建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白基因标记
芽孢杆菌及其提取物对兰花茎腐病的防治效果
作者 简介 ： 朱秋 潮 （９ ０一） １６ ，男 ，浙江 绍兴人 ，高 级农 艺师 ，从事 农业 推广工 作 。Ｅ ｍ ｉ： ｕ ｉｃａ ＠ ｙｈ ｏ ｃ 。 — ａ ｚ ｑｕ ｈ ｏ ａｏ ． ｎ ｌｈ － ａ ：ｈ ｎ ｌ ｊ ｅ ｕ ｅ 。 ｌ ｕ 通信作 者 ： 陈卫 良，Ｅ ｍ ｉ ｃ ｅ ｗ＠ ｚ ． ｄ ． ｎ
朱秋 潮 ，杨 惠 张 甲辰 陈 卫 良 ， ，
（ ．浙 江 省 绍 兴 市农 业 技术 推 广 总 站 ，浙 江 绍 兴 ３ ２ ０ ；２ １ １ ０ ０ ．浙 江 大 学 生 物 技 术研 究 所 ，浙 江 杭 州 ３ ０ ５ １０ ８
３ 杭 州 广 普 生 物 科技 有 限公 司 ，浙 江 杭 州 ３ １ １ ） ． １２ ５
为 ６ ． １ ，处 理 ３为 ６ ． ｌ ；药 后 １ ， 以 处 ２３ ％ ０ Ｏ％ ５ｄ
理 １对稻 飞虱 的防 治 效果 最 佳 为 ８ ． ３ ，处 理 ２ ６１％
次 之 为 ８ ． １ ，处 理 ３为 ７ ． ５ 。 ０２％ ３０ ％ 稻飞 虱 的 田问 药 效试 验 ［ ］ １ Ｊ．广 西植 保 ，
王 泽 乐 ，王 梓 英 ，刘 祥 贵 ，等．重 庆 市 稻 飞 虱 、稻 纵 卷 叶 螟
２０ ０９年重 发生 的特 点及原 因 ［］ Ｊ ．西南 师范 大学 学报 ，２ １ ，３ ０１ ６
（ ） ３—８ ． １ ：８ ７
刘 庆友 ，张 玉美 ，姚 骏
不 同 药剂 及 剂 量 防 治水 稻 稻 飞虱 药 效
… ｌ ｎ 人 估计 浙江 省每 年 因此 病 害而造 成 的损失 都在几 千
养兰者注意兰花头号“灾星”镰刀菌
养兰者注意兰花头号“灾星”镰刀菌养兰者注意兰花头号“灾星”镰刀菌2011年五六月份，摆放在阳台上的数盆兰花陆续出现了问题：有的小兰苗叶片起皱，轻轻一拔就抽出，其叶片基部腐烂，变黑色，呈水渍状，闻一闻似乎有点淡淡的腥臭味。
有的老株上，叶基部桔黄，后来逐渐从心叶开始，从叶片基部向上变褐变黑，最后全株干枯死亡；拔起病株，可见假鳞茎呈黑色，捏一捏还挺硬，也有的假鳞茎呈水渍状腐烂，但切开假鳞茎都可见到剖切面变褐（健康株呈乳白色），依书上说法和笔者的经验，认为前者很大可能是细菌性软腐病，后者则是兰友们所说的烂头病——茎腐病，对于较金贵的名品，切去病株后，把治细菌病的农用硫酸链露素和治茎腐病的噁霉灵等农药混合后用于浸泡发病兰盆的健康株，然后重新用新植料上盆；对于普通品种，则只是拔去病株，将农药粉末直接撒在发病株周围的植料中，可过了一段时间，发现效果并不明显，有的重新上盆后的健康株也发病了……这究竟是什么病？病原是什么呢？这年8月，笔者将一丛发病株送福建农林大学请张绍升教授做病原很久，鉴定结果出来了：病原是镰刀菌，为茎腐病。
茎腐病是兰花的不治之症，兰反们淡“腐”色变。
笔者当然知道它的厉害，但既然得了也就没什么理会它。
之后，在秋季又有两三盆得病；再后来，随着冬季气温下降，病害也基本没什么发生………笔者想，也许这“坎”就过了？！事情的发展并没有这么简单。
到了第二年，201 2年的梅雨季节，兰花又陆陆续续出现了问题，其症状与前一年相似，发病的兰盆数量明显增多，至秋季时发病盆数累计达到20多盆，占阳台的兰花盆数的三分之一，令人心痛。
在这些病株中，有些症状典型，明显是患了茎腐病；是不是也有其他的病害呢，如细菌性软腐病等呢？2012年-8月，笔者又取5个病株样本（含枯死的老苗、腐烂新苗、枯死叶片）、送福建农林大学做病原鉴定。
几天后，鉴定结果出来了： 5个样本病原都是镰刀菌！这结果有点出乎笔者的意料之外：春兰‘万字’、建兰‘铁骨白芽”均为前垄草新苗得病，且其腐烂处有点腥臭味，可能性更大的应该细菌性软腐病啊！建兰锦旗叶片从尖部开始枯黄（叶枯病），居然镰)J菌所致！由此，可以得出以下两个结论：（1）镰刀菌所致的茎腐病可发生于老苗或新苗，兰友们所持的“发病于老病为茎瞒病，发病于薪苗为细菌性软腐病”的观点是错误的。
化学生物学综合创新设计实验——大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白
３ 试 剂与 仪 器
３１ 试剂 ． 高保真 Ｔｑ酶 ，Ｎ Ｐ ， Ｔ 卡那霉 素， ａ ｄ Ｔ ｓＩ Ｇ， Ｐ 氯 化钙 ，４Ｄ Ａ连接酶 ， Ｔ Ｎ 限制性内切酶 Ｂｍ 和 Ｈｎ Ｉ ａ ＨＩ ｉｄＩ Ｉ
（ ａ ａ ａ ， 脂糖 ， 乙啶 ，Ｃ 纯化试剂 盒 （ ｍ ｇ ｉ ＴＫ Ｒ ）琼 溴 ＰＲ Ｏ ｅａＢｏ
１８ ６
江
西
农
业
学
报
２ ３卷
显微镜检测表达情况。
ｔ ，Ｎ Ｐ ｔ （ ． ｍ １ ，０ ｕｅ ｘ ｄ Ｔ ｓ Ｌ ２ ０ｍ ｏ） １ Ｂ ｆｒ ， Ｌ ２ｘ Ｘ ｆ２ 普通 Ｔｑ ａ 酶 ０２ （ ． Ｕ ， ． ２５ ）去离子水 １． 。反应条件 同４ １ ３３ ． 中条件。将反应后产物进行琼脂糖凝胶 电泳检测 ， 如果
验步骤。
收稿 日期 ： １ —０ ２ １ ６—２ ０ ５ ‘
笔者在任课教师 以往从事科研 的基础上 一 设计 ，
了该综 合 创 新 实 验 ， 绿 色 荧 光 蛋 白基 因 将 插 入 ｐ Ｔ ８ 表达系统 ， Ｅ ２ａ 进行绿色荧光蛋 白表达 ， 并使用荧光
基金项 目： 国家水体污染控制与治理科技重大专项 （０９ Ｘ ７２ — ０ ） 河南农业大学博士启动项 目（００ １ １ 。 ２０ Ｚ ０ ４３ ０３ ； ３ ３０７ ） 作者简介 ： 赵仲麟（９ Ｏ ）男 ， １ 一 ， 辽宁鞍山人 ， ８ 讲师 ， ， 博士 主要从事化学生物学及分子生物学的科研与教学工作。 通讯作者： 袁超。
江西农 业学报 ２ １ ，３ ８ ：６ ０ １ ２ （ ） １７～１８ ６
ＡｅａＡｇｉｕ ｕａ ｉｎ ｘ ｔ ｒｃ ｈ ｒｅＪａ ｇ ｉ
化 学生 物 学综 合创 新 设计 实验
西番莲茎基腐病病原尖孢镰刀菌生物学特性及木霉菌防治初探
西番莲茎基腐病病原尖孢镰刀菌生物学特性及木霉菌防治初探包文杰1，2，申凌婕3，杨效东1*（1中国科学院西双版纳热带植物园，云南勐腊666303；2中国科学院大学，北京100049；3普洱学院，云南普洱665000）摘要院西番莲（）茎基腐病是由镰刀菌（）引起的一种土传病害。
