【精品】ELISA基础知识及常见问题的处理汇总

❖ 室内质控：实验室内部使用控制实验结果可 靠性的一种质量控制。
❖ 室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性 的一种考核，可分为国家级和地方级的室间 质评。可以理解为 “各个实验室的质量评 比”。
临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳性 或有临床意义水平的数值，临界值的确定是测 定大量数据后应用统计学方法确定的。许多试 剂都会给出临界值或临界值的计算方法。
本底：就是底色。如ELISA HBsAg，阳性显色， 阴性不显色，本底就是整个阴性显色的情况。 ELISA 抗–HBcAb，阳性不显色，阴性显色， 本底就是整个阳性显色的情况。
阴性对照及阳性对照：阴、阳性对照若有正确 的结果，对试剂盒操作的结果可以有粗略的判 断。
空白对照：对ELISA试剂来说，空白对照实际 上是不加标本不加酶做对照。空白对照主要测 系统的吸光率。空白对照在单波长测量时显得 尤其重要。
诊断试剂所用的质量指标及相互关系：
灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。
❖ 相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100% ❖ 测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控血清、阳性标
本稀释终点、血清盘（pannel）及临床标本阳性率。 ❖ 灵敏度标准品可以从卫生部临检中心购买，质控血清可以
❖ 以下为ELISA试剂盒常见问题处理对策：
显色浅 灵敏度低
序号 原因
解决方法
1
试剂盒运输时间过长，受高温天气影响，酶的 试剂运输过程加放足够冰袋并尽可能缩短运输
活性降低。
时间。
2
试剂盒（包括未用完的板条及其他组分）保藏 试剂盒内所有组分都应当在4℃冷藏，未使用完
条件不正确。
பைடு நூலகம்
的板条要密封保存。
3
试剂盒使用时已超出有效期。
4
温育时间不够。
5
恒温箱温度达不到37℃。
过期试剂盒不可以使用。
严格按照说明书操作。
注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在 37±0.5℃。尽量避免频繁开关恒温箱门。
经常注意水箱中合适的水位。 在保证水不没过酶标板的前提下，使水位尽量
高，以保证反应温度。
6
加样量不足；移液时抽吸排放过快， 经常校正移液器。注意吸头要与移
特异性： 真阴性标本的检出能力。
❖ 相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）×100% ❖ 测定及表示方法：质控血清、血清盘、临床标本阴性率。 ❖ 质控血清、血清盘可以从卫生部临检中心购买，也可以自
己配制。自己配制时注意阴性标本的在血清盘中的比例以 及代表性。临床标本阴性百分率是临床使用中对试剂盒特 异性的粗略的判断。
ELISA 试剂常见问题及解答
❖ ELISA试剂的原理基础为抗原抗体免疫反应，在生 产、储存、运输、使用等各环节中，对其质量特性 产生影响的因素众多。此外，其显色系统中的过氧 化物酶在生物样品中普遍存在，故在客户使用过程 中经常会产生某种非期望的结果。对问题进行客观 的分析、有针对性的解决问题，不仅是用户的希望， 也是促进我们自身产品质量提高的关键。
使用。
10 试剂开启时间过长，污染。
试剂开启后应该在尽可能短的时间 内用完，在保证正确贮存的前 提最长不要超过。
12 不同批号试剂中混用
不同批号试剂不能混用
假阳性多，本底高甚至花板
序 原因 号
1
试剂过期
2
加样时污染
3
加酶时污染
解决方法
过期试剂不能使用
注意更换吸头。尽可能避免污染。
相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的 酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应：
固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标抗体Ab* → Ag-Ab + 底物(TMB)→不显色(+)
固相(包被)抗原Ag + 样品(无抗体Ab) + 酶标抗体Ab* → Ag-Ab* + 底物(TMB)→显色(-)
❖ 间接法
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记 的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗 原结合的受检抗体，故称为间接法。
其检测方法：
固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标二抗Ab* → Ag-Ab-抗Ab* + 底物(TMB)→显色
❖ 竞争法 其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固
有气泡、或吸头内残留液体过
液器吻合。移液不宜过快，排
多。
放要完全。
7
显色剂加量不足，或加入顺序颠倒。 按照说明书要求，先加入A液、后加
入B液，并保证加入量。
8
样品用NaN3防腐，影响了酶的活性。 不可以使用NaN3防腐。
9
试剂、样品使用前未平衡至室温。 试剂、样品从低温保藏条件中拿出
来后，要先平衡至室温方可以
ELISA基础知识及常见问题的处 理
ELISA检测方法
❖ 夹心法: 双抗原（抗体）夹心法是检测抗原最常用的方法，其检测方法：
双抗原夹心： 固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标抗原Ag* → AgAb-Ag* + 底物(TMB)→显色
双抗体夹心： 固相(包被)抗体Ab + 样品(抗原Ag) + 酶标抗体Ab * → AbAg-Ab* + 底物(TMB)→显色
从卫生部临检中心购买，也可以自己配制。因为质控血清 不一定是原倍血清，或由于片段、亚型、位点等原因，评 定试剂盒的灵敏度都带有一定的片面性。 ❖ 阳性标本稀释终点的方法常用于不同试剂盒的比较，但也 有上述的片面性。阳性pannel有些可以从卫生部临检中心 购买，如HBsAg阳性pannel，也可以自己配制。临床标本 阳性率，是一种粗略的估计，但对临床很实用。
❖ 如果数批产品都通过了特异性参比测定，是否产品的特异 性就一样了呢？不一定。因为特异性参比品的数量不可能 很大（样本与整体的差异），引起非特异性的因素很多， 目前尚不完全清楚。质控血清盘也存在同样的问题。
有关名词简介
❖ 质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制 而配制的血清。质控血清可以是定值也可以是不 定值，可以购置也可以自配。自己配制时要注意 选用无脂血的血清或血浆，不能用试剂盒内的阳 性对照。若用稀释的血清作为质控血清，应考虑 稀释基质成分对结果的影响。因质控血清与临床 标本不一致，应该注意对结果的分析，应该注意 质控血清只能用于质控活动，不可用于标定仪器 或评价方法。用于室内质控的质控血清一般选取 CUTOFF值2-3倍的质控品。