第一代无细胞百日咳疫苗毒性国家参考品制备工艺的研究

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破伤风类毒素的发展历史及进展

破伤风类毒素的发展历史及进展摘要：破伤风是一种严重危害人民生命健康的疾病,当今仍然是一个世界性的难题,在广大贫困落后的第三世界的国家和地区更为严重。

本文主要介绍破伤风类毒素的发展历史以及应用和研究进展。

关键词：破伤风；类毒素；研究；应用一些经变性或经化学修饰而失去原有毒性而仍保留其免疫原性的毒素。

某些细菌外毒素可用甲醛等处理后脱毒的制品，毒性虽消失，但免疫原性不变，故仍然具有刺激人体产生抗毒素，以起到机体从此对某疾病具有自动免疫的作用。

它们广泛地应用于预防某些传染病。

如向人体注射白喉类毒素后可以预防白喉。

其他的还有破伤风类毒素、葡萄球菌类毒素、霍乱类毒素等。

亦可把它们注射到动物体内用于制备抗毒素。

细菌的外毒素经甲醛处理后，失去毒性而仍保留其免疫原性，能刺激机体产生保护性免疫的制剂。

常用的甲醛溶液的浓度是0.3～0.4％。

它可使细菌外毒素的电荷发生改变，封闭其自由氨基，产生甲烯化合物（CH2=N-）。

其他基团（如吲哚异吡唑环）与侧链的关系亦可改变，成为类毒素。

常用的类毒素有白喉类毒素，破伤风类毒素。

另外，若在类毒素中加入适量的磷酸铝或氢氧化铝，即成吸附精制类毒素。

该类制剂在体内吸收较慢，能较长时间刺激机体，使机体产生高滴度抗体，增强免疫效果。

类毒素也可与死疫苗混合制成联合疫苗。

如百白破三联疫苗，就是由百日咳死菌苗、白喉类毒素、破伤风类毒素混合制成的。

主要用于儿童，注射后可同时预防儿童易发的白喉、百日咳、破伤风三种疾病。

类毒素在预防由外毒素引起的传染病中起重要作用，可用于人和动物的免疫接种，使其通过人工自动免疫获得抗病能力；还可用来免疫动物，再从动物血液中提取含抗毒素的血清，将此抗血清注入人体后，可使人体通过被动免疫的方式，立即获得相应的特异性免疫力。

1破伤风类毒素的发展历史破伤风是一种严重危害人民生命健康的疾病,当今仍然是一个世界性的难题,在广大贫困落后的第三世界的国家和地区更为严重。

据估计,全世界每年有几十万至一百万的死亡病例,死于破伤风的80%为新生儿[1、2]。

百日咳疫苗的生产与质量控制

百日咳疫苗的生产与质量控制百日咳疫苗是儿童接种疫苗中的一种，其主要作用是预防百日咳这种高传染性的呼吸道疾病。

由于儿童免疫系统尚未完全发育，因此百日咳对儿童的危害极大。

为此，各国政府对儿童进行百日咳疫苗的接种已成为常规实践。

然而，疫苗的生产和质量控制却是影响其效果和安全性的重要因素，本文将对这两个方面进行介绍。

一、百日咳疫苗的生产百日咳疫苗的生产是一个比较复杂的过程，其中包括病毒分离、病毒培养、灭活处理、疫苗提取、疫苗纯化、疫苗配方和疫苗灌装等步骤。

每个步骤都有其独特的要求和挑战，下面我们逐一进行介绍。

1. 病毒分离病毒分离是百日咳疫苗生产的第一步，其目的是从患者体内分离出百日咳病毒。

病毒分离可以采用细胞培养法或动物接种法。

这个过程需要在高洁净的条件下进行，以避免污染和混杂。

2. 病毒培养病毒培养是将病毒在充足的培养基中增殖，以获取足够的病毒量。

病毒在细胞培养物中的增殖需要遵循一定的生长曲线，同时还需要考虑到病毒队列的免疫原性和毒力等因素。

3. 灭活处理由于百日咳病毒具有强烈的毒力，因此必须在疫苗生产之前对其进行灭活处理。

灭活处理一般采用化学或热灭活方法，严格遵循灭活条件和灭活效果的要求。

4. 疫苗提取和纯化疫苗提取是将灭活的百日咳病毒分离出来，并加工成疫苗。

疫苗提取需要使用一系列的分离和加工技术，来确保疫苗的纯度和免疫原性。

5. 疫苗配方和灌装疫苗配方是将制好的疫苗和一定配方的其他成分混合，这些成分包括抗生素、稳定剂和助剂等，以达到预期疫苗的效果。

疫苗灌装是将已经配好的疫苗注入疫苗瓶中，并根据不同疫苗分装不同的规格。

二、百日咳疫苗的质量控制尽管各个疫苗厂家都对百日咳疫苗的制造过程进行了严格的质量控制，但是在生产和分装过程中，仍然存在着一些质量问题。

下面我们简要介绍一下百日咳疫苗的主要质量问题。

1. 疫苗批号和有效期疫苗的批号和有效期是百日咳疫苗质量的重要指标，必须要在包装上有明确标明。

如果批号或有效期有误，可能会导致给儿童接种有害的疫苗，影响儿童的健康。

什么是生物制品

生物制品命名规程Requirements for Terminology of Biologics1生物制品的定义生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。

目前，我国人用生物制品包括细菌类疫苗（含类毒素）、病毒类疫苗、抗毒素及免疫血清、血液制品、细胞因子、体内及体外诊断制品以及其他活性制剂（包括毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、重组DNA产品、抗原-抗体复合物、免疫调节剂、微生态制剂等）。

2生物制品的种类根据各种制品的组成及用途分类如下。

2．l疫苗（Vaccines）2．l．l细菌类疫苗（Bacterial Vaccines）由有关细菌、螺旋体或其衍生物制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、重组DNA疫苗、亚单位疫苗等，如卡介苗、伤寒Vi多糖疫苗、破伤风疫苗（类毒素）等。

2．1．2病毒类疫苗（Viral Vaccines）由病毒、衣原体、立克次体或其衍生物制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、重组DNA疫苗、亚单位疫苗等，如麻疹减毒活疫苗、重组（CHO细胞）乙型肝炎疫苗等。

2．l．3联合疫苗（Combined Vaccines）由二种或二种以上疫苗抗原原液配制成的具有多种免疫原性的灭活疫苗或活疫苗，如百日咳、白喉、破伤风联合疫苗（DTP），麻疹、流行性腮腺炎、风疹联合疫苗（MMR）等。

2． 2抗毒素及免疫血清（Antitoxin and Antisera）由特定抗原免疫动物所得血浆制成的抗毒素或免疫血清，如破伤风抗毒素、抗狂犬病血清等，用于治疗或被动免疫预防。

2．3血液制品（Blood Products）由健康人的血浆或特异免疫人血浆分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分或血细胞组分制品，如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子（天然或重组的）、红细胞浓缩物等，用于诊断、治疗或被动免疫预防。