为了更好地防治该病，以西番莲病株中分离的茎基腐病病原尖孢镰刀菌（）和3种木霉菌（）为材料，测定不同pH值和温度条件下病原菌生长情况，同时，通过平板对峙试验，比较3种木霉菌对病原菌生长的抑制效果，探讨其作为生物防治菌剂应用于农业生态系统中的可能性。
结果显示，酸性和高温条件不利于病原菌生长，其中，最适生长pH值为7~9，最适生长温度为25~27℃，同时，3种木霉菌对病原菌生长均具有显著的拮抗作用。
希望研究结果能够为防治西番莲茎基腐病提供理论依据。
关键词院西番莲；茎基腐病；尖孢镰刀菌；生物学特性；木霉菌；生物防治西番莲（）又称百香果、鸡蛋果，为西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（）多年生常绿藤本果树，广泛种植于热带和亚热带地区[1-2]，果实具有丰富的营养价值和药用价值[3-6]。
西番莲在我国广东、广西、福建、台湾和云南等地均有分布，种植面积已超过3万hm2[7]，目前，市场上主要种植的2个品种是紫果西番莲（）和黄果西番莲（）[8]。
然而随着西番莲产业不断发展，由于病原菌入侵，使得西番莲生产正面临严重的病害威胁，其中，茎基腐病是生产中亟待解决的问题。
茎基腐病是一种典型的土传病害，能够造成植株茎基部腐烂，影响水分和营养物质的运输，最终导致整株枯萎死亡，严重时可引起种植区大面积连片枯死。
目前，人们对西番莲茎基腐病的病原菌种类已有了一定的了解，不同地区引起西番莲茎基腐病的病原菌有所差异。
郑加协等[9]、陈星等[10]通过分离培养和接种，鉴定福建和广西地区西番莲茎基腐病病原菌为尖孢镰刀菌（）；宋晓兵等[11]、Hao等[12]通过调查广东和云南地区西番莲茎基腐病，确定病原菌为腐皮镰刀菌（）；詹儒林等[13]通过形态特征，鉴定海南琼海西番莲茎基腐病的致病菌为烟草疫霉菌（）。
兰花茎腐病病原菌的分离与鉴定
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
２ 结 果 与分 析
２ １ 兰 花 茎 腐 病 症 状 ．
兰 花茎腐 病病 株取 自中国春 兰样 品园基地 和 台 州 、温 州等地 。
１ ２ 病 原菌 的分 离 纯化 ．
病 菌是 从 兰 花 根 部 侵 入 ，通 过 维 管 束 向 上 发
将 １ 丛健 康无 病 的兰花 分成 大 小基 本 相 同的 ４
株 ，编 号 １ ，３ ，２ ，４ ，用 剪 刀 剪 开 植 株 的 根 部 ， 再 将植 株 移 栽 到灭 过 菌 的 土壤 中 ，浇 透 水 。将 ２ ， ３ ，４号接 入 已计 数 的镰 刀 菌悬液 ，１ 号作 为对 照 不 接 入 菌液 ，２ ５℃室温 下培 养 。
１ ４ 回 接 实 验 ． １ ４ １ 镰 刀 菌 计 数 ． ．
用 双蒸水 悬浮 培养皿 内的菌落 ，用 ２层擦 镜 纸 过 滤获 得孢 子悬液 。用 双蒸 水适 当稀 释后用计 数 板
计数。
１ ４ ２ 镰 刀 菌 接 种 ．．
２０ ０ ５年 ４— ８月 ， 仅因茎腐病造 成兰花 损失 在 １ 亿元
关 键 词 ：兰 花 茎 腐 病 ；镰 刀 菌 ；分 离 鉴 定 中 图分 类 号 ：ｓ６ ２ ３ ８． １ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：０ ２ －０ ７ ２ １ ） ６０ ６ －２ ５ ８９ １ （ ０ ２ ０ －８ ０ ０
兰花 （ ｙ ｂ ｉｍ ｓｐ ）属 于 兰 科 兰 属多 年 生 Ｃ ｍ ｉ ｕ ｐ ． ｄ 草 本 单 子 叶植 物 ，以其 高 雅 、幽美 、独 特 的花 型 、 花 色 、香味深得 人 们 的喜爱 与 珍藏 ，在 国 内外花 卉 市 场上 占有 重要 的地 位 。但 随着 盆栽 兰 花混 摆 和野 生兰花 的 驯化 与 推 广 ，其 病 害 的 发 生 越来 越 严 重 ， 新 的病害也 时有 出现 ，严重影 响了兰 花的观 赏价值 ， 也带来 了很 大 的经济 损失 。兰花 茎腐 病 是其 中最严 重 的病害 。通 常情 况 下 ，因茎 腐 病造 成 兰花 死亡 达 ２ ％ 以上 ，有 的甚 至 可 达 ３ ％ 。云 南 大 理 州 调 查 ０ ０
6种杀菌剂对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的毒力及联合作用
6种杀菌剂对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的毒力及联合作用黄鹏;陈峰;姚锦爱;余德亿【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2018(033)004【摘要】为筛选出对建兰茎腐病防效好的增效混剂,室内测定6种杀菌剂对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的毒力及其联合作用.结果表明:6种杀菌剂对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌均有不同程度的抑制作用,抑制中浓度EC50的由小到大依次为:咪鲜胺、苯醚甲环唑、多菌灵和肟菌酯、噁霉灵和代森锰锌;设定的4组混剂配方,苯醚甲环唑+多菌灵、多菌灵+肟菌酯混配表现为增效作用,苯醚甲环唑+多菌灵混配的最佳有效成分质量配比为5:5,共毒系数为378.63;多菌灵+肟菌酯混配的最佳配比则为8:2,共毒系数为247.80.可见,苯醚甲环唑+多菌灵和多菌灵+肟菌酯合理比例混配能较好防控建兰茎腐病的发生为害.【总页数】5页(P396-400)【作者】黄鹏;陈峰;姚锦爱;余德亿【作者单位】福建省农业科学院植物保护研究所 ,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所 ,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所 ,福建福州 350013;福建省作物有害生物监测与治理重点实验室 ,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所 ,福建福州 350013;福建省作物有害生物监测与治理重点实验室 ,福建福州 350013【正文语种】中文【中图分类】S436.8;S482.2【相关文献】1.建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性研究 [J], 姚锦爱;黄鹏;陈峰;余德亿2.几种杀菌剂对番茄茎基腐病的毒力筛选 [J], 张博;张悦丽;马立国;祁凯;李长松;齐军山3.杀菌剂对葡萄白腐病、黑痘病病原菌的室内毒力测定 [J], 张久慧;杨胜清;马贵龙4.几种杀菌剂复配对棉花红腐病菌的联合毒力研究 [J], 潘月敏;高智谋;汪敬鑫;曹君;汪涛5.建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白基因标记 [J], 姚锦爱;张鸿;黄鹏;陈峰;余德亿因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性研究
