_基于自噬调控肿瘤相关巨噬细胞表型极化的金纳米粒抗肿瘤机制研究
细胞自噬对肿瘤细胞生长调控的影响
细胞自噬对肿瘤细胞生长调控的影响人们习惯将细胞自噬当作细胞的一种无害的代谢过程。
其实，它是自身保护机制下，清除细胞内过多或异常内质网、线粒体等细胞组分，实现生物体代谢平衡的基本方式之一。
而不幸的是，许多肿瘤细胞正是利用这种自噬过程进行生长调控，并在阻碍自噬继续进行时，顺利逃避机体的清理浊化，从而迅速增殖。
一、什么是细胞自噬细胞自噬是一种原代质袋-溶酶体系统涉及的草根的、自我调整的物质循环途径，可以分解各种变质、异常、超时的蛋白质、膜类化合物和内源性代谢产物，以完成细胞自我平衡和内在新陈代谢的调整。
此过程基于一系列途径进行，并涉及蛋白质的适应性变化、核苷酸的代谢降解、组蛋白修饰和表观调控等多种方式。
自噬与细胞分化、凋亡、轴突的发生和突触分化、神经信号传递等多个方面息息相关。
二、肿瘤细胞与自噬的复杂关系当肿瘤细胞中遇到自噬时，内水平的分子调控机制抑制自噬可能发生任何的精细调节机制，导致工作的老化和分化不全。
如果肿瘤细胞不能完成巨噬细胞的清除，他们通过自噬释放成为可溶性因子，成为肿瘤细胞克隆的内在部分。
在上面这些过程中，类似抗私有化的恢复性自我修复机制也可能会参与其中。
自噬和细胞凋亡有密切的关联，是一种在肿瘤细胞中常常出现的现象。
对于癌细胞来讲，细胞自噬是一种把自己和环境分开的生存机制.在细胞自噬过程中，常会出现不适量的蛋白降解或一些活性物质的释放，导致细胞生长和细胞生存的环境变化。
三、如何将细胞自噬作为肿瘤细胞的药物靶点在肿瘤治疗中，研究自噬对肿瘤细胞生长调控的影响，发现自噬对肿瘤细胞具有重要的调控作用。
一方面，细胞自噬可以通过减少细胞对营养物质和能源的需求，限制肿瘤细胞的生长和生存。
同时，在肿瘤治疗时，可以通过调节自噬通路来提高其治疗效果。
根据细胞自噬机制的不同，针对不同自噬通路的药物研究也在不断进行。
例如，一些自噬抑制剂可以阻碍细胞自噬过程的进行，从而抑制肿瘤细胞的生长和分化。
另外，对于一些抗肿瘤药物，例如S-1、紫杉醇等，研究也发现其抑制肿瘤细胞生长的机制也和肿瘤细胞自噬的机制密切相关。
肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤免疫治疗中的意义和研究进展
肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤免疫治疗中的意义和研究进展
李明哲;申亮亮;曲璇
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】2018(029)004
【摘要】肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在肿瘤间质中占有很大比例,具有不同于炎症反应中巨噬细胞的表型和功能.在不同刺激因子作用下,TAM可以分化为具有抑制肿瘤活性的M1型巨噬细胞和具有促进肿瘤活性的M2型巨噬细胞.肿瘤组织中的TAM 主要为M2型,它们促进肿瘤的发生、发展、侵袭和转移.特定的刺激可将M2型TAM逆转为M1型TAM而抑制肿瘤生长,这将为肿瘤免疫治疗提供新思路.我们简要综述肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤免疫治疗中的研究进展.
【总页数】6页(P558-563)
【作者】李明哲;申亮亮;曲璇
【作者单位】空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,陕西西安710032;空军军医大学学员一旅八连,陕西西安710032;空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,陕西西安710032;陕西中医药大学,陕西咸阳712046
【正文语种】中文
【中图分类】R73
【相关文献】
1.巨噬细胞在肿瘤免疫治疗中的研究进展 [J], 支馨仪;刘岩厚;高晶;王轶楠
2.激活的巨噬细胞在抗肿瘤免疫治疗中的意义 [J], 李兰英;田国才
3.肿瘤相关巨噬细胞调节肿瘤免疫治疗作用的研究进展 [J], 徐栩
4.纳米材料调控肿瘤相关巨噬细胞进行肿瘤免疫治疗的研究进展 [J], 徐睿; 刘晨光
5.甲状腺乳头状癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润及CD47表达的意义 [J], 刘志敏;刘天卿;王红龙;刘楠
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自噬在巨噬细胞极化中的作用研究进展
[收稿日期]2016-09-06 [修回日期]2017-08-25[基金项目]国家自然科学基金青年基金项目(81400802)[作者单位]1.蚌埠医学院,安徽蚌埠233030;2.上海交通大学医学院附属第九人民医院(北院)内分泌科,上海201900[作者简介]孔祥歆(1989-),女,硕士研究生.[文章编号]1000⁃2200(2018)03⁃0416⁃03㊃综 述㊃自噬在巨噬细胞极化中的作用研究进展孔祥歆1,2 综述,刘卉芳2,陈凤玲2 审校[关键词]自噬;巨噬细胞;极化;综述[中图法分类号]R 392.3 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2018.03.041 自噬广泛发生在真核细胞内,是清除细胞内功能异常的细胞器㊁病原体和错误折叠的蛋白质等有害大分子物质的重要途径,在维持细胞内环境稳态中发挥重要作用[1],自噬功能失调与许多疾病的发生㊁发展有关㊂巨噬细胞是机体固有免疫的重要组成部分,在防御㊁炎症㊁修复和代谢等生理及病理过程中发挥重要作用㊂同时巨噬细胞也是一种异质性细胞,在不同刺激下可活化成为不同类型(M1㊁M2型巨噬细胞),称之为巨噬细胞极化[2]㊂两种极化类型的巨噬细胞发挥不同的生物学效应㊂本文对近年来自噬与巨噬细胞极化之间关系的研究进展作一综述㊂1 自噬 自噬广泛发生于真核细胞内,是一种在进化上高度保守的过程㊂在自噬过程中,细胞内的蛋白质和细胞器被自噬体包裹后转移到溶酶体消化,调控细胞器和蛋白质的质量,并产生大量细胞内稳态所需的氨基酸和其他构成细胞组分[1]㊂自噬可由多种因素刺激所诱导,例如饥饿㊁活性氧㊁内质网应激㊁细菌感染和缺氧,自噬启动后可以清除受损的细胞器㊁聚集的蛋白和细胞内病原体,因此自噬对细胞内稳态的维持至关重要[3]㊂1.1 自噬的分类 依据不同的功能和机制,自噬分为3种[4]㊂自噬:也就是通常所说的自噬,通过形成双层膜结构的自噬体,并且发生膜的延长,进而与溶酶体相结合,融合构成自噬溶酶体,自噬体中的内容物被溶酶体降解,完成对大部分胞质成分㊁长寿命蛋白和完整细胞器的降解[1]㊂小自噬:由溶酶体膜直接包裹胞质成分进行降解㊂分子伴侣介导的自噬:与前两种自噬不同,分子伴侣介导的自噬只选择性地降解单体的未折叠的可溶性蛋白[5]㊂在小自噬和分子伴侣介导的自噬中,目标细胞内容物直接被溶酶体降解,并不形成自噬体[1]㊂本文谈及的自噬均指大自噬㊂1.2 自噬的过程与调节 目前已知在基因水平启动自噬的主要基因有p27㊁p73和p53等,p27通过CDK2/mTOR 轴抑制自噬[6],p73通过转录激活ATG5基因促进自噬[7]㊂p53也是通过抑制mTOR 诱导自噬的,其直接靶点是flj11259,但flj11259与mTOR 及ULK1之间的通路尚不清楚[8]㊂初始隔离结构的形成及自噬泡的成核和延展需要Beclin 1(酵母的ATG6在哺乳动物则称为Beclin 1),PIK3C3/VPS34,PIK3R4/VPS15和ATG14㊁AMBRA1或UVRAG 和SH3GLB1/Bif⁃1的参与[9])㊂自噬小体的形成则需要两个泛素样结合系统:ATG12⁃ATG5和LC3⁃II /Atg8⁃PE(酵母的ATG8在哺乳动物称为LC3[9])㊂在酵母菌中,这三种蛋白在自噬泡的延展与成熟过程中均发挥作用㊂在哺乳动物细胞中,LC3的亚家族在延展阶段发挥作用,随后的自噬小体成熟过程则由GABARAP 蛋白负责[10]㊂此外,溶酶体的产生及其与自噬体的融合也受调控分子严格调控㊂转录因子EB(TFEB)是溶酶体产生及功能的主要调控者[11]㊂自噬的过程需要一系列在进化上高度保守的蛋白,也就是所称的自噬相关(ATG)蛋白㊂ATG 蛋白的磷酸化和去磷酸化可以对自噬进行调控㊂其上游的mTOR 激酶在自噬途径中发挥主要作用,其在mRNA 蛋白水平上调控自噬过程的关键组分抑制自噬㊂例如,mTOR 可磷酸化ATG13,从而抑制ULK1及自噬㊂作为重要的营养物质感受器,mTOR 通过控制蛋白复合体中的某些特定分子,例如EIF4EBP1/4E⁃BP1和RPS6KB /p70S6K 的活性[12]㊂自噬在生理及病理条件下均发生,自噬功能失调与许多疾病的发生发展相关,其中包括恶性肿瘤㊁原发性心肌病和神经退行性病变等[13-14]㊂2 巨噬细胞极化 巨噬细胞是固有免疫的重要组成部分,具有抗原提呈㊁吞噬和分泌多种炎症因子及细胞因子的功能,在防御㊁炎症㊁修复和代谢等生理及病理过程中发挥重要作用,也是机体维持自身稳定的关键因素之一㊂巨噬细胞同时也是一种异质性的细胞,具有高度可塑性,在不同组织微环境条件下被激活,可以产生不同的亚型并表现出不同的功能㊂根据Th 细胞Th1和Th2的分类方法,分为经典激活的M1型和选择性激活的M2(M2a㊁M2b 和M2c)型㊂M1由Th1淋巴因子干扰素γ(IFN⁃γ)㊁脂多糖(LPS)㊁肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)等诱导活化产生㊂M1除直接参与免疫防御反应外,还可分泌促炎因子[白细胞介素(IL)⁃1β㊁IL⁃6㊁IL⁃12㊁TNF⁃α等)㊁活化氧(ROS)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS),并分泌单核细胞趋化蛋白1(MCP⁃1)㊁IL⁃8等趋化因子吸引Th1淋巴细胞,促进强烈的Th1免疫反应㊂M2型巨噬细胞还可被细分由IL⁃4或IL⁃13诱导的M2a 型,免疫复合物诱导的M2b 型及IL⁃10㊁TGF⁃β或糖皮质激素等诱导的M2c 型[15]㊂M2型巨噬细胞514蚌埠医学院学报2018年3月第43卷第3期分泌大量IL⁃10和IL⁃lRA,抑制炎症反应㊂M2高表达精氨酸酶1㊁甘露糖受体㊁清道夫受体㊁类几丁质酶3样分子3以及炎症相关的缺氧诱导有丝分裂因子等㊂M2型巨噬细胞为抑炎性,在组织修复和重建㊁血管生成和肿瘤生长浸润等均有促进作用㊂巨噬细胞极化不仅与免疫等相关,其与代谢性疾病也有密切联系,如动脉粥样硬化㊁肥胖㊁肝细胞和脂肪细胞的胰岛素抵抗等㊂M1/M2是巨噬细胞活化类型的两个极端,但在体内巨噬细胞所处微环境复杂,同时接触多种微环境信号,比体外某单一因子刺激而发生的极化过程更为复杂㊂在同一组织中可同时存在不同表型的巨噬细胞,而巨噬细胞也可兼表达M1和M2标志物㊂在某些条件下,极化的M1与M2也可发生相互转化[15]㊂巨噬细胞极化的过程复杂,相应的所受的分子信号及其通路的调控亦较复杂,目前研究较成熟的信号通路有JAK/STAT通路[16]㊁PI3K/Akt/ NF⁃κB通路[17]㊁JNK通路[18]等㊂3 自噬与巨噬细胞极化 mTORmTOR是调节自噬的一种进化上保守的蛋白激酶,并且在巨噬细胞极化过程中也起关键作用㊂自噬抑制剂3⁃MA和CQ阻断了M2巨噬细胞表面标志分子CD11b的表达[19]㊂在LPS刺激的单核细胞中,雷帕霉素抑制mTOR通路致使其向M1型极化,与此同时敲除mTOR抑制剂TSC2,激活mTOR通路则产生了相反的作用[20]㊂mTOR及其通路的Akt㊁ClassⅠPI3K/Akt㊁IGF⁃1/2㊁MAPK和下游分子p70S6可以抑制自噬[21]㊂在骨髓来源巨噬细胞中,激活PI3K⁃mTOR可促进M2型极化,而抑制PI3K或mTOR则会导致M1型极化,证明了PI3K⁃mTOR通路在巨噬细胞极化中的作用[22]㊂但有研究[23]证明,过表达受mTOR的负性调节的TFEB,显著上调自噬小体的形成和M1型标志的细胞因子,但未证明增强的自噬与M1标志表达的增多是否有直接关系,说明mTOR通路与巨噬细胞极化之间的关系可能比目前研究证明的更为复杂㊂NF⁃κB在药理或基因水平抑制自噬,可以解除NF⁃κB激活,并使已经极化为M2型的巨噬细胞产生高水平的M1型细胞因子㊂近来有研究[24-25]证明,肝癌细胞来源的Toll样受体2相关配体可以使RELA泛素化,在巨噬细胞内形成可被聚集体样结构SQSTM1/p62介导的自噬分解,通过选择性的自噬控制RELA/NF⁃κBp65,使巨噬细胞向M2亚型方向极㊂这些研究特别指出,NF⁃κB在巨噬细胞极化中的作用是由SQSTM1/p62介导的选择性自噬所控制的㊂在病原体感染或肿瘤存在的情况下,通过LPS等病原体相关分子模式(PAMP)借TLR4或IL⁃1信号可激活IKK复合物,通过STAT1和NF⁃κB两条关键炎症信号通路调节巨噬细胞的M1活化㊂而另有研究[26]发现NF⁃κB通路活化不仅参与炎症发展,也在炎症消退和诱导巨噬细胞凋亡中发挥作用,NF⁃κB 通路活化剂IKK能直接抑制STAT1活性,并且可促进肿瘤相关巨噬细胞向M2极化㊂然而,NF⁃κB在调节巨噬细胞极化和功能中的作用是复杂的,并且巨噬细胞极化和功能本身就是环境和基因共同作用导致的㊂NF⁃κB在巨噬细胞极化的特殊作用仍需进一步的研究㊂其他CCL2和IL⁃6在介导自噬和抑制巨噬细胞内的凋亡都有确切且强效的作用,并且在刺激巨噬细胞向M2型极化㊂在巨噬细胞中,抑制CASP8促进自噬,可以提高M2型极化㊂抑制自噬削弱M2型极化,直接证明了自噬在巨噬细胞极化中有重要作用[27]㊂同时,近来的研究[28]证明索拉非尼诱导自噬,抑制M1型巨噬细胞的标志物CD80的表达,表明自噬与巨噬细胞极化之间可能的联系㊂另外,有证据证明在肿瘤相关巨噬细胞中,组织蛋白酶S调节自噬在诱导M2型巨噬细胞的机制中有重要作用,从而促进肿瘤的发展[29]㊂巨噬细胞极化对自噬的影响巨噬细胞极化也可以对自噬水平产生影响㊂有些Th1细胞因子,如在巨噬细胞内,LPS 在TICAM1/TRIF依赖的TLR4途径调节下,诱导自噬小体形成[30]㊂TNF⁃α可在未激活NF⁃κB的情况下促进自噬[31]㊂IFN⁃γ通过促进自噬小体的成熟,促进和增强自噬[32]㊂部分Th2细胞因子,如IL⁃4和IL⁃13可通过Akt/mTOR途径抑制饥饿诱导的自噬,也通过STAT6途径抑制IFN⁃γ诱导的自噬[33]㊂但也有研究[34]发现,使用M2型巨噬细胞培养上清液培养人脐静脉内皮细胞,可提高LC3⁃B的表达和自噬小体的数量,降低P62蛋白的表达,在使用氯喹封闭自噬后,此种作用便消除了,且M1型巨噬细胞培养上清液并没有以上作用㊂4 小结 自噬作为近年来的研究热点,不仅发挥维持细胞内稳态的作用,且与多种生理㊁病理过程及疾病相关㊂巨噬细胞极化在炎症㊁防御㊁修复㊁代谢等生理及病理过程中发挥重要作用㊂自噬与巨噬细胞极化有密切关系,多数实验表明自噬调节巨噬细胞向抑炎的M2型方向活化,但尚存在争议㊂若自噬在巨噬细胞极化过程中的作用明确,未来可通过调节巨噬细胞内自噬水平,从而调节巨噬细胞极化方向,则可治疗或改善巨噬细胞极化用作参与的疾病,如肿瘤的浸润和发展㊁动脉粥样硬化㊁代谢性炎症等,为这些疾病的治疗提供可能的途径和手段㊂[参考文献][1] MIZUSHIMA N,LEVINE B,CUERVO AM,et al.Autophagyfights disease through cellular self⁃digestion[J].Nature,2008,451(7182):1069.