中和抗体检测应用于新型冠状病毒mRNA_疫苗效力分析

国家药监局重点实验室专栏[重点实验室简介]国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室是国家药监局２０１９年首批认定的重点实验室ꎬ依托单位为中国食品药品检定研究院生物制品检定所ꎮ生物制品检定所主要开展应用基础研究ꎬ方向包括:治疗类生物技术产品㊁预防类菌苗/疫苗及其创新性产品和一些重要的体内外诊断试剂(血液筛查)的质量控制和质量评价研究ꎻ建立符合国际规范的质量检定用标准物质㊁生产与检定用菌种库和细胞库等ꎮ通过提供疫苗及生物技术产品等国家标准物质㊁建立标准的检验技术㊁研究与制定完善的药品质量标准ꎬ生物制品检定所在我国药品质量控制㊁创新性药品研究与产业化发展中起到不可或缺的技术支撑作用ꎮ生物制品质量研究与评价重点实验室具备完善的生物制品检验检测体系ꎬ检测技术范围与检测能力在国内相同领域是唯一的也是最全面的ꎬ共获得的ＣＮＡＳ实验室资质认定的项目２２２项ꎮ２０１３年生物制品检定所被评估认定成为ＷＨＯ生物制品标准化和评价合作中心ꎬ２０１７年通过ＷＨＯ生物制品标准化和评价合作中心再认定ꎮ通过广泛的国际药交流(ＷＨＯ㊁英国ＮＩＢＳＣ㊁美国药学会㊁美国ＦＤＡ和人用药物注册技术要求国际协调会议ＩＣＨ等)ꎬ重点实验室不仅引进国外先进的药品质量监管理念和技术ꎬ还将我国的一些优势技术运用于国际标准品和国际药品质量标准的建立中ꎬ在相关领域的国际标准制定中发挥重要作用ꎮ实验室主任:徐苗ꎬ女ꎬ医学博士ꎬ研究员ꎬ博士生导师ꎬ中国食品药品检定研究院生物制品检定所所长ꎮ主要从事疫苗等生物制品质量控制与评价的研究和管理工作ꎮ先后主持国家级课题４项ꎬ参与省部级以上课题６项ꎬ以第一或通信作者在«Ｎａｔｕｒａｌｐｒｏｔｏｃｏｌｓ»«ＥｍｅｒｇｉｎｇＭｉｃｒｏｂｅｓ＆Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ»等杂志上发表论文８０余篇ꎬ编写专著５部ꎬ获授权专利６项ꎬ其中３项已经完成转化ꎬ先后获得中华预防医学会科学技术一等奖㊁中国防痨协会科学技术奖一等奖㊁中国药学会科学技术奖二等奖㊁北京市科学技术二等奖等多个奖项ꎮ获国家市场监管总局抗击新冠疫情先进个人㊁中国药学会以岭生物青年生物奖等ꎮ㊀基金项目:国家重点研发计划(Ｎｏ.２０２１ＹＦＣ２３０２４０４)作者简介:吴小红ꎬ女ꎬ硕士ꎬ副研究员ꎬ研究方向:新型冠状病毒ｍＲＮＡ疫苗及狂犬病疫苗质量控制ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｗｕｘｉａｏｈｏｎｇ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎ通信作者:刘欣玉ꎬ男ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ研究方向:疫苗质量控制ꎬＴｅｌ:０１０－５３８５１７８０ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｌｉｕｘｉｎｙｕ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎ中和抗体检测应用于新型冠状病毒ｍＲＮＡ疫苗效力分析吴小红ꎬ赵丹华ꎬ所玥ꎬ彭沁华ꎬ王红玉ꎬ刘欣玉ꎬ李玉华(中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室ꎬ国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室ꎬ北京１０２６２９)摘要:目的㊀通过对新型冠状病毒(２０１９ｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓꎬ２０１９－ｎＣｏＶ)ｍＲＮＡ疫苗(新冠ｍＲＮＡ疫苗)免疫小鼠后产生的中和抗体进行检测ꎬ探索中和抗体检测法应用于ｍＲＮＡ疫苗体内效力评价的可行性ꎮ方法㊀采用６~８周ＢＡＬＢ/ｃ小鼠进行后肢肌肉免疫ꎬ检测不同免疫剂量和不同免疫程序的中和抗体滴度ꎮ并对８家企业生产的新冠ｍＲＮＡ疫苗免疫的小鼠血清进行中和抗体和ＩｇＧ抗体检测ꎮ结果㊀２㊁５㊁１０μｇ不同剂量ｍＲＮＡ疫苗按照不同免疫程序免疫小鼠后中和抗体检测结果显示ꎬ抗体阳转率均为１００％ꎬ中和抗体反应有明显的剂量－效应关系ꎮ２针间隔１４ｄ加强免疫组抗体滴度显著高于间隔７ｄ加强免疫组及１针组(Ｆ＝５７.１３ꎬＰ<０.００１)ꎮ２μｇ剂量间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体几何平均滴度(ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｍｅａｎｔｉｔｅｒꎬＧＭＴ)分别为２１８和４６８ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.４０ꎬＰ＝０.００３)ꎻ５μｇ剂量间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体ＧＭＴ分别为４９９和１４３６ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.６２ꎬＰ＝０.００２)ꎻ１０μｇ剂量间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体ＧＭＴ分别为６０８和１９０９ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.２３ꎬＰ＝０.００５)ꎮ国内８家企业生产的新冠ｍＲＮＡ疫苗免疫小鼠后均可产生高滴度的ＩｇＧ抗体(１０４.５~１０７.５)和中和抗体(１０２.６~１０４.８)ꎬ效力测定结果均符合企业质量标准ꎮ各企业生产的ｍＲＮＡ疫苗的中和抗体滴度结果差异有统计学意义(Ｆ＝７０.０３ꎬＰ<０.００１)ꎮ结论㊀小鼠免疫后中和抗体检测可用于ｍＲＮＡ疫苗的体内效力评价ꎮ关键词:新型冠状病毒ꎻｍＲＮＡ疫苗ꎻ中和抗体ꎻＩｇＧ抗体ꎻ效力中图分类号:Ｒ９１７㊀文献标志码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２３)１１－０８９６－００６ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２３.１１.００９ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅｐｏｔｅｎｃｙｏｆｍＲＮＡＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｉｎｖｉｖｏｕｓｉｎｇｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓａｙＷＵＸｉａｏｈｏｎｇꎬＺＨＡＯＤａｎｈｕａꎬＳＵＯＹｕｅꎬＰＥＮＧＱｉｎｈｕａꎬＷＡＮＧＨｏｎｇｙｕꎬＬＩＵＸｉｎｙｕꎬＬＩＹｕｈｕａ(ＮＭＰＡＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＱｕａｌｉｔｙＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓꎬＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＡｒｂｏｖｉｒｕｓＶａｃｃｉｎｅꎬＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０２６２９ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｐｏｔｅｎｃｙｏｆｍＲＮＡＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｉｎｖｉｖｏｂｙｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓａｙａｆ￣ｔｅｒｍｉｃｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎꎬａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｎｇｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｔｈｅｖａｃｃｉｎｅ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＢＡＬＢ/ｃｍｉｃｅａｔ６~８ｗｅｅｋｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｍＲＮＡＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅａｎｄｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｍｍｕｎｅｄｏｓａｇｅａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｓｃｈｅｄｕｌｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ.Ｔｈｅｖａｒｉａｎｔｖａｃｃｉｎｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄａｔｉｎｔｅｒｖａｌｓｏｆ７ｄｏｒ１４ｄꎬａｎｄｓｅｒｕｍｓａｍｐｌｅｓｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｔ７ｄａｆｔｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｄｏｓｅｏｆｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ.２０１９ｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒ￣ｕｓ(２０１９－ｎＣｏＶ)ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒａｎｄＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｔｅｓｔａｎｄｅｎ￣ｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｓｅｐａｒａｔｅｌｙ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｍｍｕｎｅｄｏｓａｇｅｏｆ２ꎬ５ꎬ１０μｇｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｍｉｃｅｗａｓ１００％ａｎｄｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｒｅａｃ￣ｔｉｏｎｈａｄａｎｏｂｖｉｏｕｓｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｏｆｔｈｅ１４－ｄａｙｉｎｔｅｒｖａｌｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅ７－ｄａｙｉｎｔｅｒｖａｌｇｒｏｕｐａｎｄｏｎｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ(Ｆ＝５７.１３ꎬＰ<０.００１).Ｔｈｅｇｅｏｍｅｔｒｉｃｍｅａｎｔｉｔｅｒｓ(ＧＭＴ)ｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙ２μｇｄｏｓａｇｅｉｎｔｅｒｖａｌｏｆ７－ｄａｙａｎｄ１４－ｄａｙｗｅｒｅ２１８ａｎｄ４６８ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(ｔ＝３.４０ꎬＰ＝０.００３)ꎻＴｈｅＧＭＴｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙ５μｇｄｏｓａｇｅｉｎｔｅｒｖａｌｏｆ７－ｄａｙａｎｄ１４－ｄａｙｗｅｒｅ４９９ａｎｄ１４３６ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(ｔ＝３.