建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性研究作者：姚锦爱黄鹏陈峰余德亿来源：《福建农业学报》2018年第02期摘要：为明确建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性，室内测定了温度、pH值、光照、碳氮源对病原菌生长和产孢量的影响，以及病原菌孢子的致死温度及时间。
结果表明：该病原菌生长及产孢最适温度为25℃、pH值为7、光照条件为12 h光暗交替、碳源为a-乳糖、氮源为NaNO2，病原菌孢子的致死温度及时间为55℃水浴5 min。
研究结果可为建兰茎腐病的有效防控措施的选择奠定基础。
关键词：建兰；茎腐病；尖孢镰刀菌；生物学特性中图分类号：S 436.8文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）02-190-05Abstract： Biological characteristics of pathogenic Fusarium oxysporum， which causes stem rot disease on Cymbidium ensiflium， were studied. Effects of temperature， pH， light， and carbon and nitrogen sources on the hyphal growth and sporulation of the pathogen were examined. In addition， the lethal temperature and time of F. oxysporum spores were determined. The results showed that the optimal conditions for the growth and sporulation of the pathogen were 25℃， pH 7， 12-h-L∶12-h-D exposure， lactose monohydrate for carbon， and NaNO2 for nitrogen. The lethality of the spores was 5 min in 55℃ water.The study provided reference for the effective control of stem rot on C.ensifolium.Key words： Cymbidium ensifolium； stem rot； Fusarium oxysporum； biological characteristics建兰Cymbidium ensifolium是兰科Orchidaceae兰属Cymbidium多年生单子叶草本植物，在我国民间有着悠久的栽培历史，植物学界以其主产地福建命名，是福建传统特色花卉及主要出口创汇花卉[1]。
快速检测百合鳞茎腐烂病病原菌——尖孢镰刀菌的方法[发明专利]
![快速检测百合鳞茎腐烂病病原菌——尖孢镰刀菌的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/1d51a8e652ea551811a6873d.png)
专利名称：快速检测百合鳞茎腐烂病病原菌——尖孢镰刀菌的方法
专利类型：发明专利
发明人：明军,袁素霞,杨盼盼,曹雨薇,徐雷锋
申请号：CN201511017538.4
申请日：20151230
公开号：CN106319039A
公开日：
20170111
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明为一种基于DNA分子检测技术，应用于快速检测百合鳞茎腐烂病病原菌——尖孢镰刀菌的方法。
它涉及一对用于扩增百合尖孢镰刀菌的特异性引物。
本发明解决了以往需要从感病鳞茎分离、纯化病原菌，提取DNA后经通用引物扩增及测序比对后才能鉴定出病原菌的种类，即无法用现有的通用引物直接从扩增结果中鉴定出百合尖孢镰刀菌的问题。
本发明用于扩增百合尖孢镰刀菌的特异性引物对命名为FO-lilii F/FO-lilii R，本发明的引物对能够快速准确地扩增出百合鳞茎腐烂病病原菌——尖孢镰刀菌的目的片段。
申请人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所
地址：100081 北京市海淀区中关村南大街12号中国农业科学院蔬菜花卉研究所
国籍：CN
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建莲腐败病的识别与防治
建莲腐败病的识别与防治作者：张丽春来源：《长江蔬菜·学术版》2013年第09期摘要：莲腐败病是建莲生产过程中最常发生的病害，主要为害地下茎，造成地上部叶、花枯萎死亡。
莲腐败病由多种病原菌引起，主要为尖镰孢菌莲专化型，为土传病害。
选择无病、健壮、抗病种藕，合理轮作，对土壤及种藕消毒，化学防治等是预防该病害的几种有效的方法。
关键词：建莲；腐败病；症状识别；防治中图分类号：S436.45 文献标识码：B 文章编号：1001-3547（2013）18-0105-03建莲（Nelumbo nucifera Gaertn）是福建省建宁县传统特色名产，近年的年种植面积在3 300 hm2左右，年产干莲籽约3 500 t，总产值约 1.2 亿元，占建宁县农业生产总值的20%以上[1]。
在建莲生产过程中病虫害种类繁多，其中莲腐败病是最常发生的病害。