[2] CHEN P,BONALDO P.Role of macrophage polarization in tumorangiogenesis and vessel normalization:implications for newanticancer therapies[J].Int Rev Cell Mol Biol,2013,301:1.[3] MIZUSHIMA N,LEVINE B.Autophagy in mammalian developmentand differentiation[J].Nature Cell Biol,2010,12(9):823. 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肿瘤相关巨噬细胞抗肿瘤靶点探究
肿瘤相关巨噬细胞抗肿瘤靶点探究作者：李勃刘森来源：《科技视界》2016年第11期【摘要】肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在肿瘤细胞的发生、生长、侵袭和转移方面起到了重要作用，其功能特性类似 M2型巨噬细胞。
目前多项研究表明TAM与血液系统恶性肿瘤的临床表现及预后相关。
基于TAM的促肿瘤作用，目前针对TAM的活化、招募、促血管生成活性、存活及基质重塑等方面设计的靶向治疗药物也进入了基础或临床试验。
【关键词】肿瘤相关巨噬细胞；促肿瘤作用；靶向治疗巨噬细胞是固有免疫系统中重要的细胞组成部分，具有广泛的功能，包括吞噬作用、抗原提呈作用、防御微生物的细胞毒作用及分泌生长因子、细胞因子、蛋白酶和前列腺素等功能，所以巨噬细胞的激活成为肿瘤治疗进展中一个具有诱惑力的方法。
然而，在肿瘤微环境中的巨噬细胞，被统称为肿瘤相关巨噬细胞（TAM），其能够分泌一些刺激肿瘤细胞发生、生长、侵袭和转移的物质，尤其与肿瘤血管和淋巴管的生成密切相关。
本文将针对TAM的一些肿瘤靶向免疫治疗进行综述。
1 减少TAM的聚集TAM受到多种趋化因子调控，其中最重要的是聚集刺激因子-1（colony stimulating factor-1，CSF-1）和CCL2。
低表达CCL2的人源黑色素瘤（IIB-MEL）植入小鼠的皮下组织，发现肿瘤的生长速度会明显放缓，但是如果在该细胞株内转入CCL2的表达质粒，可以明显促进肿瘤的生长速率。
在体外实验中使用宾达利（Bindarit）处理转入CCL2表达质粒的细胞株，以可以抑制CCL2的产生，从而使巨噬细胞和瘤内的血管密集度下降[1]。
因此可以发现如果阻断肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤组织中的聚集，TAM的促肿瘤形成能力将会受到明显抑制。
2 直接摧毁TAM一旦TAM进入肿瘤位点，单核巨噬细胞选择性的产生具有细胞毒性的抗肿瘤抑制剂，不但可以杀死肿瘤细胞，也可以选择性的杀灭TAM。
最新的研究表明，曲贝替定（Trabecedin，商品名：Yondelis，主要用于治疗软组织肉瘤罕见病）对NK细胞和TAM有很强的细胞毒性，但是他对淋巴细胞亚细胞群不产生杀伤作用[2]。
肿瘤相关巨噬细胞研究进展
肿瘤相关巨噬细胞研究进展作者：周旋来源：《中国科技博览》2019年第10期[摘要]巨噬细胞作为重要的免疫细胞广泛分布于机体，在固有和适应性免疫反应中发挥着重要的作用。
根据功能和表型的不同，巨噬细胞大致可以被分为M1型和M2型两类。
当受到IFN-r、LPS刺激时，单核细胞则极化为M1型巨噬细胞；当受到Th2型细胞因子如IL-4和IL-13，IL-10和肾上腺皮质激素诱导成M2型。
瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAM）指在肿瘤组织中存在，并且能够广泛浸润和具有免疫抑制、促进肿瘤进展作用的巨噬细胞，这类巨噬细胞被专家们认为是分型中的M2型巨噬细胞。
鉴于肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤演进中起重要作用，其作为潜在抗肿瘤靶点备受关注。
[关键词]肿瘤相关巨噬细胞；细胞因子；巨噬细胞极化；抗肿瘤靶点中图分类号：TP649 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）10-0394-01白细胞亚群的累积是肿瘤发生的标志。
实体瘤的主要成分除了肿瘤细胞之外，包括基质细胞（成纤维细胞和内皮细胞）和白细胞。
TAM是肿瘤微环境中数量最多的免疫细胞。
一些研究表明，当适当刺激时，巨噬细胞有可能在体外杀死肿瘤细胞。
用脂多糖（LPS）和干扰素（IFN）治疗后。
然而，诱导M1型极化的细菌刺激和Th1细胞因子通常不存在于肿瘤部位。
相反，分化的巨噬细胞可能遇到最常使它们向M2型巨噬细胞极化的因子，例如白细胞介素（IL-10）。
多年来，越来越实验证明TAM是肿瘤进展过程中的积极参与者。
此外，在临床研究中，大量肿瘤内巨噬细胞与高血管密度和肿瘤进展相关。
鉴于肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤演进中起重要作用，其作为潜在抗肿瘤靶点备受关注。
1、TAM的起源和募集Rudolf Virchow首次注意到白细胞浸润到恶性组织表明癌症在慢性炎症区域出现，并对TAM的起源，募集，存活和增殖方面进行了研究。
TAM来源于循环的单核细胞，并通过肿瘤衍生的单核细胞趋化因子在肿瘤部位募集，后来被鉴定为趋化因子CCL2 / MCP-1。
细胞自噬在肿瘤中作用的研究进展
Beclin-1 基 因 是 Atg6 的 哺 乳 动 物 同源基因，其作为肿瘤抑制基因通过调 控细胞自噬以维持机体内环境稳定。 Beclin-1 与 UVRAG （UV irradiation resistance-associated tumor suppressor gene）、Vps15 形 成 的 多 蛋 白 复 合 体 对 激 活 Vps34 十 分 重 要 ，其 是 参 与 调 控 自 噬 体双层膜形成过程的关键因子。 另外， 应 用 RNAi 抑 制 Atg5、 Atg10、 Atg12 可 阻止自噬体形成，而应用自噬抑制剂氯 喹 （Chloroquine） 可 阻 止 自 噬 体 与 溶 酶 体 结 合 以 干 预 细 胞 自 噬 过 程 ［2］。 激 素 在 自噬的调控中也起重要作用，胰岛素可 抑制自噬， 而胰高血糖素则促进自噬。 酪 氨 酸 激 酶 受 体 、MAP 激 酶 、钙 也 存 在 于自噬过程错综复杂的调控网络中，但 其 机 制 还 不 甚 清 楚 。 ［10］
细胞自噬调控机制研究
细胞自噬调控机制研究随着生命科学的发展，对于细胞自噬调控机制的研究也越来越深入。
细胞自噬是一种细胞内的降解和再利用方式，主要功能是把细胞内的垃圾、老化的蛋白质等分解成小的蛋白质，供能和新陈代谢需要。
这种结构奇特的细胞降解途径，受到越来越多的关注，它的研究可能会有助于开发新型的治疗方法，例如消除肿瘤细胞，预防脑部退化性疾病，治疗2型糖尿病等。
本文将对于细胞自噬调控机制的研究进展进行一些探讨。
一、细胞自噬的类型细胞自噬有三种类型：巨噬细胞容器介导的自噬( CMA )、微噬细胞介导的自噬 ( microautophagy ) 和膜介导的自噬 (MAC) 。
其中，CMA 是一种特殊的自噬通路。
当需要降解的蛋白质的膜内序列被一个介导分子 HSC70 定位到赤霉素酰化酶的表面时，HSC70 就会招募 LAMP2A。
LAMP2A 会形成开放的孔道使需要降解的蛋白质进入溶酶体。
与 CMA 不同，m icroautophagy 是一种非膜介导的细胞激活自噬，其中大量垃圾为通过内胞质过程在线粒体内聚。
二、细胞自噬的调控机制细胞自噬的调控机制非常复杂，其中核酸药物、蛋白质修饰、小的非编码 RNA、磷酸酸化、CLEC16A、Numb 以及肿瘤抑制因子等因素均可以调节自噬。
下面我们介绍一些关键的细胞自噬调控机制。
1. 基因调控自噬活性的调控有许多大量的基因调控，其中最为重要的是歧化相关基因 8 ( ATG8)。
它可以被脯氨酸酶和 E1 自噬酵素活化，成为后续的自噬反应物，并调节了细胞自噬过程。
2. 感受器调控目前已知的自噬负性调控感受器有 mTORC1、PI3K、Akt、AMPK 和 MAPK 这些自噬蛋白质与ATG 1 功能上最为相似，因为它们部分调节自噬的信号通路，如 AMPK 和 mTORC1 对于自噬的调节作用已经被证实。
3. 信号转导及其过程的调节在细胞自噬过程中，信号传导是一个重要的环节。
PINK1 、PARKIN 、 VPS34 等被证实参与自噬的调节过程中。
肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤中作用的研究进展
肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤中作用的研究进展肿瘤相关巨噬细胞（TAM）主要来源于血液中的单核细胞，在肿瘤中浸润，是构成肿瘤微环境（TME）的重要免疫细胞，参与调控肿瘤的多种复杂免疫反应，其数量与患者的预后密切相关[1],所以靶向作用TAM很有可能成为治疗肿瘤的新策略。
1 TAM的来源与募集TAM有两个主要来源，大部分TAM来源于外周血单核细胞（MDMS）,这些细胞作为未成熟的单核细胞前体从骨髓中释放出来，在血液中循环，并迁移到不同的组织中分化[2];还有很少一部分TAM来源于卵黄囊，并在特定组织定植的巨噬细胞（TRM）,不同来源的TAM在功能和作用上的差别尚未明确[3]。
肿瘤细胞和基质细胞可以分泌多种细胞因子和趋化因子，这些因子可将巨噬细胞募集到肿瘤细胞周围。
巨噬细胞具有高度异质性，当其被招募迁移至肿瘤间充质中后，可以通过改变自身的表型，来适应它们所处的微环境。
现已明确起募集作用的主要因子有CC・趋化因子配体-2（CC1-2）、CC1-3、CC14CC1-5、CC1・7、Ce1-8、CC1-9、CC13、CC1-14、CC1-18、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素4（∣1-4）、I1/O、I1-13、脂多糖、干扰素Y（IFN-γ）、转录生长因子B（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子。
（TNF-α）、血小板源生长因子（PDGF）等。
Hamnton［4］的研究说明，起募集作用的M-CSF,又称集落刺激因子1（CSF-1）,是将巨噬细胞募集并极化成TAM的主要因子。
李颜君等［5］认为，M-CSF 与其受体（M-CSFR）结合，继而启动RAS、MAPK.PI3K、SATA、JAK等信号通路，发挥募集巨噬细胞的作用。
已有研究证实，在多种肿瘤模型中使用针对M-CSF的阻断剂单克隆抗体（MAb）阻断M-CSF/M-CSFR向TAM的信号传递时，TAM 数量显著减少［6］。
硒纳米颗粒的合成、安全性、作用及其机制的研究进展
网络出版时间：２０２３－０３－１００９：００：１４ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３０３０８．１８０７．００２．ｈｔｍｌ硒纳米颗粒的合成、安全性、作用及其机制的研究进展石廷玉１，２，３，４，何彩林１，黄 胜１，２，３，刘 绪１，２，３，王嘉军１（湖北民族大学１．医学部、２．生物资源保护与利用湖北省重点实验室、３．硒科学与产业研究院，湖北恩施 ４４５０００；４．中国科学院武汉病毒研究所农业与环境微生物重点实验室，湖北武汉 ４３００７１）ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２１１２０６３文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０３－０４０６－０８中国图书分类号：Ｒ３１８；Ｒ３２９ ２５；Ｒ３９２；Ｒ９１６ ３；Ｒ９７８；Ｒ９７９ 摘要：硒作为必不可少的微量元素，在抗氧化和维持各种代谢过程中的氧化还原稳态方面起到非常重要的作用。