６２ꎬＰ＝０.００２)ꎻＴｈｅＧＭＴｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙ１０μｇｄｏｓａｇｅｉｎｔｅｒｖａｌｏｆ７－ｄａｙａｎｄ１４－ｄａｙｗｅｒｅ６０８ａｎｄ１９０９ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(ｔ＝３.２３ꎬＰ＝０.００５).ＨｉｇｈｌｅｖｅｌｓｏｆＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙ(１０４.５~１０７.５)ａｎｄｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ(１０２.６~１０４.８)ｃｏｕｌｄｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇｍｉｃｅｗｉｔｈｔｈｅＣＯＶＩＤ－１９ｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅꎬｐｏｔｅｎｃｙｏｆｔｈｅｖａｃｃｉｎｅｓｗｅｒｅａｌｌｍｅｔｗｉｔｈｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｗｉｔｈｇｏｏｄｌｏｔｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｅꎬｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｓａｍｏｎｇｔｈｅｖａｒｉｏｕｓｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｎ￣ｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ(Ｆ＝７０.０３ꎬＰ<０.００１).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｓｔｏｆｔｈｅｍｉｃｅａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｐｏｔｅｎｃｙｏｆＣＯＩＤ－１９ｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｉｎｖｉｖｏ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:２０１９ｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓꎻｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅꎻＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙꎻＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙꎻＰｏｔｅｎｃｙ㊀㊀新型冠状病毒感染(ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ２０１９ꎬＣＯＶＩＤ－１９)的流行对人类健康造成了严重影响ꎮ疫苗接种已被证实对严重疾病㊁降低住院率和死亡率非常有效[１－２]ꎮ其中ｍＲＮＡ疫苗由于具有能够同时诱导体液免疫和细胞免疫㊁研发和生产周期短㊁容易实现量产等优势ꎬ成为国际上主要采用的ＣＯＶＩＤ－１９疫苗研发技术ꎮ随着新型冠状病毒(２０１９－ｎＣｏＶ)变异株的不断出现ꎬ单价变异株疫苗及多价变异株疫苗可作为加强免疫以及异源序贯免疫来应对病毒变异造成的感染威胁[３]ꎮ新冠ｍＲＮＡ疫苗的效力评价目前尚无国际标准ꎬ欧洲及世界卫生组织(ＷＨＯ)专家多推荐体外活性研究作为该疫苗效力评价的主要方法[４－６]ꎮ鉴于ｍＲＮＡ疫苗为创新技术疫苗ꎬ缺乏系统的疫苗质量研究经验ꎬ我国现阶段采用体内和体外双效力指标进行评价[７]ꎬ体内效力的评价可利用动物免疫后检测中和抗体和/或总抗体的方法来进行[８]ꎮ本研究对新冠ｍＲＮＡ疫苗不同免疫剂量和不同免疫程序诱导的中和抗体反应进行初步研究ꎬ并对新冠变异株ｍＲＮＡ疫苗及二价ｍＲＮＡ疫苗免疫小鼠后的抗体阳性率和抗体水平进行体内效力分析ꎬ从而评价ｍＲＮＡ疫苗的质量ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验动物㊀ＳＰＦ级ＢＡＬＢ/ｃ小鼠ꎬ６~８周龄ꎬ体重１８~２２ｇꎬ雌雄不限ꎬ由中国食品药品检定研究院动物所提供ꎬ实验动物生产许可证号:ＳＣＸＫ(京)２０２２－０００２ꎬ使用许可证号:ＳＹＸＫ(京)２０２２－００１４ꎬ动物实验伦理批准文号:中检动(福)第２０２２(Ｂ)００８号ꎮ１.２㊀主要试剂及仪器㊀１０ˑＰＢＳ㊁ＴＭＢ㊁终止液购自索莱宝公司ꎻＨＲＰ标记的羊抗小鼠ＩｇＧ购自美国Ｊａｃｋｓｏｎ公司ꎻＢＳＡ购自美国Ｓｉｇｍａ公司ꎻＤＭＥＭ㊁胎牛血清㊁胰酶㊁ＨＥＰＥＳ㊁双抗均购自美国Ｇｉｂｃｏ公司ꎻ荧光素酶检测试剂购自美国普洛麦格Ｐｒｏｍｅｇａ公司ꎻＰｒｏｍｅｇａＧｌｏＭａｘ９６微孔板化学发光检测仪(Ｇｌｏｍａｘｎａｖｉｇａｔｏｒ)购自美国普洛麦格Ｐｒｏｍｅｇａ公司ꎻ酶标仪(ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００)购自美国蒂肯公司ꎮ１.３㊀实验用疫苗㊁细胞㊁不同型别假病毒㊀实验用疫苗为国内企业生产的ｍＲＮＡ疫苗ꎬ编号Ｖ１~Ｖ９ꎮ其中Ｖ１为原型株疫苗ꎬＶ２~Ｖ７为二价２０１９－ｎＣｏＶ变异株ｍＲＮＡ疫苗(ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.４/５株和Ｄｅｌｔａ株双价㊁ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.４/５株和Ｂｅｔａ株双价㊁ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.２株和原型株双价以及ＯｍｉｃｒｏｎＸＢＢ.１.５株和ＢＱ.１.７株双价)ꎬＶ８~Ｖ９是２０１９－ｎＣｏＶ变异株ｍＲＮＡ疫苗(ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.１)ꎻＶｅｒｏ细胞购自ＡＴＣＣꎬ本室传代保存ꎻ假病毒原型株㊁Ｄｅｌｔａ株㊁Ｂｅｔａ株㊁Ｏ￣ｍｉｃｒｏｎＢＡ.１㊁ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.２㊁ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.４/５㊁ＯｍｉｃｒｏｎＸＢＢ.１.５购自北京云菱生物技术公司ꎻ不同株２０１９－ｎＣｏＶＳ蛋白抗原分别购自北京义翘神州生物技术有限公司和北京百普赛斯公司ꎮ１.４㊀免疫剂量及免疫程序１.４.１㊀ｍＲＮＡ疫苗免疫剂量和免疫程序研究㊀将Ｖ１ｍＲＮＡ疫苗(原型株)配制成不同浓度后ꎬ按照不同的免疫程序分成Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ３组:Ａ组程序为免疫１针ꎬ１４ｄ采血ꎻＢ组程序为间隔７ｄ加强免疫１针后７ｄ采血ꎻＣ组程序为间隔１４ｄ加强免疫１针后７ｄ采血ꎮ每种免疫程序按照不同的免疫剂量分成３个小组ꎬ分别是每只小鼠注射２㊁５和１０μｇꎬ共计９组ꎬ每组１０只小鼠ꎮ同时１０只小鼠注射生理盐水作为阴性对照组ꎮ每只小鼠后肢肌肉注射１００μＬ疫苗ꎬ眼球取血分离血清ꎬ－２０ħ保存备用ꎮ用假病毒中和试验法检测抗２０１９－ｎＣｏＶ中和抗体ꎮ１.４.２㊀实验疫苗免疫和检测㊀ｍＲＮＡ变异株疫苗及二价疫苗均按照企业的免疫剂量和免疫程序进行免疫和采血ꎬ分离血清后于－２０ħ保存ꎮ分别进行中和抗体和ＩｇＧ结合抗体的检测ꎮ１.５㊀假病毒中和试验(ＰＢＮＡ法)㊀按照操作规程进行[９－１０]ꎬ在９６孔板上３倍系列稀释的血清１００μＬꎬ分别加入各型假病毒[用ＤＭＥＭ培养基稀释至１.３ˑ１０４半数组织培养感染剂量(ＴＣＩＤ５０)/ｍＬ]ꎬ每孔加入５０μＬꎬ同时设立病毒对照和细胞对照ꎮ３７ħ５％ＣＯ２培养箱中和１ｈꎬ加入２ˑ１０５个/ｍＬ的Ｖｅｒｏ细胞悬液ꎬ每孔１００μＬꎬ３７ħ５％ＣＯ２培养箱培养２０~２８ｈ后ꎬ从细胞培养箱中取出９６孔板ꎬ用多道移液器从每个上样孔中吸弃１５０μＬ上清ꎬ然后加入１００μＬ荧光素酶检测试剂ꎬ室温避光反应２ｍｉｎꎮ反应结束后ꎬ用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸６~８次ꎬ使细胞充分裂解ꎬ从每孔中吸出１００μＬ液体ꎬ加于对应９６孔化学发光检测板中ꎬ置于化学发光检测仪中读取发光值ꎮ计算抑制率＝{１－[样品组的发光强度均值－空白对照ＣＣ(ＣｅｌｌＣｏｎｔｒｏｌꎬＣＣ)均值]/[阴性组的发光强度ＶＣ(ＶｉｒｕｓＣｏｎｔｒｏｌꎬＶＣ)均值－空白对照值ＣＣ均值]}ˑ１００％ꎮ根据中和抑制率结果ꎬ按照ＲｅｅｄＭｕｅｎｃｈ法计算中和抗体滴度半数效应剂量(５０％ｍａｘｉｍａｌｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬＥＣ５０)ꎬＥＣ５０>３０为抗体阳性ꎮ１.６㊀特异性抗２０１９－ｎＣｏＶＳｐｉｋｅ蛋白ＩｇＧ抗体检测㊀将２０１９－ｎＣｏＶ各株抗原分别用１ˑＰＢＳ稀释至２μｇｍＬ－１ꎬ取９６孔板每孔加１００μＬꎬ(５ʃ３)ħ条件下包被过夜１６ｈꎬＰＢＳＴ洗板３次ꎬ拍干后加入封闭液(２％ＢＳＡ溶液)ꎬ１００μＬ/孔ꎬ３７ħ孵箱里封闭２ｈꎬ加入系列稀释后的待检测血清样本ꎬ３７ħ孵箱里孵育后１ｈꎬＰＢＳＴ洗板３次ꎬ加入辣根过氧化物酶(ＨＲＰ)标记的羊抗小鼠ＩｇＧ抗体ꎬ每孔１００μＬꎬ３７ħ孵育后１ｈꎬＰＢＳＴ洗板３次ꎬ加入底物ＴＭＢ５０μＬꎬ室温避光显色３~５ｍｉｎꎬ加入１ｍｏｌＬ－１硫酸溶液终止液终止ꎬ１５０μＬ/孔ꎬ在酶标仪上检测波长４５０ｎｍ/６３０ｎｍ的ＯＤ值ꎬ以阴性小鼠吸光度均值的２.１倍为ｃｕｔｏｆｆ值ꎮ血清Ａ值大于ｃｕｔｏｆｆ值为抗体阳性ꎬ取阳性Ａ值最大的血清稀释度为血清的ＩｇＧ抗体滴度ꎮ１.７㊀统计学方法㊀使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８.０进行数据分析ꎬ相同免疫剂量不同免疫程序以及相同免疫程序不同免疫剂量间中和抗体滴度以及不同企业ｍＲＮＡ疫苗免疫后中和抗体之间比较采用单因素方差分析评估组间差异ꎬ中和抗体和ＩｇＧ抗体之间差异采用ｔ检验分析ꎬＰ<０.０５表示差异有统计学意义ꎮ２㊀结果２.１㊀不同免疫剂量和不同免疫程序的抗体反应㊀针对原型株ｍＲＮＡ疫苗不同免疫剂量和免疫程序的中和抗体检测结果显示ꎬ２㊁５㊁１０μｇｍＲＮＡ疫苗免疫小鼠后ꎬ１针免疫组和２针免疫组抗体阳性率均为１００％ꎮ２㊁５㊁１０μｇ首针免疫后１４ｄ或２１ｄ中和抗体反应具有明显的剂量－效应关系ꎮ相同免疫剂量㊁不同免疫程序结果显示ꎬ２针免疫组高于１针免疫组ꎬ其中２μｇ剂量组不同针次之间抗体滴度结果差异有统计学意义(Ｆ＝２０.６４ꎬＰ<０.００１)ꎻ５μｇ剂量组不同针次之间抗体滴度结果差异有统计学意义(Ｆ＝１８.２７ꎬＰ<０.００１)ꎻ１０μｇ剂量组不同针次之间抗体滴度结果差异有统计学意义(Ｆ＝１１.３７ꎬＰ<０.００１)ꎮ２针免疫组中１４ｄ加强免疫组高于７ｄ加强免疫组及１针组(Ｆ＝５７.１３ꎬＰ<０.００１)ꎮ其中２μｇ间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫组产生的中和抗体几何平均滴度(ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｍｅａｎｔｉｔｅｒꎬＧＭＴ)分别为２１８和４６８ꎬ１４ｄ为７ｄ的２.１５倍ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.４０ꎬＰ＝０.００３)ꎻ５μｇ间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体ＧＭＴ分别为４９９和１４３６ꎬ１４ｄ为７ｄ的２.８８倍ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.