第三章 动物细胞工程制药文稿演示

2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
磷酸钙沉淀法和电穿孔法。
磷酸钙沉淀法是将溶解的DNA加在Na2HPO4溶液内， 再逐渐加入CaCl2溶液，当二者形成磷酸钙沉淀时，DNA被 包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸钙共沉淀物，当该沉淀与细 胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入其中。
二、生产用动物细胞的获得
生产中的动物细胞有：原代细胞、二倍体细胞系、无限 传代细胞系和利用上述3种细胞进行融合和重组的工程细胞系 。
1.原代细胞
直接取自动物组织、器官。
2.二倍体细胞系
原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的 组织中挑选并纯化出具有某些特征的细胞株，这类细胞仍 然是二倍体核型，具有贴壁依赖和接触抑制特性，无致瘤 性，一般从动物胚胎组织中获取。
纤维样细胞：主要来自中胚层组织的细胞（成纤维细胞、心 肌细胞、成骨细胞、平滑肌细胞）
上皮样细胞主要外胚层和内胚层的组织细胞（皮肤细胞、肠 管上皮细胞和肺泡上皮细胞等）
2.悬浮细胞 悬浮细胞的生长不依赖支持物表面，可以在培养液中呈
悬浮状态生长（血液中的淋巴细胞、Namalwa cell）
3.兼性贴壁细胞 既可以贴附于支持物表面生长，在一定的条件下，也
3.转化细胞系 异倍体细胞，没有正常细胞的特点，可以无限增殖。 自发形成：啮齿动物。
人工转化：病毒或化学试剂。
4.融合细胞系
细胞融合是指两个或两个以上细胞合并成一个细胞 的过程。
诱导 仙台病毒和聚乙二醇（PEG） 高压电场的电融合
（1）仙台病毒融合法
少用（感染困难、融合慢、去病毒困难）
①病毒加入两种细胞后，4℃条件下，病毒附着在两种细胞 的细胞膜上，使两种细胞互相凝聚。 ②在37℃条件下，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破 坏； ③两个细胞的连接部位穿通，周边连接部修复。 ④细胞融合。
用于临床。
利用动物细胞作为宿主细胞生产药品缺点： 培养条件苛刻，成本高，产量低。
第三节 生产用动物细胞的要求和获得
一、生产用动物细胞的要求
不是所有的动物细胞都可以用于生产人用的药品。
原代细胞→二倍体细胞→异倍体细胞 现在基本上已经取消了生产用动物细胞必须用传代细 胞的限制，但是对最终产品中的DNA含量做了严格的要求 。
6.动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 动物蛋白合成场所：游离核糖体和糙面内质网结合的核 糖体。 游离核糖体：细胞质基质内蛋白； 糙面内质网结合核糖体：分泌蛋白和膜中整合蛋白，修 饰后成为糖蛋白。
细菌：无糙面内质网。
利用动物细胞作为宿主细胞生产药品优势： ①蛋白多分泌到细胞外，易于收集和纯化； ②具有完善的翻译后修饰系统，产物更接近天然，适
第三章 动物细胞工程制药文稿演示
细胞工程是一门应用科学和工程技术，具体包括： 真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术 细胞融合的理论和技术 细胞器特别是细胞核抑制的理论和技术 染色体改造的理论和技术 转基因动植物的理论和技术 细胞大量培养的理论和技术 有关产物提取纯化的理论和技术
第二节 动物细胞的形态和生理特性
有癌变的特点，但并不是癌细胞；癌细胞可以通过无限增殖成为无限细胞系 。
4.动物细胞对周围环境敏感
动物细胞有膜无壁。
5.动物细胞对培养基的要求高
至少12种必需的氨基酸、8种以上的维生素、必要的 无机盐和微量元素、作为碳源的葡萄糖，还需要多种细胞 生长因子和贴壁因子才能生长。
不同的细胞对培养基的要求也会有所不同。
可以在培养液中呈悬浮状态良好地生长。
二、动物细胞的分化组成和代谢
1.动物细胞的化学组成
水、无机盐、蛋白质、糖、脂类和核酸组成。 细胞中水占绝大多数，占细胞鲜重的85%-95%，无机 盐占1.5%，蛋白质占7%-10%，脂类占1%-2%，其他物质 占1.5%。
2.动物细胞的代谢 糖、脂、蛋白质等有机物大分子的代谢一般都可以分成
三、基因工程细胞的构建和筛选
1.真核细体 质粒载体
腺病毒 杆状病毒
杆状病毒作为载体的优点： （1）杆状病毒基因组是双链DNA，容易进行重组； （2）可插入较大片段的外源表达基因，插入7-8kb外源基 因而不影响正常病毒粒子的形成； （3）多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外 源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染能力的病毒 粒子； （4）多角体蛋白基因有强启动子，蛋白表达量较高； （5）多角体是一个明显的标记物，可以直接用显微镜观察 ，易于筛选阳性克隆； （6）如果是家蚕杆状病毒作载体，可以直接在家蚕体内进 行外源基因表达。
（2）聚乙二醇融合法
产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备。
（3）电融合法 利用电场进行人工诱导细胞融合，是利用细胞在短时间
的电场作用下，细胞膜发生可逆性的电击穿，而使相邻的细 胞的细胞膜相互发生继发性融合。
操作简便、无化学毒性、对细胞损伤小、融合同步和融合 率高，可在显微镜下直接观察融合情况。
5.重组工程细胞系 利用基因工程技术手段重组的各种细胞系。
三、动物细胞特点
1.细胞的分裂周期长 同细菌、酵母比较 不同种属、同种属不同组织比较
2.细胞生长需贴附基质，并有接触抑制现象（密度依赖抑 制）
二倍体特有。
3.正常细胞的生长寿命是有限的
细胞从离体培养开始，我们称之为原代培养，随后细胞经 过传代后，即成为有限细胞系。
细胞经过一些人为的或自然的因素转化为异倍体后，细胞 就可转变为无限细胞系，或称连续细胞系。这种细胞的寿命是 无限的，适合工业化生产的需要。
一、动物细胞的形态
动物细胞高度分化。
离体培养的细胞可分为两类：贴壁依赖型细胞和贴壁 非依赖型细胞，前者可简称为贴壁细胞，后者简称为悬浮 细胞。
1.贴壁细胞
贴壁细胞必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身 分泌的或者培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增 殖。
贴壁细胞在表面生长后一般形成两种形态——纤维样细 胞和上皮样细胞。
三个降解阶段：
①生物大分子降解为小分子； ②小分子物质进一步代谢转化为三个主要的中间产物——乙 酰辅酶A、α-酮戊二酸和草酰乙酸； ③三种中间产物进入TCA循环，为动物的生命活动供能。
在氧气供应不足或者剧烈运动造成的局部缺氧时，动 物细胞可以进行无氧呼吸——糖酵解供能。
在动物细胞的体外培养中，供能物质主要是葡萄糖和 谷氨酰胺。