随着纳米技术的发展，硒纳米颗粒（ｓｅｌｅｎｉｕｍｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ＳｅＮＰｓ）由于其低毒性、易降解和高药效而成为极具潜力的生物医学药物。
由于具有激活凋亡或自噬和调节活性氧产生的能力，ＳｅＮＰｓ广泛用于抗癌治疗和病原菌的杀灭或清除。
另外，ＳｅＮＰｓ具有极好的稳定性和药物的包装能力，而成为一种有效的纳米载体，用于抗癌、抗炎和抗感染治疗。
有趣的是，ＳｅＮＰｓ在免疫调节方面的重要作用（如巨噬细胞和Ｔ效应细胞的活化），为抗癌和抗感染治疗提供了新的纳收稿日期：２０２２－０９－２１，修回日期：２０２２－１２－１８基金项目：国家自然科学青年基金资助项目（Ｎｏ８１８０１９７９）；国家自然科学基金地区基金资助项目（Ｎｏ３２１６０１４１）；湖北省自然科学基金青年基金资助项目（Ｎｏ２１９ＣＦＢ３５８）；生物资源保护与利用湖北省重点实验室资助项目（ＮｏＰＴ０１２２０９）作者简介：石廷玉（１９８３－），男，博士，讲师，硕士生导师，研究方向：病原微生物学，中药药理学，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｓｈｉｔｉｎｇｙｕ１９８＠１２６．ｃｏｍ米－免疫协调治疗策略。
肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤耐药及治疗研究进展
肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤耐药及治疗研究进展摘要：肿瘤耐药是肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）相互作用的结果。
TME中含有多种基质细胞，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是其主要组成部分。
作为具有可塑性的异质性群体，TME中的巨噬细胞在成熟分化过程中通过两种不同的激活途径呈现两种极化状态，即经典活化型（M1型）和替代活化型（M2型），其中M2型TAMs被认为在肿瘤耐药与疾病进展过程中发挥关键作用，预示着总生存期的缩减和不良预后。
关键词：肿瘤；巨噬细胞；肿瘤耐药；治疗一、TAM分型与肿瘤耐药的关系在化疗药物方面， M2型TAM促进了胃癌对顺铂的耐药性并揭示了其潜在机制。
他们通过微RNA（microRNA，miRNA）表型分析和M2型细胞裂解液成分分析，发现二者中外泌体miR21水平显著升高。
功能性研究表明，外泌体miR21可以直接从巨噬细胞转移到胃癌细胞，进而抑制细胞凋亡，并通过下调同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）而增强磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路。
Jagged1-Notch通路在芳香化酶抑制剂耐药的乳腺癌细胞中表达增高，进而调控TAM向M2型转换。
在靶向治疗药物方面，在成胶质细胞瘤体外实验中表现突出的多靶点酪氨酸激酶抑制剂多韦替尼和瓦他拉尼，在体内实验中的抗肿瘤效果甚微，这可能归因于肿瘤微环境导致耐药的产生。
在联合应用CSF-1受体（CSF-1receptor，CSF-1R）抑制剂后可提高疗效。
巨噬细胞的分化和存活依赖于CSF-1，利用CSF-1R抑制剂靶向TAM可以在一些肿瘤中实现延缓肿瘤生长的作用。
这一作用的实现不依赖于减少TAM负荷，而是下调M2型相关基因如mrc1，stab1和ccl22的水平，促进TAM向M1型分化，提高T细胞攻击肿瘤的免疫功能。
二、TAM增强肿瘤细胞抵抗与肿瘤耐药的关系在非小细胞肺癌中活化的M2型TAM可以使癌细胞多药耐药相关蛋白1表达增加，从而参与肺癌化疗耐药，其可能的作用机制是TAM分泌TNF-α诱导NF-κB激活，促使肺癌细胞建立快速防御机制，导致细胞凋亡耐受，从而介导多药耐药。
靶向肿瘤相关巨噬细胞的药物研究
通信作者及指导教师：赵晓寅，女，博士，讲师，主要从事细胞与分子 免 疫 方 面 的 研 究 ，E-mail：zhaoxiaoyin@zjut. edu. cn。
部位，并分化为具有特定表型和功能的巨噬细胞， 这类具有促肿瘤作用的巨噬细胞被称为 TAMs［11］。 恶 性 肿 瘤 中 ，TAMs 可 分 泌 基 质 金 属 蛋 白 酶 （MMPs）、表皮生长因子（EGF）和 IL-6 等可溶性细胞 因子和炎症介质，参与基质降解和侵袭、肿瘤血管 生成，促进肿瘤细胞转化为干细胞样细胞，从而促 进肿瘤生长、转移和复发 。 ［12-13］ 同时，TAMs 还可分 泌免疫抑制因子（IL-10、TGF-β）及特定的趋化因子 （CCL17、CCL22），抑制 CD8+T 细胞等肿瘤抗原特异 性 T 细胞免疫应答，并促进调节性 T 细胞（regulatory T cells，Tregs）募集，影响肿瘤免疫反应［14-15］。
·1138·
doi：10. 3969/ j. issn. 1000-484X. 2021. 09. 020
靶向肿瘤相关巨噬细胞的药物研究①
中国免疫学杂志 2021 年第 37 卷
钱曼青 吴东梁 赵晓寅 （浙江工业大学，杭州 310014）
中图分类号 R730. 5 文献标志码 A 文章编号 1000-484X（2021）09-1138-06 ［摘 要］ 肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境中重要的肿瘤促进细胞。近年来，随着对 TAMs 参与肿瘤进展机制 的深入了解，靶向 TAMs 的治疗药物研究日益增多。目前，靶向 TAMs 的药物研发策略主要包括：阻断 TAMs 在肿瘤部位的募 集、消除 TAMs、抑制巨噬细胞向 M2 型极化、将 M2-TAMs 转化为促炎 M1 型巨噬细胞、阻断肿瘤细胞与巨噬细胞相互作用、改善 巨噬细胞功能以及调节免疫抑制微环境。本文就近年靶向 TAMs 的治疗药物研究现状进行综述。 ［关键词］ 肿瘤相关巨噬细胞；肿瘤微环境；靶向药物
基于DNA纳米花的细胞自噬基因沉默用于增敏抗肿瘤化疗
Ｖｏｌ．４１高等学校化学学报Ｎｏ．７２０２０年７月㊀㊀㊀㊀㊀㊀ＣＨＥＭＩＣＡＬＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＨＩＮＥＳＥＵＮＩＶＥＲＳＩＴＩＥＳ㊀㊀㊀㊀㊀㊀１４６１ １４６９ｄｏｉ：１０ ７５０３／ｃｊｃｕ２０２００２４２基于ＤＮＡ纳米花的细胞自噬基因沉默用于增敏抗肿瘤化疗张开翔１，２，刘军杰１，宋巧丽１，王丹钰１，史进进１，张海悦３，李景虹２（１．郑州大学药学院，河南省肿瘤重大疾病靶向治疗与诊断重点实验室，郑州４５０００１；２．清华大学化学系，北京１０００８４；３ 长春工业大学化学与生命科学学院，长春１３００１２）摘要㊀自噬是真核细胞降解蛋白质的重要途径之一，在细胞的更新代谢中起重要作用．肿瘤细胞借助高水平的细胞自噬能够阻断细胞凋亡途径，降低化疗药物的抗肿瘤效果．本文通过设计编码有核酸适配体序列（Ａｐｔａｍｅｒ）和ＤＮＡ酶序列（ＤＮＡｚｙｍｅ）的多功能ＤＮＡ纳米花，利用ＤＮＡ序列可负载化疗药物阿霉素（Ｄｏｘ）的特性，实现了对肿瘤细胞特异靶向的药物递送，并高效沉默肿瘤细胞的自噬相关基因ＡＴＧ５，达到增敏抗肿瘤化疗的效果．通过ＲＴ⁃ＰＣＲ实验验证合成的ＤＮＡ纳米花可以有效剪切肿瘤细胞中自噬相关基因ＡＴＧ５的ｍＲＮＡ；并通过ＤＮＡ纳米花的细胞毒性和细胞凋亡实验研究了其对肿瘤细胞系ＭＣＦ⁃７的靶向治疗作用，结果显示该多功能ＤＮＡ纳米花在增敏抗肿瘤化疗方面具有明显优势．关键词㊀ＤＮＡ纳米花；药物递送；自噬；ＤＮＡ酶；抗肿瘤化疗中图分类号㊀Ｏ６５１；Ｏ６３６ ９㊀㊀㊀㊀文献标志码㊀Ａ收稿日期：２０２０⁃０４⁃２９．网络出版日期：２０２０⁃０６⁃１５．基金项目：国家自然科学基金（批准号：２１９０４１１９，２１６２１００３）和河南省科技攻关项目（批准号：１９２１０２３１０１４７）资助．联系人简介：李景虹，男，博士，教授，中国科学院院士，主要从事生物传感与分析化学研究．Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｈｌｉ＠ｍａｉｌ．ｔｓｉｎｇｈｕａ．ｅｄｕ．ｃｎ张海悦，女，博士，教授，主要从事天然产物研究与开发．Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈｈａｉｙｕｅ＠１６３．ｃｏｍ史进进，男，博士，副教授，主要从事纳米药物设计研究．Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｓｈｉｊｉｎｙｘｙ＠ｚｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ自噬是一种重要的细胞生物学过程，是将受损的细胞器或蛋白质递送到溶酶体中进行降解，在细胞的更新代谢中起重要作用［１，２］．自噬过程对肿瘤细胞的影响根据所处环境的不同有显著区别，基于自噬激活或自噬抑制的肿瘤治疗方法均有报道［３，４］．对抗肿瘤化疗而言，目前已有研究［５ ７］指出，通过抑制肿瘤细胞中的自噬过程可以有效提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，显著增强化疗药物对肿瘤的疗效．因此，本文设计了一种基于ＤＮＡｚｙｍｅ的自噬基因沉默体系，用于辅助增敏抗肿瘤化疗．基于ＤＮＡｚｙｍｅ对目标ｍＲＮＡ高效剪切的基因沉默方法是近年发展起来的一种新型基因沉默策略［８ １０］．经过特殊设计的ＤＮＡｚｙｍｅ对特定的靶标ｍＲＮＡ具有高特异的识别能力和高效的催化切割能力，可以实现循环多轮的催化剪切反应，有效沉默细胞中相关ｍＲＮＡ的功能［１１］．此外，ＤＮＡｚｙｍｅ比ｓｉＲＮＡ具有更高的生物稳定性且合成简单㊁成本较低，目前已作为重要的基因沉默策略用于多种疾病的治疗［１２，１３］．然而，针对特定细胞的高效递送仍是ＤＮＡｚｙｍｅ应用领域面临的重要挑战［１４，１５］．此外，由于ＤＮＡｚｙｍｅ需要特定的辅助因子（如Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋等离子）来发挥剪切作用．因此，在设计递送体系时还需同时考虑辅助因子的共同递送．ＤＮＡ纳米花（ＮＦｓ）是一种球形多孔的ＤＮＡ纳米结构，可以有效解决目前ＤＮＡｚｙｍｅ纳米递送中的成本高㊁生物稳定性低和工艺复杂等问题［１６ ２１］．ＤＮＡ纳米花可通过滚环扩增反应（Ｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉ⁃ｆｉｃａｔｉｏｎ）合成，由高浓度的ＤＮＡ自组装包裹焦磷酸镁内核形成致密的纳米结构，从而高效地形成含有大量功能性核酸序列的纳米载体［２２ ２５］．此外，通过调整反应时间㊁改变模板序列设计等方法，可以有效调整ＤＮＡ纳米花的大小，编码不同功能性的ＤＮＡ单元［２６］．研究［２１，２７ ２９］表明，ＤＮＡ纳米花具有显著２６４１高等学校化学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Ｖｏｌ．４１㊀的抗酶切性能，在血清中可以稳定存在，且纳米花中的ＤＮＡ序列结构可以有效结合抗肿瘤药物阿霉素（Ｄｏｘ），用于肿瘤细胞特异性的药物递送．更重要的是，ＤＮＡ纳米花合成过程中内核包裹的焦磷酸镁会在细胞的溶酶体酸性环境下崩解，诱导溶酶体逃逸［１６］；而释放的Ｍｇ２＋可以作为ＤＮＡｚｙｍｅ的辅助因子，用于激活ＤＮＡｚｙｍｅ对目标ｍＲＮＡ的剪切能力［３０，３１］．本文通过滚环扩增反应制备了粒径约为２００ｎｍ呈花状球形结构的ＤＮＡ纳米花．该ＤＮＡ纳米花编码了ＡＳ１４１１核酸适体序列，ＡＴＧ５ＤＮＡｚｙｍｅ序列和Ｄｏｘ结合序列（ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５／ＤＯＸ），且在溶酶体的微酸性环境下表现出响应性崩解的特征，能够释放ＤＮＡｚｙｍｅ的辅助因子Ｍｇ２＋，实现高效的ＤＮＡｚｙｍｅ激活，剪切肿瘤细胞内的自噬相关基因ＡＴＧ５．被剪切后的ＡＴＧ５ｍＲＮＡ不能被完整翻译而失去诱导细胞自噬的相关功能，用于增敏Ｄｏｘ对人乳腺癌细胞系ＭＣＦ⁃７的细胞抑制效果，实验原理如Ｓｃｈｅｍｅ１所示．Ｓｃｈｅｍｅ１㊀ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆＤＮＡｎａｎｏｆｌｏｗｅｒｆｏｒａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄｅｎｈａｎｃｅｄａｎｔｉｔｕｍｏｒｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙＤＮＡｎａｎｏｆｌｏｗｅｒｓ（ＮＦｓ）ｗｅｒｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂｙｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ），ｅｎｃｏｄｉｎｇ３ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＤＮＡｚｙｍｅｆｏｒＡＴＧ５ｍＲＮＡ，ＡＳ１４１１ａｐｔａｍｅｒａｎｄＤｏｘｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓ（ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５／ＤＯＸ）．ＮＦｓｃａｎｂｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｕｐｔａｋｅｎｂｙｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ，ｄｅｇｒａｄｅｄｂｙｔｈｅａｃｉｄｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｌｙｓｏｓｏｍｅａｎｄｒｅｌｅａｓｅＭｇ２＋ｔｏｔｒｉｇｇｅｒｔｈｅｃｌｅａｖａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＤＮＡｚｙｍｅ．ＴｈｅａｃｔｉｖａｔｅｄＤＮＡｚｙｍｅｓｗｏｕｌｄｃｌｅａｖｅＡＴＧ５ｍＲＮＡｉｎｓｉｄｅｃｅｌｌｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔａｕｔｏｐｈａｇｙｐｒｏｃｅｓｓ，ｗｈｉｃｈｌｅａｄｔｏｅｎｈａｎｃｉｎｇａｎｔｉｔｕｍｏｒｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．１㊀实验部分１．１㊀试剂与仪器寡核苷酸由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表１；连接酶Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ，聚合酶Ｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｄＮＴＰ混合溶液和磷酸激酶ＰＮＫ购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；盐酸阿霉素（纯度＞９８％）购自大连美仑生物技术公司；其它试剂均购自北京索莱宝科技有限公司．Ｔａｂｌｅ１㊀ＳｅｑｕｅｎｃｅｏｆｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳａｍｐｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅ（５ᶄ⁃３ᶄ）ＡＴＧ５ＤＮＡｚｙｍｅ１ＣＡＡＴＣＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧ５ＤＮＡｚｙｍｅ２ＴＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＴＴＧＡＴＧ５ＦＦＡＭ⁃ＣＣＡＧＡＧＴＴＧＣＴＴＧＴＧＡＴＣＴＴＡＴＧ５ＱＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＴＣＣＣＡ⁃ＢＨＱＡＴＧ５ｓｕｂｓｔｒａｔｅＡＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＡＡＣＴＣＴＧＧ／ｒＡ／ｒＵ／ＧＧＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＡＧＣｉｒｃｌｅＣＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＴＣＴＧＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣＰｒｉｍｅｒＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＲａｎｄｏｍｃｉｒｃｌｅＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＡＧＧＣＴＴＴＧＡＴＡＡＴＡＡＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＣＲａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｒＧＡＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＴ㊀㊀荧光光谱分析采用ＲＦ⁃５３０１ＰＣ型荧光分光光度计（日本岛津公司）；ＭＥＲＬＩＮＣｏｍｐａｃｔ型场发射扫描电子显微镜（德国Ｚｅｉｓｓ公司）；实时荧光ＰＣＲ数据由Ｔ１００ＴＭＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ型ＰＣＲ仪（美国Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ公司）测定；细胞成像照片用ＺｅｉｓｓＬＳＭ８００型激光共聚焦显微镜（德国Ｚｅｉｓｓ公司）拍摄．１．２㊀ＤＮＡ纳米花的合成１．２．１㊀ＤＮＡ磷酸化反应㊀将环模板链（Ｃｉｒｃｌｅ，终浓度１０μｍｏｌ／Ｌ）㊁Ｔ４多聚核苷酸激酶（ＰＮＫ酶，终浓度２ ５Ｕ／μＬ）㊁ＡＴＰ（终浓度１ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ＝７ ０）和灭菌双蒸水混合，在Ｔ４多核苷酸激酶反应缓冲液（１ˑ）中于３７ħ反应１ｈ．１．２．２㊀成环连接反应㊀将环模板链（终浓度为１μｍｏｌ／Ｌ）和引物链（Ｐｒｉｍｅｒ，终浓度１μｍｏｌ／Ｌ，作为连接模板）混合，在核酸连接酶缓冲液（１ˑ）中于９５ħ加热５ｍｉｎ，静置１ｈ逐渐冷却至室温．将退火产物与Ｔ４ＤＮＡ连接酶（３ ６Ｕ／μＬ）在３７ħ下反应３ｈ，生成环化ＤＮＡ产物．１．２．３㊀滚环扩增反应㊀将环化ＤＮＡ产物（０ ５μｍｏｌ／Ｌ）与Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶（２Ｕ／μＬ）和ｄＮＴＰ混合液（１ｍｍｏｌ／Ｌ）在Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶反应缓冲液（１ˑ）中于３７ħ反应若干小时后，再于９０ħ反应１０ｍｉｎ，酶失活使反应终止．以１２０００ｒ／ｍｉｎ速率离心２０ｍｉｎ，洗涤ＤＮＡ纳米花３次，于－２０ħ冰箱中保存备用．使用前通过轻微涡旋或超声２０ｍｉｎ分散ＤＮＡ纳米花．利用琼脂糖凝胶电泳㊁动态光散射（ＤＬＳ）㊁扫描电子显微镜（ＳＥＭ）及透射电子显微镜（ＴＥＭ）表征了合成的ＤＮＡ纳米花的尺寸和形貌；利用Ｘ射线能谱（ＥＤＳ）和质谱（ＩＣＰ⁃ＭＳ）分析了其元素组成和不同ｐＨ条件下的Ｍｇ２＋释放量．１．３㊀ＤＮＡ纳米花剪切ＡＴＧ５底物能力的表征设计了２种以Ｍｇ２＋作为辅助因子的核酶（ＤＮＡｚｙｍｅ）用于ＡＴＧ５基因沉默，首先通过体外核酸检测实验表征了２种ＤＮＡ酶的剪切能力．在２００μＬ反应体系中（ＤＰＢＳ缓冲液，含１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋），将２种ＡＴＧ５ＤＮＡｚｙｍｅ（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）分别与底物ＡＴＧ５（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）在３７ħ下共孵育５ｈ，加入ＡＴＧ５Ｆ（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）和ＡＴＧ５Ｑ（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）混合孵育３０ｍｉｎ后，移入９６孔板中，通过检测ＦＡＭ荧光基团的荧光强度评估ＤＮＡ酶对底物的剪切效率．此外，还利用变性ＰＡＧＥ胶分析了不同ｐＨ值条件下ＤＮＡ纳米花对底物的剪切效率．１．４㊀ＤＮＡ纳米花负载化疗药物阿霉素（Ｄｏｘ）及ｐＨ响应释放的表征将一系列浓度的ＤＮＡ纳米花溶液超声分散后，加入相同浓度的Ｄｏｘ并孵育一段时间，测试其在５９５ｎｍ处的荧光强度Ｉ．将不存在ＤＮＡ纳米花时Ｄｏｘ（１００μｍｏｌ／Ｌ）的荧光强度定义为Ｉ０．存在ＤＮＡ纳米花时，Ｄｏｘ的荧光强度降低；将荧光强度降低到平台值时对应的ＤＮＡ纳米花浓度用于计算Ｄｏｘ负载能力，该最小荧光值定义为Ｉｆ，药物负载率计算式为［（Ｉ－Ｉｆ）／（Ｉ０－Ｉｆ）］ˑ１００％．将ＤＮＡ纳米花与Ｄｏｘ（１００μｍｏｌ／Ｌ）加入ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ＝７ ４）中混合．药物释放实验分为４组，分别为ｐＨ＝７ ４，ｐＨ＝６ ５，ｐＨ７ ４＋ＤＮＡｓｅＩ（５Ｕ／ｍＬ）和ｐＨ５ ０＋ＤＮＡｓｅＩ（５Ｕ／ｍＬ）．此外，还考察了负载阿霉素的ＤＮＡ纳米花对ＡＴＧ５底物的剪切能力．１．５㊀细胞实验利用Ｄｏｘ的荧光特性（激发波长为４８０ｎｍ，发射波长为５９５ｎｍ），借助共聚焦显微镜和流式细胞仪分析了人乳腺癌细胞系ＭＣＦ⁃７对ＤＮＡ纳米花的摄取能力．实验分为ＤＯＸ组㊁ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５／ＤＯＸ组和ＲａｎｄｏｍＮＦｓ／ＤＯＸ组．利用ＲＴ⁃ＰＣＲ分析了ＤＮＡ纳米花对ＭＣＦ⁃７细胞中ＡＴＧ５基因的沉默效３６４１㊀Ｎｏ．７㊀张开翔等：基于ＤＮＡ纳米花的细胞自噬基因沉默用于增敏抗肿瘤化疗果．使用ＣｕｓｔｏｍｇｅｎｅｑＲＴ⁃ＰＣＲ定量试剂盒（上海ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ公司）进行测试．首先，利用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取各组细胞中的总ＲＮＡ，提取后每组均使用Ｎａｎｏｄｒｏｐ对ＲＮＡ总浓度进行定量，并用ＤＥＰＣ水稀释为相同浓度（２００ｎｇ／μＬ）；之后利用逆转录试剂对ＲＮＡ进行逆转录，得到ｃＤＮＡ后利用ＰＣＲ方法进行扩增．３０μＬ的反应体系中包含１５μＬ２ＸＰＣＲｓｕｐｅｒｍｉｘ，１ ５μＬｐｒｉｍｅｒｓ，０ ６μＬ５０ＸＲＯＸｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄｙｅ，３μＬ逆转录得到的ｃＤＮＡ和１０μＬ水．每组反应均重复３次．ＲＴ⁃ＰＣＲ反应条件：９５ħ／３ｍｉｎ，再重复３５次９５ħ／３０ｓ，５８ħ／３０ｓ，７２ħ／３０ｓ的循环．每组样品中ｍＲＮＡ的表达水平以ＧＡＰＤＨ为标准归一化．此外，还利用ＣＣＫ⁃８试剂分析了ＤＯＸ，ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５／ＤＯＸ，ＲａｎｄｏｍＮＦｓ／ＤＯＸ，ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５及ＲａｎｄｏｍＮＦｓ溶液（ＤＯＸ：３２ｍｍｏｌ／Ｌ，ＮＦｓ：１６０ｎｍｏｌ／Ｌ）对ＭＣＦ⁃７细胞的毒性，并利用ＡｎｎｅｘｉｎＶ⁃ＦＩＴＣ和ＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ染色结合流式细胞仪分析了细胞凋亡情况．Ｆｉｇ．１㊀ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄＤＮＡｎａｎｏｆｌｏｗｅｒｓ（Ａ）ＡｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄＤＮＡｎａｎｏｆｌｏｗｅｒ．Ｌａｎｅ１：ＤＮＡｌａｄｄｅｒ，ｌａｎｅ２：ｌｉｇａｔｅｄＤＮＡｃｉｒｃｌｅ，ｌａｎｅ３：ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄＮＦｓ；（Ｂ）ＤＬＳａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｉｚｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＮＦｓ；（Ｃ）ＺｅｔａｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＮＦｓ；（Ｄ）ＳＥＭｉｍａｇｅｏｆＮＦｓ；（Ｅ）ＴＥＭｉｍａ⁃ｇｉｎｇｏｆＮＦｓ；（Ｆ）ＥＤＳｅｌｅｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ；（Ｇ）ＩＣＰ⁃ＭＳａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｌｅａｓｅｄＭｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＮＦｓａｔｐＨ７ ４，６ ０ａｎｄ４ ５．２㊀结果与讨论２．１㊀ＤＮＡ纳米花的表征ＤＮＡ纳米花（ＮＦｓ）的表征结果如图１所示．由凝胶电泳实验结果［图１（Ａ）］可见，合成的ＮＦｓ（Ｌａｎｅ３）因分子量较大，在凝胶上无明显移动，基本处于加样处．而环化连接后的ＤＮＡ（Ｌａｎｅ２）则会在琼脂糖胶上较快移动，初步证实经ＲＣＡ反应合成了尺寸较大的ＤＮＡ产物．利用动态光散射（ＤＬＳ）方法分析了合成的ＤＮＡ纳米花的平均粒径和Ｚｅｔａ电位，由图１（Ｂ）和（Ｃ）可见，ＮＦｓ的平均水合粒径约为２００ｎｍ，平均电位约为－３５ ４ｍＶ，与ＤＮＡ本身携带负电荷的性质一致．ＳＥＭ照片［图１（Ｄ）］和ＴＥＭ照片［图１（Ｅ）］显示，ＮＦｓ表面呈花瓣状，粒径约２００ｎｍ，分布均匀，证明ＤＮＡ纳米花已成功制备．为更好地分析ＤＮＡ纳米花的元素组成和结构，利用ＥＤＳ能谱对其进行了元素分析［图１（Ｆ）］，发现纳米花中存在Ｎ，Ｏ，Ｍｇ和Ｐ等元素，这与文献［３０］报道的ＤＮＡ纳米花包含焦磷酸镁的表征结果一致．实验中分析了ＮＦｓ在不同ｐＨ条件下Ｍｇ２＋的释放情况［图１（Ｇ）］．当ｐＨ＝７ ４时，Ｍｇ２＋的释放量约３０ ８μｇ／ｍＬ；当ｐＨ＝６ ０和４ ５时，Ｍｇ２＋释放量分别约为２０４ ７和３１７ ８μｇ／ｍＬ．此结果表明，随着酸性增强，ＮＦｓ对Ｍｇ２＋的释放量显著增加，且在溶酶体的酸性条件下能大量释放Ｍｇ２＋，可作为ＤＮＡｚｙｍｅ的辅助因子用于增强ＤＮＡｚｙｍｅ在细胞中的基因沉默效果．４６４１高等学校化学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Ｖｏｌ．４１㊀２．