疯牛病(TSE)检测的研究进展X

疯牛病(TSE)检测的研究进展Ξ

曾　明,漆文革3综述　雷殿良,李德富审校

(中国药品生物制品检定所,北京　100050)

摘　要:近年来,对TSE检测的研究发展非常迅速。尽管朊病毒的分类本质尚不明确,但一些生物学特性已有研究,如传染性、抵抗力等,其检测技术包括:早期利用宿主动物牛或转基因小鼠的生物学方法;有多种免疫诊断方法可区分正常和异常的朊病毒蛋白,欧盟验证了三种免疫诊断方法,瑞士Prionics公司的免疫印迹法、爱尔兰En fer Scientific公司的E LIS A法和法国CE A和英国Bio2Rad公司开发的夹心免疫法,三种检测方法准确性为100%,因此,欧盟授权这三种检测方法用于欧洲检测疯牛病,此外,基于免疫荧光方法和毛细管免疫电泳的方法也有应用;研究人员还尝试通过对TSE感染过程中出现的相关蛋白、朊病毒的形态变化的检测来诊断TSE,也有针对TSE发病过程中,异常朊病毒蛋白在脑部出现聚集,采用不同手段用以诊断;在体外模拟感染性PrP(Sc)引起正常细胞表面蛋白PrP构象改变的过程也应用于TSE的检测。对潜伏期的诊断试剂研究正在进行中,但目前并未取得满意的结果。对朊病毒污染生物制品的可能性进行评估非常必要,对生产过程的监测非常重要。相信未来3～5年将开发出高敏感性、高特异性和使用方便的TSE诊断方法。

关键词:疯牛病;TSE;检测

中图分类号:S858.23 文献标识码:A 文章编号:100525673(2002)20320058204

在过去几年中,介入TSE诊断领域的公司急剧增加,主要原因在于潜在的巨大市场利润,一方面是对牛群是否感染的检测,欧盟要求对所有30月龄以上的牛进行检测;另一方面是对生物制品,主要是血液制品的检测,也包括疫苗生产原材料如小牛血清的检测。基于投入力度的增加,TSE检测的研究发展非常迅速,相信在未来几年,多种敏感且特异的诊断方法将广泛应用。现将其研究进展作一简要综述。

1　几个与疯牛病相关的名词

Transmissible spongiform encephalopathy(TSE)可传播海绵状脑炎,由朊病毒引起的一类进行性、不可治愈的致死性疾病的统称,主要特征为痴呆,验尸时脑部有空洞;当一种哺乳动物食用另一种哺乳动物的脑或脊髓时可传播。

Mad cowldisease:疯牛病,TSE的俗称。

Prion:朊病毒,新型感染因子,通过链式反应摧毁神经细胞的感染性蛋白。

Creutz feldt2Jakob disease(C JD):克2雅氏病,发生于人的、自发的TSE。

Variant creutz feldt2Jakob disease(vC JD):新型克2雅氏病,食用污染牛肉而发生于人的TSE。

Bovine spongiform encephalopathy(BSE):牛海绵状脑炎,发生于牛的TSE。

Scrapie:羊骚痒病,发生于羊的TSE。

Chronic wasting disease(CW D):慢性消瘦疾病,发生于鹿或麋鹿的TSE。

2　TSE病原体的特点〔1,2〕

1996年报道,认为新型克雅氏病(vC JD)来源于BSE,引起人们对通过食用污染的肉类而由牛到人种间传播的关注,有实验表明BSE和vC JD的病原体是一致的。TSE为非传统意义上的病原体,数十年的研究已为我们提供了大量的信息,但仍有几个关键性的问题并未解决,如病原体的分类本质(如病毒/朊病毒/细菌/或其他;传播途径;最小感染量;)。

对TSEs病原体的解释包括感染性蛋白(朊病毒理论);非传统/慢病毒或细菌;自身免疫学说等;最为广泛接受的是朊病毒学说,即一种新型的无核酸感染性蛋白粒子引起的,PrP(朊病毒蛋白)是一种正常细胞蛋白构象改变的类型,一般宿主中不存在。正常和异常蛋白的差异见表1〔1〕。在实验动物中去除PrP基因可使小鼠完全抵抗感染。病原体的传播能力受多种因素的影响,包括:途径、剂量、种属和中间屏障的有无;如脑内途径比静脉的感染性高10

