液相色谱定量方法指导原则

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通过测量和计算得到的色谱参数(二）
• 柱效能：色谱柱在分离过程中主要有动力学参数 决定的分离效能。通常用理论板数或有效板数表 示。 • 理论板数： 若应用调整保留时间 tR′计算理论塔板数，所得值 称为有效理论塔板数( n有效或 neff ) • 有效板数：
2 通过测量和计算得到的色谱参数(三） 分离度：两个相邻色谱峰的分离程度， 以两个组分保留值之差与其平均峰宽之 比表示。
f A ms i ' i f s As xi 100% m样品
'
若固定试样称取量，加入内标物也恒定，则有：
m sf ' i m样品f' s
为一常数，上式则可化为：
xi % =
Ai 常数 As
• 若以 Ci % 对 Ai / As作图，则可得一条通过原点的直 线——内标标准曲线。
7 常用的几种定量测定方法（八）
m i / A i A sm i 1 f fi / fs m s / A s A im s S i


mi、ms用质量单位时，f 'w称相对质量校正因子
mi、ms用摩尔为单位时，f 'M称相对摩尔校正因子
注意：应用中一般地略去“相对”两字
6 质量校正因子的测定方法（三）
• 准确称取一定量待测组分的纯物质和标准物 质的纯物质混和后，取一定量（在检测器的 线性范围内）在实验条件下注入色谱仪，出 峰后分别测出两者峰面积，由前式可求得校 正因子。
7 常用的几种定量测定方法（四）
内标法待测组分含量计算式如下（由前可推得）:
f A ms i ' i f s As xi 100% m样品
'
（各符号意义同上） 内标法中常以内标物为基准，即：f 's ＝ 1 ， 也可用峰高代替峰面积，做法同上。
7 常用的几种定量测定方法（五）
内标法注意事项 a. c. 内标物应是试样中不存在的纯物质； 内标物的色谱峰应位于待测组分色谱峰附近 或几个待测组分色谱峰之间。
5 峰面积 A 的测量方法（三）
（5）自动积分法
• 将记录仪与自动积分仪连接，可直接准确、快
速地测出峰的面积。
（6）以峰高代替峰面积定量法
• 当各种实验条件严格保持不变时，一定进样范
围内色谱峰的半峰宽不变，即可用峰高代替峰
面积定量，特别对于狭窄的峰，较面积定量法 更为准确。
6 定量校正因子（一）
内标标准曲线的绘制 a. 将待测组分的纯物质配成不同浓度的标准溶 液（系列）； b. 取固定量的标准溶液和内标物，混合后进样 分析，测出 Ai 和 As； c. 用 Ai / As 对标准溶液浓度作图，可得一组通 过原点的直线（内标标准曲线）。
7 常用的几种定量测定方法（九） 样品测定与组分定量
a. 称取与绘制标准曲线相同量 的试样和内标物，测出其峰 面积比，由标准曲线即可查 出待测组分的含量。 b. 内标标准曲线法应用在生产 过程控制分析上，不须计算 校正因子，对液体样品也可 量取体积，具有简便快速的 特点。
当觉得上述过程麻烦时，可只加标一次，分别测量样品和加标样品的仪器 响应，再直接通过公式进行计算。
优点：基体(matrix)相近，或者说基体干扰相同； 缺点：麻烦，适于小数量的样品分析。
8 影响定量准确度的因素
• 1、样品制备 • --衍生化成可气化的或有紫外吸收或带荧光的，转化率 要高 • --溶剂 • --样品回收率 • --样品溶液的贮存 • 2、进样技术 • --人员手动进样 • --进样装置的准确性 • 3、色谱条件变化—柱温（气相）、流动相组成（液 相）；柱效对峰高有影响，峰面积无影响（保证分离 度的情况下） • 4、检测器特性：线性范围和稳定性、特殊组分使用选 择性检测器
X X A ( h ) X A( h )
' ' i i i i i
7 常用的几种定量测定方法（十四）
标准加入法（二）
b.可以加入一系列浓度，按标准曲线外推法计算 出欲测物在样品中的含量。 • 优点：不需要另外的内标物，不必要进样非常 准确；操作简单；若在前处理过程加入，可补 偿被测组分在处理过程中的损失。 • 缺点：色谱条件要求完全一致，否则会带来分 析误差。
外标法 样品测定（一）
a. 在同样操作条件下注入同样量（一般为体积） 的待测试样，从色谱柱上测得峰面积或峰高， 在标准曲线上即可查出待测组分的浓度。 b. 外标法也用于生产过程的控制分析，操作简 便，计算简单，但分析结果准确性取决于操 作条件的稳定性和进样的重现性。
7 常用的几种定量测定方法（十二）
• 检测器对不同物质的响应值不同，故相同质 量的不同物质通过检测器时，产生的峰面积 不等，因而不能直接应用峰面积计算组分含 量。 • 为此引入“定量校正因子”以校正峰面积， 使之能更真实地反映组分含量。 • 前面已知：mi ＝ fi Ai 即：fi ＝ mi / Ai
6 定量校正因子（二）
• fi 称绝对校正因子，定量分析中常用的是相对校正因 子 f 'i ，定义为组分的绝对校正因子与标准物质的绝 对校正因子之比：
7 常用的几种定量测定方法（十五）
标准加入法（三）
标准加入法标准曲线绘制
① 将一系列已知量待测物分别加入到几等份的样品中，配制成 浓度为(cx+0), (cx+c1), (cx+c2), (cx+c3)…….. 和样品有相同基体的 标准系列溶液(加标，spiking)； ② 通过仪器分别测量以上系列溶液的响应值 S0 ， S1 ， S2 ， S3 ，
检测限（LOD）：系指试样中的被测物能被检查的最低 量，是鉴别试验的灵敏度指标。其越低，反应的灵敏度 越高。
3 液相色谱的定性分析 • • • • 1、与已知物直接对照 2、已知物峰高增加法 3、二极管阵列检测器的三维图谱定性 4、与其他仪器联用定性
4 色谱法定量的依据
在一定的操作条件下，检测器的响应 信号（色谱峰的峰面积或峰高）与进入检 测器组分的量成正比。
外标法 样品测定（二） c. 当试样中待测组分浓度变化不大时，可不必 作标准曲线，而用单点校正法。即配制一个 与被测组分含量接近的标准样，分别取相同 量体积进样，测定标准样和待测样的峰面积， 按下式计算组分含量: Ci% = Ai/As ×Cs%
7 常用的几种定量测定方法（十三）
（4）标准加入法（一） • 标准加入法实质上是一种特殊的内标法，以欲 测组分的纯物质加入到待测样品中，分别测定 加入前后的峰面积，从而计算欲测组分在样品 中的含量。 • a. 可以单点加入，色谱条件完全相同的情况下， 按以下公式计算：
不对称峰不能作前述近似，可于峰高0.15及 0.85处测得峰宽，取其平均值进行计算： A = h× (w0.15+w0.85)/2
5 峰面积 A 的测量方法（二）
（3）峰高乘保留时间法
• 难以量度半峰宽的狭窄峰或半峰宽以上重叠的峰 可用下式计算：
• A ＝ 1.065h× b× tR （相对计算可略去1.065和 常数b） （4）剪纸称重法 • 对于不对称或分离不完全的峰，可将峰剪下，以 质量代其面积，使用较少。
7 常用的几种定量测定方法（三）
（2）内标法
• 使用条件：试样中各组分不能全部出峰、各组分含量悬 殊、仅需测定其中部分组分
操作步骤：
a. 准确称取一定量的试样；
b. 加入一定量的选定标准物（内标物）；
c. 混匀后进样，进行色谱分析；
d. 根据内标物和试样质量以及色谱图上相应的峰面积， 计算待测组分的量。
分离度图示
2 通过测量和计算得到的色谱参数(四） • 响应值：组分通过检测器系统产生的信 号值。 • 相对响应值：单位量物质与单位量参比 物质的响应值之比。
2 通过测量和计算得到的色谱参数(五）
• 校正因子（f）：相对响应值的倒数，它与峰面积的乘 积正比于物质的量。
• 定量限（LOQ）：是指样品中被测物能被定量测定的 最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。定 量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。
即：mi = fi Ai 或 mi = fi hi
式中：mi－组分的量 fi－比例常数
这就是色谱法定量的依据。
5 峰面积 A 的测量方法（一）
（1）峰高 h 乘半峰宽 w1/2 法
将色谱峰视为等腰三角形，得到的面积为 实际面积的 0.94 倍，故实际面积应为：（适合 于对称峰） A ＝ 1.065 h ×w1/2（相对计算可略去前面系 数） （2）峰高乘平均峰宽法
fiAi
fA
i i 1
n
×100
i