２㊀ＤＮＡ纳米花的ＡＴＧ５ｍＲＮＡ剪切能力为分析ＤＮＡ纳米花中编码的ＤＮＡ酶对ＡＴＧ５ｍＲＮＡ的剪切能力，首先采用荧光和凝胶电泳的体外表征方法分析了ＮＦｓ对底物的剪切能力．由图２（Ａ）可见，编码了ＤＮＡｚｙｍｅ的纳米花对底物的剪切能力比相同浓度的ＤＮＡｚｙｍｅ明显提高，这主要是由于ＤＮＡ纳米花携带了诸多ＤＮＡｚｙｍｅ的重复序列，因此，在较低的浓度（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）下仍能高效率地剪切底物．此外，由之前的讨论可知，ＤＮＡｚｙｍｅ的剪切催化活性高度依赖Ｍｇ２＋，然而细胞中游离Ｍｇ２＋离子的浓度较低，难以促进ＤＮＡｚｙｍｅ催化结构域的形成．如图２（Ｂ）所示，在酸性条件下，当反应体系中不存在Ｍｇ２＋时，单纯的ＤＮＡｚｙｍｅ基本无剪切能力，而ＮＦｓ则因自身可以释放Ｍｇ２＋，故对底物仍有较高的剪切效率．本文使用的ＤＮＡ纳米花浓度与游离的ＤＮＡｚｙｍｅ浓度相同．除荧光方法外，本文还利用变性ＰＡＧＥ凝胶电泳分析了不同条件下ＮＦｓ对底物的剪切情况．由图２（Ｃ）可见，不同ｐＨ条件下ＮＦｓ在凝胶电泳中无明显移动．而随着反应时间的增加，ＮＦｓ对底物的剪切逐渐增多，剪切产物条带的强度逐渐增强．由于ＤＮＡ纳米花的结构通常被认为是ＤＮＡ链包裹焦磷酸镁，而焦磷酸镁会在酸性环境下释放Ｍｇ２＋，酸性越强Ｍｇ２＋释放越多［３０］．因此，还考察了不同Ｍｇ２＋浓度对应的ＤＮＡｚｙｍｅ的剪切效率．由图２（Ｄ）可见，当反应体系中不存在Ｍｇ２＋时，ＤＮＡｚｙｍｅ对底物几乎无剪切活性；当Ｍｇ２＋浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ时，反应体系中的ＤＮＡｚｙｍｅ比５ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋存在时具有更高的剪切效率．Ｆｉｇ．２㊀ＤＮＡｚｙｍｅｃｌｅａｖａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＮＦｓ（Ａ）ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆＮＦｓａｎｄＤＮＡｚｙｍｅｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｌａｒｒａｔｉｏｓ；（Ｂ）ｃｌｅａｖａｇｅａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈｏｕｔＭｇ２＋；（Ｃ）ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｌｅａｖ⁃ａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｖａｌｕｅｓａｎｄＮＦｓ／ｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｏｌａｒｒａｔｉｏｓ．Ｌｅｆｔｌａｎｅ：ＡＴＧ５ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｔｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓｃｏｎｓｔａｎｔｌｙ４００ｎｍｏｌ／Ｌ．Ｔｉｍｅｒａｎｇｅｓｉｎ（Ｃ）ｗｅｒｅ１０，１２０ａｎｄ３００ｍｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；（Ｄ）ｃｌｅａｖａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＤＮＡｚｙｍｅｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＭｇ２＋．２．３㊀ＤＮＡ纳米花的阿霉素（Ｄｏｘ）负载和释放性能阿霉素分子能高效插入ＤＮＡ纳米花中的核酸序列，可被ＮＦｓ高效负载［３２，３３］．由图３（Ａ）可见，固定Ｄｏｘ浓度为１００μｍｏｌ／Ｌ时，随着ＮＦｓ浓度逐渐增大，其对Ｄｏｘ的负载率也逐渐提高．当ＮＦｓ浓度为２５０ｎｍｏｌ／Ｌ时，计算所得负载率约为９７ ４％．由药物释放实验结果［图３（Ｂ）］可见，包载了Ｄｏｘ的ＮＦｓ在正常生理条件下比较稳定，阿霉素４８ｈ的释放量仅为１９ ７％；而在ｐＨ＝５ ０的环境下，阿霉素４８ｈ的释放量为９０ １％，与ＤＮａｓｅ处理的对照组药物的释放效率相当，证明其具有ｐＨ敏感的药物释放特性，有望减少ＮＦｓ对正常组织的毒副作用．此外，还分析了负载Ｄｏｘ后的ＮＦｓ对ＡＴＧ５ｍＲＮＡ的剪切效５６４１㊀Ｎｏ．７㊀张开翔等：基于ＤＮＡ纳米花的细胞自噬基因沉默用于增敏抗肿瘤化疗率，结果［图３（Ｃ）］表明，负载了Ｄｏｘ的ＮＦｓ仍然可以高效剪切ＡＴＧ５ｍＲＮＡ，剪切效率与未负载Ｄｏｘ组无明显差异．Ｆｉｇ．３㊀ＤｏｘｌｏａｄｉｎｇａｎｄｒｅｌｅａｓｅｃａｐａｃｉｔｙｏｆＮＦｓ（Ａ）１００μｍｏｌ／ＬＤｏｘｗａｓｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＮＦｓ；（Ｂ）ｐＨａｎｄＤＮａｓｅｔｒｉｇｇｅｒｅｄｒｅｌｅａｓｅｏｆＤｏｘｆｒｏｍＮＦｓ；（Ｃ）ＤＮＡｚｙｍｅｃｌｅａｖａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＮＦｓｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＤｏｘｌｏａｄｉｎｇ．２．４㊀ＤＮＡ纳米花的细胞摄取过程ＤＮＡ纳米花中编码的ＡＳ１４１１核酸适配体可以介导高效的细胞内吞［３４，３５］．为进一步研究ＮＦｓ识别靶细胞的特异性和Ｄｏｘ递送能力，采用荧光共聚焦显微镜观察了ＭＣＦ⁃７细胞对ＤＮＡ纳米花的摄取过程［图４（Ａ）］．由荧光成像结果可见，ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５／Ｄｏｘ在ＭＣＦ⁃７细胞内的荧光强度与游离Ｄｏｘ组相当，主要集中在细胞核部位；而作为对照组，ＲａｎｄｏｍＮＦｓ／ＤＯＸ的荧光强度很低．这主要是因为ＮＦｓ内编码的ＡＳ１４１１适配体可以特异性结合肿瘤细胞表面高表达的核仁素蛋白，而对非恶性肿瘤细胞几乎无影响．此外，使用流式细胞仪表征了ＭＣＦ⁃７细胞对ＤＮＡ纳米花的摄取情况［图４（Ｂ）］，实验结果表明，ＭＣＦ⁃７对游离Ｄｏｘ的摄取速度最快，４ｈ的摄取率为９９ ７３％，ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５／ＤＯＸ在８ｈ时的摄取率为９９ ５５％，而ＲａｎｄｏｍＮＦｓ／Ｄｏｘ的摄取率仅为３０９４％．Ｆｉｇ．４㊀ＴｕｍｏｒｃｅｌｌｔａｒｇｅｔｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｏｆＮＦｓ（Ａ）ＣｏｎｆｏｃａｌｉｍａｇｉｎｇｏｆＭＣＦ⁃７ｃｅｌｌｓｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈＤｏｘ，ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５／ＤｏｘａｎｄＲａｎｄｏｍＮＦｓ／Ｄｏｘ；（Ｂ）ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆＭＣＦ⁃７ｃｅｌｌｓｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈＤｏｘ，ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５／ＤｏｘａｎｄＲａｎｄｏｍＮＦｓ／Ｄｏｘ．６６４１高等学校化学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Ｖｏｌ．４１㊀２．５㊀ＤＮＡ纳米花的细胞自噬抑制和增敏抗肿瘤化疗性能为研究ＮＦｓ递送至ＭＣＦ⁃７细胞后能否抑制自噬相关基因ＡＴＧ５的表达，利用ＲＴ⁃ＰＣＲ方法检测了不同ＮＦｓ处理后的细胞中ＡＴＧ５的表达量．由图５（Ａ）可见，与空白对照组相比，ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５处理后的ＭＣＦ⁃７细胞中ＡＴＧ５的表达量显著降低，而ＲａｎｄｏｍＮＦｓ阴性对照组细胞中的ＡＴＧ５含量无显著变化，表明编码ＤＮＡｚｙｍｅ的ＮＦｓ在ＭＣＦ⁃７细胞内能有效剪切ＡＴＧ５ｍＲＮＡ．此外，通过ＣＣＫ⁃８实验分析了不同ＮＦｓ组对ＭＣＦ⁃７细胞的抑制作用［图５（Ｂ）］，结果表明，ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５／Ｄｏｘ组对ＭＣＦ⁃７细胞的抑制率显著高于其它组，与游离阿霉素相当．因为ＤＮＡ纳米花本身结合Ｄｏｘ的特性会影响阿霉素对肿瘤细胞的抑制能力，以上结果证实了基于ＤＮＡ纳米花的自噬抑制策略有望增强抗肿瘤化疗药物的疗效．Ｆｉｇ．５㊀ＣｅｌｌｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＮＦｓ（Ａ）ＲＴ⁃ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｏｆＡＴＧ５ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎＭＣＦ⁃７ｃｅｌｌｓｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５ｏｒＲａｎｄｏｍＮＦｓ．ａ．Ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ；ｂ．ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５；ｃ．ＲａｎｄｏｍＮＦｓ；（Ｂ）ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｔｅｓｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＮＦｓｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈＭＣＦ⁃７ｃｅｌｌｓｆｏｒ２４ｈ．ａ．Ｄｏｘ；ｂ．ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５／Ｄｏｘ；ｃ．ＲａｎｄｏｍＮＦｓ／Ｄｏｘ；ｄ．ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５；ＲａｎｄｏｍＮＦｓ；（Ｃ）ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｑｕａｎｔｉ⁃ｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｔｉｃＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩｓｔａｉｎｅｄＭＣＦ⁃７ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔＮＦｓ．实验中还利用ＡｎｎｅｘｉｎＶ⁃ＦＩＴＣ和ＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ染色结合流式细胞仪方法分析了各类ＮＦｓ诱导ＭＣＦ⁃７细胞的凋亡情况．实验结果［图５（Ｃ）］表明，ＮＦｓ／ＡＳ１４１１／ＡＴＧ５／Ｄｏｘ组诱导的细胞凋亡率最高，显著高于ＲａｎｄｏｍＮＦｓ／ＤＯＸ组，表明所设计的多功能ＤＮＡ纳米花结构凭借其高特异的肿瘤细胞识别７６４１㊀Ｎｏ．７㊀张开翔等：基于ＤＮＡ纳米花的细胞自噬基因沉默用于增敏抗肿瘤化疗８６４１高等学校化学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Ｖｏｌ．４１㊀能力及高效的细胞自噬相关基因沉默能力，可以显著增敏抗肿瘤化疗效果，为生物医学应用和癌症治疗研究提供了实验基础．３㊀结㊀㊀论设计了一种新型的多功能ＤＮＡ纳米花结构，可以实现基于核酸适体的肿瘤细胞靶向和自噬相关ＡＴＧ５基因沉默用于增敏抗肿瘤化疗．设计合成的ＤＮＡ纳米结构具有如下特点：ＤＮＡ纳米花编码的核酸适配体ＡＳ１４１１可以特异性靶向肿瘤细胞表面高表达的核仁素蛋白，用于高效的靶向药物递送；ＤＮＡ纳米花在细胞溶酶体的酸性环境中可快速释放Ｍｇ２＋，用于激活ＤＮＡｚｙｍｅ的剪切活性；激活后的ＤＮＡｚｙｍｅ序列可以剪切自噬相关基因ＡＴＧ５实现自噬基因沉默，且可以和化疗药物Ｄｏｘ协同作用增敏化疗，促进肿瘤细胞凋亡；通过将Ｄｏｘ嵌入核酸序列的形式显著提高了纳米花的药物负载量．此外，该ＤＮＡ纳米结构具有合成简单㊁生物相容性好，能够通过改变序列设计实现多重功能等优势，在生物医药领域具有巨大的应用潜力．参㊀考㊀文㊀献［１］㊀ＫｏｎｄｏＹ．，ＫａｎｚａｗａＴ．，ＳａｗａｙａＲ．，ＫｏｎｄｏＳ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．，２００５，５（９），７２６ ７３４［２］㊀Ｐｏｉｌｌｅｔ⁃ＰｅｒｅｚＬ．，ＸｉｅＸ．，ＺｈａｎＬ．，ＹａｎｇＹ．，ＳｈａｒｐＤ．Ｗ．，ＨｕＺ．Ｓ．，ＳｕＸ．，ＭａｇａｎｔｉＡ．，ＪｉａｎｇＣ．，ＬｕＷ．，ＺｈｅｎｇＨ．，ＢｏｓｅｎｂｅｒｇＭ．Ｗ．，ＭｅｈｎｅｒｔＪ．Ｍ．，ＧｕｏＪ．Ｙ．，ＬａｔｔｉｍｅＥ．，ＲａｂｉｎｏｗｉｔｚＪ．Ｄ．，ＷｈｉｔｅＥ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１８，５６３（７７３２），５６９ ５７３［３］㊀ＬｅｖｙＪ．Ｍ．Ｍ．，ＴｏｗｅｒｓＣ．Ｇ．，ＴｈｏｒｂｕｒｎＡ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２０１７，１７（９），５２８ ５４２［４］㊀ＡｂｅｄｉｎＭ．