非洲猪瘟病毒DNA检测方案

非洲猪瘟病毒DNA检测方案

1.常见样本类型：

分泌物、血液、脾脏、扁桃体、肾脏和淋巴结等样本中的非洲猪瘟。

2.. 样品预处理方式（样本处理区）

2.1 样本前处理

2.1.1组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心2min，取上清液 200μL于 1.5mL 灭菌离心管中；病样组织直接上机提取也有实验室在用（江苏泰州农委）

2.1.2全血样本：取全血离心后的上清（血清） 200μL于 1.5mL 灭菌离心管中。

相关实验设备：动物组织研磨仪、手持式电动组织研磨仪

高通量组织破碎仪手持式组织研磨仪离心机根据样本数量多少可用高通量组织破碎仪或者手持式组织研磨仪破碎组织样本，之后用离心机将样本离心分层，取上清液。

2.2样本保存和运输

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用蓝冰和干冰运输，严禁反复冻融。

2.3 DNA 提取

对上述处理好的标本加入到预装好提取试剂的96深孔板中，将加好样本的耗材放置到96全自动核酸提取仪中提取核酸。

96全自动核酸提取仪用于病毒核酸的提取，配套提取试剂可以以散装形式提供，也可以以预装的形式提供，96高通量移液工作站可以用于散装试剂的分装。

3. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，将上游引物、下游引物、荧光定量探针、酶液预混好，将混合好反应液分装到 PCR 反应管中。举例如下：

试剂

用量 非洲猪瘟病毒荧光PCR 引物探针Mix 1.6 uL 非洲猪瘟病毒荧光PCR Premix

10 uL

病毒核酸提取试剂（散装）

96全自动核酸提取仪

96高通量移液工作站

病毒核酸提取试剂 （预分装试剂）

提取样品ＤＮＡ 2 uL

RNase free H2O 6.4 uL

反应总体积20 uL

根据样本的多少可以选用96高通量移液工作站或移液排枪进行体系的配置和分装。

4. 加样（样本处理区）

将提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取一定量，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

5. PCR 扩增（核酸扩增区）

5.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

5.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 20μL；

荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM，淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择ROX 参比荧光，选择None 即可。

5.3 相关设备：

BTK-6 荧光PCR 仪、BTK-10 超快速荧光PCR仪、ABI7500、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量PCR 检测仪。

6. 结果分析判定

按照非洲猪瘟核酸检测试剂盒指导进行判读。