非洲猪瘟病毒DNA检测方案
一、非洲猪瘟现场快速检测实验操作规程
一、非洲猪瘟现场快速检测实验操作规程本规程推荐的检测程序、仪器设备和试剂等可作为非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的一般性指南，用户可根据实验室需求选择仪器设备型号及耗材，优化最佳的检测程序。
1 样品处理1.1试验材料：待检样品为采集的猪全血，非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒（缓冲液B1和缓冲液B2）。
1.2 设备与材料：小型离心机，涡旋振荡器，100μl移液器，吸头，1.5ml离心管。
1.3 操作步骤血液混样操作：可将5份猪全血进行混样，每份血样取10μl于离心管后，涡旋振荡混匀，即为混样。
取10μl单样或混样新鲜抗凝全血加入100μl的缓冲液B1中，室温消化3分钟，涡旋混匀3~5次。
向上述混合液中加入100μl的缓冲液B2（恢复至室温并混匀使用），涡旋混匀，12000转/分钟离心1分钟，上清为PCR待检核酸，取2μl PCR待检核酸进行PCR反应。
如在2小时内检测则PCR待检核酸置于4℃保存，否则置于﹣20ºC以下冰箱保存。
2 PCR反应2.1 试验材料：待检样品为PCR待检核酸，非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒（PCR反应液、反应阳性对照和阴性对照）2.2 设备与材料：荧光定量PCR仪，掌式离心机，20μl移液器，10μl移液器，吸头，荧光定量PCR反应管，乳胶手套，口罩。
2.3 操作步骤扩增试剂准备：每个反应的体积为20μl。
根据检测样品数量每个反应管加入18μl PCR反应液。
依次取2μl阴性对照、PCR待检核酸、反应阳性对照到PCR反应管中。
PCR反应：加样后，将PCR管置于荧光定量PCR仪内进行如下反应：1）95ºC预变性20秒；2）95℃变性10秒，58℃延伸20秒，共40个循环；设置58℃收集FAM荧光信号。
判定结果的有效性：阳性对照应出现特异性扩增曲线且Ct值＜35，阴性对照无特异性扩增曲线或无Ct值。
当样品的扩增结果有典型的扩增曲线且Ct 值<40时可判定为阳性（强阳性样本的Ct 值<30）。
非洲猪瘟荧光定量pcr检测原理
非洲猪瘟荧光定量pcr检测原理
非洲猪瘟荧光定量PCR检测原理通常包括以下步骤：
1. 样品处理：首先，从疑似感染非洲猪瘟的猪只体组织或血样中提取RNA/DNA。
这可以通过常见的提取方法，如盐酸酚/
氯仿法或商用提取试剂盒来完成。
2. 反转录：如果提取的样本为RNA，则需要通过反转录将其
转化为cDNA。
这可以通过反转录酶和引物进行逆反应来完成。
3. PCR反应：接下来，在反转录的cDNA或DNA盘中，加入
引物（特异性股非猪瘟病毒基因序列两侧的引物）和荧光探针（与靶基因序列相互作用并发出荧光信号），然后在PCR仪
中进行PCR反应。
4. 实时荧光检测：PCR反应进行时，PCR仪内的光束会以恒
定频率扫描荧光信号，检测引物与靶基因序列的结合。
如果存在非洲猪瘟病毒，荧光信号将随着PCR循环的进行而逐渐增加。
5. 阈值周期（Ct）测定：分析PCR反应结果，确定引物与靶
基因序列结合的周期数（Ct 值）。
Ct 值反映了起始非洲猪瘟
病毒基因序列数量，即PCR开始时间与发光信号超过背景噪
音之间的周期数。
较低的Ct 值表示非洲猪瘟病毒的数量较高。
通过这样的荧光定量PCR检测方法，可以快速、准确地检测
非洲猪瘟病毒的存在和数量。
这种方法的优点在于高灵敏度、高特异性和高精确性，可以对大量样品进行高通量检测。
生猪屠宰厂非洲猪瘟病毒PCR检测技术浅析
为规范生猪屠宰环节非洲猪瘟检测工作，降低非洲猪瘟病毒扩散风险、切断非洲猪瘟传播途径，确保生猪产品质量安全，结合屠宰厂实际，现就屠宰环节非洲猪瘟PCR检测技术和注意事项浅析如下：一、适用范围适用猪脾脏、淋巴结、扁桃体、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。
二、仪器与用具分析天平、高速台式离心机、冰盒、荧光PCR仪及配套反应管、组织研磨器、振荡器、冰箱、可调移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）及吸头、1.5mL离心管（无核酸酶）、非洲猪瘟检测PCR试剂盒（按厂家说明使用）、防护用品等。
三、操作步骤1、样品采集及运输采集淋巴结、脾脏、扁桃体、血液或血粉等材料。
样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。
采样时应穿戴个人生物安全防护用品，实施现场消毒和废弃物处理。
活猪大多采用全血或血清检测，对同一来源的生猪最多100头为1份混合血样。
病死猪多采取组织样品检测。
2、样品处理检测前样品应在二级生物安全柜中处理。
处理后的样品应置于60℃条件下灭活30分钟。
血液样品：用EDTA抗凝采血管采集血液，充分混匀，编号或用不加抗凝剂血管采集后静置2-4小时分离出血清或按8000转/秒离心2分钟取血清。
组织样品：用无菌工具取淋巴结、脾脏、扁桃体约2g，加入10mLPBS或生理盐水，在组织匀浆器中充分研磨后将研磨液转入1.5mL离心管中编号备用。
血粉样品：取血粉约2g，加入10mLPBS或生理盐水混合均匀，编号备用。
3、样品保存处理好的待检样品在2℃～8℃条件下保存一般不超过24小时，如需长期保存，应放置于-70℃以下冰箱，切忌反复冻融。
4、病毒DNA的提取①待检样品总份数用n表示，取n个1.5mL灭菌离心管，每管按顺序编号。
②每管加入样本处理液A30?L。
③每管分别加入处理好的待检样品3?L，充分混匀，在室温18-25℃下处理5分钟，旋涡振荡30秒。
④每管再加入样本处理液B30?L，振荡混匀离心后待检。
非洲猪瘟病原学检测方法
非洲猪瘟病原学检测方法介绍非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种高致病性的猪病，对于猪养殖业来说是一种严重威胁。