Ｊ．，ＷａｎｇＤ．，ＭｃＤｏｎｎｅｌｌＭ．Ａ．，ＬｅｈｍａｎｎＵ．，ＫｅｌｅｋａｒＡ．，ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ．，２００７，１４（３），５００ ５１０［５］㊀ＲｕａｎＳ．，ＸｉｅＲ．，ＱｉｎＬ．，ＹｕＭ．，ＸｉａｏＷ．，ＨｕＣ．，ＹｕＷ．，ＱｉａｎＺ．，ＯｕｙａｎｇＬ．，ＨｅＱ．，ＧａｏＨ．，ＮａｎｏＬｅｔｔ．，２０１９，１９（１１），８３１８ ８３３２［６］㊀ＴｏｒｍｏＤ．，ＣｈｅｃｉｎｓｋａＡ．，Ａｌｏｎｓｏ⁃ＣｕｒｂｅｌｏＤ．，Ｐｅｒｅｚ⁃ＧｕｉｊａｒｒｏＥ．，ＣａｎｏｎＥ．，Ｒｉｖｅｉｒｏ⁃ＦａｌｋｅｎｂａｃｈＥ．，ＣａｌｖｏＴ．Ｇ．，ＬａｒｒｉｂｅｒｅＬ．，ＭｅｇｉａｓＤ．，ＭｕｌｅｒｏＦ．，ＰｉｒｉｓＭ．Ａ．，ＤａｓｈＲ．，ＢａｒｒａｌＰ．Ｍ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ⁃ＰｅｒａｌｔｏＪ．Ｌ．，Ｏｒｔｉｚ⁃ＲｏｍｅｒｏＰ．，ＴｕｔｉｎｇＴ．，ＦｉｓｈｅｒＰ．Ｂ．，ＳｏｅｎｇａｓＭ．Ｓ．，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ，２００９，１６（２），１０３ １１４［７］㊀ＷａｎＸ．Ｍ．，ＺｈｅｎｇＦ．，ＺｈａｎｇＬ．，ＭｉａｏＹ．Ｙ．，ＭａｎＮ．，ＷｅｎＬ．Ｐ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２０１１，１２９（５），１０８７ １０９５［８］㊀ＦａｎＨ．，ＺｈａｏＺ．，ＹａｎＧ．，ＺｈａｎｇＸ．，ＹａｎｇＣ．，ＭｅｎｇＨ．，ＣｈｅｎＺ．，ＬｉｕＨ．，ＴａｎＷ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１５，５４（１６），４８０１ ４８０５［９］㊀ＪｉａｎｇＬ．，ＺｈｏｕＳ．Ｓ．，ＺｈａｎｇＸ．Ｋ．，ＷｕＷ．，ＪｉａｎｇＸ．Ｑ．，ＳｃｉｅｎｃｅＣｈｉｎａ⁃Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１８，６１（１１），１４０４ １４１９［１０］㊀ＷａｎｇＪ．，ＷａｎｇＴ．，Ｃｈｅｍ．Ｊ．ＣｈｉｎｅｓｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ，２０２０，４１（３），３７７ ３８７（王军，王铁．高等学校化学学报，２０２０，４１（３），３７７ ３８７）［１１］㊀ＷａｎｇＨ．，ＣｈｅｎＹ．，ＷａｎｇＨ．，ＬｉｕＸ．，ＺｈｏｕＸ．，ＷａｎｇＦ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１９，５８（２２），７３８０ ７３８４［１２］㊀ＦａｎＨ．，ＺｈａｎｇＸ．，ＬｕＹ．，ＳｃｉｅｎｃｅＣｈｉｎａＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１７，６０（５），５９１ ６０１［１３］㊀ＺｏｕＧ．，ＬｉｕＣ．，ＺｅｎｇＷ．，ＹａｎｇＷ．，ＺｈａｎｇＫ．，ＸｉｅＹ．，ＣｈｅｎＣ．，ＺｈｏｕＸ．，ＣＣＳＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０２０，１（３），５４ ６３［１４］㊀ＺｈｏｕＷ．，ＤｉｎｇＪ．，ＬｉｕＪ．，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，２０１７，７（４），１０１０ １０２５［１５］㊀ＹａｎｇＢ．，ＺｈａｎｇＸ．Ｄ．，ＬｉＪ．，ＴｉａｎＪ．，ＷｕＹ．Ｐ．，ＹｕＦ．Ｘ．，ＷａｎｇＲ．，ＷａｎｇＨ．，ＺｈａｎｇＤ．Ｗ．，ＬｉｕＹ．，ＺｈｏｕＬ．，ＬｉＺ．Ｔ．，ＣＣＳＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１９，１（２），１５６ １６５［１６］㊀ＺｈａｎｇＫ．，ＬｉｕＪ．，ＳｏｎｇＱ．，ＹａｎｇＸ．，ＷａｎｇＤ．，ＬｉｕＷ．，ＳｈｉＪ．，ＺｈａｎｇＺ．，ＡＣＳＡｐｐｌ．ＭａｔｅｒＩｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２０１９，１１（５０），４６６０４ ４６６１３［１７］㊀ＡｌｉＭ．Ｍ．，ＬｉＦ．，ＺｈａｎｇＺ．，ＺｈａｎｇＫ．，ＫａｎｇＤ．Ｋ．，ＡｎｋｒｕｍＪ．Ａ．，ＬｅＸ．Ｃ．，ＺｈａｏＷ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２０１４，４３（１０），３３２４ ３３４１［１８］㊀ＧａｏＨ．，ＺｈａｎｇＫ．，ＴｅｎｇＸ．，ＬｉＪ．，ＴｒＡＣ，ＴｒｅｎｄｓＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１９，１２１（９），１１５７００［１９］㊀ＹｕａｎＹ．，ＧｕＺ．，ＹａｏＣ．，ＬｕｏＤ．，ＹａｎｇＤ．，Ｓｍａｌｌ，２０１９，１５（２６），ｅ１９００１７２［２０］㊀ＺｈｕＧ．，ＭｅｉＬ．，ＶｉｓｈｗａｓｒａｏＨ．Ｄ．，ＪａｃｏｂｓｏｎＯ．，ＷａｎｇＺ．，ＬｉｕＹ．，ＹｕｎｇＢ．Ｃ．，ＦｕＸ．，ＪｉｎＡ．，ＮｉｕＧ．，ＷａｎｇＱ．，ＺｈａｎｇＦ．，ＳｈｒｏｆｆＨ．，ＣｈｅｎＸ．，ＮａｔＣｏｍｍｕｎ．，２０１７，８（１），１４８２ １４８８［２１］㊀ＳｈｉＪ．，ＹｕＷ．，ＸｕＬ．，ＹｉｎＮ．，ＬｉｕＷ．，ＺｈａｎｇＫ．，ＬｉｕＪ．，ＺｈａｎｇＺ．，ＮａｎｏＬｅｔｔ．，２０２０，２０（１），７８０ ７８９［２２］㊀ＨｕＲ．，ＺｈａｎｇＸ．Ｂ．，ＺｈａｏＺ．Ｌ．，ＺｈｕＧ．Ｚ．，ＣｈｅｎＴ．，ＦｕＴ．，ＴａｎＷ．Ｈ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１４，５３（２３），５８２１ ５８２６［２３］㊀ＺｈａｎｇＫ．，ＤｅｎｇＲ．，ＳｕｎＹ．，ＺｈａｎｇＬ．，ＬｉＪ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１７，８（１０），７０９８ ７１０５［２４］㊀ＺｈａｎｇＫ．，ＧａｏＨ．，ＤｅｎｇＲ．，ＬｉＪ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１９，５８（１５），４７９０ ４７９９［２５］㊀ＺｈａｎｇＫ．，ＤｅｎｇＲ．，ＴｅｎｇＸ．，ＬｉＹ．，ＳｕｎＹ．，ＲｅｎＸ．，ＬｉＪ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１８，１４０（３６），１１２９３ １１３０１［２６］㊀ＺｈａｎｇＬ．，ＡｂｄｕｌｌａｈＲ．，ＨｕＸ．，ＢａｉＨ．，ＦａｎＨ．，ＨｅＬ．，ＬｉａｎｇＨ．，ＺｏｕＪ．，ＬｉｕＹ．，ＳｕｎＹ．，ＺｈａｎｇＸ．，ＴａｎＷ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１９，１４１（１０），４２８２ ４２９０［２７］㊀ＺｈａｎｇＺ．，ＡｌｉＭ．Ｍ．，ＥｃｋｅｒｔＭ．Ａ．，ＫａｎｇＤ．Ｋ．，ＣｈｅｎＹ．Ｙ．，ＳｅｎｄｅｒＬ．Ｓ．，ＦｒｕｍａｎＤ．Ａ．，ＺｈａｏＷ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１３，３４（３７），９７２８ ９７３５［２８］㊀ＸｕＬ．，ＴｏｎｇＧ．，ＳｏｎｇＱ．，ＺｈｕＣ．，ＺｈａｎｇＨ．，ＳｈｉＪ．，ＺｈａｎｇＺ．，ＡＣＳＮａｎｏ．，２０１８，１２（７），６８０６ ６８１８［２９］㊀ＤｕＸ．Ｃ．，ＨａｏＨ．Ｘ．，ＱｉｎＡ．Ｊ．，ＴａｎｇＢ．Ｚ．，Ｃｈｅｍ．Ｊ．ＣｈｉｎｅｓｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ，２０２０，４１（３），４１１ ４１６（杜宪超，郝红霞，秦安军，唐本忠．高等学校化学学报，２０２０，４１（３），４１１ ４１６）［３０］㊀ＪｉｎＹ．，ＬｉＺ．，ＬｉｕＨ．，ＣｈｅｎＳ．，ＷａｎｇＦ．，ＷａｎｇＬ．，ＬｉＮ．，ＧｅＫ．，ＹａｎｇＸ．，ＬｉａｎｇＸ．Ｊ．，ＺｈａｎｇＪ．，ＮＰＧＡｓｉａＭａｔｅｒｉａｌｓ，２０１７，９（３），ｅ３６５［３１］㊀ＫａｎｇＤ．Ｋ．，ＡｌｉＭ．Ｍ．，ＺｈａｎｇＫ．，ＨｕａｎｇＳ．Ｓ．，ＰｅｔｅｒｓｏｎＥ．，ＤｉｇｍａｎＭ．Ａ．，ＧｒａｔｔｏｎＥ．，ＺｈａｏＷ．，ＮａｔＣｏｍｍｕｎ．，２０１４，５（４），５４２７ ５４３３［３２］㊀ＣｈａｎｇＭ．，ＹａｎｇＣ．Ｓ．，ＨｕａｎｇＤ．Ｍ．，ＡＣＳＮａｎｏ．，２０１１，５（８），６１５６ ６１６３［３３］㊀ＭｏＲ．，ＪｉａｎｇＴ．，ＤｉＳａｎｔｏＲ．，ＴａｉＷ．，ＧｕＺ．，ＮａｔＣｏｍｍｕｎ．，２０１４，５（４），３３６４ ３３７１［３４］㊀ＫｏｎｇＲ．Ｍ．，ＺｈａｎｇＸ．，ＤｉｎｇＬ．，ＹａｎｇＤ．，ＱｕＦ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１７，４０９（２４），５７５７ ５７６５［３５］㊀ＬｉＬ．，ＨｏｕＪ．，ＬｉｕＸ．，ＧｕｏＹ．，ＷｕＹ．，ＺｈａｎｇＬ．，ＹａｎｇＺ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１４，３５（１２），３８４０ ３８５０ＭｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＤＮＡＮａｎｏｆｌｏｗｅｒｓｆｏｒＡｕｔｏｐｈａｇｙＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄＥｎｈａｎｃｅｄＡｎｔｉｔｕｍｏｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ†ＺＨＡＮＧＫａｉｘｉａｎｇ１，２，ＬＩＵＪｕｎｊｉｅ１，ＳＯＮＧＱｉａｏｌｉ１，ＷＡＮＧＤａｎｙｕ１，ＳＨＩＪｉｎｊｉｎ１∗，ＺＨＡＮＧＨａｉｙｕｅ３∗，ＬＩＪｉｎｇｈｏｎｇ２∗（１．ＫｅｙｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴａｒｇｅｔｉｎｇＴｈｅｒａｐｙａｎｄＤｉａｇｎｏｓｉｓｆｏｒＣｒｉｔｉｃａｌＤｉｓｅａｓｅｓ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＺｈｅｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００１，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＴｓｉｎｇｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８４，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＣｈａｎｇｃｈｕｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００１２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ａｕｔｏｐｈａｇｙｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｒｏｃｅｓｓｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｉｎｗｈｉｃｈｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｍｅｍｂｒａｎｅｓｕｎｄｅｒｇｏｄｙｎａｍｉｃｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓ，ｌｅａｄｉｎｇｔｏｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ．Ｈｉｇｈｌｅｖｅｌｓｏｆｃｅｌｌｕｌａｒａｕｔｏｐｈａｇｙｃｏｕｌｄｐｒｏｔｅｃｔｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｆｒｏｍａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅａｎｔｉｔｕｍｏｒｅｆｆｅｃｔｏｆｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｄｒｕｇｓ．Ｉｎｔｈｉｓｗｏｒｋ，ｗｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＤＮＡｎａｎｏｆｌｏｗｅｒ，ｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅＤＮＡａｐｔａｍｅｒａｎｄＤＮＡｚｙｍｅｆｏｒｔａｒｇｅｔｅｄｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙａｎｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｔｏｉｎｈｉｂｉｔａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ．ＵｓｉｎｇＲＴ⁃ＰＣＲ，ｗｅｖｅｒｉｆｉｅｄｔｈａｔｔｈｅｄｅｓｉｇｎｅｄＤＮＡｎａｎｏｆｌｏｗｅｒｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｃｌｅａｖｅｔｈｅｍＲＮＡｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ⁃ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ（ＡＴＧ５）ｉｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ．ＴｈｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｓｓａｙａｌｓｏｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＤＮＡｎａｎｏｆｌｏｗｅｒｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅａｎｔｉｔｕｍｏｒｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＤＮＡｎａｎｏｆｌｏｗｅｒｓ；Ｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙ；Ａｕｔｏｐｈａｇｙ；ＤＮＡｚｙｍｅ；Ａｎｔｉｔｕｍｏｒｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（Ｅｄ．：Ｖ，Ｋ）†ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（Ｎｏｓ．２１９０４１１９，２１６２１００３）ａｎｄｔｈｅＫｅｙＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｊｅｃｔｓｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．１９２１０２３１０１４７）．９６４１㊀Ｎｏ．７㊀张开翔等：基于ＤＮＡ纳米花的细胞自噬基因沉默用于增敏抗肿瘤化疗。
