基因工程抗体

基因工程抗体综述

前言：抗体的实验研究始于上世纪末，1888年Emile及Alexander Yersin由白喉杆菌的培养上清分离到可溶性毒素，后者注入动物内可引起典型的白喉发病症状。Von Behring及同事Kitasato(北里)报告，以白喉或破伤风毒素免疫动物后，其血清中可产生一种中和毒素的物质，该物质能阻止毒素引发的疾病，来自实验动物的抗血清用于感染的患儿，获得明显的治疗效果，尤其是在发病的早期。于是将能中和毒素的物质称为抗毒素(antitoxin)，随后引入抗体一词，泛指抗毒素一类的物质，而将引起相应抗体产生的物质称为抗原（antigen）。1896年Gruber和Durham发现了凝集素。1897年Draus发现可与相应抗原形成沉淀反应的抗体，称为沉淀素。于是认识到毒素及细菌之外的众多蛋白质均可诱导相应抗体的生成，是一种广义的免疫现象。

直至本世纪30年代，“抗体”一词才得以通用，1939年，Tiselius和Kabat采用电泳方法证实抗体的活性存在于泳动速度最慢的血清组分，称为丙种球蛋白（gammaglobulin）。免疫后的抗血清的电泳图形中，gamma球蛋白明显升高，抗血清经相应抗原吸收后再电泳，其gamma球蛋白又恢复到正常血清图形相同。在之后相当长的一段时期内，人们曾将抗体与gamma球蛋白作为同义词相互用。但事实上，具有抗体活性的球蛋白并不都泳动至gamma组分，反之在gamma组分的球蛋白并不都具有抗体活性。在1968年和1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会所属专门委员会决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白（immunoglobulin），由此可见，抗体是一个生物学和功能的概念，可理解为能与相应抗原特异结合的具有免疫功能的球蛋白，免疫球蛋白则是一个结构概念，除抗体外，它尚包括正常个体中天然存在的免疫球蛋白及病理情况下（如骨髓瘤，巨球蛋白血症及冷球蛋白血症等）患者血清中的免疫球蛋白及其亚单位等，因此，抗体是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都具有抗体活性，至少目前尚不了解这此天然的或病理的球蛋白的免疫功能。一：抗体产生技术

自上世纪末，以抗原免疫动物获得抗血清这一途径一直是获得抗体的经典方法。1975年Kohler及Milstein建立了B淋巴细胞杂交瘤技术，这是抗体产生的重大技术革命。该技术的普及使得众多科学家通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单隆抗体。由于单抗特异性强，性质均一，易于大量生产，在生命科学研究及医学实践方面作出了杰出的贡献，并形成产业，成为生物技术的重要支柱之一。然而，单抗多为鼠源性，采用类似的原理制备人源单抗迟迟未获进展，极大地限制了单抗作为治疗制剂在人体内的应用。为克服鼠源单抗的异源性反应，80年代中期人们开始尝试基因工程方法改造鼠源单抗，即所谓单抗的“人源化（humanized antibody）”，包括鼠Ig的V区与人Ig的C区拼接而成的嵌合抗体，或将鼠IgV 区的CDR区移植到人Ig的V区拼接成的改型抗体[3]。同时，考虑到完整抗体的分子过大，不利于发挥“药物”的作用，从而采用基因工程方法使之“小型化”，如单链抗体（single chain antibody），为VH与VL直接相连，分子量仅为完整抗体的1/6。以基因操作的方式制备抗体却始于1989年底英国剑桥Winter小组与Scripps研究所Lerner小组创造性的工作，他们采用PCR方法克隆抗体全部的可变区基因（reptoire）并装于原核表达载体中，以标记抗原即可筛选到相应抗体，当时称为组合抗体库技术。90年代初期，这一技术有了进一步的发展，即将抗体基因（VH或Fd）与单链噬菌体的外壳蛋白合并表达于噬菌体表面，以固相化的抗原吸附相对应的噬菌体抗体，经多次“吹附－洗脱－扩增”即可筛选得所需抗体。这是抗体产生的又一次重大技术革命，首先该技术将抗体的基因型及表型密切连系起来，每轮操作可使特异性抗体富集102-103。噬菌体抗体库技术不仅摆脱了细胞融合等繁琐的操作，而且可不经免疫制备抗体，为制备人源抗体开辟了新途径。这一点已为实验所证实，然而由一个未经免疫的初级抗体库中筛选出理想的抗体肯定不是一件轻松的事情，由于人体不能随意免疫，转人Ig基因小鼠的尝试80年代后期即有进行，免疫后约4%的抗体为人源。新近这一技术有