该病主要为害地下茎，造成地上部叶、花枯萎死亡，一般发病率在10%～20%。
结合多年田间调查及试验分析，将其识别要点及防治方法总结如下。
1 症状识别病菌从植株立叶抽生后开始侵染，至开花结实后期停止。
地下茎（莲鞭）及根被此病菌侵入后呈褐色至黑褐色病变，最后腐烂（图1A），将发病植株的地下茎在28℃左右保湿培养48 h后，可看见白色的菌丝体（图1B）。
地上部叶片病变表现为从叶缘开始青枯，最后整个叶片枯死（图1C）[2，3]。
2 病原菌的形态特征及生活习性莲腐败病由多种病原菌引起，主要为尖镰孢菌莲专化型[Fusarium oxysporum Sch. f. sp. nelumbicola （Nis. & Wat.） Booth]，属半知菌亚门真菌[4]。
2.1 形态特征目前此病原菌主要根据无性世代的形态特征来划分。
无性世代的分生孢子分为大型分生孢子和小型分生孢子。
大型分生孢子透明、无色、新月形、两端尖，具脚胞或不甚明显，顶细胞尖、顶端略弯曲，主要为3个隔膜，少部分为1～2个隔或4～5个隔。
绿色荧光蛋白（GFP）标记的尖孢镰刀菌 在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖
绿色荧光蛋白（GFP）标记的尖孢镰刀菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖作者：吕桂云郭绍贵张海英耿丽华许勇来源：《中国瓜菜》2019年第08期目的与意义：西瓜枯萎病是由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀菌寄生引起的一种真菌土传病害，是世界范围内导致西瓜产量和品质降低的最严重病害。
明确枯萎病菌与寄主植物之间的互作机制，揭示其相互作用的分子机制，可为西瓜抗枯萎病育种和病害防治奠定理论基础。
利用绿色荧光蛋白（GFP）作为标记，研究枯萎病菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖动态，从组织学的角度来阐释西瓜与枯萎病菌亲和互作和非亲和互作的差异。
材料与方法：1.以农杆菌AGL1为介导，将带有潮霉素抗性基因pCH-sGFP质粒转化到西瓜枯萎病菌中，成功获得了能稳定持续表达绿色荧光蛋白的枯萎病菌的突变株BEIJING1-sGFP，对转化子进行抗性鉴定表明，组成型表达sGFP的BEIJING1- sGFP不影响枯萎病菌的致病力。
2.以抗病品种‘PI 296341-FR’（PI）与感病品种‘Black Diamond ’（BD）为试验材料，种子消毒后催芽，采用浸根法接种病菌。
3.在接种后的 6 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d 、8 d取样进行激光共聚焦显微镜观察。
结果与分析：从西瓜枯萎病菌GFP转化株中选出致病力与转化前的野生型FON1在西瓜抗、感鉴别寄主上的表现无明显差异菌株命名为BEIJING1- sGFP，继代培养后的菌体都有稳定而强的荧光信号，但在细胞质中的液泡无荧光信号。
通过人工接种，在无菌条件下进行致病力的检测，BEIJING1- sGFP与转化前的野生型FON1在西瓜抗、感鉴别寄主上的表现无明显差异，说明GFP的转化和表达对枯萎病菌的转化株的致病力无明显影响。
用激光共聚焦显微镜观测GFP标记的西瓜枯萎病菌侵染西瓜感病品种‘Black Diamond’过程。
在接种6 h后，仅有少量孢子开始萌发（<5%），孢子从一端伸出形成芽管;在1 dpi附著在根系表面的孢子大部分都已经萌发，形成一个长芽管，芽管可向各个方向生长，菌丝在根表生长，随处可见。
用于鉴定尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病的分子标记及其应用[发明专利]
![用于鉴定尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病的分子标记及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/55a8cd40cbaedd3383c4bb4cf7ec4afe04a1b100.png)
专利名称：用于鉴定尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病的分子标记及其应用
专利类型：发明专利
发明人：王辉,王富,王宇,朱文莹,李文丽
申请号：CN202011145147.1
申请日：20201023
公开号：CN112176090B
公开日：
20220610
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了用于鉴定尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病的分子标记及其应用。
所述分子标记FrlDel30‑1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其为鉴定尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐专化型的分子标记；所述分子标记FrlDel30‑2的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，其为鉴定尖孢镰刀菌番茄枯萎病致病菌生理小种3型的分子标记，并且用于检测分子标记的引物对包括FrlDel30F：
5’‑GAGCGGGAGTTGAATTCTTG‑3’；FrlDel30R：5’‑AAGAGCCTGCTCCAGTTGAA‑3’。
本发明的分子标记能够简答、快速准确的区分尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型菌株及尖孢镰刀菌番茄枯萎病致病菌生理小种3型病菌，其对于感病番茄中尖孢镰刀菌的类型的鉴定以及感病番茄发病部位或组织的检测具有重要的作用。
申请人：青岛农业大学
地址：266000 山东省青岛市城阳区长城路700号
国籍：CN
代理机构：青岛合创知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：王晓晓
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不同镰孢菌侵染玉米茎部的效能分析