（可以为质量百分含量或摩尔百分含量）
7 常用的几种定量测定方法（二）
归一法的特殊情况
• 若试样中各组分的相对校正因子很接近（如同系物中 沸点接近的组分），上式则可简化为：
xi % =
ຫໍສະໝຸດ Baidu
Ai
A
i 1
n
×100
i
当测量参数为峰高时，也可以用峰高归一法计算组分含量。 （用峰高校正因子，以峰高代峰面积代入前页算式即可，） 归一法具有简便、准确的特点 不足之处在于仅可使用于所有组分都出峰的情况
S4……；
③ 以响应信号S对浓度c作图，再将直线外推与浓度轴相交于 一点(下图)，求得样品中待测物浓度cx。
1.2 1.0 0.8
S
0.6 0.4 0.2 S2 S1 0.0 10 20 S3
S4
0.0
-10
cx
30
浓度，c
当样品量很少时，可在一份样品中加标，加一次作一次测量，可得到上述 方法相同的结果；
m i / A i A sm i 1 f fi / fs m s / A s A im s S i
7 常用的几种定量测定方法（一）
（1）归一法
当试样中的全部组分都出峰（即都反映在 色谱图上）时，可以从校正后每峰峰面积占全部 色谱峰总面积的分数，求得该组分的质量分数。
x i% =
b. 加入的内标物量与试样中待测组分量相近；
7 常用的几种定量测定方法（六） 内标法优缺点 • 优点：定量准确，对试样含有不出峰的 组分情况下，也不影响测定。 • 缺点：每次测定都必须准确称取样品和 内标物质量，不适于快速分析。
7 常用的几种定量测定方法（七）
内标曲线法
用内标法待测组分含量计算式
1 有关色谱峰的基本概念（二）
2 通过测量和计算得到的色谱参数（一）
♦死时间(dead time，t0)—不保留组分的保留时间，即流动相（溶剂）通 过色谱柱的时间。 ♦死体积(dead volume，V0)—由进样器进样口到检测器流动池未被固定 相所占据的空间。V0＝F×t0（F为流速） ♦保留时间(retention time，tR)—从进样开始到某个组分在柱后出现浓度 极大值的时间。 ♦保留体积(retention volume，VR)—从进样开始到某组分在柱后出现浓度 极大值时流出溶剂的体积，又称洗脱体积。VR＝F×tR。 ♦调整保留时间(adjusted retention time，t'R)—扣除死时间后的保留时间 。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因 此t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0 ♦调整保留体积(adjusted retention volume，V'R)—扣除死体积后的保留 体积V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R
7 常用的几种定量测定方法（十）
（3）外标标准曲线法
标准曲线的绘制 a. 取被测组分的纯物质，配制成 一系列不同浓度的标准溶液； b. 分别取一定体积上述溶液注入 色谱柱； c. 得到色谱图后测出峰面积或峰 高； d. 绘出峰面积（或峰高）对浓度 的关系曲线 —— （标准曲线）。
7 常用的几种定量测定方法（十一）
液相色谱定性定量方法
1 有关色谱峰的基本概念（一）
• 峰底(CD):峰的起点与终点之间连接的直线 • 峰高(h):峰最大值到峰底的距离 • 峰宽(KL):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 • 半高峰宽(W1/2):通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两 侧相交两点之间的距离 • 峰面积（A）:峰与峰底之间的面积,又称响应值 • 拖尾峰（Tailing peak）:后沿较前沿平缓的不对称峰 • 前伸峰（Leading peak）:前沿较后沿平缓的不对称峰 • 基线（Baseline):在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信 号的曲线 • 基线噪声（N）:由各种因素所引起的基线波动 • 基线漂移(Baseline drift):基线随时间定向的缓慢变化