６２ꎬＰ＝０.００２)ꎻ１０μｇ间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体ＧＭＴ分别为６０８和１９０９ꎬ１４ｄ为７ｄ的３.１４倍ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.２３ꎬＰ＝０.００５)ꎮ相同免疫程序㊁不同免疫剂量诱导的抗体反应结果显示ꎬ１针免疫组不同剂量间相比(Ｆ＝７.３３ꎬＰ＝０.００３)ꎻ２针免疫组ꎬ间隔７ｄ不同剂量间相比(Ｆ＝６.４０ꎬＰ＝０.００５)ꎻ２针免疫组ꎬ间隔１４ｄ不同剂量间相比(Ｆ＝７.６４ꎬＰ＝０.００２)ꎬ差异均有统计学意义ꎬ结果见表１ꎮ表１㊀Ｖ１疫苗不同免疫剂量和免疫程序的中和抗体滴度及阳性率剂量/μｇＧＭＴ(９５％ＣＩ)Ａ组Ｂ组Ｃ组Ｆ值Ｐ值阳性率(％)２６０(４６~７３)２１８(１６７~６２９)４６８(２６３~６７４)２０.６４Ｐ<０.００１１００.０５１８７(１０２~２７１)４９９(３１１~６８８)１４３６(７５９~２１１２)１８.２７Ｐ<０.００１１００.０１０３４９(５２~６４６)６０８(２６９~９４８)１９０９(７０９~３１０９)１１.３７Ｐ<０.００１１００.０Ｆ值７.３３６.４０７.６４３.４０ａ３.６２ｂ３.２３ｃＰ值０.００３０.００５０.００２０.００３ａ０.００２ｂ０.００５ｃ阳性率(％)１００.０１００.０１００.０///㊀注:ＧＭＴ为几何平均滴度:９５％ＣＩ:９５％可信区间ꎻ/表示无统计ꎻａｂｃ２㊁５㊁１０μｇ间隔７ｄ和间隔１４ｄ中和抗体滴度分别进行ｔ检验ꎮ２.２㊀８家企业生产的新冠变异株ｍＲＮＡ疫苗体内效力检测结果㊀８家企业生产的疫苗Ｖ２~Ｖ９按照企业的免疫剂量和免疫程序免疫ＢＡＬＢ/ｃ小鼠后ꎬ中和抗体及特异性ＩｇＧ抗体检测结果见表２ꎮ表２㊀不同企业生产的ｍＲＮＡ疫苗抗体检测结果生产者免疫程序检测批数ＬｇＩｇＧ(ＧＭＴ)中和抗体ＥＣ５０(ＧＭＴ)(ＬｇＥＣ５０)Ｖ３７ｄ２针免疫１４ｄ采血Ｖ４７ｄ２针免疫１４ｄ采血Ｖ５１４ｄ２针免疫２１ｄ采血Ｖ６１４ｄ２针免疫２１ｄ采血Ｖ７１４ｄ２针免疫２１ｄ采血Ｖ８１４ｄ２针免疫２８ｄ采血Ｖ９１４ｄ２针免疫２８ｄ采血２５.９５.６１２０２(３.１)Ｎ/Ａ３５.６５.７１２６８(３.１)Ｎ/Ａ１５.９６.０４１０(２.６)９６６(３.０)２６.０５.７６１７(２.８)１４５６(３.２)３６.０５.７６４４(２.８)１６７１(３.２)４６.９６.６６６７(２.８)３９３５(３.６)１４.５４.８１２９１(３.１)２０８０(３.３)２４.７４.９１５５６(３.２)２３５３(３.４)３４.７４.８１３６１(３.１)２５８２(３.４)４４.６４.９１０５０(３.０)１９３１(３.３)１６.０６.１１２７４(３.１)３８１２(３.６)２６.１５.８１１７０(３.１)２７９８(３.４)３６.０５.８１５８９(３.２)３０９７(３.５)４６.０６.０１２９８(３.１)４０７４(３.６)１５.０４.８７４９５(３.９)１４２７(３.２)２５.１５.０６２３０(３.８)１２５７(３.１)３５.３５.２９５８０(４.０)２８０６(３.４)１７.１/２４４５３(４.４)/２７.５/２７９７６(４.４)/３７.５/２６９７９(４.４)/１５.６/６５６３０(４.８)/２５.６/４０４４５(４.６)/３５.６/２５３４３(４.４)/Ｆ值或ｔ值１１.４７ａ１７.５６ｂ７０.０３ｃＰ值Ｐ<０.００１ａＰ<０.００１ｂＰ<０.００１ｃ㊀注: / 代表该疫苗为单价疫苗ꎻ Ｎ/Ａ代表该组分未检测ꎻ １㊁２㊁３㊁４分别代表检测批数ꎮａ代表组分１ＩｇＧ结合抗体和中和抗体滴度ｔ检验结果ꎻｂ代表组分２ＩｇＧ结合抗体和中和抗体滴度ｔ检验结果ꎻｃ代表各企业之间中和抗体滴度方差分析结果ꎮ组分１和组分２代表双价疫苗中的单价组分ꎬ如Ｖ７疫苗:组分１为德尔塔株ꎬ组分２为奥密克戎ＢＡ.４/５株ꎮ２.３㊀特异性ＩｇＧ结合抗体和中和抗体结果分析㊀检测结果以对数转换后进行ｔ检验ꎬ组份１ＩｇＧ和ＥＣ５０比较ｔ＝１１.４７ꎬＰ<０.００１ꎻ组份２ＩｇＧ和ＥＣ５０比较ｔ＝１７.５６ꎬＰ<０.００１ꎬ均显示中和抗体检测结果和ＩｇＧ结合抗体检测差异有统计学意义ꎮＰｅａｒｓｏｎ相关系数ｒ分别为０.４２和０.２２ꎮ虽然两种方法抗体检测结果相关性较差ꎬ但均可以检测到高水平的抗体特异性反应ꎮ两种方法检测各企业３~４批疫苗ꎬＩｇＧ抗体结果批间变异系数在１.０％~７.６％ꎬ中和抗体结果批间变异系数在２.０％~７.９％ꎬ提示两种抗体检测方法均可以用于评价疫苗体内效价的批间一致性ꎮ各企业ｍＲＮＡ疫苗的中和抗体结果对数转换后进行组间方差分析ꎬ差异有统计学意义(Ｆ＝７０.０３ꎬＰ<０.００１)ꎮ３㊀讨论新冠ｍＲＮＡ疫苗临床前和临床研究中均证实疫苗的有效性与动物或人群保护力之间有一定的量效关系[１１－１４]ꎮ中和抗体是最重要的保护性抗体ꎬ与２０１９－ｎＣｏＶ感染者症状严重程度之间也有一定的相关性[１５－１６]ꎮ因此建立标准的中和抗体检测平台技术对ＣＯＶＩＤ－１９疫苗进行评价尤为重要[１７]ꎮ本研究采用的假病毒中和方法经国内多家实验室联合验证[９ꎬ１８]ꎬ抗体检测结果相对客观ꎬ与ＩｇＧ结合抗体检测相比更能体现疫苗的免疫原性ꎮ尤其对于多价疫苗ꎬ假病毒中和抗体检测方法可实现对不同变异株抗体分别进行检测ꎬ能较好的反映出针对多价疫苗各毒株组份疫苗诱导的抗体中和活性ꎮ通过对１批ｍＲＮＡ原型株疫苗不同免疫剂量和不同免疫程序的分析ꎬ提示ｍＲＮＡ疫苗免疫小鼠后的中和抗体水平与免疫剂量和免疫程序有密切关系ꎮ本研究发现ꎬ同等剂量下(２㊁５㊁１０μｇ)间隔７ｄ与间隔１４ｄ２针免疫的抗体结果差异有统计学意义ꎬ对于ｍＲＮＡ疫苗来说ꎬ间隔７ｄ的第２针加强免疫不是产生高滴度中和抗体的最适宜的程序ꎬ疫苗实际使用过程中第２针加强免疫的时间选择在２１ｄ或２８ｄ[１１－１２]ꎮ因此ｍＲＮＡ疫苗体内效力的评价应适当关注免疫程序的设计ꎮ研究结果显示ｍＲＮＡ变异株单价疫苗或二价疫苗中针对不同组分的ＩｇＧ抗体滴度均在１０４.５~１０７.５间ꎬ符合各企业的质量标准(不低于１０３或１０４)ꎬ且各企业生产的疫苗ＩｇＧ抗体结果批间一致性良好ꎬ变异系数在１.０％~７.６％之间ꎮ假病毒法检测中和抗体滴度在１０２.６~１０４.８之间ꎬ不同企业生产的疫苗免疫后中和抗体水平差异有统计学意义(Ｆ＝７０.０３ꎬＰ<０.００１)ꎬ与国产ｍＲＮＡ疫苗已公布的Ⅰ~Ⅱ期临床研究数据一致ꎬ不同企业新冠ｍＲＮＡ疫苗在人体内产生的中和抗体滴度有差异[１２－１５]ꎮ各企业不同批次中和抗体检测结果变异系数为２.０％~７.９％ꎮ因此中和抗体检测可用于不同企业ｍＲＮＡ疫苗效力的比较研究以及疫苗批间一致性的评价ꎮ辉瑞公司生产的ＢＮＴ１６２ｂ为３０μｇ/剂ꎬ莫德纳公司ｍＲＮＡ－１２７３为１００μｇ/剂ꎮ两款疫苗对２０１９－ｎＣｏＶ感染的保护效力分别达到了９４.６％和９４.１％ꎬ不同的人用剂量和免疫程序可产生相同的临床保护力[１９－２１]ꎮｍＲＮＡ－１２７３Ⅲ期临床研究结果显示接种该疫苗后假病毒法检测中和抗体滴度半数抑制稀释(５０％ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｄｉｌｕｔｉｏｎꎬＩＤ５０)为１０㊁１００和１０００ꎬ测算疫苗保护效力分别为７８％㊁９１％和９６％[２２]ꎻ新冠灭活疫苗ＮＶＸ－ＣｏＶ２３７３中和抗体滴度ＩＤ５０为５０㊁１００和７２３０(ＩＵ５０ｍＬ－１)ꎬ疫苗保护效力分别为７５.７％㊁８１.７％和９６.８％[２３]ꎮ本研究结果显示国产新冠ｍＲＮＡ疫苗小鼠免疫后中和抗体均达到较高水平ꎬ无论是１针免疫还是２针免疫ＥＣ５０除个别企业因单价组分配比含量低ꎬ造成滴度偏低(Ｖ４)外ꎬ其余企业中和抗体滴度均在在１０００以上甚至更高ꎬ提示国产新冠ｍＲＮＡ疫苗的体内效力结果已达到较高的标准要求ꎮ虽然本研究未利用上述新冠ｍＲＮＡ疫苗进一步开展攻毒保护力研究ꎬ但随着ｍＲＮＡ疫苗大量的临床研究数据以及真实世界的保护力数据公布ꎬ会对疫苗的效力评价标准提供更有效的数据支持ꎮ尽快建立效力评价用疫苗参考品和血清检测用标准物质ꎬ提高国产ｍＲＮＡ疫苗的质量评价水平是下一步研究方向ꎮ参考文献:[１]㊀ＥＡＲＬＥＫＡꎬＡＭＢＲＯＳＩＮＯＤＭꎬＦＩＯＲＥ－ＧＡＲＴＬＡＮＤＡꎬｅｔａｌ.ＥｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａｎｔｉｂｏｄｙａｓａｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｅｆｏｒＣＯ￣ＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅꎬ２０２１ꎬ３９(３２):４４２３－４４２８. [２]ＫＨＯＵＲＤＳꎬＣＲＯＭＥＲＤꎬＲＥＹＮＡＬＤＩＲＡꎬｅｔａｌ.Ｎｅｕ￣ｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌｓａｒｅｈｉｇｈｌｙｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｏｆｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｒｏｍｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔＭｅｄꎬ２０２１ꎬ２７(７):１２０５－１２１１.[３]ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ.Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ(ＣＯＶＩＤ－１９)Ｄａｓｈｂｏａｒｄ[ＥＢ/ＯＬ].(２０２３－０８－３０).ｈｔｔｐｓ://ｃｏｖｉｄ１９.ｗｈｏ.ｉｎｔ(ＡｃｃｅｓｓｅｄＡｕｇ３０ꎬ２０２３).[４]ＷＨＯＴＲＳＮʎ１０３９.ＷＨＯＥｘｐｅｒｔＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ.Ｓｅｖｅｎｔｙ－ｆｏｕｒｔｈｒｅｐｏｒｔ[ＥＢ/０Ｌ].(２０２２－０４－１２).ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｗｈｏ.ｉｎｔ/ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ/ｉ/ｉｔｅｍ/９７８９２４００４６８７０.[５]ＬＩＵＭＡꎬＺＨＯＵＴꎬＳＨＥＥＴＳＲＬꎬｅｔａｌ.ＷＨＯｉｎｆｏｒｍａｌｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎｏｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｑｕａｌｉｔｙꎬｓａｆｅｔｙａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙｏｆＲＮＡ－ｂａｓｅｄｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃｖａｃｃｉｎｅｓｆｏｒｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ２０－２２Ａｐｒｉｌ２０２１[Ｊ].ＥｍｅｒｇＭｉｃｒｏｂｅｓＩｎｆｅｃｔꎬ２０２２ꎬ１１(１):３８４－３９１. [６]ＥｕｒｏｐｅａｎＭｅｄｉｃｉｎｅｓＡｇｅｎｃｙ.Ｃｏｎｃｅｐｔｐａｐｅｒｏｎｔｈｅｄｅｖｅｌ￣ｏｐｍｅｎｔｏｆａＧｕｉｄｅｌｉｎｅｏｎｔｈｅＱｕａｌｉｔｙａｓｐｅｃｔｓｏｆｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｓ[ＥＢ/ＯＬ].(２０２３－０６－２３).ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｐｒｉｎｔ￣ｆｒｉｅｎｄｌｙ.ｃｏｍ/ｐ/ｇ/Ｋ３ＢｗＲｑ.[７]中国食品药品检定研究院.ʌＷＨＯ会议ɔ王军志院士㊁王佑春研究员参加ＷＨＯ传染病预防性ｍＲＮＡ疫苗质量㊁安全及有效性评价法规考虑要点网络咨询会[ＥＢ/ＯＬ].(２０２１－０５－１１).ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎ//ｎｉｆｄｃ/ｇｊｈｚ/ｇｊｊｌ/２０２１０５１１１５５０５１３４１６.