几种细胞破碎方法对提取S_腺苷甲硫氨酸的研究_万红贵

收稿日期： ２００８－ ０１－ ２８ 作者简介： 万红贵（１９５５—）， 男， 研究员， 研究方向为发酵工程。
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提取物与应用
从 而 大 大提高 ＳＡＭ 的收率而降低生产成本。我们 研 究了几种破碎方法并进行了比较。
１ 材料和方法
１．１ 菌种 毕赤酵母基因工程菌： 南京工业大学制药与生
表 ２ 各破碎方法效果比较
破碎方法 超声波
ＳＡＭ 浓度／（ｇ／Ｌ） ０．５３１５
破 碎 率 ／％ ３２．４８
２０％ ＴＣＡ
１．６３６２
１００
２５％ ＨＣｌＯ４ 乙酸乙酯
１．２８５１ ０．９３１３
７８．５４ ５６．９２
１ ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４ １ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ
０．５０９４ ０．６６１１
３１．１３ ４０．４０
冻 融 法 是 将 细 胞 冻 结 后 再 融 化 ［９］。 冻 结 的 作 用 是破坏细胞膜的疏水键， 增加其亲水性和通透性。 同时由于细胞内水的结晶使细胞内外产生溶液浓 度差， 产生渗透压， 并且细胞内形成的冰晶也会 破坏细胞壁。本实验用冻融法破碎细胞， 所得 ＳＡＭ 浓 度 为 ０．７８６２ ｇ／Ｌ， 破 碎 效 果 为 ＴＣＡ 溶 液 的 ４８．０５％。
Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： Ｃｅｌｌｓ Ｂｒｅａｋｉｎｇ； Ｓ ＡＭ； Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ； ＴＣＡ
随 着 ２０ 世 纪 ８０ 年 代 初 期 基 因 重 组 技 术 的 广 泛 应用， 国内外生物技术发生了质的飞跃， 但是生 物技术的下游加工过程却很薄弱， 一定程度上制 约了生物产品的工业化。利用基因重组技术构建 的基因工程菌所产的生物制品中有相当一部分是 胞内产物， 因此必须将细胞壁破碎使产物释放出 来， 这也为此类产品的分离提纯过程提出了挑战。 细 胞 破 碎 的 方 法 很 多［１］， 有 机 械 法（如 珠 磨 法 、 高 压 匀浆法、超声波 法）和非机械法（如溶酶法、渗透压 冲 击 、 干 燥 法 、 化 学 渗 透 法 ）。 用 于 释 放 胞 内 物 质 的研究近年引起人们的关注， 但国内外有关这方 面的研究进展缓慢， 有关报道集中在有机溶剂、 抗生素、表面活性剂、螯合剂、变性剂等化学试 剂 进 行 细 胞 破 碎［２－ ４］。
命科学学院保存。 １．２ 试剂
三氯乙酸、高氯酸、硫酸、盐酸、乙酸乙酯： 分析纯。 １．３ 仪器
超声波细胞破碎机 ＪＹ９２－ ＩＩＮ 型： 宁波新芝 生 物 科技股份有限公司； ＧＬ－ ２１Ｍ 离心机： 上海市离心机 械 研 究 所 ； Ａｌｌｔｅｃｈ 高 效 液 相 色 谱 仪 ： Ａｌｌｔｅｃｈ 公 司 ； ＵＶ 检测器。 １．４ 方法 １．４．１ ＳＡＭ 的 ＨＰＬＣ－ ＵＶ 检 测 色 谱 柱 ： Ｐｒｅｖａｉｌ Ｃ１８ 柱（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ， ５ μｍ）； 流动相： ０．０６％ ＨＦＢＡ 溶 液 － 乙 腈 （８８ ∶１２ ） ， 用 ＴＦＡ 调 节 ｐＨ 至 １ ． ０ ； 流 速 １ ． ０ ｍＬ／ｍｉｎ； 检测波长 ２５４ ｎｍ。 １．４．２ 超 声 波 破 碎 毕 赤 酵 母 细 胞 发 酵 液 ４０００ ｒ／ ｍｉｎ， ４ ℃离心， 去上 清收集菌 体， 超 声 波 ２００ Ｗ 处 理 ２５ ｍｉｎ， 再离心， 取上清液并稀释一定浓度。 １．４．３ 化学渗透法 取一定量发酵液， 加入等体积各 化学试剂（三氯乙酸、高氯酸 、硫 酸 、盐 酸 、乙 酸 乙 酯）， 于 ４ ℃破碎 ２ ｈ， ４０００ ｒ／ｍｉｎ， ４ ℃离心 １０ ｍｉｎ， 取上清。 １．４．４ 冻融法 发酵液于－ ２０ ℃冷冻处理 ２０ ｍｉｎ， 然 后 置 于 沸 水 浴 ２０ ｍｉｎ， 依 次 循 环 ３ 次 ， 最 后 于 ４０００ ｒ／ｍｉｎ， ４ ℃离心 １， 本实验选用了超 声波破碎法、化学渗透法、冻融法进行研究比较。 ２．１ 超声波破碎