了重大突破，首先采用同源重组技术将小鼠胚胎干细胞（ES）中的鼠Ig基因敲除（knock out），而后采用融合技术将YAC库中大片段人Ig基因（200MB）导入，筛选后代即可获得免疫后仅产生人抗体的转基因小鼠，转人Ig基因小鼠的商品化并与噬菌体抗体库技术相结合，终于使多年徘徊不前的人源抗体的产生取得了突破。

由多克隆抗体到单克隆抗体，直至噬菌体抗体，由不均质的异源抗体到均质的异源性抗体，直至人源抗体，是抗体产技术的三个时代，从一个侧面反映了生命科学由整体水平、细胞水平、到基因水平水平的进展，同时也为抗体作为医药生技术产业的一个重要支柱奠定了基础。

二：抗体的分子结构

（一）、抗体分子的基本结构

尽管抗体分子是一个极不均一的分子群，既有许多不同的类和亚类，又表现出各不相同的抗原特异性，但所有抗体分子都有着相同的基本结构：二条相同的重链和二条相同的链组成的免疫球蛋白单体，重链（heavy chain）为分子量在50－70KD的多肽链，轻链（light chain）,较短，分子量在23KD左右，每一条肽链可分为二个区域，重链氨基端的四分之一或五分之一与轻链氨基端的二分之一的氨基酸序列在不同抗体分子之间变化较大，称作可变区，其余部分称为恒定区，免疫球蛋白单体是对称性的分子，一个重链和一个轻链以一个二硫键和非共价键结合在一起，二个重链又靠非共价键及一个或多个二硫键接在一起形成免疫球蛋白单体，有些抗体分子是由多个单体连接起来形成多聚体，如IgM可为五聚体，IgA可为二聚体。

早在50年代末期，Porter和Nisonoff通过将免疫球蛋白用蛋白酶消化成不同的片段研究免疫球蛋白的结构，使人们对免疫球蛋白的基本组成有的初步的了解，由此形成对免球蛋白片段的命名也延用至今，在免疫球蛋的研究中仍在广泛使用。

Porter用木瓜蛋白酶（papain）消化免疫球蛋白单体可得到二个相同的Fab(fragment with antigen binding)和一个Fc(fragment of crystallization)，前者可以和抗原结合，后者则与抗体的效应功有有关。Nisonoff用胃蛋白酶水解得到由二个Fab段构成的片段，这是因为木瓜蛋白酶在重链间二硫键的羧基侧切断了重链，从而二个Fab段仍由链间二硫键连接在一起，而剩余的Fc段则水解成小分子肽。这一研究，结合电镜观察结果，导致了经典免疫球蛋白单体的Y型结构模式，其二个臂为每一个Fab段，由一个轻链和部分重链组成，Fc 段则包含剩下的重链。

除了Fab,Fc段和F(ab')2段，免疫球蛋白分子还可以分成其它不同的片段，VH为重链可变区，VL为链可变区。Fv是VH和VL结合在一起的片段，是抗体与抗原结合的最基本的单位，VH和VL之间没有二硫键，而是靠共非价键结合在一起的，在浓度较低的溶液中易于解离，Fd段为Fab段中的重链部分，这些不同的片段对基因工程抗体的组建有重要的意义。（二）抗体分子的功能区结构

抗体分子的轻链和重链都有若干个结构类似的功能区组成，每一个功能区含有大约110个左右氨基酸，内有二个半胱氨酸，二者间隔约60个氨基酸，所形成的链内二硫键使功能区成为一个环状结构，将不同功能区的氨基酸进行比较，可发现它们之间有明显的同源性，即有些位置的氨基酸有着高度保守性，如形成二硫键的二个半胱氨酸，与第一个半胱氨酸相隔约14个氨基酸的色氨酸等等，因此所有的功能区都有非常类似的立体结构：它们含有二个反向平行β折叠片，这二个片层由链内二硫键连在一起，互相作用，形成一个球状结构；其核心为疏水区；在恒定区，一个β折叠片层含有四个反向平行肽链，另一个含有三个反向平行肽链，可变区与此类似，但二个β折叠片都含有四个反向平行肽链，在反向平行链折返处的环状结构，其氨基酸序列的保守性要低一些，可变区这些环形成了抗原结合部位。

轻链含有二个功能区，氨基端为可变区，羧基端恒定区，重链在不同的类或亚类可以有四个功能区或五个功能区，其氨基端为可变区，其余是恒定区，大部分重链在CH1和CH2之