ｈｔｍｌ.[８]国家药品监督管理局.国家药监局药审中心关于发布«新型冠状病毒预防用疫苗研发技术指导原则(试行)»等５个指导原则的通告(２０２０年第２１号)[ＥＢ/ＯＬ].(２０２０－０８－１４).ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｍｐａ.ｇｏｖ.ｃｎ/ｘｘｇｋ/ｇｇｔｇ/ｙｐｇｇｔｇ/ｙｐｑｔｇｇｔｇ/２０２００８１４２３０９１６１５７.ｈｔｍｌ. [９]ＮＩＥＪꎬＬＩＱꎬＷＵＪꎬｅｔａｌ.Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆａｐｓｅｕｄｏ－ｖｉｒｕｓｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２[Ｊ].ＥｍｅｒｇＭｉｃｒｏｂｅｓＩｎｆｅｃｔꎬ２０２０ꎬ９(１):６８０－６８６.[１０]ＮＩＥＪꎬＬＩＱꎬＷＵＪꎬｅｔａｌ.ＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｂｙａｐｓｅｕｄｏ－ｔｙｐｅｄｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄａｓｓａｙ[Ｊ].ＮａｔＰｒｏｔｏｃꎬ２０２０ꎬ１５(１１):３６９９－３７１５.[１１]ＬＩＪＬꎬＬＩＵＱꎬＬＩＵＪꎬｅｔａｌ.ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＢｉｖａｌｅｎｔｍＲＮＡＶａｃｃｉｎｅｓａｇａｉｎｓｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｖａｒｉａｎｔｓ[Ｊ].Ｖａｃ￣ｃｉｎｅｓ(Ｂａｓｅｌ)ꎬ２０２２ꎬ１０(１１):１８０７.[１２]ＹＡＮＧＲꎬＤＥＮＧＹꎬＨＵＡＮＧＢＹꎬｅｔａｌ.Ａｃｏｒｅ－ｓｈｅｌｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄＣＯＶＩＤ－１９ｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｗｉｔｈｆａｖｏｒａｂｌｅｂｉｏ￣ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎａｎｄｐｒｏｍｉｓｉｎｇｉｍｍｕｎｉｔｙ[Ｊ].ＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔＴａｒｇｅｔＴｈｅｒꎬ２０２１ꎬ６(１):２１３.[１３]ＣＨＥＮＧＬꎬＬＩＸＦꎬＤＡＩＸＨꎬｅｔａｌ.Ｓａｆｅｔｙａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅ￣ｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＡＲＣｏＶｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｉｎＣｈｉｎｅｓｅａｄｕｌｔｓ:ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄꎬｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄꎬｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎ￣ｔｒｏｌｌｅｄꎬｐｈａｓｅ１ｔｒｉａｌ[Ｊ].ＬａｎｃｅｔＭｉｃｒｏｂｅꎬ２０２２ꎬ３(３):ｅ１９３－ｅ２０２.[１４]ＸＵＫꎬＬＥＩＷＷꎬＫＡＮＧＢꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅꎬＳＹＳ６００６ꎬａｇａｉｎｓｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２[Ｊ].ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０２３(１３):１０５１５７６.[１５]ＧＡＲＣＩＡ－ＢＥＬＴＲＡＮＷＦꎬＬＡＭＥＣꎬＡＳＴＵＤＩＬＬＯＭＧꎬｅｔａｌ.ＣＯＶＩＤ－１９－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｐｒｅｄｉｃｔｄｉｓｅａｓｅｓｅｖｅｒｉｔｙａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０２１ꎬ１８４(２):４７６－４８８. [１６]ＫＨＯＵＲＹＤＳꎬＣＲＯＭＥＲＤꎬＲＥＹＮＡＬＤＩＡꎬｅｔａｌ.Ｎｅｕ￣ｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌｓａｒｅｈｉｇｈｌｙｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｏｆｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｒｏｍｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔＭｅｄꎬ２０２１ꎬ２７(７):１２０５－１２１１.[１７]ＷＡＮＧＹＣ.ＳｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓａｙｓａｒｅｎｅｅｄｅｄｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｎｇＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｓ[Ｊ].ＥＢｉｏＭｅｄｉ￣ｃｉｎｅꎬ２０２１(７３):１０３６７７.[１８]ＧＵＡＮＬＤꎬＹＵＹＬꎬＷＵＸＨꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｆｉｒｓｔＣｈｉｎｅｓｅｎａ￣ｔｉｏｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｓｆｏｒＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅꎬ２０２１ꎬ３９(２８):３７２４－３７３０.[１９]ＰＯＬＡＣＫＦＰꎬＴＨＯＭＡＳＳＪꎬＫＩＴＣＨＩＮＮꎬｅｔａｌ.ＳａｆｅｔｙａｎｄＥｆｆｉｃａｃｙｏｆｔｈｅＢＮＴ１６２ｂ２ｍＲＮＡＣｏｖｉｄ－１９Ｖａｃｃｉｎｅ[Ｊ].ＮＥｎｇｌＪＭｅｄꎬ２０２０ꎬ３８３(２７):２６０３－２６１５.[２０]ＳＫＯＷＲＯＮＳＫＩＤＭꎬＤＥＳＥＲＲＥＳＧ.ＳａｆｅｔｙａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｔｈｅＢＮＴ１６２ｂ２ｍＲＮＡｃｏｖｉｄ－１９ｖａｃｃｉｎｅ[Ｊ].ＮＥｎｇｌＪＭｅｄꎬ２０２１ꎬ３８４(１６):１５７６－１５７７.[２１]ＢＡＤＥＮＬＲꎬＥＬＳＡＨＬＹＨＭꎬＥＳＳＩＮＫＢꎬｅｔａｌ.ＥｆｆｉｃａｃｙａｎｄｓａｆｅｔｙｏｆｔｈｅｍＲＮＡ－１２７３ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｖａｃｃｉｎｅ[Ｊ].ＮＥｎｇｌＪＭｅｄꎬ２０２１ꎬ３８４(５):４０３－４１６.[２２]ＧＩＬＢＥＲＴＰＢꎬＭＯＮＴＥＦＩＲＲＩＤＣꎬＭＣＤＥＲＭＯＴＴＡＢꎬｅｔａｌ.ＩｍｍｕｎｅｃｏｒｒｅｌａｔｅｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｍＲＮＡ－１２７３ＣＯ￣ＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ３７５(６５７６):４３－５０.[２３]ＦＯＮＧＹꎬＨＵＡＮＧＹꎬＢＥＮＫＥＳＥＲＤꎬｅｔａｌ.Ｉｍｍｕｎｅｃｏｒｒｅ￣ｌａｔｅｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＰＲＥＶＥＮＴ－１９ＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ[Ｊ].ＮａｔＣｏｍｍｕｎꎬ２０２３ꎬ１４(１):３３１.(收稿日期:２０２３－１０－１３)(上接第８８３页)[１５]ＷＵＹＢꎬＰＥＮＧＭＣꎬＺＨＡＮＧＣꎬｅｔａｌ.Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｒ￣ｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉ－ｃｌａｓｓｂｉｏａｃｔｉｖｅｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｆｏｒｑｕａｌｉｔｙａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｅｎＡｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓꎬｆｏｕｒＧｏｏｄｙｅｒａａｎｄｏｎｅＬｕｄｉｓｉａｓｐｅｃｉｅｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＣｈｉｎＨｅｒｂＭｅｄꎬ２０２０ꎬ１２(４):４３０－４３９.[１６]ＤＵＸＭꎬＩＲＩＮＯＮꎬＦＵＲＵＳＨＯＮꎬｅｔａｌ.ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎｔｈｅＡｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓａｎｄＧｏｏｄｙｅｒａｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＪＮａｔＭｅｄꎬ２００８ꎬ６２(２):１３２－１４８.[１７]ＤＵＸＭꎬＳＵＮＮＹꎬＣＨＥＮＹꎬｅｔａｌ.Ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｌｉ￣ｐｈａｔｉｃｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｆｒｏｍｔｈｒｅｅＧｏｏｄｙｅｒａｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＢｉｏｌＰｈａｒｍＢｕｌｌꎬ２０００ꎬ２３(６):７３１－７３４.[１８]张婉菁ꎬ刘量ꎬ胡荣ꎬ等.斑叶兰抗氧化活性组分研究及其乳膏的制备[Ｊ].中医药导报ꎬ２０１７ꎬ２３(１):５９－６２. [１９]朱平福ꎬ赵怡ꎬ金晶.斑叶兰抗炎作用的实验研究[Ｊ].中国民族民间医药ꎬ２０１０ꎬ１９(４):３５－３６.[２０]ＤＡＩＬＹꎬＹＩＮＱＭꎬＱＩＵＪＫꎬｅｔａｌ.ＧｏｏｄｙｓｃｈｌｅＡꎬａｎｅｗｂｕｔｅｎｏｌｉｄｅｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔＢｃｈＥｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｆｒｏｍＧｏｏｄｙｅｒａｓｃｈｌｅｃｈｔｅｎｄａｌｉａｎａ[Ｊ].ＮａｔＰｒｏｄＲｅｓꎬ２０２１ꎬ３５(２３):４９１６－４９２１.[２１]ＤＵＸＭꎬＳＵＮＮＹꎬＴａｋｉｚａｗａＮꎬｅｔａｌ.Ｓｅｄａｔｉｖｅａｎｄａｎｔｉ￣ｃｏｎｖｕｌｓａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｇｏｏｄｙｅｒｉｎꎬａｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｆｒｏｍＧｏｏｄｙｅｒａｓｃｈｌｅｃｈｔｅｎｄａｌｉａｎａ[Ｊ].ＰｈｙｔｏｔｈｅｒＲｅｓꎬ２００２ꎬ１６(３):２６１－２６３.[２２]党友超ꎬ黄哲ꎬ李蒙禹ꎬ等.黔产金线莲及其易混品(斑叶兰)的显微鉴定研究[Ｊ].贵阳中医学院学报ꎬ２０１８ꎬ４０(４):３０－３４.[２３]黄哲ꎬ党友超ꎬ王世清.黔产金线莲与其易混品斑叶兰的叶表皮显微特征研究[Ｊ].贵阳中医学院学报ꎬ２０１９ꎬ４１(２):３４－３７.(收稿日期:２０２３－０５－０８)。

