生防菌的分离

2. 用品与仪器：三角瓶、刻度试管、灭菌水、称
量纸、玻璃吸管、电子天平、超净工作台、微波炉。
3. 培养基：
（1）高氏一号：培养放线菌。 （2）PDA：分离真菌; （3）KB：培养细菌。
生防微生物的筛选程序
（1）样品的采集
（2）生防菌的分离（分离培养基）
原始菌种保存
（3）纯化与培养 （单菌落稀释后划线、单孢分离纯化）
K2HPO4 0.5g K2HPO4 0.5g
NaCl 0.5g
NaCl 0.5g
KNO3 1g
KNO3 1g
MgSO4 0.5g
MgSO4·7H2O 0.5g
FeSO4 0.01g 琼脂 10g 水1000ml。
FeSO4·7H2 O 0.01g 琼脂 18-20g 水 1000ml，pH 7.2～7.4。
算浓度，用无水配成不同浓度梯度的药液，加到NYDA培 养基中，配制成合乎设计浓度要求的含药平板，然后按逐 级梯度筛选法，从低浓度到高浓度逐级锻炼培养，直至获 得抗适宜利福平浓度的标记菌株。
药物传导实验
① 供试作物：番茄（品种：早丰） ② 步骤：将标记的Ｂ-51菌悬液用涂抹法接于番茄最
上端叶片，按不同时间不同部位取样，经升汞表 面消毒后用NYDA药板分离，统计分离结果。 （接种部位和分离部位示意图)
土样25℃恒温箱中干燥3天，干燥后的土样与 CaCO3 10:1混 合，26℃下保温4天。
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土壤预处理方法: 为了提高土壤中放线菌的分离效率，采集的 土样应立即于28℃风干10d，用6%酵母膏和0.05%SDS（5mmol/L 磷酸缓冲液配置）对其悬浮液进行预处理，再采用接种至添加重 铬酸钾（250mg/L）的培养基中分离放线菌，加入抗真菌试剂和 抗细菌抗生素抑制细菌和真菌的生长增加放线菌的分出率。
放线菌的分离计数用培养基（淀粉铵盐培养基）：
可溶性淀粉 10g, (NH4)2SO4 2g, K2HPO4 1g , MgSO4·7H2O 0.5g, KCl 0.5g, FeSO4·7H2O 0.01g , 琼脂 18g, 水 1000ml , pH7.6～7.8。
实验方法
<1>熔化培养基倒皿，每皿12ml左右。设三个皿为 对照(CK)，每个土样处理3个皿。培养基冷凝后， 放入80℃的烘箱中，除去表面的冷凝水，一般烘 10～15分钟。
酵母菌出芽繁殖
新生隐球菌
酵母型菌落 C. albicans菌落 曲霉属
(类酵母型)
青霉菌落
乳酸菌Lactobacillus
Bordetella pertussis
芽孢杆菌的分离鉴定和活性测定
1．生长适温测定 将供试枯草芽孢杆菌单胞菌系接于牛肉膏蛋白胨
培养液中(pH7.2)，置于25℃，30℃，35℃，40℃ 四个温度等级下培养，每日用血球计数崐板检测 菌液的浓度。 2．适宜碳源测定 ① 培养基的制作：在无葡萄糖的营养洋菜中分别加 入可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、木糖、果糖、 蔗糖、甘露醇和桔粉(由广州糖果厂生产)，浓度为 2％(W/V)，灭菌备用。 ② 培养测定：将供试单胞菌分别接于上述各培养基 平板上，30℃下恒温培养72h后，测定菌落直径。
<2>选取每皿放线菌菌落数20～200个的平板用于计 数
五、实验结果的观察记录与实验课作业
1. 描述2-3种培养性状不同的放线菌： 菌落的形态、大小、颜色，绘图。 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
2. 分离结果记录与计算： 放线菌分离结果的调查表
分离方法 弹土法 稀释法
放线菌
数量
种类数
已融化好的高氏一号培养基中加入K2Cr7O4溶 液(每300ml加入100ppm 1ml)调至pH 7.2～7.4，待 温度降至40℃时倒皿，皿/40毫升培养基。
其它分离培养基
玉米粉琼脂、黄豆粉琼脂、Waksman 、Bennett 培养基均用 于分离放线菌。
几丁质培养基是分离放线菌的最有用的培养基之一，只有放 线菌够利用几丁质，所分离的放线菌菌落较小，呈白色， 再转接到适于产生可溶性色素的适当培养基上来加以区 别。
细菌 真菌 数量 数量
放线菌/总菌落数
3. 每克土样中的菌落数的计算（间接法）
每克土样中的菌落数＝（每皿菌落平均数×稀释倍数）/干土的百分数 注：干土的百分数即土壤干重％，本次实验烘干土样的百分数按100% 计。
*认真填写每次实验报告，完成实验记录、计算、绘图等，实 验报告成绩占30%
实验结果的观察与记录方法
自然条件下的传导实验
生防菌的标记实验
① 抗生素：利福平（有效成份甲哌力复霉素：150mg/片；陕 西省医药工业研究所制造）
