晓光【作者单位】中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050【正文语种】中文【中图分类】R446肿瘤免疫治疗己成为继手术、化疗和放疗之后的第四种常用的肿瘤治疗方法.肿瘤免疫治疗是通过激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫能力，从而控制和杀灭肿瘤细胞.而效应T淋巴细胞是诱发有效的抗肿瘤免疫反应的主要执行者，行使对肿瘤细胞的识别和消灭作用[1].在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞通过上调一些免疫检查点分子的配体，与T淋巴细胞表面这些共抑制性受体(PD1、CTLA4、LAG3等)相互作用，从而抑制T细胞的增殖与活化，形成肿瘤免疫逃逸微环境[2-3].目前，绝大多数上市或处于临床研究阶段的抗肿瘤免疫药物都是通过抑制T细胞的负性调控信号，通过激活T淋巴细胞的增殖和活性，强化T细胞的免疫应答，最终达到抵御肿瘤细胞增长的目的.因此，T淋巴细胞的增殖与活性水平的检测是细胞免疫功能研究的常用方法，也是目前抗肿瘤免疫药物研发中一个重要的考察指标[4].氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法被广泛用于淋巴细胞增殖的检测.但是其需要使用放射性同位素标记，具有潜在的污染，并且不容易大批量操作.其次，还有一些研究者采用MTT或MTS的方法检测淋巴细胞增殖.虽然MTT或MTS的操作方法相对简单，但灵敏性不高，且此方法不适合检测一些具有氧化还原性作用的药物，这类药物可直接与MTT反应，造成假阳性.此外，3H-TdR掺入法和MTT/MTS法均是以细胞的数量来反应增殖的变化，不能反应细胞的分裂情况，且无法测定不同亚群淋巴细胞的增殖情况[5-6].羧基荧光素乙酰乙酸(Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester, CFSE)染色是一种有效的检测淋巴细胞分裂与增殖的方法.CFSE可穿过细胞膜，不可逆地与细胞内的氨基共价结合偶联到细胞内蛋白.在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记的荧光可平均分配到两个子代细胞中，出现连续的荧光强度递减现象，在流式细胞术检测过程中出现类似“五指峰”的特征[7-8].抗CD3/28抗体、刀豆蛋白A(ConA)、植物血凝素(PHA)佛波酯(PMA)可刺激小鼠脾或人外周血T淋巴细胞增殖.目前，文献中尚未对这些刺激剂促进T淋巴细胞增殖的强度进行比较.而且报道的这些刺激剂的最佳有效剂量也不尽相同.因此，本文采用CFSE标记法检测不同刺激剂诱导人外周血淋巴细胞分裂与增殖的活性，为验证肿瘤免疫药物的活性提供有效的评价方法.1.1 全血健康志愿者的抗凝血购自中国食品药品检定研究院.1.2 主要试剂人外周血淋巴细胞提取分离液购自达科为生物技术有限公司.CFSE、PMA、和PHA购自Sigma公司，人源抗CD3、CD28抗体购自美国Miltenyi?Biotec公司.人源IFN γ 的ELISA检测试剂盒购自cloud-clone公司.RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国GIBCO公司.1.3 主要仪器FACSVerse流式细胞仪为美国BD公司产品，Synergy H1多功能酶标仪为美国Bio-Tek公司产品，CO2培养箱为日本三洋公司产品，冷冻离心机为美国Sigma 公司产品.2.1 淋巴细胞的制备将健康志愿者的抗凝血与PBS混合，再缓慢加至淋巴细胞分离液中(这三者的终体积比例为1∶1∶1)，室温，800 r/min离心30 min.小心吸取中间的一层薄而致密的白膜(淋巴细胞层)至另一层离心管中，用PBS重悬洗涤2次，计数，调整细胞浓度为1×107/mL.2.2 CFSE标记淋巴细胞在上述淋巴细胞悬液中加入CFSE染液(CFSE，终浓度为1 μmol/L)，37 ℃避光孵育10 min，每5 min混匀细胞.加入预冷的2 mL灭活牛血清冰上终止2 min，1 500 r/min离心5 min，用预冷的含10%灭活胎牛血清的PBS洗涤2次.离心，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，计数，将细胞调整为3×106/mL，加入96孔圆底板，每孔100 μL，洗涤及离心过程中注意避光.2.3 流式细胞术检测淋巴细胞增殖活性向上述接种至96孔圆底板的淋巴细胞中分别加入100 μL含不同剂量的刺激剂的RPMI1640完全培养基：抗CD3/28抗体(终质量浓度：0.125、0.5、1、1.5μg/mL)、PHA(终质量浓度：1、5、10 μg/mL)和PMA(终质量浓度：1、5、10 ng/mL).每组实验做三个平行孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中继续孵育72h.离心，收集细胞上清，冻于-80 ℃冰箱保存.将细胞用预冷PBS洗涤2次，并用200 μL PBS重悬，采用流式细胞检测仪(BD FACS Verse)检测淋巴细胞的分裂和增殖情况，并采用Flowjo 7.6软件计算淋巴细胞增殖情况(CFSE荧光强度减低的细胞百分比)和分裂指数(CFSE荧光强度减低的细胞百分比与CFSE荧光强度不变的细胞百分比的比值).2.4 ELISA法检测淋巴细胞上清IFNγ质量浓度取上述条件下淋巴细胞上清液，采用ELISA法检测IFNγ的质量浓度.操作步骤参照试剂盒说明书.