为了及时有效地进行疫情监测和病原学分析，科学家们发展了多种非洲猪瘟病原学检测方法。
本文将对这些检测方法进行详细的探讨。
PCR方法传统PCR1.样品收集：从患病猪只的脾脏、淋巴结或血液中收集样品。
2.DNA提取：使用DNA提取试剂盒将样品中的DNA提取出来。
3.PCR反应体系：设置PCR反应体系，其中包括引物、模板DNA、酶和缓冲液。
4.PCR扩增程序：设定PCR扩增程序，包括一系列不同温度的循环反应。
5.结果分析：利用凝胶电泳的方法，观察PCR产物的大小。
实时定量PCR1.样品收集和DNA提取：与传统PCR相同。
2.PCR反应体系：与传统PCR相同，但引入了荧光探针。
3.实时定量PCR程序：设定实时定量PCR程序，包括多个不同温度的循环反应。
4.数据分析：根据荧光信号的强度和阈值周期数，计算出病毒数量。
优点•灵敏度高：PCR方法能够检测到非洲猪瘟病原体的极低浓度。
•特异性强：引物的设计使得PCR方法能够区分非洲猪瘟病原体和其他相关病原体。
•快速性：PCR方法可以在短时间内得到结果。
缺点•对实验操作要求高：PCR方法需要精确计量样品和试剂。
•易受污染：PCR方法容易受到外部环境中目标DNA的污染。
•不适合现场应用：PCR方法的设备和试剂有一定的成本，不适合一些资源有限的地区。
ELISA方法直接ELISA1.样品准备：从患病猪只的血液中收集样品。
2.酶标板涂层：将非洲猪瘟病毒的抗原涂在酶标板上。
3.样品加入：将已稀释的血清样品加入到酶标板中。
4.洗涤步骤：用洗涤缓冲液洗涤酶标板，去除未结合的抗体。
5.反应步骤：加入与非洲猪瘟病毒抗体标记的酶联二抗。
6.洗涤步骤：洗涤酶标板，去除未结合的酶联二抗。
7.显示步骤：加入底物，使酶与底物反应产生可见的颜色。
8.终止反应：加入终止液停止酶的反应。
非洲猪瘟检测试剂操作方法
非洲猪瘟检测试剂操作方法非洲猪瘟（African Swine Fever，简称ASF）是一种高度传染性疾病，对猪群健康和养殖业都造成了巨大损失。
为了迅速检测和诊断非洲猪瘟，科学家们开发了多种检测试剂。
下面将详细介绍非洲猪瘟检测试剂（包括PCR、ELISA和纸条快速检测试纸）的操作方法。
1. PCR检测方法：PCR（聚合酶链反应）是一种通过扩增病原体的特定基因片段来检测病原体的方法。
下面是非洲猪瘟PCR检测方法的步骤：a. 实验准备：- 准备PCR试剂盒，包括DNA提取试剂、PCR引物和酶。
- 准备PCR工作站和仪器（如PCR仪）。
- 防止污染，使用无菌器材和顶级实验室规范的操作。
b. 样本提取：- 取非洲猪瘟病畜体、组织或血液样本。
- 使用合适的试剂盒进行DNA提取，按照操作手册中的指示进行。
- 将提取的DNA储存到低温条件下，避免降解。
c. PCR扩增：- 准备PCR反应液，包括DNA模板、引物、dNTPs、酶和缓冲液。
- 按照PCR反应液体积的要求逐一加入反应管中。
- 定量PCR反应溶液，确保所有反应中的成分配比准确。
- 放入PCR仪中，按照所使用的引物设计好的程序运行PCR反应。
d. 结果分析：- 运行PCR反应后，获取PCR反应管。
- 将PCR产物经电泳分离，依据目标基因片段大小来判断是否存在非洲猪瘟病毒。
- 使用显色剂或转印装置对PCR产物进行直接检测。
- 分析PCR结果并记录，确认样本是否为非洲猪瘟阳性。
2. ELISA检测方法：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学检测方法，用于检测非洲猪瘟病毒的抗体或抗原。
下面是非洲猪瘟ELISA检测方法的步骤：a. 实验准备：- 准备ELISA试剂盒，包括抗体/抗原、酶标记物、底物等。
- 准备ELISA板（包括微孔板或膜）和读板机。
- 防止交叉污染，使用不同的器材和操作台进行样本分析。
b. 样本处理：- 取非洲猪瘟血清样本，通过离心等操作去除杂质。
非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法
非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法1、范围本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。
本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。
2、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3、试剂3.1DNA提取试剂DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。
3.2 2 × PCR缓冲液2 × PCR缓冲液的配制见附录A。
3.3引物探针3.3.1采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'3.3.2可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'下游引物ASF-OIE-rPCRR：5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'荧光探针ASF-OIE-Probe：5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'3.3.3使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。
非洲猪瘟病毒核酸检验标准操作规程全套
非洲猪瘟病毒核酸检验标准操作规程全套1.取样类别及处理方法疫苗1.Ll活疫苗取至少2瓶样品，按瓶签注明头份用适宜稀释液分别稀释成10头份∕0.2ml,等量混合，取混合液进行核酸提取。
1.1.2灭活疫苗取至少2瓶样品，等量混合后进行以下处理。
1.121油佐剂灭活疫苗取36ml混合疫苗，加入正戊醇4.0ml,充分振荡混合1分钟，2~8℃冰箱静置不少于60分钟，直至油相和水相分离。
取水相进行核酸提取。