频 率 高 于 １５￣２０ ｋＨｚ 的 超 声 波 在 高 强 度 声 能 输 入下可以进行细胞破碎［８］。按照 ２．４．２ 方法对毕赤酵母 进 行 超 声 波 破 碎 ， 破 碎 后 产 物 ＳＡＭ 于 ＨＰＬＣ－ ＵＶ 检 测 ， 所 得 浓 度 为 ０．５３１５３ ｇ／Ｌ。ＳＡＭ 对 温 度 及 酸 碱 度 敏感， 容易分解或降解， 较低的温度及 ｐＨ 有利于其 保持稳定性， 而超声波产生的化学自由基团能使某 些敏感性活性物质（如 ＳＡＭ）变性失活， 而且会产生大 量热， 不利 于 ＳＡＭ 保持稳定， 从而相当于降低了破 碎率。
DOI:10.13684/ki.spkj.2008.09.004
提取物与应用
几种细胞破碎方法对提取 Ｓ － 腺苷甲硫氨酸的研究
万红贵， 郭一丹， 郑伟刚 （南京工业大学制药与生命科学学院， 南京 ２１０００９）
摘要： 考察几种提取 Ｓ－ 腺苷甲硫氨酸的细胞破碎方法， 包括超声波法、化学渗透法及冻融法。结 果
ＷＡＮ Ｈｏｎｇ－ ｇｕｉ， ＧＵＯ Ｙｉ－ ｄａｎ， ＺＨＥＮＧ Ｗｅｉ－ ｇａｎｇ
（Ｃｏｌｌｅ ｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓ ｃｉｅ ｎｃｅ ａ ｎｄ Ｐ ｈａ ｒｍａ ｃｅ ｕｔｉｃａ ｌ Ｅｎｇｉｎｅ ｅ ｒｉｎｇ， Ｎａ ｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅ ｒｓ ｉｔｙ ｏｆ Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎａ ｎｊｉｎｇ ２１０００９）
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｕｓ ｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｙｓ ｔｏ ｂｒｅａｋ ｃｅｌｌ ｆｏｒ ｒｅｌｅａｓ ｉｎｇ Ｓ ＡＭ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓ ｔｉｇａｔｅｄ， ｓ ｕｃｈ ａｓ ｕｌｔｒａｓ ｏｎｉｃ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｒｅｅｚｅ － ｔｈａｗ． Ｔｈｅ ｒｅｓ ｕｌｔｓ ｓ ｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｕｓ ｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｒｅｌｅａｓ ｅ Ｓ ＡＭ ｃａｎ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓ ｔ ｂｒｅａｋｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ， ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｓ ｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅａｇｅｎｔ ｗａｓ ２０％ ｏｆ ＴＣＡ．
我们利用毕赤酵母基因工程菌通过在培养基中 加 入 Ｌ － Ｍｅｔ， 使 Ｍｅｔ 和 ＡＴＰ 经 ＳＡＭ 合 成 酶 合 成 ＳＡＭ。 所 产 ＳＡＭ 为 胞 内 产 物 ， 约 有 ４５％的 ＳＡＭ 存 在于细胞质内的液泡中， 其他存在于细胞质内［７］。成 熟的酵母菌细胞壁较厚， 不易被破碎， 而且 ＳＡＭ 对 温度及酸碱度敏感， 容易分解或降解， 因此从酵母 中分离提纯 ＳＡＭ 是一个较为复杂的过程， 它 直接影 响着整个生产的成本， 必须寻找一种既能高效率破 碎 酵 母 细 胞 ， 又 能 有 效 保 持 ＳＡＭ 的 稳 定 性 的 方 法 ，
超声波破碎在实验室规模应用较普遍， 处理少 量样品时操作简便， 液量损失少， 但是此方法不能用 于生产， 超声波破碎工业应用潜力有限。
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２．２ 化学渗透法 化学渗透法用于释放胞内物质的研究是近几年