简要步骤如下：1)加入100 μL倍比稀释的人源IFNγ标准品及淋巴细胞上清原液，室温静置1 h；2)充分弃上清，分别加入1∶100稀释的IFNγ的一抗，室温静置1 h；3)弃上清，洗涤三次后，加入1∶100稀释后的IFNγ的二抗，室温静置30 min；4)弃上清，洗涤5次后，加90 μL底物(TMB)显色，室温避光放置15 min；5)加50 μL的硫酸终止反应；6)酶标仪450 nmol/L下检测淋巴细胞培养上清液中IFNγ的含量.2.5 统计分析数据采用Mean±SD表示，用SPSS17.0软件对实验数据进行显著性分析，P≤0.05具有统计学意义.3.1 CFSE法淋巴细胞增殖实验中细胞门的确定采用Flowjo 7.6软件对淋巴细胞分裂与增殖进行分析.根据前向散射角(FSC)和侧向角散射(SSC)显示图，发现排除了细胞碎片群外，在正常条件下，淋巴细胞主要分布为左下群，均一度较好的一簇细胞群.在接受不同刺激剂活化后，左下的淋巴细胞群开始往右上方移动，且出现比较散在的细胞群.根据流式细胞术的原理，我们认为在刺激剂活化淋巴细胞后，淋巴细胞出现不同程度的分裂和增殖，其细胞大小和均一度都发生改变，从而显示在右上方散在的细胞群.我们把原始淋巴细胞命名为R1门，刺激剂活化后的淋巴细胞命名为R2门(如图1(A)～(B)所示).且在正常条件下，R1门的细胞具有强的CFSE染色荧光(单峰)；在刺激剂作用下，R2门内增殖的淋巴细胞出现逐渐递减的CFSE染色荧光(多峰)(如图1(C)～(D)所示).3.2 抗CD3/28抗体对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响抗CD3和CD28抗体分别在体外模拟特异性T淋巴细胞活化的第一信号和第二信号，是T淋巴细胞活化常用的刺激剂.我们采用CFSE染色，通过流式细胞术检测抗CD3和CD28抗体对淋巴细胞增殖的影响.如图2(A)～(B)所示，抗CD3/28抗体可以强效地诱导绿色荧光强度逐渐递减，形成类似“五指峰”样图谱，说明抗CD3/28抗体可以显著促进淋巴细胞分裂和增殖.且在0.125～1.5 μg/mL剂量范围内，抗CD3/28抗体诱导的“五指峰”图几乎重叠.对其增殖指数和分裂指数进行统计，如图2(C)～(D)所示，0.125～1.5 μg/mL 的抗CD3/28抗体诱导淋巴细胞增殖百分比基本可达到75%(P≤0.001)，其诱导淋巴细胞分裂指数可达3倍(P≤0.001).但随着抗CD3/28抗体质量浓度的增加，1.5 μg/mL的抗CD3/28抗体诱导淋巴细胞分裂指数反而有所下降.因此，在诱导淋巴细胞增殖实验中，选用终质量浓度为0.125 μg/mL的抗CD3/28抗体即可.3.3 PHA对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响PHA是一种有丝分裂原，主要用于激活淋巴细胞.对PHA的不同质量浓度进行分析表明，PHA可以剂量依赖性地促进淋巴细胞分裂与增殖.1 μg/mL的PHA促进淋巴细胞增殖和分裂指数分别为40.9%和0.69倍.当质量浓度为10 μg/mL 时，PHA促进淋巴细胞增殖的效果最为明显，淋巴细胞增殖和分裂指数为85.7%和4.7倍(如图3所示).3.4 PMA对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响PMA是PKC信号的激活物，PKC信号在T淋巴细胞活化中占据重要地位.所以PMA也是T淋巴细胞活化常用刺激剂之一.对PMA的不同质量浓度进行分析表明，虽然PHA也可剂量依赖性地促进淋巴细胞分裂与增殖，但其诱导淋巴细胞增殖能力较弱，5 ng/mL和10 ng/mL的PMA诱导淋巴细胞增殖指数才到达20%，此剂量下的分裂指数才达到0.2倍(如图4所示).3.5 不同刺激剂对淋巴细胞IFNγ分泌的影响收集不同刺激剂培养淋巴细胞72h后的上清液，采用ELISA法检测IFNγ的质量浓度.如图5所示，0.125 μg/mL抗CD3/28抗体、10 μg/mL PHA和10 ng/mL PMA均可显著增加淋巴细胞IFNγ的分泌(P≤0.001).但其增加淋巴细胞IFNγ分泌量的顺序是抗CD3/28抗体>PHA>PMA.淋巴细胞增殖实验是评价机体免疫功能的常用方法.CFSE染色法是近年来广泛代替3H-TdR掺入法和MTT显色法的一种快速、无污染的检测淋巴细胞增殖的方法.CFSE染色结合流式细胞术技术能在不同淋巴细胞亚群及单个细胞水平上动态的分析淋巴细胞增殖情况[9-11].小分子药物单独作用在体外几乎不刺激淋巴细胞增殖，需要在淋巴细胞活化的基础上，进一步评价小分子药物调节淋巴细胞增殖的作用.因此，采用CFSE法，寻找不同刺激剂活化淋巴细胞的最佳剂量，是评价调节淋巴细胞增殖的小分子药物的必要前提.本实验采用人外周血提取获得淋巴细胞，在不同剂量的抗CD3/28抗体、PHA和PMA作用下，观察淋巴细胞的增殖和分裂指数.实验中发现，比以往报道用量更低的抗CD3/28抗体(0.12 5μg/mL)即可高效的刺激T淋巴细胞的分裂与增殖[12].5 μg/mL的PHA促进淋巴细胞增殖和分裂指数分别为75%和3倍，这与Fulcher D等研究者的报道一致[7].由于PHA可以剂量依赖性地增加淋巴细胞增殖与分裂，可根据需要活化的淋巴细胞的强弱选择合适的PHA的剂量，同时，PHA 又便宜.因此，PHA可用于调节淋巴细胞增殖的化合物的大量筛选.相比之下，PKC 信号的激动剂PMA促进淋巴细胞增殖的能力较弱.可能是因为T淋巴细胞的活化需要PKC信号和Ca2+信号共同参与，因此单一的PMA对淋巴细胞的活化作用较弱，需要与离子霉素联用(Ca2+激动剂)可能对显示出更强的促进淋巴细胞增殖的活性.这与Castagna M等人的研究相一致[13].IFNγ是T淋巴细胞活化的重要指标[14-15].实验发现抗CD3/28抗体、PHA和PMA都能显著增加淋巴细胞IFNγ的分泌，也证明了这三类刺激剂对T淋巴细胞的活化作用.并且这三种刺激剂增加IFNγ的分泌的程度与其诱导淋巴细胞分裂与增殖的程度相对应.后续将进一步研究这些刺激剂对不同亚群T淋巴细胞的促增殖作用.