1.122铝胶佐剂灭活疫苗取混合疫苗5.0ml,摇匀，加入0.25g解离剂CPG-Odn（人工合成的寡聚核甘酸），放入摇床（20OrPm）37℃解离1小时，500OrPm离心10分钟，取上清液进行核酸提取。
1.1233其他水性佐剂灭活疫苗直接取混合样品进行核酸提取。
1.124生物制品和半成品冻干制品取至少2份（瓶）样品按冻干前体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提取；液体制品及半成品取至少2份（瓶）样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
1.125毒种取至少2支毒种。
冻干毒种，按冻干前体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提取；非冻干毒种，等量混合后直接取混合液进行核酸提取。
1.126细胞除另有规定外，取至少2瓶细胞浓度不少于107.0个细胞/ml的细胞悬液进行核酸提取。
1.127猪源原辅材料151猪组织每种组织，分别取样和处理。
取不少于2.0g组织，研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮,70℃灭活30分钟,4。
C下以2000~3000g离心10分钟，取上清液进行核酸提取。
1.127.2清每批血清取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
153猪胰酶干粉状胰酶，取至少2份样品，根据使用情况分别配制成不低于2.5%浓度的溶液，等量混合，取混合液进行核酸提取；液体胰酶，取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
1.127.4猪源衍生物固体、液体或干粉状猪源衍生物，可分别按组织、血清或干粉状胰酶的方法进行取样和样品处理。
非洲猪瘟实验室检测流程
非洲猪瘟实验室检测流程非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种高度致命的病毒性疾病，主要影响猪的健康和生存。
为了预防和控制ASF的传播，各国都设立了实验室来进行ASF的检测。
下面是非洲猪瘟实验室检测的基本流程。
1.样品收集：首先需要从疑似感染ASF的猪的组织、血液、粪便等样品进行采集。
收集到的样品必须遵循适当的采样方法，以确保样本的完整性和准确性。
2.样品处理：收集到的样品需要进行处理，以便提取病毒或检测病毒的核酸。
处理过程可能包括样品离心、冻干或冷冻保存等步骤，以确保样品的保存和稳定性。
3.样品提取：处理后的样品需要进行核酸提取，以获取样品中的ASF 病毒的DNA或RNA。
提取方法包括使用商用试剂盒或自制提取试剂等多种方式。
4.PCR检测：提取到的核酸可以用于聚合酶链式反应（PCR）检测ASF 病毒的存在。
PCR是一种常用的分子生物学方法，可以放大病毒的核酸并检测其存在与否。
5.结果分析：通过PCR检测，可以获得ASF病毒的阳性或阴性结果。
阳性结果表明样品中存在ASF病毒，阴性结果则表示样品中不存在ASF病毒。
6.病毒分离与鉴定：如果样品经过PCR检测呈阳性结果，接下来需要进行病毒的分离和鉴定。
这通常是通过将阳性样品接种到特定细胞系或动物体内，观察病毒是否能够繁殖和感染。
7.结果报告：最后，实验室将审核、整理和报告检测结果。
病毒检测报告通常包括样品信息、检测方法、结果和相关建议等内容，以便于参与疫情控制和预防的机构进行后续处理。
此外，非洲猪瘟实验室检测流程还可能包括对样品进行深度测序以了解ASF病毒株系、进行病毒血清学检测以了解对ASF病毒的免疫反应等。
总的来说，非洲猪瘟实验室检测流程需要收集、处理和提取样品，通过PCR检测病毒核酸，进行病毒的分离与鉴定，并最终形成检测结果和报告。
这些检测流程的目的是及时、准确地检测ASF病毒，为疫情监测和控制提供依据。
非洲猪瘟病原学检测方法
《非洲猪瘟病原学检测方法》非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是一种严重危害全球养猪业的烈性传染病，给世界各国的生猪养殖业带来了巨大的经济损失和社会影响。
及时、准确地检测非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）对于疫情的防控、诊断和扑灭至关重要。
本文将对目前常用的非洲猪瘟病原学检测方法进行详细的介绍和分析，以期为相关领域的研究和实践提供参考。
一、病毒分离培养病毒分离培养是非洲猪瘟病原学检测的经典方法，也是确诊 ASFV 的金标准。
该方法通过将疑似感染组织样本接种到适宜的细胞培养体系中，在特定的培养条件下培养，观察细胞病变效应（Cytopathic Effect，CPE）以及进行病毒的鉴定和分离。
病毒分离培养的优点是具有高度的特异性和敏感性，能够直接检测到病毒的存在和增殖。
然而，该方法也存在一些局限性。
病毒分离培养需要较长的时间周期，通常需要数天到数周甚至更长时间才能观察到结果，不利于疫情的快速诊断和及时防控。
病毒分离培养对实验条件和技术要求较高，需要专业的实验室设备和熟练的技术人员，操作较为复杂且成本较高。
一些弱毒株或变异毒株可能在细胞培养中难以分离和鉴定，从而影响检测的准确性。
二、实时荧光定量 PCR 技术实时荧光定量 PCR（Real-time Fluorescence Quantitative PCR）技术是目前非洲猪瘟病原学检测中应用最为广泛、最具发展潜力的方法之一。
该技术基于 PCR 原理，通过特异性引物和荧光探针，在 PCR 反应体系中实时监测荧光信号的变化，从而定量检测 ASFV 的核酸。
实时荧光定量 PCR 技术具有以下显著优点。
检测速度快，一般几个小时内即可获得结果，大大缩短了检测周期，能够满足疫情快速响应和处置的需求。
灵敏度高，可以检测到极低浓度的病毒核酸，提高了检测的准确性和可靠性。
特异性强，能够特异性地识别 ASFV 核酸，避免与其他病毒的交叉干扰。
非洲猪瘟荧光定量pcr检测原理