不同镰孢菌侵染玉米茎部的效能分析玉米镰孢菌茎腐病是玉米生产上的重要病害,该病的发生不仅给玉米产业造成重大损失,严重影响了玉米的机械化收获,而且病菌产生的毒素严重影响人与家畜的健康。
玉米茎腐病病原组成复杂多变,侵染机制尚不明确,现阶段对玉米茎腐病菌的研究大多局限于单一致病菌侵染。
本研究利用ATMT技术将青色荧光蛋白(CFP,Cyan fluorescent protein)标记到禾谷镰孢,并结合本实验室之前获得的绿色荧光蛋白标记的层出镰孢、红色荧光蛋白标记的拟轮枝镰孢,将3种不同标记的镰孢菌单独或者复合接种到玉米茎部,通过荧光检测和定量分析比较3者在侵染效能之间的差异,主要结果如下:1.采用重叠PCR方法改造质粒pCAMBIA1300,获得了带有青色荧光蛋白基因的质粒载体pCAMBIA1300-CFP-Kan,通过农杆菌介导的遗传转化将CFP基因导入了禾谷镰孢基因组中,通过PCR鉴定以及荧光检测,获得了31株青色荧光蛋白标记的禾谷镰孢转化子,从中选择了4株荧光信号较强的转化子进行了致病力鉴定,其中转化子Fg 9的致病力与野生型没有明显差异,另外3株转化子的致病力明显下降。
2.选取致病性与野生型菌株没有明显差异的禾谷镰孢转化子Fg 9,与本实验室前期获得的绿色荧光蛋白标记的层出镰孢以及红色荧光蛋白标记的拟轮枝镰孢,单独或复合接种到玉米茎基部,于接种后不同时间段取样观察。
结果发现,3种镰孢菌均能单独侵染玉米茎部组织,但是在玉米茎部的扩展能力差异较为明显,其中接种层出镰孢、拟轮枝镰孢的茎部病变较为严重,接种禾谷镰孢的症状较轻;3种镰孢菌复合接种时,茎部病变症状较单独接种拟轮枝镰孢或禾谷镰孢时严重。
3.对接种部位进行荧光观察,发现层出镰孢在侵染初期的24~48 h,可在细胞间隙扩展,沿寄主细胞壁延伸,72 h后开始侵入细胞,侵染后期(120~144 h)破坏植物细胞壁结构,侵占细胞内部;拟轮枝镰孢接种后72 h在细胞间隙可出现明显扩展,而禾谷镰孢96 h时明显扩展。
金线莲茎腐病病原菌分离及分子鉴定
金线莲茎腐病病原菌分离及分子鉴定赵云青;陈菁瑛;林晓军;刘保财;黄颖桢【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2014(000)010【摘要】采用组织块法对金线莲疑似茎腐病病原菌进行分离，用致病性试验、病原菌形态学观察、分子生物学方法对该病原菌进行鉴定。
结果表明：从收集的金线莲疑似茎腐病病原菌感染植株中分离得到的菌株，在培养基中产生大量气生菌丝呈棉絮状，菌丝在培养基中产生紫色色素，有隔及分枝，大型分生孢子纺锤形，小型分生孢子卵形或长圆形。
分离的菌株回接后可使金线莲植株产生病害，对扩增得到的rDNA-ITS序列进行 Blast对比分析，确定该病害为尖孢镰刀菌FusariumoxysporumSchl．引起的茎腐病。
【总页数】5页(P995-999)【作者】赵云青;陈菁瑛;林晓军;刘保财;黄颖桢【作者单位】福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建福州 350003; 福建省农业科学院药用植物研究中心，福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建福州 350003; 福建省农业科学院药用植物研究中心，福建福州350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建福州 350003; 福建省农业科学院药用植物研究中心，福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建福州 350003; 福建省农业科学院药用植物研究中心，福建福州350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建福州 350003; 福建省农业科学院药用植物研究中心，福建福州 350003【正文语种】中文【中图分类】S718【相关文献】1.金线莲白绢病病原菌分离及分子鉴定 [J], 赵云青;黄颖桢;陈菁瑛;刘保财2.海南南繁基地玉米茎腐病病原菌的分离及鉴定 [J], 牛艺诺;林宝英;刘全凤;刘永震;吴金山;戎伟;梅双双3.黄葵茎腐病病原菌的分离与鉴定 [J], 房云彬;刘常宏4.宁夏地区玉米镰孢茎腐病病原菌的分离与鉴定 [J], 张小杰;王春明;周天旺;刘浩;沈瑞清;李敏权;郭成5.1株海洋草酸青霉HY181-2的分离鉴定及其对金线莲茎腐病病原菌的生防能力[J], 林文珍;郭迟鸣;郭莺;林志楷;陈菲;刘黎卿因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
尖镰孢菌
镰孢属自然条件下分生孢子梗无色，有隔膜或无隔膜，培养条件下，分生孢子梗由菌丝直接分枝产生，极少形成分生孢子座。
分生孢子梗不分枝至多次分枝，顶端为产孢细胞。
产孢细胞内壁芽生瓶梗式产孢，具单个产孢口或多个产孢口。
一般产生两种类型的分生孢子：大型分生孢子微弯或弯曲显著，镰刀形，无色，多隔膜，基部常有一显著的突起称为足胞；小型分生孢子椭圆形、卵形、短圆柱形，无色，单胞或双胞，单生或串生。
瓜类枯萎病症状•瓜类作物枯萎病在黄瓜和西瓜等瓜类作物上的症状相似。
•黄瓜自幼苗期到成株期均可发病，以结瓜期为发病盛期，在长江中下游地区为5～6月。
幼苗发病多表现为出土前的苗腐和出苗后的猝倒。
•成株期枯萎病的典型症状是：初期基部叶片褪绿成黄色斑块，逐渐全叶发黄，随之叶片由下向上凋萎，似缺水症状，中午凋萎，早晚恢复正常，3～5天后，全株凋萎不再恢复。
拔出病根，外表症状不明显，但剖开根后，可见维管柬中有褐变或出现褐色条纹状病变。
•在多雨或高湿环境下，病株基部茎上常产生白色至粉红色的霉层（分生孢子梗和分生孢子）。
•全株凋萎、根系腐烂、茎基部有霉层和维管束变褐色等是黄瓜枯萎病的田间识别特征，据此可将该病和同样引起黄瓜死藤的菌核病和疫病区别开来。
病原物•病原物为尖镰孢Fusarium [fju:'zɑ:raiəm]oxysporum Schlecht.,半知菌亚门镰孢属。