【相关文献】[1] LANITIS E, POUSSIN M, KLATTENHOFF A W, et al. Chimeric antigen receptor T Cells with dissociated signaling domains exhibit focused antitumor activity with reduced potential for toxicity in vivo [J]. Cancer immunology research, 2013, 1(1): 43-53.[2] YAO S, ZHU Y, CHEN L. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation [J]. Nature reviews Drug discovery, 2013, 12(2): 130-146.[3] NIRSCHL C J, DRAKE C G. Molecular pathways: coexpression of immune checkpoint molecules: signaling pathways and implications for cancer immunotherapy [J]. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 2013, 19(18): 4917-4924.[4] BOCHAROV G, LUZYANINA T, CUPOVIC J, et al. Asymmetry of Cell Division in CFSE-Based Lymphocyte Proliferation Analysis [J]. Front Immunol, 2013, 4(264): 1-7.[5] 王玲, 王宏, 刘越坚, 等. 利用CFSE标记检测CD8+淋巴细胞增殖[J]. 大连医科大学学报, 2004, 26(4): 262-264.[6] 季宇彬, 冯小燕, 高世勇, 等. 甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版, 2008, 24(4): 385-388.[7] FULCHER D, WONG S. Carboxyfluorescein succinimidyl ester-based proliferative assays for assessment of T cell function in the diagnostic laboratory[J]. Immunol Cell Biol, 1999, 77(6): 559-564.[8] POPMA S H, KRASINSKAS A M, MCLEAN A D, et al. Immune monitoring in xenotransplantation: the multiparameter flow cytometric mixed lymphocyte culture assay [J]. Cytometry, 2000, 42(5): 277-283.[9] VENKEN K, THEWISSEN M, HELLINGS N, et al. A CFSE based assay for measuringCD4+CD25+ regulatory T cell mediated suppression of auto-antigen specific and polyclonal T cell responses [J]. J Immunol Methods, 2007, 322(1-2): 1-11.[10] GANUSOV V V, MILUTINOVIC D, DE BOER R J. IL-2 regulates expansion of CD4+ T cell populations by affecting cell death: insights from modeling CFSE data[J]. J Immunol, 2007,179(2): 950-957.[11] 包晶晶, 林海霞, 马璟, 等. CFSE示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T淋巴细胞增殖的影响[J]. 中国药理学通报, 2010, 26(6): 828-831.[12] THOMAS A K, MAUS M V, SHALABY W S, et al. A cell-based artificial antigen-presenting cell coated with anti-CD3 and CD28 antibodies enables rapid expansion and long-term growth of CD4 T lymphocytes [J]. Clin Immunol, 2002, 105(3): 259-272. [13] CASTAGNA M, TAKAI Y, KAIBUCHI K, et al. Direct activation of calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase by tumor-promoting phorbol esters [J]. J Biol Chem, 1982, 257(13): 7847-7851.[14] 严俊, 姚堃, 周瑶玺. T细胞活化、活化信号和IFN-γ诱生的关系研究[J].免疫学杂志, 1992,8(2): 95-98.[15] MCNANARA M J, HILGART-MARTISZUS I, BARRAGAN E D M, et al. Interferon-gamma production by peripheral lymphocytes predicts survival of tumor-bearing mice receiving dual PD-1/CTLA-4 blockade [J]. Cancer Immunol Res, 2016, 4(8): 650-657.。