Ξ江西民星集团,南昌　330046

作者简介:曾明(19662),男,博士,副研究员,主要从事微生物学与免疫学工作。

倍,而种间屏障则可减少1000倍,朊病毒在动物缩主间传播时可进行修饰,所以,一羊骚痒型在通过牛的传递后可对人产生威胁。潜伏期长短取决于感染途径,可有数年和数月不等。

表1　朊病毒蛋白PrP的正常和异常类型特点对比〔1〕

正常PrP 异常PrP 称为PrPsen或PrPc称为PrPres或PrPsc

对蛋白酶敏感对蛋白酶相对不敏感

与动态平衡相关与TSEs相关,推测为其感染因子

在几种组织和细胞类型中发现脑、中枢神经组织和其他非神经组织

细胞表面糖蛋白大型聚集体和淀粉样纤维

可溶于温和清洁剂不可溶于温和清洁剂

大多为螺旋结构大多为折叠结构

自然蛋白有神经毒性

一般来说,TSE病原体对一系列物理和化学方法具有强抵抗力,干热(160℃,24小时无影响;360℃1小时后有感染能力),高压灭菌(126℃1小时后仍有感染性);抗UV和碘照射;适应广泛的pH范围(2～10);抗酒精以及酚类消毒剂。

3　首次有诊断意义的突破性研究

最早应用的生物学方法为,将所怀疑已感染的动物材料接种至正常宿主动物,若干月或年之后,出现结果,显然这一方法不可能在实际诊断中应用。1997年,加利福尼亚大学的学者建立了一株超表达小牛朊病毒蛋白PrP的转基因小鼠〔3〕。正常小鼠对于BSE有一定抗性,加入小牛PrP基因后导致小鼠不仅敏感,甚至比自然宿主—牛还要敏感,转基因小鼠感染后几个月即死亡,而牛一般几年出现死亡。这一研究的意义显然不仅仅在于提供了一种较为快速的检测方法,同时为研究BSE提供了重要实验手段,并且可确定感染牛组织中较为精确的朊病毒浓度。

4　免疫学诊断

TSE诊断的实际应用需要更加快速并且可同时检测大量样本的方法,目前有多种免疫诊断方法可区分正常和异常的朊病毒蛋白,可以满足这一需求。欧盟验证了三种免疫诊断方法,瑞士Prionics公司的免疫印迹法、爱尔兰En fer Scientific公司的E LIS A法和法国CE A和英国Bio2Rad公司开发的夹心免疫法〔2,4〕验证研究包括检测300份感染BSE牛脑组织样本,1000份来自正常牛样本,结果表明,三种检测方法准确性为100%,无假阳性和假阴性,因此,欧盟授权这三种检测方法用于欧洲检测疯牛病。

Pronics公司的Pronics Check法采用Western blot 法检测朊病毒蛋白,全程需要24小时,自1999年初已为瑞士和英国授权用于牛的过筛检测,并可对处于潜伏期动物进行BSE检测。其推荐使用的Invit2 rogen公司生产的蛋白电泳凝胶NuPAGE最近已获美国专利。Prionics公司最近与R oche公司签定了协议,一方面推广其产品,另一方面合作开发对活动物进行血液检测的试剂,鉴于血液中所含朊病毒少,这一研究预计需要较长时间。

CE A/Bio2Rad公司的Platelia试剂采用夹心免疫法,约4小时出结果,尤其适用于有大量样本的情况下,该产品预计将有每月1百万的生产量,目前在德国等欧洲国家的销售良好。该方法最近与传统接种动物的方法平行对比,检测感染BSE牛脑组织稀释样本,结果表明至少其准确性良好,有可能用于检测处于潜伏期的标本。目前该公司同样着力于对血液标本检测的研究和开发。

En fer的产品为E LIS A法,24小时可出结果,通过采用自动化仪器可用于高通量检测。目前主要在爱尔兰使用,用于检测宰杀后人用牛脊髓和感染BSE牛的检测。

其他一些公司也在着力开发免疫诊断试剂。如EGG Wallac的基于免疫荧光方法的Delfia试剂,敏感性非常高,也经过了欧盟的评价,因结果不理想而未获欧盟授权使用,但英国农渔食品部(M AFF)同意将其用于检测英国的牲畜以进行确证,并推荐由欧盟进行再次评估。目前欧盟正考察其他5种检测方