非洲猪瘟荧光定量pcr检测原理非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种严重的猪类传染性疾病，其病毒属于病毒超科阿斯法瑞毒科（Asfarviridae），感染后会导致高死亡率的猪群流行，并对猪类养殖业造成巨大损失。
为了及时、准确地检测非洲猪瘟病毒，荧光定量PCR （qPCR）技术被广泛应用。
荧光定量PCR是一种基于PCR的扩增技术，它结合了荧光探针技术和实时监测技术，能够实现对目标DNA分子的定量分析。
非洲猪瘟荧光定量PCR检测原理如下：1. 样品制备：从猪体组织或血液样品中提取总RNA或DNA，并进行纯化处理，以去除潜在的抑制性物质。
2. 反转录（RT）过程：如果使用RNA作为样品，需要首先将RNA转录成相应的cDNA。
反转录过程中，将RNA模板与反转录酶和引物结合，通过逆转录反应将RNA转录成cDNA。
反转录后获得的cDNA用作PCR的模板。
3. 目标基因扩增：设计引物和荧光探针，使其与非洲猪瘟病毒的特定序列互补。
引物的5'端和3'端各位于荧光探针结构的两个相邻区域。
扩增反应用荧光标记的引物，在PCR反应体系中，引物与模板DNA碱基互补，引物结合并扩增目标DNA。
4. 荧光信号检测：荧光信号检测系统包括荧光DNA探针、荧光素酶等。
在PCR的扩增过程中，当荧光探针与目标DNA靶标序列匹配时，探针被引物的3'端剪切酶切割，释放荧光信号。
系统通过光学检测设备实时监控荧光信号强度，并记录下来。
5. 数据分析：荧光强度与扩增的目标DNA数量成正比，可以根据标准曲线或特定算法计算出非洲猪瘟病毒的总量。
非洲猪瘟荧光定量PCR的优点在于：高度敏感、高度特异性、快速、准确、自动化和多重检测。
该方法能够在几个小时内完成检测，并且能够在感染早期就进行检测，有助于控制病情的扩散。
参考文献：1. Yanez RJ, Rodriguez JM, Nogal ML, et al. Analysis of the complete nucleotide sequence of African swine fever virus. Virology. 1995;208(1):249-278.2.서성배, 박성진, & 김연희. (2017). 동물마약물검사증탁-polymerase chain reaction 적용미국합동작전편성부대의비구루비르스검출률나타내기 / Evaluation of Bovine viral diarrhea virus detection rate in thiacloprid-polymerase chain reaction applied combined force conducting animal narcotics test. Korean Journal of Veterinary Research, 57(3), 163-168.3. Gallardo C, Nieto R, Soler A, et al. Experimental Transmissionof African Swine Fever (ASF) Low Virulent Isolate NH/P68 by Surviving Pigs. Transbound Emerg Dis. 2013.4. Zhang Z, Geng G, Wang N, et al. Development of a TaqMan-Based Real-Time PCR Assay for Rapid and Specific Detection of Nigerian Isolate of African Swine Fever Virus. J Sci Food Agric. 2016;97(12):3986-3991.5.Zhai S, Zou J, Wang L, et al. Comparative transcriptome analysis shows that the extracellular matrix receptor interaction contributesto the venous metastases of hepatocellular carcinoma. Cancer Genomics Proteomics. 2020;17(3):297-311.。
非洲猪瘟荧光定量pcr检测原理
非洲猪瘟荧光定量pcr检测原理非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种急性、高度致死性的病毒性疾病，对于养猪业造成了巨大的经济损失。
荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）是一种敏感且可靠的检测方法，用于检测和定量ASFV的存在。
以下将介绍非洲猪瘟荧光定量PCR检测的原理及相关参考内容。
荧光定量PCR是一种通过检测并定量目标序列的DNA或RNA的数量来确定其起始数量的技术。
它结合了聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、荧光探针和实时荧光检测技术。
在非洲猪瘟荧光定量PCR检测中，主要包括以下关键步骤：样品制备、模板提取、引物设计、PCR条件设定和荧光定量。
首先，需要对样品进行制备。
在非洲猪瘟荧光定量PCR检测中，通常从疑似感染的猪体中提取组织样品，如脾脏、淋巴组织等，或者从病毒悬液中提取病毒RNA或DNA。
其次，需要进行模板提取。
模板提取是为了从样品中提取出病毒RNA或DNA，以供后续的PCR反应使用。
常用的提取方法包括商业化的RNA/DNA提取试剂盒，如基于硅胶柱或磁珠吸附的方法。
然后，需要设计引物。
引物是用于扩增ASFV目标序列的DNA片段的特异性DNA寡核苷酸。
引物的设计是非洲猪瘟荧光定量PCR检测中的关键步骤，合适的引物可以提高PCR扩增的特异性和灵敏性。
接下来，需要设置PCR条件。
PCR条件是指PCR反应中的温度和时间等参数。
对于非洲猪瘟荧光定量PCR检测，典型的条件为：预变性（pre-denaturation）95°C，10分钟；变性（denaturation）95°C，15秒；退火（annealing）55°C，15秒；延伸（extension）72°C，30秒。