来才引起人们普遍关注的。乙醇、乙酸乙酯、甲苯、 高氯酸等试剂能有效地破碎酵母细胞， 作用机理为 它们能溶解酵母细胞壁上的类脂物质， 从而改变酵 母细胞的通透性或使 细胞壁破裂， 使内合物 ＳＡＭ 渗 透。我们分别研究了三氯乙酸、高氯酸、盐酸、硫酸 及乙酸乙酯的破碎效果并进行比较。
提取物与应用
最好。
表 １ 化学渗透法破碎结果
破碎试剂 ２０％ ＴＣＡ ２５％ ＨＣｌＯ４
Ｃ４Ｈ８Ｏ２ １ ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４ １ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ
ＳＡＭ 浓度／（ｇ／Ｌ） １．６３６２ １．２８５１ ０．９３１３ ０．５０９４ ０．６６１１
表 １ 列出了几种化学试剂对破碎毕赤酵母细胞 提取 ＳＡＭ 的结果， 由表 １ 可以看出， 采用 ２０％ ＴＣＡ 溶液作为化学渗透试剂进行细胞破碎， 效果最佳， 其 次是 ２５％ ＨＣｌＯ４。 ２．３ 冻融法
表明， 用化学渗透法提取 ＳＡＭ 较其他方法破碎率较高， 其中又以 ２０％三氯乙酸破碎效果最佳。
关键词： 细胞破碎； Ｓ－ 腺苷甲硫氨酸； 化学渗透法； 三氯乙酸
中图分类号： Ｑ ５０３
文献标志码： Ａ
文章编号： １００５－ ９９８９（２００８）０９－ ０１７１－ ０３
Ｓ ｔｕｄｙ ｏｎ ｒｅ ｌｅ ａ ｓ ｉｎｇ Ｓ － Ａｄｅ ｎｏｓ ｙｌ－ Ｌ－ Ｍｅ ｔｈｉｏｎｉｎｅ ｂｙ ｂｒｅ ａ ｋｉｎｇ ｙｅ ａ ｓ ｔ ｃｅ ｌｌｓ
Ｓ－ 腺苷甲硫氨酸（Ｓ－ Ａｄｅｎｏｓｙｌ－ Ｌ－ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ， ＳＡＭ） 是一种新兴的既可作为疾病治疗药物， 又可作为食
品营养强化剂的物质。它可用于治疗各种肝病、肝硬 化所致的胆汁郁积、抑郁症， 对各种关节炎和关节损 伤疗效显著， 而且还是预防癌症、心血管疾病和抗衰 老的高级保健药物［５］。另外， ＳＡＭ 还可作为抗氧化剂 以及酶法合成生物素、亚精胺和精胺等的原 料［６］。近 年来， 它还被用来生产去屑、止痒、减皱、抗衰老的 美容化妆品。
向［Ｊ］．化工进展，１９９４，（１）：１５－ ２１ ［２］ Ｎｏｖｅｌｌａ Ｉ Ｓ， Ｃｌａｉｒｅ Ｆａｒｇｕｅｓ． Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｎ ａｃｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｃｏｍ － ｂｉｎｅｄ ｕｓｅ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ， １９９４，４４（３）：３７９ ［３］ Ｆａｌｃｏｎｅｒ Ｒ Ｊ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： １Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ，１９９７，５３（３）：４５３ ［４］ Ｈｅｔｔｗｅｒ Ｄ， Ｗａｎｇ Ｈ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｅｌｌ ｐｅｒ－ ｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ － ＨＣｌ ａｎｄ ＴｒｉｔｏｎＸ － １００ ［Ｊ ］． Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ，１９９２，３３（４）：８８６ ［５］ 陶敏，干信．Ｓ－ 腺苷甲硫氨酸的研究现状及应用前景［Ｊ］．氨 基酸和生物资源，２００５，２７（３）：４９－ ５１ ［６］ 公 剑，王 旻，韦 平 和．Ｓ－ 腺 苷 甲 硫 氨 酸 合 成 酶 及 其 在 Ｓ－ 腺 苷 甲 硫 氨 酸 合 成 中 的 应 用 ［Ｊ］．药 物 生 物 技 术 ，２００１，８（２）： １０８－ １１１ ［７］ 曾 俊 华，王 昌 禄，陈 容 容，等．破 碎 酵 母 释 放 腺 苷 蛋 氨 酸 的 研究［Ｊ］．中国食品添加剂，２００５，（２）：２４－ ２６ ［８］ 李 宏 君，尹 际 彤，杨 启 东．细 胞 破 碎 方 法 简 述［Ｊ］．黑 龙 江 医 药，２００２，１５（２）：１２４ ［９］ 杨 翠 竹，李 艳，阮 南，等．酵 母 细 胞 破 壁 技 术 研 究 与 应 用 进 展［Ｊ］．食品科技，２００７，（７）：１３８－ １４２