淋巴细胞转化实验报告

一、实验目的本实验旨在了解淋巴细胞转化的基本原理，掌握淋巴细胞转化实验的操作方法，并通过对实验结果的分析，评估机体细胞免疫功能。

二、实验原理淋巴细胞转化是指淋巴细胞在体外受到某些刺激物（如植物血凝素、刀豆蛋白A等）的作用下，发生增殖、分化，转化为淋巴母细胞的过程。

淋巴细胞转化实验是检测细胞免疫功能的重要方法之一。

通过观察淋巴细胞转化率，可以评估机体的细胞免疫功能。

三、实验材料1. 实验动物：小白鼠2. 试剂与耗材：植物血凝素（PHA）、小牛血清、培养液、显微镜、计数板、移液器、离心机等。

四、实验方法1. 采集小白鼠血液，分离淋巴细胞。

2. 将分离得到的淋巴细胞加入含有PHA的培养液中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养48小时。

3. 培养结束后，收集细胞，用固定液固定细胞，进行染色。

4. 在显微镜下观察淋巴细胞形态变化，计数淋巴母细胞数量。

5. 计算淋巴细胞转化率。

五、实验结果1. 观察到淋巴细胞在培养过程中，部分细胞体积增大，核染色质疏松，核仁明显，胞浆丰富，呈嗜碱性，符合淋巴母细胞特征。

2. 计算淋巴细胞转化率，本实验中淋巴细胞转化率为60.2%。

六、实验讨论1. 淋巴细胞转化实验是检测细胞免疫功能的重要方法，通过观察淋巴细胞转化率，可以评估机体的细胞免疫功能。

2. 本实验中，淋巴细胞转化率为60.2%，说明小白鼠的细胞免疫功能处于正常水平。

3. 实验过程中，应严格控制实验条件，如温度、CO2浓度、培养液成分等，以保证实验结果的准确性。

七、结论本实验通过淋巴细胞转化实验，成功观察到了淋巴细胞在体外培养过程中的转化现象，并计算出淋巴细胞转化率。

结果表明，小白鼠的细胞免疫功能处于正常水平。

八、注意事项1. 实验操作过程中，应严格遵循无菌操作原则，防止污染。

2. 实验过程中，应严格控制实验条件，如温度、CO2浓度、培养液成分等，以保证实验结果的准确性。

3. 实验结果的分析应结合临床实际情况，综合评估机体的免疫功能。

检测淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖实验设计

③细胞培养至56h，每孔内加入3H-TdR工作液各20 μl，轻轻震荡混匀后置37°c CO ₂培养箱内继续培养至72h终止培养
④终止培养时，用多头细胞收集器将细胞收集在49型玻璃纤维滤膜上，将滤膜置烤箱内烤干
⑤滤膜冷却后移入存有5ml闪烁液的闪烁杯中，避光放置一段时间后，用FJ-2107液闪计算器测量放射性，结果用刺激指数（SI）表示
实验步骤：
①静脉采血肝素抗凝，充分摇匀后加入细胞微量培养板内（20 μl/孔）每个样品设自发转化孔和分裂原刺激孔均为三个复孔
②自发转化孔每孔内加完全RPMI-1640液 0.2ml，分裂原刺激孔每孔内加PHA液0.1ml， RPMI-1640液0.1ml。加样后，轻轻震荡混匀，置37°c CO ₂培养箱内培养
管、玻片等常规实验仪器。三、PHA、瑞氏姬姆萨染液，肝素，Hanks液
等常规实验试剂。
1、T淋巴细胞功能的测定（T细胞转化、增殖实验、迟发性超敏反应的检测、T细胞分泌细胞因子的检测、CTL细胞介导的细胞毒试验）