反应的循环次数视情况而定。
非洲猪瘟的病毒检测
由于非洲猪瘟（ASF）缺乏预防用疫苗，为防止疫病的传播，就需要实施严格的卫生和生物安全控制措施，而这就依赖于疫病的快速、可靠的早期诊断。
ASF的诊断是指确诊动物正在感染或者曾经感染过非洲猪瘟病毒（ASFV）。
因此，适用的诊断技术包括检测和识别ASFV特异性抗原、DNA或抗体的技术，所获取的检测信息也是控制和根除计划的重要保障。
在选择诊断技术时，分析疫病感染期非常重要（图1）。
由于感染动物所处的感染期不同，因此在疫情和控制/根除计划中，需要同时检测病毒和抗体以确保准确性。
根据报道，ASF的自然感染潜伏期为4～19天。
在临床症状出现的两天前，ASF感染动物开始散播大量病毒。
病毒散播因所感染的ASFV毒株毒力不同而异。
感染后约7～9天血清转阳，抗体阳性可持续终生（见图1）。
非洲猪瘟的病毒检测文│中国动物疫病预防控制中心病原学检测为阳性（即抗原）则表明，所检测的动物在取样时正在发生感染。
而抗体检测阳性则表明感染正在或者已经发生，包括感染后已经恢复的动物（且可能终身保持血清阳性）。
自2015年底以来，东欧血清学流行病学调查数据显示血清学阳性动物的检出率显著增加，特别是在发生疫情的欧盟国家的野猪群体中尤为明显。
这些结果表明，ASF感染耐过动物可存活超过一个月并可能出现亚临床感染的病例，就像在伊比利亚半岛、美洲和非洲之前所描述的情况。
因此，抗体检测技术对于实施控制和根除计划所需的完整信息而言是必要的。
一、应用聚合酶链式反应（PCR）检测非洲猪瘟病毒基因组PCR已成功应用于猪样品（血液、器官等）和蜱中ASFV基因组的检测。
病毒DNA片段通过PCR扩增获得足以检测的量，从而实现检测。
所有经过验证的PCR技术均可以在临床症状出现前实现检测。
P C R 能在样品到达实验室数小时内，完成ASF的诊断。
PCR是可以代替病毒分离鉴定的一种灵敏、特异、快速的ASFV检测技术。
同时，相比于抗原检测技术，如酶联免疫吸附试验（ELISA）和直接荧光抗体测试（FAT），具有更高的敏感性和特异性。
金标准诊断-非洲猪瘟病毒检测方案说明书
Diagnosis Solutions for African Swine Fever VirusTo collaborate in the prevention of spread of ASFV, and to maintain the well-being of your farm animals, Gold Standard Diagnostics provides a wide range of support tools, as well as in-field or laboratory tests to guarantee an early detection of the disease, as there is currently no effective vaccine or treatment available for the disease.Prevention and early detection play a key role in the control strategy of the ASFV. We aim to offer management tools and comprehensive diagnostic solutions - ELISA, LFA and molecular assays - to detect ASFV in domestic pigs and wild boars.Key Benefits• Easy and reliable tests with high specificity and sensitivity• Detecting a wide range of ASFV genotypes• Different formats available to fulfill specific requirements• Streamlined workflows• Offering one solution for eachscenario of ASFV situationRecommended Protocols of Analysis for the Management of different ASFV Scenarios*How Many Animals Do I Have to Analyze on my Facilities?The following data is just informative, it is not mandatory to strictly follow the information in the table.*Taking into account the following parameters: 95% confidence and 10% prevalence, you have to analyze 10% of the animals to ensure that the disease is not in your facilities with: • PPA COMPAC • INgene q PPA• Combination of INgezim PPA CROM Ag and INgezim PPA CROM Ab •INgezim PPA DASIf you use separately INgezim ASF CROM Ag detection or INgezim PPA CROM Ab detection, you have to analyze 13% of the animals to ensure that the infection has no presence in your facilities.These parameters are used for populations of more than 2,000 pigs. If this