人轮状病毒疫苗研究进展

2782021, 37 (3)中国人兽共患病学报Chinese Journal of ZoonosesD0l ：10.3969/j.issn.1002 —2694.2021.00.021・综述・人轮状病毒疫苗研究进展王俊12，闻晓波12，冉旭华1 2摘要：轮状病毒(RV)是引起婴幼儿和幼龄动物腹泻的主要病原体，轮状病毒无特效药物进行治疗，只能通过疫苗免疫预防，因此，轮状病毒疫苗的合理应用在降低全世界轮状病毒性腹泻的发病率和死亡率中显得尤为重要.但目前商品化的口服减毒活疫苗存在潜在的安全性问题以及在中低收入国家免疫效力不高的缺陷，需要研发更加安全、高效的疫苗来防控轮状病毒性腹泻.近年来，随着轮状病毒研究的不断深入，鉴定出了新的轮状病毒血清型，并且有4种轮状病毒疫苗通过世界卫生组织的使用资格预审，还有一些新型疫苗正处于研发阶段.本文根据各国学者的研究对轮状病毒疫苗研究进展做一综述，为进一步研究提供一定的参考.关键词：轮状病毒；轮状病毒疫苗；研究进展；口服减毒活疫苗；候选疫苗中图分类号:R373.2.R186 文献标识码:A 文章编号：1002 — 2694(2021 )03 — 0278 — 07Advances in the development of human rotavirus vaccinesWANG Jun 12，WEN Xiao-bo 1'2，RAN Xu-hua 1 2(1 .College of Animal Science and Veterinary Medicine , Heilongjlang Bay!Agricu11ural University , Daqing 1 633 1 9 , China ;2.College of Animal Science Technology , Hainan University , Haikou 570228 , China )Abstract : Rotavirus (RV) is a major pathogen causing diarrhea in infants , young children , and animals. There are no spe cific medicines , thus far , for treating diseases caused by R V infection. The rational administration of R V vaccines , therefore ,maybeanimportantwaytodecreasetheworldwidemorbidityand mortalityduetotheseverediarrheaassociatedwithvariousRV infections. However , the current commcrcial oral live attenuated vaccines have potential safety problems and confer poor immunity in low- and middle-income countries. 'Therefore , safer and more efficient vaccines must be developed to prevent and control disease associated with R V infection. In recent years , from further research on R V , various new serotypes of R Vstrains have emerged , thus indicating that the current commcrcial vaccines have failed to provide complete cross-protection a gainst infection due to new RV strains. To date, four RV vaccines have been prcqualficd by the World Health Organization (WHO) , and other new vaccines arc being developed or arc in clinical trials. This review summarizes the progress in RV vac cine development in some countries ; this information may guide the development of RV vaccine candidates.Keywords : Rotavirus ； vaccine ； research progress ； oral attenuated vaccine ； vaccine candidateSupported by the Natural Science Foundation Leading Project of Heilongjiang Province (No.LH2019C052) Corresponding author ： Ran Xu-hua , Email ： ****************轮状病毒(rotavirus, RV)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，是引起婴幼儿及幼龄动物轮状病毒性腹泻的主要病原体]1],临床症状为呕吐、腹泻、脱水，严重的可造成死亡。

第五章生物制品制造工艺1

致病性细菌所产生的特异性毒性物质――细菌毒素，经甲醛处理及加温处理以除去毒性而保留免疫原性，称为类毒素
吸附精制白喉类毒素的制造
1. 菌种及培养基 2. 培养：温度、pH 糖量、通气量、补料和生长因子、培养时间 3. 脱毒：温度、pH 甲醛含量
五、生物制品的质量检定
（一）理化性质检定
1.物理性状的检查
减毒活疫苗
牛痘苗流感活疫苗麻疹活疫苗腮腺炎活疫苗水痘活疫苗风疹活疫苗斑疹伤寒疫苗脊椎灰质炎疫苗
灭活疫苗
乙型脑膜炎疫苗流感疫苗 Q热疫苗脊髓灰质炎疫苗乙型肝炎疫苗
亚单位疫苗
流感亚单位疫苗腺病毒亚单位疫苗
基因工程疫苗
乙肝疫苗
二、分类
1、疫苗(Vaccine)
一切通过注射或黏膜途径接种，可以诱导机体产生针对特定致病原的特异性抗体或细胞免疫，从而使机体获得保护或消灭该致病原的生物制品统称为疫苗，包括蛋白质、多糖、核酸活载体，感染因子等。
（二）病毒的培养和繁殖 ( Culture and Replication of Viruses)
1、动物培养(Animals) 2、鸡胚培养(Embryonated eggs） 3、组织培养(Organ and tissue culture） Organ culture Embryo culture 4、细胞培养 Cell culture:原代细胞(primary culture cell ) 传代细胞二倍体细胞
指利用微生物载体，将保护性抗原基因重组到微生物中，使用这种能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗（多为活疫苗）
3）核酸疫苗（DNA疫苗，基因疫苗）
指使用能够表达抗原的基因本身即核酸制成的疫苗。

多肽疫苗生产及质控技术指导原则

多肽疫苗生产及质控技术指导原则前言多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗.传统疫苗一般由两种方式制备，一种为能诱发免疫力却不致病的减毒疫苗，例如黄热病、脊髓灰质炎和麻疹疫苗或卡介苗；另一种为灭活疫苗（例如百日咳杆菌、狂犬病毒、伤寒杆菌）。

多肽疫苗由于完全是合成的，不存在毒力回升或灭活不全的问题。

特别是一些还不能通过体外培养方式获得足够量的抗原的微生物病原体。

有些虽能进行体外培养，但这些病原体有潜在致病性和免疫病理作用等涉及安全性与有效性的问题.多肽作为体内引起效应细胞免疫应答形成的免疫原，将成为一种新型的疫苗，但还有很多理论和技术问题要继续研究,目前尚无多肽疫苗获准上市.因此，应采取适当可行的途径对这种潜能疫苗进行生产及质控，并在其生产过程中积累经验,为此，应加强咨询和论证，以便提出一个确保安全有效而又适合实际的申报资料.同时,对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终产品的制备，务必制定标准操作规程和质控标准,并予严格实施。

一、多肽疫苗的化学合成首先应该确定天然抗原的氨基酸序列，选择和确定寻找有效肽段的方法，并寻找该肽段所针对的抗原决定簇。

其次应选择合适的合成方法。

合成中等大小的多肽也会涉及众多反应，每加入一个氨基酸需多次反应,在一个氨基酸的α氨基与另一个氨基酸的羧基缩合形成肽链之前，必须使其中一个形成高反应的活化状态，这个选择自然落到羧基上，合成因而从C到N端.如果A氨基酸的C端与B氨基酸的N端缩合产生2肽A－B,则A的N端及B的C端必须保护起来,才能转化成在A－B之间形成特异性肽的形式。

此外，氨基肽的侧链基团也能与活化羧基反应，因此也必须保护起来。

这些侧链保护基团必须能耐受除去α－氨基保护基团的条件,这样才能生成新的氨基基团使肽链得以继续延长。

合成结束后必须除去所有的保护性基团以得到所需的多肽。

多肽的合成循环包括了一系列的反应,每一循环生成一个新肽键。

药典会细菌制品专业委员会会议纪要(2007)

药典会细菌制品专业委员会会议纪要根据国家食品药品监督管理局有关指示及药品标准提高行动计划，国家药典委员会于2007年6月27～29日在京召开了药典会细菌制品专业委员会会议，会议对部分细菌类制品企业注册标准的修订、部分治疗类细菌制品国家标准提高以及鼠布炭活疫苗国家标准修订进行了审定，并对2010年版《中国药典》三部设计纲要草案进行了审议。

参加会议的有国家食品药品监督管理局注册司生物制品处尹红章处长、卫良调研员，药典会相关专业委员会唐巧英、陈薇、王国治、谢贵林、程鹏飞、曾明、刘保奎委员，中国药品生物制品检定所专家李凤祥、张庶民、侯启明、何丽研究员，药典会生物制品标准处佘清处长及工作人员，以及相关的16个生产企业的代表参加了会议。