② 供试菌：Ｂ-51菌系 ③ 培养基：改良NYDA(％)[107]：牛肉膏0.8，酵母浸出液0.5，
蔗糖1.0 琼脂2.0，pH为7.0。 实验方法：将利福平药片去糖衣，研成粉末，按有效成分计
（4）拮抗菌株的筛选（体外平板初筛） 涂抹法或混菌法接种
（5）发酵培养
（5）化合物鉴定 农抗的下游加工工艺
（6）提取总化合物
（7）化合物分离 （5）盆栽试验（抗菌谱） 作用机理
理化性质 生物学性质
四、实验操作
1.土样准备：
采集土样应该尽快进行土样预处理与分离工作，放置时间过 长会影响分菌的准确性。
对番茄早疫病的防效
① 供试菌株浓度分别为 1×10標拝6个/ｍｌ。② 供试化学农 药：70％甲基托布津ＷＰ800×液，杀毒矾Ｍ８ 400×液。 ③ 供试番茄品种：利春。④试验地点：咸阳市秦都区沣西 乡伍家堡。生态环境为塑料大棚（总面积约300平方米）。 ⑤ 试验小区设计：各供试药剂及空白对照各自为一个处理， 共９个处理，重复三次，小区面积为5×0.7米，按随机区 组排列。⑥ 田间喷雾及病情调查：在4月8日（现蕾期）和 4月19 日（开花期）两崐次喷雾，每次均在傍晚进行，空 白对照喷清水；喷药前调查一次发病基数，每次喷药以后， 大致在第五、十、十五天以小叶为单位调查发病情况，分 别崐记载病叶数和严重度。
实验一 生防菌的分离
一、实验目的
1. 掌握生防菌的分离方法、分离培养基与培养条件。 2. 观察生防菌如放线菌、细菌、真菌的菌落形态。
二、实验原理
采用稀释法、弹土法。将土壤样品接种到相应 的分离培养基上培养，利用适宜生防菌生长的培养 基与条件，分离不同种类的生防菌。
三、实验材料和仪器
1. 样品：土壤、植物（表面、体内）、果实。
4．定植、转移的研究 无菌条件下的定植、转移(无菌液培法) 供试作物：辣椒 (8819线辣子) 供试菌：Ｂ4-110，Ｂ-54两个菌系 生长容器：标本瓶(210×300mm) [产地：武汉] 瓶内放一特制网架(直径16.5cm，高8cm)，瓶口用
5cm厚的脱脂棉和一层纱窗网封严。(15磅下蒸气 灭菌20分钟，备用。) 培养液成分：Shive和Robbins营养液Ⅰ(1942) g／l
细菌 连片 连片
42 连片
25 19 连片
6%酵母膏+0.05%SDS CK1
5 10 0(CK2) 5 10
67
16
72
13
8
连片
21 连片
29
45
真菌 连片
2 0 8 1 0 连片
0 0 连片
2 1
2. 培养基与平板的制作：
高氏1号培养基： 改良高氏无机一号琼脂培养基：
淀粉 20g
淀粉 20g
中,加入无菌水定容至10ml,充分 振荡10分钟，静置待土粒沉淀。
b 9ml灭菌水＋ 1ml土壤悬浮 液，充分混匀，即1/100浓度。
c 依次配制，1/1000浓度。 d 同上，即1/10000浓度。 e 同上，即1/100000浓度。
在稀释时，可在盛有无菌水 的试管中加入1滴100g/L的石炭 酸溶液，用以抑制细菌生长。
③ 分离方法：
A:分部位压印分离：按无菌操作条件，分别剪取处 理和对照地上部苗和地上部分别剪取３对真叶和 茎段，一对真叶分正反两面(一片取正面，一片取 反面)，放在培养基平板上，盖一层无菌滤纸， 用 镊子轻压使样品与崐培养基紧密接触，然后取出 滤纸和样品，置30℃温箱培养48h观察。
B:表面消毒后分离：分别选取不同茎段、叶片，剪 成小块(约2mm)， 接崐常规无菌操作于NYDA培 养基上分离，置于30℃温箱培养48h检测供试菌分 布。
田间防治效果测定
对柑桔炭疽病的防效 ① 药剂品种：广谱增产菌（北农大生防室）；高脂
膜（沙城）；70％甲基托布津可湿性粉剂（日 本）；Bacillus sp.菌悬液；Trichoderma sp. 菌悬液。 ②方法：对桔园新生春叶进行不同药剂处理，喷药 后对 Bacillus 和 Trichoderma套塑料袋保湿24小时， 每处理４个重复。喷药三天后统一接种炭疽菌 （浓度1.2×106个孢子/ml）。同时设立两个对照， ＣＫ1仅接炭疽菌而不任何药剂，ＣＫ2是仅喷水， 作原始校正。11Ｄ后采叶片保湿培养，5Ｄ后统计 病叶率及防效。
HV 培养基是以土壤腐殖质为唯一的碳源和氮源的培养基， 只有放线菌能利用腐殖质，所以它能够选择性分离包括 稀有放线菌在内的多种放线菌。但是，HV 培养基的颜 色较深，而且此培养基上长出的放线菌菌落一般比较小， 不易辨认和挑菌。
3. 接种方法：
（1） 稀释平板法 A. 土壤悬浮液制备： a 称取研细的土样1g,倒入试管
B. 接种方法： d或e土壤溶液，每皿加入20～30µl，用吸管吸
0.1ml(2滴)，取用无菌三角玻璃棒涂抹接种。
（2） 弹土法 每皿弹入约0.2毫克土壤样品粉末。
4. 培养：
放线菌28℃培养7-14 天 细菌3－5天 真菌5－7天 观察、调查菌落数、计数。
5．放线菌计数方法