is not the case, and the number of pigs is lower, it is advisable to follow the table below to know the minimum number of pigs to be analyzed:* The following information is collected in the coming document: World Organisation for Animal Health (OIE); Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals; Infection with African Swine Fever VirusGold Standard Diagnostics**********************************.com Antibody Detection SolutionsAntigen Detection SolutionsINgezim PPA COMPAC - 11.PPA.K.3Blocking ELISA IgG and IgM detection (1)(2)• Detection in pig serum samples.• >99% Specificity & >99,5% Sensitivity respect the OIE method• This test has been validated by the European Reference Laboratory (EURL)•This method is recognized and recommended by the OIE Reference Laboratory for ASFVINgezim PPA CROM Ab- 11.PPA.K.41Laterla Flow Assay (2)• Detection in pig and wild boar serum, plasma and blood samples • Processing time of 10 minutes• Sensitivity: 99% correspondence with the OIE ELISA.• Specificity: 99.5% correspondence with INGEZIM ® PPA COMPAC and OIE ELISA. •96%specificity and >80% sensitivity respect IPMA (wild boars)INgezim ASF Ab – 11.ASF .K1 NEW!Indirect ELISA IgG detection• Detection of Ab in wild boars and pigs serum and blood samples •Particularly useful for “non-well-preserved” samplesINgezim PPA DAS - 11.PPA.K.2 RENEWED!Double Antibody Sandwich ELISA (2)• Analytical Sensitivity: detection of antigen in blood from day 7-10 p.i.• Detection in pig and wild boar blood, serum, exudates, tissues samples •Market Exclusivity for this referenceINgezim ASF CROM Ag - 11.ASF .K.42Lateral Flow Assay (3)• Detection in pig and wild boar blood samples• Analytical Sensitivity: detection of antigen in blood from day 7-10 p.i.• Processing time of 10 minutes•Especially efficient in acute stages of the diseaseINgene q PPA - 11.PPA.K.5TX/Q RENEWED!Real-Time PCR kit• Improved Sensitivity, LOD95%=10 copies/rxn • Improved formulation and stability• Detection in blood, serum, exudates and tissue samples • Designed in compliance with OIE guidelines • Validated by the EURL-ASF (CISA-INIA)• Perfect agreement with the OIE reference method (UPL) & better sensitivity than the UPL assay in pooled samples •Suitable for pools of up to 20 samples (for subclinical or chronic infections (CT>30), pools of 3-5 samples are recommended)(1) This method is recognized by the OIE Reference Laboratory for ASFV(2) Evaluation of protection induced by immunisation of domestic pigs with deletion mutant African swine fever virus BeninMGF by different doses and routes. Sanchez-Cordon PJ, Jabbar T, Berrezaie M, Chapman D, Reis A, Sastre P , Rueda, P , Goatley L, Dixon LK. Vaccine. 2018(3) Development of a novel lateral flow assay for detection of African swine fever in blood. Sastre P , Gallardo C, Monedero A, Ruiz T, Arias M, Sanz A, Rueda P . BMC Vet Res. 2016 Sep 15;12:206. doi: 10.1186/s12917-016-0831。