镰刀菌是一类世界性分布的真菌，它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，寄主植物达100余种，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最艰难的重要病害之一•尖镰孢菌在PDA培养基平板上，气生菌丝白色絮状，培养基质呈淡黄或淡紫至紫蓝或紫黑色，在老熟菌丝上可以产生许多直径为1～2毫米的疏松絮状菌核。
三七根腐病菌茄腐镰刀菌的实时荧光LAMP快速检测方法的建立与应用
三七根腐病菌茄腐镰刀菌的实时荧光LAMP快速检测方法的建立与应用车晓莉;梁婷婷;曲媛;刘迪秋【期刊名称】《农业生物技术学报》【年(卷),期】2024(32)4【摘要】根腐病是我国三七(Panax notoginseng)种植区高发的一种严重病害,茄腐镰刀菌(Fusarium solani)是引起三七根腐病的重要病原菌。
本研究建立了一套对三七根腐病菌茄腐镰刀菌进行现场快速检测的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)体系。
首先通过PCR反应筛选D-氨基酸氧化酶基因(D-amino acid oxidase gene,DAO)为特异性检测茄腐镰刀菌的基因位点,并对该基因设计LAMP反应的特异性引物组并优化其反应条件,其中65℃为最佳反应温度,MgSO_(4)的最佳浓度为6 mmol/L;dNTPs的最佳浓度为0.6 mmol/L;有环引物存在的情况下,扩增效率更高。
分析了LAMP法检测茄腐镰刀菌的灵敏度,模板浓度可低至0.009 pg/μL。
最后结合DNA免提法以及钙黄绿素显色法建立了三七根腐病菌茄腐镰刀菌的LAMP现场快速检测技术。
本研究为三七种植以及种子种苗交易过程中的根腐致病菌茄腐镰刀菌的快速检测提供技术支撑。
【总页数】10页(P939-948)【作者】车晓莉;梁婷婷;曲媛;刘迪秋【作者单位】昆明理工大学生命科学与技术学院;云南省三七资源可持续利用重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S412【相关文献】1.三七根腐病菌尖孢镰刀菌的Real-time PCR检测方法2.分析工民建工程施工中节能技术的应用3.黄芪根腐病尖孢镰刀菌LAMP可视化快速检测方法的建立4.腐皮镰刀菌SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测方法的建立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种改进的尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法
一种改进的尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法摘要为实现荧光定量PCR对土壤病原真菌数量更为高效、灵敏的检测，本研究将液体培养的孢子悬浮液和长年耕作的水稻土制作成孢子浓度为4×101～4×106 spore/g的带菌土，采用MoBio PowerSoil@ DNA Isolation Kit提取模拟带菌土壤总DNA，引入常规PCR预扩增包含qPCR目标序列的1 446 bp片段，以预PCR产物为模板进行qPCR，构建荧光定量PCR标准曲线。
研究结果表明：以试剂盒提取的带菌土壤总DNA为模板绘制的qPCR标准曲线相关系数r为0.985，检测下限为4×103 spore/g土；引入预PCR后，qPCR标准曲线相关系数r为0.974，检测下限为4×102 spore/g土，较未引入时提高了10倍，结合不同土壤病原真菌的特异性引物，该检测方法可为土壤病原真菌的有效定量检测提供技术支撑。
关键词实时荧光定量PCR；土壤病原真菌；尖孢镰刀菌；检测下限中图分类号：S 436.68，S 154.3文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.04.024AbstractThe aim of this study is to develop a more efficient and sensitive method for quantitative detection of soil pathogens by realtime PCR. The soil samplescontaining 4×101-4×106 spore/g were prepared by mixing the cultured spore suspension and longterm cultivated paddy soil. The total DNA was extracted from the prepared soil samples using MoBio PowerSoil@ DNA Isolation Kit. A 1 446 bp DNA fragment containing the qPCR target sequence was amplified from soil DNA by conventional PCR，then the PCR products were used as templates to construct the standard curve of the fluorescence quantitative PCR. The results indicated that the correlation coefficient of qPCR standard curve was 0.985，and the lower limit of detection was 4×103 spore/g when the soil DNA was used as PCR templates. When the preamplified PCR products were used as template，the correlation coefficient of qPCR standard curve was 0.974，and the lower limit of detection was 4×102 spore/g，that is the sensitivity of the method increased by 10fold. These results showed that when combined with the specific primers of different soil pathogenic fungi，this method can provide technical support for effective quantitative detection of soil pathogens.Key wordsrealtime PCR；soil pathogenic fungi；Fusarium；detection limit土壤是農业生产的基本资料，土壤供给和协调农作物生长发育所需要的水分、养分、空气、热量、扎根条件等。