金纳米粒子在抗肿瘤方面应用
Background
➢ 早在150年前，英国著名的物理学家 、化学家M.Faraday就在该领域做出 了突出贡献，他发现了胶体金的变色 现象。
➢ 近年来，人们越来越多的研究金纳米 粒子，发现其具有高电子密度、介电 特性和催化作用，能与多种生物大分 子结合等性质
➢ 其应用领域涉及光学探针、电化学探 针、组织修复、传感器、DNA、催化 剂、检测，葡萄糖传感器、药物传递 及表面增强拉曼散射。
金纳米粒子作为光热造影剂
金纳米壳 磁共振成像图：结 果显示，纳米壳辐 射热治疗平均温升 为37.4。C— 6.6 。 C ，控制组为9.1 。 C —4.7 。C
金纳米粒子作为光热造影剂
金纳米棒辐射热 治疗，对照组、 静脉注射组、直 接注射组对比效 果。
金纳米粒子作为光热造影剂
❖ 球型金纳米粒子接合肿瘤坏死因子（TNF）就是一个很好 的研究方向。TNF-金纳米粒子结合物进一步证明相对于天 然分子有两倍的导致肿瘤消退的效果。等效质量条件下共 轭物也显示出低毒性相对于原生TNF（0％与15％的死亡 率）。这种技术目前正在II期临床试验阶段。其他接合药 物有他莫昔芬、顺铂类、紫杉烷类、奥沙利铂、甲氨蝶呤 等。
金纳米棒比金纳米壳和笼有着更大和狭窄的吸收面积和更 高的吸收效率。
在近红外激光的光热实验中每单位质量的金纳米棒比起 SiO2-Au纳米壳表现出1/3的光谱带宽，约3倍更高的消光 截面，和6倍的加热能力。
金纳米粒子作为给药载体
❖ 金纳米粒子除了其独特的光热和光声特性而被用于PTT， 它作为有选择性和多功能抗癌药物结合物的平台也引起了 人们的强烈兴趣。
金纳米粒子用于基因治疗
❖ 基因治疗（gene therapy） 是利用分子生物学方法将目 的基因导入患者体内，使之 表达目的基因产物，从而使 疾病得到治疗，为现代医学 和分子生物学相结合而诞生 的新技术。
细胞自噬在抗肿瘤免疫治疗中的作用
细胞自噬在抗肿瘤免疫治疗中的作用引言自噬是一种重要的细胞代谢过程，其可以维持细胞内环境稳定性、促进细胞存活及代谢平衡，并参与多种细胞生物学过程。
近些年来，研究表明自噬在肿瘤发生、发展、耐药和免疫逃逸过程中也发挥着重要的角色。
细胞自噬与肿瘤的关系许多研究表明，自噬在肿瘤的发生和发展过程中起着重要的调节作用。
在肿瘤细胞中，自噬通路的活性往往异常升高，导致细胞存活能力增强、凋亡途径的受损以及过氧化物酶体活性下降。
同时，自噬还能够通过调节肿瘤代谢，维持肿瘤细胞的生存环境，保护肿瘤细胞免受环境压力和应激造成的损伤。
因此，研究自噬在肿瘤治疗中的作用非常重要。
自噬在免疫治疗中的作用在癌症免疫治疗中，抗原递呈细胞（APC）起着重要的作用。
APC可以通过自噬途径摄取肿瘤抗原并递呈给免疫效应细胞，从而发挥抵抗肿瘤的作用。
此外，自噬还参与了多种免疫效应细胞的发育、极化、介导及维持。
自噬途径在肿瘤抗原递呈中的应用自噬途径是一种原位抗原递呈途径。
在细胞内，自噬体是通过吞噬泡解聚形成的，这意味着包括肿瘤抗原在内的一些细胞内成分可以被加载到自噬体中。
在固有免疫和适应性免疫的协同作用下，这些包括肿瘤抗原、检验点受体抑制剂和共刺激分子的蛋白质被递呈给免疫效应细胞（如T细胞），从而促进免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。
自噬参与免疫效应细胞的发育、介导和维持免疫效应细胞的发育、极化、介导及维持都与自噬途径有密切联系。
例如，在活化细胞生物学过程中，T细胞通过起始的胞内代谢通路控制自身的生存。
T细胞在活化的同时，会通过自噬控制代谢通路的平衡，使其能够更好地分化和增殖。
其他一些免疫效应细胞如巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞等也通过自噬维持自身代谢及生物合成的平衡，从而发挥其细胞免疫功能。
结论在癌症治疗中，自噬途径在免疫治疗中的优越性逐渐引起了人们的关注。
通过开发适合的自噬途径药物，科学家们可以利用自噬来调节肿瘤转化的生化事件，从而对癌症进行有效的单一或联合治疗。
一种自噬抑制协同光热治疗靶向杀死肿瘤细胞的金纳米药物合成方法[发明专利]
![一种自噬抑制协同光热治疗靶向杀死肿瘤细胞的金纳米药物合成方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/83420921bfd5b9f3f90f76c66137ee06eff94e2b.png)
专利名称：一种自噬抑制协同光热治疗靶向杀死肿瘤细胞的金纳米药物合成方法
专利类型：发明专利
发明人：李丹,赵亭磊,蒋艳夏蕾
申请号：CN202210103500.2
申请日：20220127
公开号：CN114617963A
公开日：
20220614
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种自噬抑制协同光热治疗靶向杀死肿瘤细胞的金纳米药物合成方法，属于药物合成技术领域。
上述方法包括：合成海胆金纳米粒子SUL‑Au；然后利用SUL‑Au与甲氧基聚乙二醇巯基反应，进行表面修饰PEG；然后进行表面修饰自噬抑制剂Beclin1；最后进行SH‑AS1411的修饰，得到SUL‑Au@PEG@Beclin1@AS1411。
本发明制备的SUL‑Au@PEG@Beclin1@AS1411既可以靶向肿瘤细胞，实现定向杀死肿瘤细胞的目的，又联合细胞自噬与光热治疗，大大的提高金纳米材料在肿瘤光热治疗应用的效率。
申请人：临沂大学
地址：276000 山东省临沂市兰山区双岭路中段
国籍：CN
代理机构：北京市广友专利事务所有限责任公司
代理人：张仲波
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肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤耐药关系及调节机制研究进展
肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤耐药关系及调节机制研究进展
李斯言;潘燕
【期刊名称】《中国药理学与毒理学杂志》
【年(卷),期】2018(32)7
【摘要】肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤组织中巨噬细胞的总称,作为肿瘤微环境的成分之一,受多种细胞因子影响,进而影响肿瘤的生长、侵袭和转移。
其中,M2型TAM通过促进肿瘤血管发生和免疫逃逸影响肿瘤的发展。
近年来研究发现,TAM 与肿瘤化疗和靶向治疗药物耐药密切相关。
TAM参与的肿瘤耐药调节机制包括释放多种细胞因子、M2表型的特定转化、增强肿瘤细胞抗凋亡和对机体的免疫抑制作用等。
【总页数】6页(P573-578)
【关键词】肿瘤相关巨噬细胞;耐药性,肿瘤;抗肿瘤药;分子靶向治疗
【作者】李斯言;潘燕
【作者单位】北京大学基础医学院药理学系
【正文语种】中文
【中图分类】R967
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1.肿瘤相关巨噬细胞及其与实体肿瘤关系的研究进展 [J], 李腊梅;胡章勇;周艳
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5.肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤侵袭转移机制的研究进展 [J], 林花;李雨涵;王云娜;王勇
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纳米材料靶向肿瘤相关巨噬细胞用于肿瘤成像及治疗的研究进展
纳米材料靶向肿瘤相关巨噬细胞用于肿瘤成像及治疗的研究进展郭峰亮;汤谷平;胡青莲【期刊名称】《浙江大学学报（医学版）》【年(卷),期】2017(046)002【摘要】肿瘤组织由肿瘤细胞和复杂的微环境构成.肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤微环境的重要组成成分,在肿瘤生长转移及微环境调控中扮演着重要的角色.近年来的研究表明,纳米材料作为新兴的技术平台,为肿瘤的成像和治疗提供了新的思路.一方面可以通过TAM成像为肿瘤发生、发展以及肿瘤治疗的效果提供直观的证据;另一方面通过TAM靶向杀伤或者促进TAM类型转化,调节肿瘤微环境的免疫抑制,提高肿瘤治疗效果.本文阐述了TAM的功能,同时对靶向TAM的纳米材料在肿瘤成像以及治疗方面的应用进行了综述.%Tumor tissues are composed of tumor cells and complicated microenvironment.Tumor associated macrophages (TAMs) as an important component in tumor microenvironment,play fundamental roles in tumor progression,metastasis and microenvironment regulation.Recently,studies have found that nanotechnology,as an emerging platform,provides unique potential for cancer imaging and therapy.With the nanotechnology,TAMs imaging presents direct evidence for cancer development,progression,and the effectiveness of cancer treatments;it also can regulate the immunosuppression of tumor microenvironment and improve therapeutic efficiency through TAMs targeted killing or phenotypic transformation.In this article,we illustrate thefunction of TAMs and review the latest development in nano-carriers and their applications in tumor associated macrophage targeting cancer imaging and therapy.【总页数】6页(P167-172)【作者】郭峰亮;汤谷平;胡青莲【作者单位】浙江工业大学生物工程学院,浙江杭州310032;浙江大学化学系,浙江杭州310028;浙江大学化学系,浙江杭州310028【正文语种】中文【中图分类】R730.5【相关文献】1.靶向肿瘤相关巨噬细胞的肿瘤治疗研究进展 [J], 夏莹;张岩;杨永广;刘文涛2.肿瘤相关巨噬细胞作用和靶向治疗的研究进展 [J], 王煦苏;徐娟(综述);贾雪梅(审校);3.纳米材料调控肿瘤相关巨噬细胞进行肿瘤免疫治疗的研究进展 [J], 徐睿; 刘晨光4.肿瘤相关巨噬细胞靶向治疗宫颈癌研究进展 [J], 陆杭铖;魏炜炜;陈继明;施如霞5.纳米载药系统靶向肿瘤相关巨噬细胞用于肿瘤治疗的研究进展 [J], 孙宏晨;李杏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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海军军医大学博士学位论文基于自噬调控肿瘤相关巨噬细胞表型极化的金纳米粒抗肿瘤机制研究Study on the Mechanism of AuNPs in Anti-tumor Growth Based on Autophagy Regulating Phenotypic Polarization of Tumor-associated Macrophages研究生姓名：学号：指导教师：学科、专业：学位类型：答辩委员会主席：委员：答辩日期：原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，遵照严肃求实的科学精神，独立进行研究工作所取得的成果。