非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴别检测规范
非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴别检测规范本规范适用于非洲猪瘟病毒流行毒株与非洲猪瘟病毒CD2v和MGF 360-505R基因缺失株的荧光PCR方法鉴别检测。
1.主要试剂1.1核酸提取试剂盒。
1.2无核酸酶水。
1.3荧光PCR预混液（2×）。
1.4引物和探针：P72、CD2v、MGF360-505R基因扩增引物和探针由国家非洲猪瘟参考实验室设计并提供（联系人：李林，电话：）。
1.5 阳性和阴性对照：阳性对照样品为ASFV基因组DNA 标准物质（用无核酸酶水稀释1000倍后使用），由国家非洲猪瘟参考实验室提供；阴性对照样品为无核酸酶水。
2. 主要仪器设备2.1 荧光PCR扩增仪。
2.2 台式低温高速离心机。
2.3 组织匀浆机。
2.4 微量可调移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL等不同规格）。
2.5 无核酸酶离心管与吸头。
2.6 PCR扩增管。
3. 样品采集和运输保存对活猪，可采集抗凝全血（EDTA抗凝）、口鼻拭子或血清等；对病死猪或已屠宰猪，可采集脾脏、淋巴结、扁桃体、肝脏等组织。
尽快送至实验室进行病毒核酸检测。
样品的运送与保存应满足NY/T 541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》相关要求。
上述样品可在4°C最长保存2天；如需长时间保存，应置于-20°C以下。
4.样品处理4.1 组织样品取0.1 g～0.2 g样品，加入1 mL～2 mL预冷的PBS（pH 7.4），用组织匀浆机高速匀浆，制成10%组织匀浆液，以5000 r/min离心10 min，取200 μL上清液进行核酸提取。
4.2 液体样品抗凝全血、血清等液体样品不需进行特殊处理，直接取200 μL进行核酸提取。
5.病毒核酸的提取和纯化取已进行前处理的样品200 μL，可按传统方法提取病毒核酸，也可采用病毒核酸提取试剂盒、自动化核酸提取仪提取病毒核酸。
提取后的病毒核酸应立即使用或置于-20°C以下冷冻保存。
非洲猪检测方案
非洲猪检测方案非洲猪瘟是一种高度传染性的猪类疾病，对农业和经济造成了严重的危害。
为了及早发现和控制非洲猪瘟病毒的传播，提出了一种有效的非洲猪检测方案。
该方案旨在确保及时的病毒检测和正确的防控措施，以保护养猪业和粮食安全。
一、方案目标非洲猪检测方案的主要目标是尽早发现和确诊非洲猪瘟病毒，阻止其进一步传播，降低对养猪业和农业经济的损失。
具体目标包括：1. 提高对非洲猪瘟的认识和了解；2. 发展快速、准确、敏感的检测方法；3. 加强疫情监测和报告体系；4. 建立健全的病毒溯源与传播追踪体系；5. 促进防控措施的有效落地。
二、方案内容1. 提高对非洲猪瘟的认知：加强非洲猪瘟疫情的宣传教育，提高养殖户和相关从业人员对非洲猪瘟的认知水平。
通过培训和宣传活动，提高养殖户对非洲猪瘟的预防和控制意识，加强养猪场的自查自测能力。
2. 发展快速、准确、敏感的检测方法：采用PCR技术（聚合酶链反应）或ELISA（酶联免疫吸附实验）等方法，对猪只的血液、脏器和组织样本进行采集和检测。
确保检测方法的准确性和敏感性，提高检测结果的可靠性和精确性。
3. 加强疫情监测和报告体系：建立健全的非洲猪瘟疫情监测和报告体系，包括养殖场的日常监测、定期排查和疫情报告。
相关部门应及时收集、汇总和分析疫情数据，及时发布疫情通报，以便采取有效的防控措施。
4. 建立健全的病毒溯源与传播追踪体系：通过对疫情病毒进行溯源研究，了解其传播途径和传播机制，为疫情防控提供科学依据和支持。
同时，建立完善的病毒传播追踪体系，及时跟踪病毒的传播路径，制定相应的防控策略。
5. 促进防控措施的有效落地：制定全面、科学、可行的非洲猪瘟防控措施，包括疫苗接种、消毒、隔离和人员管理等方面的措施。
加强养殖场的管理与监督，确保防控措施的有效落实和执行。
同时，加强与相关行业的交流合作，推广和分享成功的防控经验和技术。
三、方案实施与效果评估非洲猪检测方案应由相关政府部门和专业机构共同负责组织和实施。
非洲猪瘟抽样方案
非洲猪瘟抽样方案1. 引言非洲猪瘟（African Swine Fever，简称ASF）是一种高度传染性、致死性极强的猪病，对猪养殖业造成了严重的经济影响。
为了及时发现和控制ASF的传播，制定有效的抽样方案对于疫情监测和防控工作至关重要。
本文将介绍一种可行的非洲猪瘟抽样方案。
2. 抽样方法非洲猪瘟抽样方法主要包括传统抽样和现代（分子生物学）抽样两种方法。
2.1 传统抽样传统抽样方法是指通过现场观察、病死猪检测和实验室检测等手段采集样本进行检测。
具体步骤如下：1.现场观察：通过观察猪的症状、行为和外观等信息，对患病猪进行初步判断。
如发现病猪，应立即报告相关部门。
2.病死猪检测：将病死猪送往指定的实验室进行解剖和病理学检测，以确定是否为非洲猪瘟。
3.采集样本：根据病死猪的情况，采集不同的组织样本，如淋巴结、肺、脾等，送往实验室进行病毒学检测等。
2.2 现代抽样现代抽样方法是指利用PCR（聚合酶链反应）等分子生物学技术进行抽样和检测。
相比传统抽样方法，现代抽样方法更快速、更准确，可以提高非洲猪瘟的早期检测率。