2、B淋巴细胞功能的测定 3、单核巨噬细胞、NK细胞等的功能测定 4、细胞因子的检测 5、CD分子、表面受体、黏附分子的检测
问题背景：
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用请设计一个方案证实之。（从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角度考虑。）
T淋巴细胞受到特异性抗原或非特异性抗原（PHA、PWM和ConA）刺激均能使细胞发生转化。T淋巴细胞转化率的高低可反映人体细胞免疫功能水平，常被作为细胞免疫功能指标之一。
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
① 稳定、特异，且抗原用量少； ②可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测 ③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞

新疆黑蜂胶对淋巴细胞的体外增殖作用研究

新疆黑蜂胶对淋巴细胞的体外增殖作用研究【摘要】目的研究不同浓度的新疆黑蜂胶乙醇提取物对Balb/c小鼠淋巴细胞的增殖作用。

方法新疆黑蜂胶经乙醇提取混合物，做倍比稀释。

Balb/c小鼠脾淋巴细胞分别加入500μg/mL及倍比稀释至15.6μg/mL的黑蜂胶共6个测定浓度，同时设脂多糖对照组、刀豆蛋白A对照组和空白对照组。

采用CCK-8测定不同浓度黑蜂胶在体外刺激脾淋巴细胞后的OD450值。

结果500μg/mL至62.5μg/mL的黑蜂胶刺激小鼠淋巴细胞增殖的活性显著高于空白对照组，但低于ConA 对照组。

黑蜂胶的免疫激活作用与其药物浓度呈正相关。

结论新疆黑蜂胶可非特异性的促进淋巴细胞显著增殖。

【关键词】新疆黑蜂胶；淋巴细胞；CCK-8051文章编号：1004-7484-06-3045-02蜂胶是医学宝库的古典名药，已有数千年的历吏。

药理学研究发现，蜂胶具有多种生物作用.如抗菌、消炎、止痛、抗肿瘤等。

而新疆黑蜂胶产自新疆，其是否也存在上述药效却很少见诸文献报道。

研究新疆黑蜂胶调节小鼠淋巴细胞增殖作用，可明确新疆黑蜂胶所具有的天然免疫学活性效果。

本研究采用cck-8法检测新疆黑蜂胶在体外对Balc/c小鼠脾淋巴细胞刺激48小时后淋巴细胞增殖活性，初步探讨其对淋巴细胞的免疫激活作用，对于有效的利用和开发这种新疆本土药物资源提供理论依据。

1资料与方法1.1材料1.1.1实验动物Balb/c小鼠：雌雄兼用，体重g。

1.1.2黑蜂胶混合物新疆黑蜂胶产品1.1.3实验仪器与试剂试剂：小鼠淋巴细胞分离液TBD 货号：LTS1083；RPMI1640；CCK-8试剂；豆蛋白95%无水乙醇。

仪器：酶标仪iMark；细胞计数仪恒温水浴箱等。

1.2方法1.2.1获取新疆黑蜂胶提取物将粗蜂胶置于-20℃冰箱中过夜后用研钵粉碎；水浴法除蜡；冷浸法提纯蜂胶，称取15g 除蜡蜂胶，按照固液比1：5的比例，加75%乙醇75ml，封口浸泡两周；滤去沉渣，配制成100g/L蜂胶醇溶液，调整PH=7.0，使用0.2μm的无菌滤器过滤备用。