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建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白基因标记姚锦爱;张鸿;黄鹏;陈峰;余德亿【摘要】[目的]开展建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白标记研究,直观观察尖孢镰刀菌在建兰植株上的侵染为害,明确病原菌的致病过程,为开展建兰茎腐病原菌的相关研究提供良好技术手段.[方法]采用农杆菌介导法对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02进行绿色荧光蛋白(GFP)转化,并检测转化子的遗传稳定性.[结果]G F P基因可被成功导入到尖孢镰刀菌F-02中并获得表达,转化子在蓝色光源激发下,菌丝和分生孢子均能稳定散发绿色荧光;转化子10次继代培养后菌落生长良好,菌丝和分生孢子仍可稳定散发出绿色荧光,对寄主植物的致病力也未发生改变,[结论]G F P基因可在建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02中稳定存在,并对其致病力没有影响.【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2019(034)001【总页数】6页(P70-75)【关键词】建兰;茎腐病;尖孢镰刀菌;绿色荧光蛋白;基因标记【作者】姚锦爱;张鸿;黄鹏;陈峰;余德亿【作者单位】福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省作物有害生物监测与治理重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院作物研究所,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省作物有害生物监测与治理重点实验室,福建福州 350003【正文语种】中文【中图分类】S436.80 引言【研究意义】由尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum引起的建兰茎腐病是影响福建省建兰种植的最严重真菌病害之一，可引起兰株假鳞茎和根部腐烂、维管束褐变，导致兰株萎蔫至死亡，兰株感病率高达15%～35%[1]。
目前对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性已有一些认知[2]，但对该菌的致病机理还缺乏深入研究，因此探讨如何更直观、方便地观察该菌在建兰植株上的侵染、致病过程，对研究该菌在建兰上的致病机理、科学防治建兰茎腐病具有指导意义。
【前人研究进展】绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)是一种良好的标记物，其片段小，易于与多种不同蛋白N端或C端融合，表达后对寄主细胞无毒性作用并能自发产生荧光蛋白，可作为报告基因进行定位与定性检测，目前已广泛应用于植物病原菌致病机理的研究[3-5]。
现阶段，国内外学者已成功利用GFP基因标记了番茄、香蕉、甜瓜和香石竹等寄主植物上的尖孢镰刀菌[6-10].【本研究切入点】目前尚未见将GFP用于标记建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的研究报道。
【拟解决的关键问题】本研究以pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp为转化载体，农杆菌AGL-1为转化介体，采用农杆菌介导法对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02进行绿色荧光蛋白(GFP)基因标记，并检测转化子的遗传稳定性，为建兰茎腐病原菌的致病机理研究提供技术手段。
1 材料与方法1.1 试验材料建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F.oxysporum野生型菌株 F-02，来源于福建省农业科院学植物保护研究所。
转化载体pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp和转化介体农杆菌AGL-1，来源于福建省农业科学院农业生物资源研究所。
抗生素(潮霉素B、卡那霉素、特美汀)购自美国Sigma公司。
农杆菌转化所用药品均为分析纯，储存液及MM(Minimal Medium)液体培养基、IM(Induction Medium)液体培养基、CM(Complete Medium)固体培养基的配制见表1。
表1 农杆菌转化所需储存液及培养基的配制Table 1 Ingredients in stock solutions and media used for agrobacterium transformation制剂Reagent100 mL储存液Stock solution to 100 mL100 mL培养基所需药品用量Amount required to make 100 mL药品Chemical用量Amount requiredMM 液体培养基MM liquid mediumIM 液体培养基IM liquid mediumCM固体培养基CM solid mediumK-缓冲液 K-buffer (pH 7.0)K2HPO420 g1 mL1 mL1 mLKH2PO414.5 gM-N 缓冲液M-N bufferMgSO4·7H2O3 g2 mL2 mL2 mLNaCl 1.5 g1% 二水合氯化钙1% CaCl2·2H2OCaCl2·2H2O1 