具体步骤如下：1.样本采集：从猪体内采集血液、组织等样本，保存在离心管中。
2.样本处理：将样本进行离心分离，分离出血清或组织液，然后进行DNA或RNA的提取。
3.PCR检测：采用PCR技术对提取的DNA或RNA进行扩增，通过检测扩增产物来确认是否存在ASF病毒。
3. 抽样计划为制定有效的非洲猪瘟抽样计划，需要考虑以下因素：•抽样目的和检测要求：确定所需抽样数量和频率。
•抽样对象：包括健康猪和患病猪。
•抽样地点：根据疫情分布，选择有代表性的地点进行抽样。
•抽样方法：根据实际情况选择传统抽样方法或现代抽样方法。
•抽样时间：根据ASF的季节性和流行病学特点，选择适当的时间进行抽样。
根据以上因素，可以制定出一个合理的抽样计划。
例如，每月对养猪场进行抽样，每次抽样100头猪，其中50头健康猪和50头疑似患病猪，采用现代抽样方法进行检测。
非洲猪瘟的检测技术
非洲猪瘟的检测技术非洲猪瘟是一种高度致死性和传染性的病毒疾病，它在猪群中的传播非常迅速，并且没有任何有效的治疗手段。
因此，及早监测和检测非洲猪瘟病毒的存在至关重要，这将使养殖业能够采取必要的预防措施，以确保猪的健康和农业的可持续性。
本文将介绍目前用于检测非洲猪瘟的各种技术，以及它们的优缺点。
1. PCR检测聚合酶链反应（PCR）是一种广泛应用于生物学和医学领域的检测技术。
通过PCR技术，可以在短时间内扩增非洲猪瘟病毒的DNA或RNA片段，然后使用电泳等方法分析扩增产物。
PCR检测方法非常敏感和准确，可以在样品中检测到非常小的病毒数量，但是它需要实验室基础设施和专业知识。
2. ELISA检测酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用于检测病毒和抗体的技术。
在ELISA检测中，可以使用抗体识别非洲猪瘟病毒的特异性抗体，并通过特定的酶反应来测量样品中的病毒或抗体水平。
ELISA技术可以在猪血样、组织样和病毒培养物中检测非洲猪瘟病毒，但是它对病毒的种类和毒株的识别有一定的限制。
等温扩增（LAMP）是一种PCR的变体，也是一种用于DNA扩增的技术。
LAMP反应可选择性放大非洲猪瘟病毒的DNA，它比标准PCR技术更快速，也可以在较为简单的实验室条件下进行。
LAMP检测还可以通过光学观察颜色变化的方式来验证检测结果，这种技术也被称为LAMP-LFD。
综上所述，目前有多种技术可用于检测非洲猪瘟，但每种技术都有其自己的优缺点。
PCR检测具有高度灵敏性和准确性，但需要条件苛刻的实验室基础设施和专业技能。
ELISA检测可用于检测血清样品，但对病毒种类和毒株的识别有一定的限制。
LAMP检测可以通过简单的实验室条件和非常敏感的技术来识别非洲猪瘟病毒，这使其成为一个重要的检测工具，可以在野外环境中使用。
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非洲猪瘟病毒DNA检测方案
1.常见样本类型：
分泌物、血液、脾脏、扁桃体、肾脏和淋巴结等样本中的非洲猪瘟。
2.. 样品预处理方式（样本处理区）
2.1 样本前处理
2.1.1组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心2min，取上清液 200μL于 1.5mL 灭菌离心管中；病样组织直接上机提取也有实验室在用（江苏泰州农委）
2.1.2全血样本：取全血离心后的上清（血清） 200μL于 1.5mL 灭菌离心管中。
相关实验设备：动物组织研磨仪、手持式电动组织研磨仪
高通量组织破碎仪手持式组织研磨仪离心机根据样本数量多少可用高通量组织破碎仪或者手持式组织研磨仪破碎组织样本，之后用离心机将样本离心分层，取上清液。
2.2样本保存和运输
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用蓝冰和干冰运输，严禁反复冻融。
2.3 DNA 提取
对上述处理好的标本加入到预装好提取试剂的96深孔板中，将加好样本的耗材放置到96全自动核酸提取仪中提取核酸。
96全自动核酸提取仪用于病毒核酸的提取，配套提取试剂可以以散装形式提供，也可以以预装的形式提供，96高通量移液工作站可以用于散装试剂的分装。
3. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，将上游引物、下游引物、荧光定量探针、酶液预混好，将混合好反应液分装到 PCR 反应管中。
举例如下：
试剂
用量 非洲猪瘟病毒荧光PCR 引物探针Mix 1.6 uL 非洲猪瘟病毒荧光PCR Premix
10 uL
病毒核酸提取试剂（散装）
96全自动核酸提取仪
96高通量移液工作站
病毒核酸提取试剂 （预分装试剂）
提取样品ＤＮＡ 2 uL
RNase free H2O 6.4 uL
反应总体积20 uL
根据样本的多少可以选用96高通量移液工作站或移液排枪进行体系的配置和分装。
4. 加样（样本处理区）
将提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取一定量，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
5. PCR 扩增（核酸扩增区）
5.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
5.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 20μL；
荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM，淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择ROX 参比荧光，选择None 即可。
5.3 相关设备：
BTK-6 荧光PCR 仪、BTK-10 超快速荧光PCR仪、ABI7500、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量PCR 检测仪。
6. 结果分析判定
按照非洲猪瘟核酸检测试剂盒指导进行判读。