会议就有关内容进行了讨论和审定，形成以下会议纪要：部分细菌类制品企业注册标准的修订按照国家食品药品监督管理局食药监注函[2005]46号“关于预防性生物制品企业注册标准修订及申报的通知”要求和审核原则，我会对企业申报的注册标准及相关资料进行了初审，初审意见提交本次会议，经专家讨论和审定，对相关制品各企业注册标准中关于种子批管理和传代代次、关键工艺的参数、原液合并、半成品配方以及质量标准范围的确定等方面进行了明确和规范，各生产企业应根据会议要求对注册标准进行再次修订，并于2007年9月1日前将确认的标准报药典会生物制品标准处。

（专家审核意见见附件1）部分治疗类细菌制品国家标准提高的审定提交本次会议讨论的6个治疗类细菌制品系2000年版《中国生物制品规程》收载，但未在2005年版《中国药典》三部收载的品种，会议根据2003年到2004年三次专业委员会会议的修订要求，以及2005年版《中国药典》三部各论中标准内容和格式，对提交本次会议讨论的6个治疗类细菌制品标准的修订进行了审定，由于相关单位未按照先前召开的三次专业委员会提出的修订意见进行相应的试验和验证，未能提供充分的技术资料和数据，因此本次会议未能对标准的修订作出决定，对此专家认为，企业应按照本次会议的审核意见，尽快完成相应试验和验证工作，除单独规定外，应在2007年年底前将结果提交药典会生物制品标准处。

微生物学免疫学进展2010年38卷1—4期分类索引

ｂ型流感嗜血杆菌结合疫苗冻干剂型的研究 … …………… …… 马国荣，朱亚平，妍，２１（）１— 李等００２：８不同稀释液对冻干Ａ、脑膜炎球菌结合疫苗质量的影响 … 薛红刚，蓉，Ｃ群郭马艳明，２１（）９—１等００２：２
：ｌ：猪链球菌２型感染实验动物模型的研究进展
……… ………… ………… … 宋洁，庶２１（）５６黎００３：７— ０
变异链球菌和血链球菌全代谢途径比对分析 …… ………… …………… ……… … 李呜宇２１３： —８００（）１炭疽灭活和裂解芽胞抗原免疫家兔后血清中的ＩＧ抗体应答ｇ
９２
微生物学免疫学进展２１００年第３８卷第４期
Ｐｏｃｏｉｕ０Ｎｖ２１，ｏ．８Ｎ．ｒｉＭｉｂｌｍｍｎｌ０．００Ｖ１３ｏ４ｍｎｒｏＩ
微生物学免疫学进展２１００年３８卷１ —４期分类索引
说明：目前有：为综述，题｝： ☆为简报， △为论坛， ※为史记，著的题目不标符号论
病毒与病毒性疫苗
人免疫球蛋白中肠道病毒７型中和抗体效价的测定１ ……… 毛群颖，郝春生，霞，２１（）１２张等００１：８— １
冻干麻疹减毒活疫苗残余水分影响因素的探讨 ……………… 徐斌，瞍，园，２１（）２ — ５王周等００１：２２牛肾组织及其培养物的不同消化法效果评价 … ………… … 刘学平，至栋，劲草，２１（）２３魏沈等００１：６— １：乳头瘤病毒１ｌ：人６型Ｅ５蛋白功能研究进展 ……… …………… ……… …… 李薇，万艳平２１（）５６００１：３— ５

中国生物制品规程

生物制品统一名称规程生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程生物制品国家标准品的制备和标定规程生物制品分批规程生物制品分装规程吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂制造及检定规程吸附百日咳菌苗、白喉类毒素混合制剂制造及检定规程钩端螺旋体菌苗制造及检定规程冻干皮注射用卡介苗制造及检定规程A群脑膜炎球菌多糖菌苗制造及检定规程冻干皮上划痕用鼠疫活菌苗制造及检定规程皮上划痕人用炭疽活菌苗制造及检定规程冻干皮上划痕人用布氏菌病活菌苗制造及检定规程治疗用布氏菌病菌苗制造及检定规程短棒状杆菌菌苗制造及检定规程流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程冻干流行性乙型脑炎活疫苗制造及检定规程森林脑炎疫苗制造及检定规程人用浓缩狂犬病疫苗制造及检定规程冻干麻疹活疫苗制造及检定规格冻干流行性腮腺炎活疫苗制造及检定规程口服脊髓灰质炎活疫苗制造及检定规程血源乙型肝炎疫苗制造及检定规程冻干黄热活疫苗制造及检定规程吸附精制白喉类毒素制造及检定规程吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程成人用吸附精制白喉类毒素制造及检定规程吸附精制白喉、破伤风二联类毒素制造及检定规程精制抗毒素制造及检定规程精制抗蛇毒血清制造及检定规程精制抗炭疽血清制造及检定规程精制抗狂犬病血清制造及检定规程原料血浆采集〔单采知浆术〕规程人胎盘血白蛋白制造及检定规程人血白蛋白〔低温乙醇法〕制造及检定规程人血丙种球蛋白制造及检定规程乙型肝炎免疫球蛋白制造及检定规程狂犬病免疫球蛋白制造及检定规程破伤风免疫球蛋白制造及检定规程冻干组织胺丙种球蛋白制造及检定规程冻干人凝血因子Ⅷ浓制剂制造及检定规程冻干人凝血酶原复合物制造及检定规程冻干人纤维蛋白原制造及检定规程冻干基因工程α1b干扰素制造及检定规程冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程冻干精制人白细胞干扰素制造及检定规程旧结核菌素制造及检定规程结核菌素纯蛋白衍化物〔TB-PPD〕制造及检定规程卡介菌纯蛋白衍化物〔BCG-PPD〕制造及检定规程布氏菌素制造及检定规程锡克试验毒素制造及检定规程生物制品无菌试验规程生物制品化学规定规程伤寒菌苗制造及检定规程伤寒、副伤寒甲二联菌苗制造及检定规程伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗制造及检定规程生物制品包装规程生物制品储存、运输规程生物制品生产用马匹检疫及管理规程实验动物和动物试验管理规程人二倍体细胞建株、检定及制备疫苗规程生物制品统一名称规程生物制品系指以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织作为起始材料，采用生物学工艺或别离纯化技术制备，并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂，包括菌苗，疫苗，毒素，类毒素，免疫血清，血液制品，免疫球蛋白，抗原，变态反响原，细胞因子，激素，酶，发酵产品，单克隆抗体，DNA重组产品，体外免疫诊断制品等。

一些生物制品的制造检定规程

重组人干扰素α2b注射液Chongzu Ren Ganraosuα2b Zhusheye Recombinant Human Interferon α2b Injection本品系由含有高效表达人干扰素α2b基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后制成。

含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。

1基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2制造2.1工程菌菌种2.1.1名称及来源重组人干扰素α2b工程菌株系由带有人干扰素α2b基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。

2.1.2种子批的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。

2.1.3菌种检定主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。

2.1.3.l划种LB琼脂平板应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。

2.1.3.2染色镜检应为典型的革兰阴性杆菌。

2.1.3.3对抗生素的抗性应与原始菌种相符。

2.1.3.4电镜检查(工作种子批可免做)应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

2.1.3.5生化反应应符合大肠杆菌生物学性状。

2.1.3.6干扰素表达量在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。

2.1.3.7表达的干扰素型别应用抗α2b型干扰素参考血清做中和试验，证明型别无误。

2.1.3.8质粒检查该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。

2.2原液2.2.1种子液制备将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基(可含适量抗生素)中培养。

2.2.2发酵用培养基采用适宜的不含任何抗生素的培养基。

2.2.3种子液接种及发酵培养2.2.3.1在灭菌培养基中接种适量种子液。

2.2.3.2在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。

发酵液应定期进行质粒丢失率检查(附录ⅨG)。

2.2.4发酵液处理用适宜的方法收集处理菌体。

2.2.5初步纯化采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。

百日咳毒素单克隆抗体的制备及其ELISA定量检测方法的建立

良好。结论已成功制备了抗ＰＴ的单抗，并建立了精密性和准确性均较好的定量检测ＰＴ的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ，
可用于无细胞百日咳疫苗生产中ＰＴ的定量检测。关键词：百日咳毒素；单克隆抗体；酶联免疫吸附试验
中图分类号：Ｑ９３９．９文献标志码：Ａ文章编号：１００５— ５６７３（２０１３）０２— ００１９— ０５
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｐｒｅｐａｒｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ（ＭｃＡｂ）ａｎｄｄｅｖｅｌｏｐａｎＥＬＩＳＡｉｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｔｕｓｓｉｓｔｏｘｉｎ（ＰＴ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅＭｃＡｂｓａｇａｉｎｓｔＰＴｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｈｙｂｒｉｄｏｍａｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅｐｒｏｐｅ￣ｉｅｓｏｆ
ＺＨＡＮＱｉａｎ，ＬＩＵＺｈｉ — ｆｅｉ，ＰＥＮＧＸｉａｎｇ — ｂｉｎｇ，ＮＩＮＧＨａｏ — ｒａｎ，ＣＨＥＮＷｅｎ，ＺＨＡＮＧＡｉ — ｈｕａ，ＹＡＮＧＸｉａｏ — ｍｉｎｇ（ＷｕｈａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＣｏ．Ｌｔｄ．，Ｗｕｈａｎ４３００６０，Ｃｈｉｎａ）

一种白喉杆菌培养基及应用其制备白喉类毒素的方法[发明专利]

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2015.01.07C N 104263678A (21)申请号 201410442565.5(22)申请日 2014.09.02C12N 1/20(2006.01)C12P 21/00(2006.01)C12R 1/16(2006.01)(71)申请人成都欧林生物科技股份有限公司地址610000 四川省成都市高新区天欣路99号(72)发明人马礼耕陈元芬(74)专利代理机构成都金英专利代理事务所(普通合伙) 51218代理人袁英(54)发明名称一种白喉杆菌培养基及应用其制备白喉类毒素的方法(57)摘要本发明公开了一种白喉杆菌培养基，由基础培养基、Ⅰ号液和Ⅱ号液组成，基础培养基由下述原料组成：HyPep5630、Amisoy 、Na 2HPO 4·12H 2O 、乳酸、酵母粉、氯化钙；Ⅰ号液为L-胱氨酸溶液；Ⅱ号液由下述原料组成：硫酸镁、β-丙氨酸、烟酸、庚二酸、五水硫酸铜、七水硫酸锌、四水氯化锰。