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（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：年月日导师签名：年月日目录摘要...................................................................................................... - 1 - Abstract ................................................................................................. - 5 - 缩略词表.............................................................................................. - 11 - 前言.................................................................................................. - 12 - 第一章PEG修饰的金纳米粒的制备、表征和细胞毒性研究....... - 18 -一、仪器与试剂........................................................................... - 18 -二、实验方法............................................................................... - 19 - （一）PEG修饰的金纳米粒的制备.......................................... - 19 - （二）PEG修饰的金纳米粒的表征.......................................... - 19 - （三）PEG修饰的金纳米粒细胞毒性实验.............................. - 20 - 三、结果与讨论........................................................................... - 21 - （一）PEG修饰的金纳米粒的表征.......................................... - 21 - （二）PEG修饰的金纳米粒细胞毒性...................................... - 23 - 四、本章小结............................................................................... - 25 - 第二章金纳米粒体外对肿瘤相关巨噬细胞表型极化的影响....... - 26 -一、仪器与试剂........................................................................... - 27 -二、实验方法............................................................................... - 28 - （一）肿瘤细胞悬液TSN培养巨噬细胞................................. - 28 - （二）金纳米粒对TSN培养条件下的巨噬细胞表型作用的考察-33 -（三）统计学处理....................................................................... - 34 -三、结果与讨论........................................................................... - 34 -（一）TSN培养条件诱导巨噬细胞向M2表型极化............... - 34 - （二）金纳米粒对TSN培养条件下巨噬细胞表型极化作用. - 38 -四、本章小结............................................................................... - 43 - 第三章金纳米粒体内抑制肿瘤相关巨噬细胞表型极化发挥抗肿瘤作用.......................................................................................................... - 44 -一、仪器与试剂........................................................................... - 45 -二、实验方法............................................................................... - 46 -（一）荷瘤小鼠模型的建立、给药和分组............................... - 46 - （二）小鼠肿瘤体积测量........................................................... - 46 - （三）肿瘤组织免疫荧光实验................................................... - 47 - （四）肿瘤组织中巨噬细胞的分离和纯化............................... - 48 - （五）肿瘤相关巨噬细胞表型鉴定流式实验........................... - 50 - （六）肿瘤相关巨噬细胞mRNA的检测（Real-time PCR）. - 50 - （七）统计学处理....................................................................... - 50 -三、结果与讨论........................................................................... - 50 -（一）肿瘤生长曲线及抑制率................................................... - 50 - （二）肿瘤组织中巨噬细胞表型的鉴定................................... - 52 -四、本章小结............................................................................... - 59 -第四章金纳米粒对肿瘤相关巨噬细胞自噬的作用....................... - 60 -一、仪器与试剂........................................................................... - 60 -二、实验方法............................................................................... - 62 - （一）细胞培养和金纳米粒孵育............................................... - 62 - （二）Western检测巨噬细胞自噬相关蛋白的表达................. - 62 - （三）mRFP-GFP-LC3双荧光检测自噬流............................... - 64 - （四）溶酶体酸性测定............................................................... - 65 - （五）吖啶橙(Acridine Orange, AO)测定溶酶体稳定性.......... - 65 - （六）统计学处理....................................................................... - 66 - 三、结果和讨论........................................................................... - 66 - （一）肿瘤相关巨噬细胞自噬相关蛋白的表达变化............... - 66 - （二）mRFP-GFP-LC3双荧光检测肿瘤相关巨噬细胞自噬流水平....................................................................................................... - 67 - （三）肿瘤相关巨噬细胞溶酶体功能的考察........................... - 70 - 四、本章小结............................................................................... - 73 - 第五章调节自噬对肿瘤相关巨噬细胞表型的影响....................... - 74 -一、仪器与试剂........................................................................... - 74 -二、实验方法............................................................................... - 75 - （一）细胞培养........................................................................... - 75 - （二）含mRFP-GFP-LC3质粒的腺病毒转染细胞.................. - 76 -（三）Atg5siRNA转染巨噬细胞.............................................. - 76 - （四）Atg5siRNA转染效果的检测.......................................... - 76 - （五）氯喹（CQ）和雷帕霉素（Rapa）的配制及细胞孵育. - 77 - （六）统计学处理....................................................................... - 78 - 三、结果和讨论........................................................................... - 78 -（一）TSN培养条件下巨噬细胞自噬水平的变化.................. - 78 - （二）自噬抑制剂对TSN培养条件下巨噬细胞M2表型极化的作用............................................................................................... - 80 - （三）自噬诱导剂对TSN培养条件下巨噬细胞M2表型极化的作用............................................................................................... - 85 - 四、本章小结............................................................................... - 86 - 全文总结.............................................................................................. - 87 - 参考文献.............................................................................................. - 89 - 纳米载体靶向肿瘤相关巨噬细胞治疗肿瘤新策略（综述）... - 94 - 在读期间科研成果........................................................................... - 102 - 致谢................................................................................................................................. - 103 -基于自噬调控肿瘤相关巨噬细胞表型极化的金纳米粒抗肿瘤机制研究摘要【研究背景及目的】巨噬细胞（MΦ）在体内受到不同因素的影响可以向两种方向极化：一种是经典途径活化的M1型，能够分泌的IL-12、iNOS和TNFα等炎症因子，发挥抑制和杀伤肿瘤细胞的作用。