g0.1 mL0.1 mL0.1 mL微量元素Spore elementsZnSO4·7H2O0.01 g1 mL 1 mL 1 mL CuSO4·5H2O0.01 gH3BO30.01 gMnSO4·H2O0.01 gNa2MoO4·2H2O 0.01 g20%硝酸铵20% NH4NO3NH4NO320 g0.25 mL 0.25 mL 0.25 mL 20% 葡萄糖20% GlucoseGlucose20 g1 mL 1 mL 1 mL 0.01%硫酸铁0.01%FeSO4FeSO40.01 g1 mL1 mL1 mL50% 甘油50% GlycerolGlycerol50 mL-1 mL1 mL1 mol·L-1乙磺酸1 mol·L-1 MES (pH 5.3)MES 21.32 g -4 mL4 mL卡那霉素Kanamycin stock0.15 mL0.15 mL0.15 mL乙酰丁香酮Acetosyringone-0.2 mL0.2 mL琼脂Agar1.5g去离子水Sterile H2O93.5 mL88.3 mL88.3 mL1.2 农杆菌转化及培养建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02菌株的GFP基因标记参照Khang和张俊华等[11-12]的方法，略作改动。
具体步骤：(1)将菌株F-02在PDA固体培养基上纯化培养6 d，后加入无菌水将分生孢子刮洗后用2层无菌擦镜纸过滤，滤液用IM液体培养基将分子浓度调整到1×106 个·mL-1，备用；(2)将转入pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp载体的农杆菌AGL-1在MM液体培养基中，28℃及250 r·min-1摇培2 d，后用IM液体培养基将菌液吸光值调整为OD600=0.15，接着摇培6 h(OD600≈0.60)；(3)将混合纤维微孔滤膜[生工生物工程(上海)股份有限公司]放置在CM固体培养基上，将100 μL菌株F-02孢子悬浮液和100 μL农杆菌AGL-1孢子悬浮液轻轻混匀后均匀涂布于混合纤维微孔滤膜上，25℃暗培养2 d；(4)2 d 后，将共培养的混合纤维微孔滤膜用无菌解剖刀划成小块，接菌面朝上分散摆放到筛选培养基(含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀的PDA固体培养基)上，28℃暗培养3 d；(5)经筛选培养基上培养后，将培养皿整皿放置在BD-BGC1蓝光切胶仪(上海勤翔科学仪器有限公司)中，在蓝色激发光下观察菌落发光情况，挑选发出绿色荧光的小菌落，取边缘菌丝于无菌水中，按梯度稀释涂布培养3～5 d后，将单一的孢子体转接到PDA固体培养基(含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀)上进行单孢分离与纯化，获得转化子。
1.3 转化子荧光显微镜观察鉴定将转化子用含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀的PDA固体培养基，28℃培养6 d后，挑取转化子菌丝和分生孢子样品制玻片，在奥林巴斯IX73荧光显微镜下进行观察鉴定以及照相。
1.4 转化子的遗传稳定性测定随机挑取6个经单孢纯化后的单菌落即转化子，接种于PDA 固体培养基中，28℃培养6 d，选取平皿边缘的菌丝转接到新的PDA固体培养基中，按以上方法连续培养9代，后将第10代接种到PDA固体培养基(含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀)中，观察转化子菌落生长情况；同时挑取转化子的菌丝和分生孢子制成玻片，在荧光显微镜下进行观察鉴定及照相，以野生型菌株F-02为对照。
1.5 转化子的致病力测定参照许志刚[13]的方法测定转化子的致病力。
将野生型菌株F-02和转化子菌株在PDA固体培养基上于28℃活化培养6 d，备用。
田间选取叶片和假鳞茎等无伤痕的一年生建兰健康植株，用无菌水轻轻冲洗干净，自然晾干后用于致病性测定。
采用造伤接种法进行接种：在植株假鳞茎部用无菌接种针轻轻刺伤，后敷上0.5cm×0.5 cm待测菌株的菌丝块，用无菌水浸湿的棉花包裹菌丝块保湿，后置于冷光源植物气候箱DRX-400(宁波赛福实验仪器有限公司)中，温度(28±0.5)℃，光周期16 L∶8 D，接菌5、7、15 d后观察发病情况，两处理菌株各接菌5株建兰植株，3次重复，待假鳞茎部产生典型病斑后重新分离病原菌。
同时，切取转化子的接种部位进行徒手切片，在奥林巴斯IX73荧光显微镜下选取观察效果佳的玻片，后使用Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜进行观察及拍照。
2 结果与分析2.1 菌株在混合纤维微孔滤膜上的转化情况建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02孢子悬浮液，在混合纤维微孔滤膜上与农杆菌AGL-1孢子悬浮液共培养2 d后，发生转化，产生少量菌丝和细菌混合物，略呈紫色(图1)。
图1 菌株F-02与农杆菌共培养后在混合纤维微孔滤上的生长情况Fig.1 Co-culture of F-02 and agrobacterium on mixed fiber microporous membrane 2.2 菌株转化后在筛选培养基上的生长情况经转化后的建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02，平贴在筛选培养基(含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀的PDA固体培养基)上，经过28℃暗培养3 d 后，在蓝光切胶仪中呈现绿色荧光小菌落，此小菌落即为转化子(图2)。
图2 转化子在筛选培养基上生长形态Fig.2 Morphology of transformants onselective medium2.3 转化子的荧光显微镜观察鉴定转化子的菌丝和分生孢子均能发出稳定的绿色荧光(图3)，说明GFP 基因已成功转入到建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02中并获得表达。