利用其培养基制备白喉类毒素的方法为菌种开启、传二代培养、传三代培养、传四代培养和发酵罐培养。

本发明培养基为无动物源培养基，能在菌种传代时进行良好的菌种复苏和扩增培养，产毒亦可达到现行药典标准要求；利用此培养基制备白喉类毒素的方法具有操作简单、生产方便、取材容易、成本低的优点。

(51)Int.Cl.权利要求书1页说明书9页附图1页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页说明书9页附图1页(10)申请公布号CN 104263678 A1.一种白喉杆菌培养基，其特征在于，所述培养基由基础培养基、Ⅰ号液和Ⅱ号液组成，且重量比为100:0.3～0.6:0.3～0.6；所述基础培养基由下述浓度的原料组成：HyPep 5630：10～20g/L，Amisoy：10～20g/L，Na2HPO4·12H2O：1～5g/L，乳酸：2～3g/L，酵母粉：0.1～0.5g/L，氯化钙：5～15g/L；所述Ⅰ号液为L-胱氨酸溶液，浓度为150～250g/L；所述Ⅱ号液由下述浓度的原料组成：硫酸镁：100～120g/L，β-丙氨酸：0.5～1.5 g/ L，烟酸：0.5～1.5g/L，庚二酸：0.04～0.15g/L，五水硫酸铜：0.3～0.8g/L，七水硫酸锌：0.2～0.8g/L，四水氯化锰：0.1～0.2g/L。

第十三章生物制品PPT课件

O
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O CH2
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O CH2
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O
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*
二、安全性检查
（一）无菌检查（二）热原检查家兔法检查热原（三）细菌内毒素检查：家兔法、鲎试验（四）异常毒性检查与特异性毒性检查：
观察一定剂量药物的急性毒性反应。（五）过敏试验：检查异源蛋白（六）致突变试验（七）生殖毒性试验
人血白蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白
*
4、重组DNA制品（recombinant DNA products）利用重组DNA技术，将遗传修饰的编码DNA通
过质粒或病毒载体导入受体细胞、微生物，DNA在细胞中不断复制、表达，产生蛋白质(药物)。
*
重组DNA制品种类： 1、细胞因子：重组人干扰素、白介素 2、生长因子：重组人表皮生长因子 3、激素：重组人胰岛素 4、酶：重组链激酶 5、疫苗：重组乙型肝炎疫苗（酵母） 6、单克隆抗体：抗人T细胞CD3鼠单抗
*
生物芯片技术是一种将生命科学研究中的许多分析检测步骤和装置通过并行化和微型化处理后集成在一个只有几平方厘米大小的载体上的分析检测系统。

破伤风疫苗研究进展

破伤风疫苗研究进展摘要：自从破伤风类毒素开始用于免疫,取得了较好的免疫效果。

现在的研究主要集中在从较少量的破伤风疫苗接种,获得较高效的免疫应答方面，以此更好地预防破伤风。

本文简述了破伤风的临床表现及治疗，对国内外破伤风类毒素疫苗主要研究进展和方向做一简要概述。

关键词：破伤风；类毒素；免疫原性破伤风(tetanus)一词来源于希腊语，表示痉挛的意思,常发生在创伤之后。

如果机体伤口被厌氧的破伤风梭状芽孢杆菌感染，该细菌就会在缺氧的环境下生长并产生外毒素而引起的急性、致死性的神经系统疾病[1]。

因为破伤风的临床表现让人触目惊心，并且有较高的发病率和病死率,所以该病引起了人们的高度重视,并在世界范围内成为医学界关注的问题。

据估计,全世界每年有800 000到1000 000个破伤风死亡病例,其中新生儿占400 000[2],因此破伤风是一种严重危及人类健康的疾病。

该病死亡多发生在非洲和东南亚等不发达国家[3]。

虽然在发达国家破伤风发病率较低，,但近年来,战争和自然灾难的不断发生导致外伤,烧伤，撕伤,磨伤,划伤等都可感染破伤风梭菌,使破伤风在各个国家的发病也呈上升的趋势，而且随着毒品成瘾者越来越多,采用被污染的注射器注射吸毒,也导致发生破伤风的病例在逐年增加,此外还有耳部感染，牙龈发炎,动物咬伤，堕胎，分娩，刺伤,纹身等都能引起破伤风。

1.临床裹现及治疗现状1.1临床裹现潜伏期：破伤风的潜伏期平均为6~10夭，短的可以仅24小时，长可达数月甚致数年。

一般来说，潜伏期越短，受伤部位离中枢越近，则症状越重，死亡率越高。

前驱期：常有12~2理小时之久，病人感觉乏力，头痛，嚼肌紧张，烦躁不安，打呵欠，少数病人感伤口有抽搐样疼痛，局部疼痛，肌肉牵拉感，抽搐及强直，感下领紧张，张口不便，颈部肌肉紧张或酸痛。

.发作期：表现为肌肉持续性收缩，顺序是:咀嚼肌、面肌、颈项肌、四肢肌群和脆肌，部分病人表现为局部肌肉的收缩。

病人开始感到咀嚼不便，张口困难，逐渐变为牙关紧闭，面部表情肌群则呈阵发性痉孪，出现独特的“苦笑”病容。

无细胞百日咳疫苗和其制备方法[发明专利]

专利名称：无细胞百日咳疫苗和其制备方法
专利类型：发明专利
发明人：R·E·法希姆,J·R·沃色,J·泰普法王,L·巴雷托,G·E·D·雅克森,L·U·L·谈,A·赫尔伯特,M·H·克莱恩
申请号：CN96195229.6
申请日：19960502
公开号：CN1193324A
公开日：
19980916
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：通过多个步骤从博德特氏杆菌菌株,尤其是百日咳博德特氏杆菌菌株中制备菌毛凝集原制剂,包括从细胞匀浆中提取菌毛凝集原,浓缩和纯化提取物。

菌毛凝集原制剂可与其它百日咳抗原一起配制无细胞百日咳疫苗,其中其它百日咳抗原包括百日咳毒素或其类毒素,69kDa蛋白和丝状血凝素和其它博德特氏杆菌抗原。

该疫苗可使易感人群的至少70%获得保护。

申请人：康诺特实验室有限公司
地址：加拿大安大略省
国籍：CA
代理机构：中国专利代理(香港)有限公司
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NOVEL CORONAVIRUS MRNA VACCINE, PREPARATION METHOD

专利名称：NOVEL CORONAVIRUS MRNA VACCINE, PREPARATION METHOD THEREFOR ANDUSE THEREOF发明人：HU, Yong,胡勇,LIU, Chenli,刘陈立,LI, Nan,李楠,ZHANG, Hao,张昊,AI, Liangxia,艾亮霞申请号：CN2021/121536申请日：20210929公开号：WO2022/068846A1公开日：20220407专利内容由知识产权出版社提供摘要：The present invention provides a novel coronavirus mRNA vaccine, a preparation method therefor and use thereof. The present invention provides a protein of the following (a) or (b): (a) a protein consisting of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1; and (b) a derivatized protein which is obtained by means of substitution, deletion and/or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 and has the same function as the protein consisting of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1. The present invention designs an S protein sequence of a pre-fusion conformation in a novel coronavirus (SARS-CoV-2), thereby achieving high-efficiency expression of human cells and increasing immunogenecity. The mRNA of the present invention can realize immunity against the novel coronavirus, and has wide applicability.申请人：SHENZHEN RHEGEN BIOTECHNOLOGY COMPANY,深圳市瑞吉生物科技有限公司地址：Floor 4, Building B, Wanhe Medical Park, No.8 Gaoxin Zhongyi Road, Maling Community, Yuehai Street, Nanshan District Shenzhen City, Guangdong 518057,中国广东省深圳市南山区粤海街道麻岭社区高新中一道8号万和医药公司大楼B座4层, Guangdong 518057国籍：CN,CN更多信息请下载全文后查看。

无细胞百日咳疫苗效力国家参考品的建立

无细胞百日咳疫苗效力国家参考品的建立候启明;梁亚文;张路民;雷殿良;肖詹蓉;刘德铮;杨景芳;张嘉铭【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】1998(11)4【摘要】采用罐培养百日咳CS菌株，培养物经硫酸铵两段盐析、浸提后，再经蔗糖密度梯度离心，收集以FHA．PT为主的百日咳菌保护性抗原，经福尔马林解毒，制备成原液。

该原液按照中国和日本的生物制品规程检定合格后，加入保护剂，稀释至18μgPN／ml，分装冻干制备成无细胞百日咳疫苗效力参考品。

以JNIH3和JNIH－6参考品为标准，按照日本规程的小鼠脑腔攻击法标定其效力单位。

根据14次效力试验所得的结果和日本NIH标定的结果，该批疫苗效力国家参考品的效力单位定为15PIU／ml。

【总页数】3页(P230-232)【关键词】百日咳疫苗;参考品;效力单位【作者】候启明;梁亚文;张路民;雷殿良;肖詹蓉;刘德铮;杨景芳;张嘉铭【作者单位】中国药品生物制品检定所;卫生部北京生物制品研究所;卫生部长春生物制品研究所【正文语种】中文【中图分类】R516.605;TQ460.7【相关文献】1.083化学交联抗原组成的无细胞百日咳疫苗的效力 [J],2.无细胞百日咳疫苗小鼠中和抗体法的建立及效力评价验证 [J], 卫辰;晁哲;吴燕;王丽婵;骆鹏;马霄3.德国对无细胞百日咳疫苗效力评估 [J], 孙述学4.第一代无细胞百日咳疫苗毒性国家参考品制备工艺的研究 [J], 侯启明;刘志强;孟丽;李松;金于兰;冯洁;陈晓婷;孙晓林;张庶民;梁雅文;张路民;项美娟;蒋强华;肖詹荣;付春晖;吴玫5.第5批百日咳疫苗效力国家标准品的建立 [J], 侯启明;张庶民;田博;梁雅文;张路民;项美娟;黄佐林;肖詹荣;付春晖;郑晓丽;刘志强;孟丽;李松;金于兰;冯洁;朱丽萍;宋继萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。